Universidad Autnoma de Nuevo Len *Facultad de Ciencias Biolgicas*

Prctica #1 Extraccin de ADN Genmico en Higado de Vaca Bos taurus

Alumna: Fca. Idalia Aguilar Martnez.

Asignatura: Biologa Molecular.

Maestra: Laura Trejo.

Grupo: 151

6 Semestre

24 de Abril del 2012

INTRUDUCCIN:
El cido desoxirribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico. Estructura de los cidos nucleicos: Cada molcula de ADN est formada por dos polmeros extremadamente largos sostenidos entre s por enlaces de hidrgeno y enrollados en lo que se conoce como doble hlice. Cada uno de los dos polmeros est formado por numerosas subunidades llamadas nucletidos, enlazadas covalentemente formando las cadenas. Cada nucletido est compuesto por tres partes: un compuesto de fsforo llamado fosfato, un azcar de 5 carbonos simples y una base nitrogenada. Las dos cadenas de nucletidos que constituyen una molcula de ADN, se mantienen unidas entre s porque se forman enlaces puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas, y este apareamiento est condicionado qumicamente de forma que la adenina (A) slo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN est definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucletidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la informacin gentica del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crtico para la clula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa gentico de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje gentico. En otras palabras, los genes son bsicamente un ordenamiento de nucletidos. En nuestro ADN que simplemente determina como sern nuestras protenas. La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente a secuencia de bases de la complementaria. Muchas de las tcnicas de biologa molecular incluyen algn tipo de manipulacin del material gentico. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimiento del cdigo gentico, que ya es posible clonar organismos enteros. Hoy da podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas, para estudiar la molcula de ADN con fines identificativos, es necesario previamente aislar dicha molcula en su forma nativa, libre de protenas y otros componentes celulares. La purificacin del DNA es importante porque permite: - Identificar mutaciones. - Ver caractersticas propias de los tipos de DNA (Polimorfismo). - Para clonar (Genes especficos, fragmentos de cromosomas o individuos). - Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno. - Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patognicos. - Identificar resistencia microbiana. - Evaluar desordenes genticos, neurodegenerativos, neoplsicos, imunolgicos. - Medicina forense para la identificacin de personas. - Para hacer tests de paternidad.

OBJETIVO:
Extraer ADN genmico de una muestra de hgado de vaca Bos taurus.

MATERIAL:
200ml Muestra del tejido hgado de vaca Tubo Eppendorf Micropipeta Vortx Centrifugadora 600 ml de Redand cell lysis 300 ml Tissue and cell solutions 175 ml MPC (protein precipitation reagent) 500ml de isopropanol 1 ml Etanol

MTODO:
1.- Pasar 200 ml de muestra a un tubo Eppendorf 2.- Agregar al tubo de muestra 600 ml de Redand cell lysis 3.-Mezclar 3 veces manualmente 4.-Incubar a temperatura ambiente 5 minutos y aplicar vortx 5.- Centrifugar 30 segundos 6.- Descartar el sobrenadante y dar vortx 7.-Resuspender el pellet en 300 ml de Tissue and cell solutions 8.-Agregar 175ml de MPC (protein precipitation reagent) 9.-Dar vortx por 10 segundos 10.-Centrifugar a 10,000 rpm X 10 minutos 11.-Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 12.-Agregar 500ml de isopropanol al sobrenadante 13.-Invertir con la mano 30-40 veces 14.-Centrifugar 10 minutos a 10,000rpm 15.-Quitar el isopropanol (sin disolver el pellet) 16.-Lavar 2 veces con etanol (1ml) 17.-Centrifugar 30 segundos a 1000 rpm 18.-Eliminarl el etanol 19.-Dejar secar

DISCUSIN:
Al hacer la extraccin y purificacin del ADN, a partir del tejido de hgado de vaca fue un procedimiento laborioso y repetitivo, los buenos resultados dependieron en gran medida del material y los pasos a seguir. Al extraer el ADN lo hicimos mediante una tcnica orgnica, lo primero que hicimos fue el (Rompimiento de paredes y disolucin de membranas) consiste en homogeneizar las clulas y distar los ncleos de los cuales se extrae el DNA, esto lo logramos con un detergente Redand cell lysis, (esto fue porque entra en las clulas y genera una desestabilizacin osmtica, haciendo que las clulas se hinchen y se estallen sus membranas celulares), hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solucin. Todo esto se logra en un tiempo de incubacin de 5 minutos a T ambiente para favorecer la reaccin. Luego procedemos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y a la vez para sedimentar los ncleos, quedando un sobrenadante compuesto por restos de membrana, organelas celulares y dems, est sobrenadante lo descartamos con ayuda de la micropipeta. Despues la cantidad de ncleos sedimentados es llevada al vrtex para resuspenderlos y facilitar el mismo proceso. Despus agregamos Tissue and cell solutions el cual el efecto que produce es que acta selectivamente en la membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los cidos nucleicos ejerciendo as su funcin detergente. Purificacin del ADN: Al instante colocamos MPC (protein precipitation reagent), su efecto fue que al dar vrtex, la solucin de precipitacin de protena que es bsicamente cloruro de sodio, solvata las protenas afectando su solubilidad e inicia su precipitacin, despus Centrifugamos para hacer ms rpido el proceso de precipitacin, al terminar la centrifugacin, se pudo observar una pequea porcin sedimentada esta contiene las protenas y el sobrenadante es de color transparente y contiene el DNA, aunque an no es visible. (Precipitacin de los cidos nucleicos): Retiramos el sobrenadante y lo mezclamos con isopropanol, luego lo invertimos varias veces, buscando la buena interaccin de los componentes, pudimos observar el DNA como unas pequeas fibras de algodn color blanco y esto se logr gracias a que el isopropanol deshidrata el DNA e inicia su sedimentacin y hacer ms rpido el proceso centrifugamos, despus sacamos la mayor parte posible de isopropanol. (Limpieza), le agregamos al DNA sedimentado, etanol para rehidratarlo (hicimos 2 lavados) y luego centrifugamos para sedimentar el DNA ya hidratado, quitamos cuidadosamente el etanol con la micropipeta y depues invertimos el tubo en una servilleta para quitar el exceso de etanol quedando el DNA en el tubo, posteriormente lo dejamos secar. (Secado)

CONCLUSIN:
Realizamos la extraccin de ADN presente en las clulas del hgado de vaca Bos taurus. Para esto utilizamos un mtodo o tcnica orgnica que permiti purificar en un grado alto el ADN .Para ello debemos provocar la ruptura de los tejidos ya que, el ADN se encuentra en el interior del ncleo celular, disperso y muy replegado unido a protenas para formar la cromatina, para extraerlo fue necesario homogenizar el tejido y romper las clulas para separar el ncleo, romper est para liberar el ADN, separarlo de las protenas y precipitarlo en forma de pastilla pellet. Esta pastilla es factible, ya que solo se tiene que resuspender en un tampn adecuado que es un paso previo para que este ADN pueda ser usado en: reacciones de restriccin y en reacciones de PCR.

BIBLIOGRAFIA:
A simple salting out procedure for extracting DNA from human cell. S. A. Miller, D. D. Dykes and H. F. Polesky. 1988. *Nucleid Acids Research: 16 (3): 1215. http://eprints.ucm.es/tesis/bio/ucm-t26242.pdf http://www.elportaldelasalud.com/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=127