Está en la página 1de 4

Propagación de plantas superiores__________

_______Tema 5. ..cultivo de tejidos “in vitro”..

5 5.1

OBTENCIÓN DE PATRONES O PLANTAS COMPLETAS POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS “in vitro”. Definición.

La técnica de cultivo de vegetales “in vitro” consiste, muy esquemáticamente, en el cultivo dirigido de porciones de tejido ( células aisladas u otras estructuras, tales como granos de polen, embriones, meristemos, etc. ) en condiciones asépticas y en ambientales controladas. Esto significa que hay que proporcionar al explanto ( estructura o porción del vegetal que se introduce en los recipientes de cultivo ) objeto del cultivo una serie de condiciones que aseguren el éxito de la operación, entre las que cabe destacar:  Un medio de cultivo adecuado, que proporcione a dicho explanto los nutrientes y metabolitos que la planta madre le suministraría.  Unas condiciones de asépsia adecuadas, que aseguren la no contaminación del medio de cultivo durante el cultivo.  Unas condiciones ambientales ( temperatura, iluminación y fotoperiodo ) que promuevan el desarrollo de los explantos.  Unas buenas condiciones para la aclimatación de las plantas obtenidas para su posterior crianza en condiciones más o menos “normales “. De todas las fases del cultivo, la menos espectacular pero la más importante es la última, ya que significa el paso de condiciones más que óptimas a otras más “duras”. 5.2 Instalaciones necesarias. Un vivero ( o parte de un vivero ) que se dedique a la obtención de plantas “in vitro” suele constar de las siguientes instalaciones:  Oficinas, para el control administrativo.  Almacén de utensilios y materias primas.  Cocina, donde se preparan los medios de cultivo.  Sala de siembra.  Sala de cultivo.  Invernaderos, para la aclimatación de las plantas. Vamos a describir estas instalaciones y los detalles correspondientes. 5.2.1 Medios de cultivo: Los medios de cultivo se componen de:  Sales minerales; macro y microelementos, dosificados en diferentes proporciones, pero siempre asegurando su correcta disolución y asimilabilidad.  Hidratos de Carbono, como fuente de energía, fácilmente asimilable. Se suele usar Sacarosa y/o Glucosa.  Vitaminas hidrosolubles, tales como Ácido Ascórbico, Ácido Nicotínico, etc. Y otras, como el Sorbitol, de efectos antioxidantes.  Hormonas de los grupos Auxína, Giberelinas y Citoquininas. Esta se dosifican en diferentes equilibrios, según la dirección que queramos en que se desarrolle el cultivo. Concretamente:  La Auxina promueve la formación de callos.  Las Giberelinas favorecen el alargamiento de brotes.  Las Citoquininas diferencian nuevos brotes.  El medio de cultivo se gelifica usando, normalmente, Agar. Estos medios de cultivo se preparan en la “cocina”, lugar del laboratorio dotada de los elementos necesarios. La preparación de los medios se hace según una “receta”:  Dilución de la sales minerales, a partir de soluciones madre previamente preparadas y conservadas en cámaras frigoríficas, con agua bidestilada.  Adición, en frío, de: Hidratos de Carbono, Vitaminas y Hormonas, por este orden.  Comprobación y ajuste, en su caso, del pH del medio, con Ácido Clorhídrico o Hidróxido Potásico ( 1 N ) hasta alcanzar valores de 5,0-5,5.  Calentamiento de las soluciones hasta 45-50 ºC y adición del Agar, hasta que desaparece la turbidez. Una vez preparadas, y todavía en caliente, se reparte en los recipientes de cultivo, que pueden ser de vidrio o de plástico termoestable. En viveros comerciales se emplean francos de

