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PRACTICA DE ENFASIS EN GENETICA MOLECULAR No.

1 Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca Elaborada por : Patricia E. Vlez Pedro A. Moreno

Bioseguridad Introduccin El conocimiento de algunas reas de la Biologa tales, como la Biologa molecular, la Gentica Molecular y las ms recientes como la Genmica y la protemica hace necesaria la capacitacin del bilogo a prepararse en obtener los fundamentos y destrezas bsicas en la manipulacin de los cidos nucleicos y protenas, a fin de llevar a cabo en el da de maana- un trabajo eficiente en el laboratorio de investigacin a tono con las nuevas exigencias de la biotecnologa moderna. Dar conocimiento en la correcta manipulacin de tales reactivos Colocar papel vinilo para proteger las manos y el visor del transiluminador Usar guantes adecuados para el bromuro de etidio Usar gafas especiales para proteccin del visor de ultravioleta que a veces tiene una longitud de onda de 300 nm o ms. Usar protocolo de desactivacin del bromuro de etidio. Colorear el gel o colorear el buffer de corrida.

PRACTICA DE GENETICA MOLECULAR No. 1 Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca BIOSEGURIDAD

TRATAMIENTO DE LAS SOLUCIONES DE BROMURO DE ETIDIO

El bromuro de etidio es un mutgeno muy poderoso. Como un agente intercalante, es muy utilizado para visualizar los cidos nucleicos directamente del gel. El bromuro de etidio debe siempre ser tratado como un residuo txico; la manipulacin apropiada de este material incluye la prevencin de la contaminacin ambiental despus de su uso. Solamente despus del tratamiento apropiado del bromuro de etidio puede ser desechado con un mnimo cuidado, por supuesto en un envase apropiado. Muchas publicaciones acerca del tratamiento del tratamiento para desechar el bromuro de etdio han sido largamente descritos (Lunn and Sansone,1987; Bensaude, 1988; Lunn and Sansone, 1990). A este respecto, hay que recordar que la prctica comn de adicionar blanqueadores a los desechos de bromuro de etidio no es recomendado, debido a que tal tratamiento, anque reduce la mutagenicidad del bromuro de etidio, convierte al colorante en otro componente mutagnico (Quillardet and Hofnung, 1988). En lugar de ello, se sugiere usar uno de de los siguientes protocolos, los cuales deben ser adoptados como polticas estandar de laboratorio, en especial en los cuales se use el bromuro de etidio como colorante de cidos nucleicos. Estos protocolos recomiendan la manipulacin de soluciones diludas de bromuro de etidio; las soluciones que contienen bromuro de etidio en concentraciones mayores de 0.5 gr/ml pueden ser diludas y procesadas tal como se describe en el Protocolo No. 1 o 2. Protocolo No.1 El mtodo preferido de la descontaminacion de solucines diluidas de bromuro de etidio (< 0.5 g/ml) es adicionar 3 gr de Amberlite XAD-16 (de Rohm - Hass, y Farrell) para cada 100 ml de solucin (Joshua, 1986; Lunn and Sansone, 1987). Esta resina es un absorbente polimrico no inico. La solucin debe ser agitada intermitentemente por 12 a 16 horas a temperatura ambiente, despus de esto la solucin filtra (con papel de filtro Whatman No. 1 o su equivalente). El filtro y la Amberlita deben ser tratados como desechos txicos y deben ser descartados de acuerdo a las polticas de seguridad y de

laboratorio internas. Finalmente, el producto del filtrado podr ser descartado. Protocolo No. 2 Para este procedimiento, adicione 100 mg de carbon activado a cada 100 ml de solucin de bromuro de etidio (< 0.5 g/ml) (Bensuade, 1988). La mezcla resultante debe ser agitada intermitentemente por 1 hora a temperatura ambiente, despus de esto, se filtra (con papel de filtro Whatman No 1 o su equivalente). El filtro y el carbn activado deben ser tratados como residuos txicos y desacartados de acuerdo a las polticas internas de laboratorio. Solo entonces, el filtrado resultante podr ser desacartada. Referencias Bensuade, O. (1988). Ethidium bromide and safety - readers suggest alternative solutions. Letter to editor. Trends Genet. 4, 89. Joshua, H. (1986). Quantitative absorption of ethidium bromide solutions from aqueous solutions by macroreticular resins. BioTechniques 4(3), 207-208. Lunn, G. And Sansone, E.B. (1987). Ethidium bromide: Destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162, 453. Lunn, G. And Sansone, E.B. (1990). Degradation of ethidium bromide in alcohols. BioTechniques 8(4), 372. Quillardet, P. And Hofnung, M. (1988). Ethidium bromide and safetyreaders suggest alternative solutions. Letter to editor. Trends Genet. 4,89. Farrel, E. R. (1993).RNA Methodologies. Academic Press, INC, London, 287-288.

