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INTRODUCCIÓN

Este es un protocolo de extracción rápida para aislar el ADN del organismo de investigación más comúnmente utilizado procariótico, Escherichia coli. El protocolo no sólo es similar a los ampliamente utilizados en los laboratorios de investigación, también es bastante robusta: temporización, la temperatura y volúmenes tienen una amplia rango de tolerancia. Los diferentes pasos en el protocolo están diseñados para lograr la purificación creciente del ADN, principalmente por liberándola de membrana, las proteínas y ARN. Las variaciones en el protocolo (por ejemplo, dejando de lado algunos pasos, acortando los tiempos de incubación, etc) dará ADN de menor pureza, pero este ADN es, sin embargo suficiente para muchas actividades en el aula. Las características del protocolo que lo hacen atractivo para uso en la clase son la disponibilidad y la seguridad de los reactivos y el hecho de que tiene una respuesta visual (uno realmente ve el ADN durante la etapa de precipitación).

9. Resuspender un asa de colonias de una placa de agar en 500µl de TE hasta conseguir una perfecta homogenización o cultivar un caldo LB una cepa de E. A la suspensión.000 RPM durante 5 min).es decir. Esperar y observar durante unos 5 min.PROCEDIMIENTO 1. sino que puede llegar a ser algo transparente y difícil de ver. 12. 50 µl de proteinasa K. añadir con cuidado 100µl TE buffer y dejar reposar a temperatura ambiente durante la noche o en el refrigerador por varios días para permitir que el ADN se resuspendio completamente. Poner el precipitado en el tubo de microcentrifuga. . Dejar el tubo abierto durante unos 5 min. Se incuba a 60º C durante al menos una hora y un máximo de 24 horas 6. Cuidadosamente “enrolle” este precipitado en la varilla de vidrio. Para dejar evaporar el alcohol (es decir. centrifuge el cultivo en una microcentrifuga (esto debe hacerse relativamente suave --. añadir RNasa e incubar a 37º C por 30 min. En la interfase se forma un material blanco de aspecto fibroso que es el ADN. 8. Opcional: a la suspensión celular añadir 10ml de lisozima e incubar 30 min. A continuación. 2. A la suspensión añade: 10µl de SDS al 3%. Se debe tener cuidado en este paso no “perder” el ADN. cuando a no se puede oler el alcohol). suavemente añadir 2 volúmenes de etanol frio congelador con cuidado por el orillo del tubo de manera que forme una capa en la parte superior de la suspensión acuosa.coli. 3. 100µl de NaCl 5M. Resuspender el precipitado (s) en 200µl de solución salina-EDTA 4. (Junto con otros grandes moléculas contaminantes) 7. A 37º C 5.

si lo desea. como alternativa. Centrifuga (alrededor de 4000RPM durante 2 min en una microcentrifuga. Retire con cuidado la parte superior fase no acuosa. incluyendo la resuspencion del ADN en buffer TE PROCEDIMIENTO 2 . con la mano. Repita el paso precipitación con etanol. durante 10 min. 11. RESULTADOS junto con el material esponjoso de color blanco de la interfaz (se trata principalmente de proteína desnaturalizada) 12. en la fase acuosa final.10. 13. como se indica más arriba. mezcle suavemente las dos capas de forma continua. hasta que la interfaz ya no es blanco. la reacción de RNasa y etapa de extracción se puede realizar en un tubo más grande adecuado para su uso en una centrifuga de mesa). El paso de extracción con alcohol cloroformoisoamilico puede realizarse 2-3 veces más. Añadir un volumen igual de cloroformo isoamilico.