39

 Desinfección del material vegetal: cuando se hacen cultivos sucesivos. frío-calor. debiendo ser repicados a un medio fresco o bien pueden conservarse durante semanas en frigorífico. en autoclave. Cuando es imprescindible el uso de sustancias muy termolábiles. más o menos grandes. consisten en habitaciones aisladas térmicamente. 5.  Equipo de climatización.000 y 4. pueden producirse contaminaciones ( procedentes del aíre.  Programadores para efectuar un fotoperiodo intermitente. 5. etc.2 Condiciones de asépsia: Los medios de cultivo son. paredes y suelos. de los medios de cultivo. por lo que hay que asegurar su ausencia en el interior de los frascos. 5.  Los utensilios ( pinzas. etc. ) dichas operaciones hay que realizarlas en unas salas especiales ( salas de siembra ) en las cuales:  Se realizan desinfecciones periódicas con lejía en techos. normalmente se utilizan ciclos de 16/8 horas de luz-oscuridad.  El personal utiliza ropas y calzado esterilizado.  Antes de comenzar el trabajo se desinfectan con tubos fluorescentes de rayos UVA germicidas. como el AIA. Este calentamiento degrada las vitaminas y hormonas. donde se introducen los frascos una vez “sembrados”.2.  Baterías de iluminación. un ciclo de cultivo suele durar alrededor de 30 días. ropas. . En estas condiciones. repicados.3 Condiciones ambientales: En las cámaras de cultivo.2. por ejemplo ).  Asépsia durante la manipulación: con las precauciones anteriormente descritas tendremos tanto en interior de los frascos de cultivo como el material suficientemente limpio. pero cuando se inicia un cultivo. lavándolas en agua corriente. dispuestos en cantidad. para eliminar restos de los mismos.cultivo de tejidos “in vitro”. además de idóneos para el desarrollo de los explantos. así como en los utensilios que se emplean en la manipulación de los mismos. capaz de mantener durante todo el año temperaturas del orden de 25 ºC.000 luxes.  La manipulación se realiza en mesas de cultivo de flujo laminar.2. Se suelen utilizar temperaturas de 120-121 ºC. ) se esterilizan y flamean antes de ponerse en contacto con los explantos. las pérdidas son elevadísimas y ponen en peligro el éxito técnico y económico del vivero. vidrio de los usados por la industria conservera mientras que en laboratorios de investigación es frecuente el uso de tubos de ensayo de vidrio especial. Para resolver este problema se recurre a las siguientes soluciones:  Esterilización. se añaden a los medios de cultivo cuando están a punto de gelificarse mediante microfiltros microbianos. según la cantidad de material a cultivar. durante 10-15 minutos. separación y altura suficientes para asegurar una iluminación homogénea de intensidades entre 2. escalpelos. si no interesa seguir en este momento con el cultivo. a base de tubos fluorescentes de luz blanca o del tipo Growth Lux. a partir de plantas cultivadas en condiciones normales ( aíre libre o invernadero ) es necesario desinfectar la superficie del material ( brotes. durante los cuales los explantos habrán evolucionado y están en condiciones de iniciar otro nuevo ciclo. Una vez mantenidos durante 15-20 minutos en soluciones de estos productos se lavan tres veces con agua bidestilada previamente esterilizada . etc.. troceado. óptimos para el desarrollo de patógenos ( Bacterias y Hongos ). Esta aclimatación supone:  Para evitar contaminaciones posteriores a las nuevas plantas se les eliminan los restos del medio de cultivo. dotadas de los siguientes elementos:  Estanterías para la colocación de los frascos. Pero como durante las operaciones de siembra. procedentes de cultivos anteriores no es preciso desinfectarlos. una vez entubados. en el propio explanto. para lo cual se usa Hipoclorito Cálcico o Sódico o Cloruro de Mercurio ( solo para semillas ).4 Condiciones para la aclimatación: Si el paso de las condiciones de cultivo dentro de las cámaras a las de campo no son graduales para que las nuevas plantas se vayan aclimatando poco a poco. 40 ..Propagación de plantas superiores__________ _______Tema 5.

por ejemplo. una vez comprobadas las características agronómicas de una nueva variedad o patrón.000. Si por suerte las características producidas por la mutación ( color de la flor. No obstante. Existe un parámetro importante. donde todavía no se han formado nuevos vasos conductores. ). 1012 nuevas plantas. poder introducirla en el mercado en tan poco tiempo. y registradas como nuevas. en cultivos para flor cortada como el Clavel ) son de interés comercial podrán ser aprovechadas.A. al haber sido fabricadas en caliente. Tan solo citaremos las que pueden resultar de interés práctico en viveros comerciales:  Producción rápida de grandes cantidades de plantas. o alguno de los axilares. vamos a detallar tres casos.I. es decir. Cuando se realizan cultivos con este fin. pero en aquellas en que el material responde normalmente suele estar comprendido entre 5 y 15. aunque el resto de la planta esté contaminada en dicha zona no pueden llegar los virus por falta de comunicación. normalmente basal. que expresa el número de explantos resultantes tras un ciclo de cultivo.    41 . Si se comparan estas cifras con las correspondientes a cualquier sistema clásico de multiplicación ( con las cuales se precisarían decenas de años ). Como ejemplos prácticas de aplicaciones de esa técnica. estéril y en un ambiente controlado. en el caso de que sean bandejas multipot de plástico termoformado. en muy poco tiempo y en grandes cantidades.  El paso de las condiciones de iluminación en las cámaras de cultivo ( iluminaciones bastante bajas ) a las normales de los climas mediterráneos ( muy altas ) se hace utilizando mallas de sombreo de porcentajes altos ( 80-90 % de sombra ) que se van retirando gradualmente a medida que se avanzando el periodo de endurecimiento. con virus.cultivo de tejidos “in vitro”..000. Para ello hay que comprobar dichas características antes de poner en el mercado los nuevos ejemplares. partiendo de un solo explanto ya establecido se obtendría.  El paso de las condiciones térmicas iniciales a las del interior de un invernadero ( con saltos térmicos diarios importantes ) se consigue con el uso de calefacción. tras un año de cultivos. para que las plantas se vayan acostumbrando. Si tomamos el ejemplo de un índice de valor 10 y un periodo de cultivo de un mes. se pueden lavar previamente con lejía. se pueden cultivar porciones de tejido vegetal y obtener nuevos ejemplares.  Se utilizan recipientes nuevos que. sumergiéndolas plantas en soluciones fungicidas y/o con estreptomicina. una vez obtenidas las nuevas plantas hay que comprobar dos puntos fundamentales:  Que. Esto se comprueba mediante test inmunológicos ( Test E. se ha conseguido la eliminación del patógeno. .000. de la zona indiferenciada. de idéntico genotipo ( en principio ) y con igual grado de desarrollo.S.Propagación de plantas superiores__________ _______Tema 5. para pasar de las condiciones de humedad del interior de los frascos ( cercanas al 100% ) a las del aíre más o menos libre se utilizan túneles de plástico.000. se comprenderá la ventaja que supone disponer de una técnica que permite. por ejemplo. efectivamente. La fase de aclimatación es la más importante de todas. el índice de multiplicación.  Se usan substratos esterilizados en autoclave o por medio de vapor de agua.  La utilidad de las técnicas de cultivo “in vitro” es múltiple..  Eliminación de patógenos no curables: mediante el cultivo de meristemos ( a veces combinando la técnica con la de la termoterapia ) se pueden obtener ejemplares “limpios” a partir de plantas contaminadas. Es imprescindible utilizar el equilibrio hormonal adecuado. el cual se va retirando poco a poco. suelen estar limpias. utilizando porciones muy pequeñas de tejidos del meristemo terminal.L.  Por último. Esto es posible porque. en los cuales se utiliza la técnica “in vitro” de forma muy diferente: RESUMEN Recordar que: Utilizando un medio de cultivo artificial. 1. Este índice varia bastante de unas especies y/o variedades a otras.  Que no se han producido mutaciones que alteren las características agronómicas de la variedad ( más frecuentes en cultivo “in vitro “ que en otras técnicas de propagación vegetativa ). Se dan tratamientos preventivos contra bacterias y hongos.

cultivo de tejidos “in vitro”.Propagación de plantas superiores__________ _______Tema 5. hay que comprobar el éxito de la operación con los tests correspondientes.. .   Esta técnica también sirve para eliminar virus de plantas contaminadas. 42 . Cuando se trata de eliminar patógenos..