7. Aprendimos que para realizar el aislamiento de la E. digestión con enzimas de restricción Se evidencio el ADN electroforesis. En el poso número 9 podemos observar que se realizó una buena técnica pero a la hora de la siembra se puyo el agar y por esto se ve diferente el corrido de bandas. 5. esto es. y todo su procedimiento incluido reactivos y tiempos que necesita esta técnica Aprendimos que dicha rotura celular se lleva a cabo en presencia de “conservantes”. gracias el desplazamiento que se mostró en la     Se aprendió a realizar una práctica de electroforesis en gel de agarosa para hacer el corrido de bandas. ya sea por mala siembra o por no haber realizado correctamente los procedimientos al preparar la práctica.  En el poso número 1 se realizó siembra de un marcador al igual que el número 16. desnaturalización de restos celulares y separación de RNA por ribonucleasa seguida de una precipitación selectiva DNA. que impiden o limitan la acción de las DNAsas presentes en las células o contaminantes del medio y nos ayudan a realizar el aislamiento de una forma efectiva sin ninguna limitación. y en el 16 si se ve la perfecta siembra y corrido que se obtuvo. para obtener resultados efectivos del aislamiento. 12.RESULTADOS  Los resultados de esta práctica fueron evidenciados al hacer la lectura en la lámpara UV. una buena técnica de siembra y un buen procedimiento al alistar los materiales y manejo de reactivos. p u r i f i c a d o s e p u e d e u t i l i z a r p a r a a p l i c a c i o n e s c o n PCR .coli debemos hacer la rotura de células. d e a l t a c a l i d a d . que garantizan la integridad del DNA. obteniendo la extracción y purificación. porque no se logra ver el corrido de las bandas en la lámpara UV En los posos número 10 y 11 se puede ver el ADN por el corrido electroforético que se realizó de la mejor forma. 13. Se llevo a cabo mediante la técnica de electroforesis. pero el primer poso no se logra observar el desplazamiento. 6.  . los cuales deberían tener mejor desplazamiento en el corrido electroforético. de la muestra. En los posos número 4. 8.    CONCLUSIONES  Se logro la extracción y purificación de ADN.  En los posos número 2 y 3 se ve muy leve el corrido que se pudo obtener. realizamos el corrido electroforético de ácidos nucleicos (muestra) El ADN genómico. 14 y 15 no se determina presencia de ADN.

el mismo que descubrió la penicilina. también llamada muramidasa. Qué hace la lisozima en este protocolo? ¿Dónde se producen de forma natural? ¿Cuál es su función? R/: La lisozima. la leche y el cartílago. de donde se extrae para su uso industrial. la lisozima está presente en el bazo. También es muy abundante en la clara del huevo. los leucocitos. debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12. Además de encontrarse en la saliva y en las lágrimas. las lágrimas y el moco.CONSULTA 1. La lisozima fue descubierta por Fleming. El SDS es un detergente iónico que lisar mayoría de las células y desnaturalizar algunas proteínas 4. ha sido asociada a displasias esqueléticas y a un aumento de la propensión a las infecciones.4 entre los residuos de ácido Nacetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano. La deficiencia en lisozima. es una enzima de 14. Qué haria ud para demostrar que el material precipitado es realmente ADN? ¿ como cuantificar la cantidad? R/: Realizaria pruebas donde me muestren que lo que fue aislado se encuentra la información genética de este microorganismo como la prueba cualitativa condifelamina en donde se comparara con muestras patrón de ARN y ARN y para cuantificar realizaría una curva de calibración que es utilizada para determinar la concentración de ADN en una muestra.reventar la apertura de la célula o bacteria para liberar el contenido de celdas en el seno del medio 3. . Una gran cantidad de esta enzima puede hallarse en las claras de huevo. puesto que dicha concentración se infiere según el valor de Ct encontrado o se puede hacer diluciones también de la muestra obtenida o se calculara la concentración del ADN bacteriano extraído mediante el uso de la espectrofotometría 2. el plasma. La lisozima es abundante en numerosas secreciones como la saliva.este proceso separa los ácidos nucleicos a partir de proteínas.4 kilodalton que daña las células bacterianas catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1. en particular para el control de las bacterias lácticas en los vinos. Cuáles son los principales contaminantes en la extracción de ADN ¿ como se mide su concentración R/: Precipitante proteínas . que es uno de los principales contaminantes en la extracción de ADN Lisis de la célula . Está presente también en los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos polimorfonucleares PMN. los pulmones. La lisozima es una enzima presente en las lágrimas y la saliva en donde actúa como una barrera frente a las infecciones.