PRACTICA DE ENFASIS EN GENETICA MOLECULAR No. Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca MANEJO DE CATALOGOS Y DE EQUIPOS

Elaborada por: Patricia E. Vlez. Pedro A. Moreno

INTRODUCCIN A medida que surjen cada dia nuevos desarrollos tecnologicos, se tiene a disposicin casi de inmediato, dichas herramientas para su aprovechamiento, dependiendo de los objetivos que deseamos alcanzar. Para este respecto, se dispone de toda la informacin precisa de los equipos y reactivos de estos nuevos desarrollos en Catalogos, los cuales estan puestos a disposicin por las casas comerciales en medio impreso y de manera electrnica, va Internet. El estudiante en formacin en el campo de la Biologa y de la Genetica Molecular necesita adiestarse en el conocimiento y manejo de tales catalogos, permitindole optimizar y racionalizar costos en la investigacin y en los objetivos que persiga. La presente gua se elabor con el propsito de proporcionar al estudiante algunos parmetros que le servirn para desarrollar los objetivos y preguntas de la presente gua de laboratorio. OBJETIVOS a. Preparar al estudiante en el manejo de catlogos de equipos y reactivos. b. El estudiante se entrenar en la correcta eleccin del reactivo adecuado para cada protocolo. c. El estudiante adquirir destreza en la elaboracin correcta de un presupuesto para un determinado nmero de muestras a ser analizadas bajo un protocolo o estrategia especfica de inters.

d. El estudiante se adiestrar en la adquicisin de equipos y reactivos especialmente en la forma de embalaje de los mismos, lo cual genera siempre ms gastos, dependiendo de condiciones particulares de envo. MARCO TEORICO. b) Reactivos a)Utilidades Para la solicitud de reactivos que se quiere usar en un protocolo, se debe tener en cuenta dos parmetros importantes: la cantidad necesaria para el protocolo a desarrollar y el numero de muestras que van a ser analizadas. En los cataogos vienen datos imprtantes como la cantidad a la cual estan envasadas ( ul, mls o L, gr, ugr, mgr, gr.). En estos se encuentran los precios para cada forma envase por cantidades. Se puede conocer la temperatura a la cual se puede mantener en forma mas adecuada, y cual es la temperatura y pH optimos de reaccin. c) Precauciones A este respecto se debe tener en cuenta, que algunos recativos, como las enzimas, por ejemplo la Taq polimerasa, las enzimas de restriccion, y los iniciadores, se conservan (como almacenamiento a largo plazo) mejor a temperaturas) de 70 oC. En este aspecto, se debe terner en cuenta que debe tenerse disponibilidad para almacenamiento de las mismas en un aparato de congelacion con estas condiciones. Si las enzimas se van a utilizar de forma inmediata, se puede tener unas condiciones de almacenamiento en un sistema de congelamiento de 20 oC, con EXCEPCION de los clonos, que solo pueden estar a 70 oC y las protenas. d) Equipos Para este topico, debemos estar dispuestos a tener en cuenta dos importantes puntos de vista acerca de los equipos de laboratorio que requerimos: a) Utilidades e) Precauciones f) Utilidades: En este punto, es interesante, conocer que un equipo puede tener mas de una funcionalidad, como es el caso, del espectrofotometro: Este nos puede servir por ejemplo, para analizar la concentracin del ADN, de las proteinas y de los carbohidratos. Tambien resulta interesante conocer, que en este equipo podemos obtener la informacin de las anteriores en forma de dato, en forma de grafica o en forma de histograma. Lo cual puede ser util para la apreciacin y anlisis de los resultados. Es importante tambien tener en cuenta que existen espectrofotmetros en los cuales se pueden hacer mediciones desde 1ml hasta 5 mls. Es necesario tener en cuenta que los equipos de espectrofotometria usan celdas de cuarzo, que son muy delicadas, por lo tanto deben ser guardadas en cajas con sistema de amortiguamiento para golpes, que deben tocarse por la

parte esmerilada, preferiblemente con guantes (ademas por proteccion de la salud, debido a las sustancias que mse manipulan alli), y nunca debe permitrse ser rayadas. En el caso de equipos de fotodocumentacin, por ejemplo podemos pensar en la gran funcionalidad que puede tener un equipo de estos, ya que nos permite por ejemplo registrar y analizar geles que contengan informacin precisa de fragmentos de ADN (fragmentos amplificados, polimorfismos, etc), de proteinas y de ARN. Asi mismo, podemos registrar informacin de cariotipos de diferentes fuentes (animales, plantas, humanos, microorganismos). En el caso de equipos de centrifugacin, es importante para el estudiante conocer aqu que existen diferentes posibilidades en un equipo. En estas, podemos encontrar algunas con una gran versatilidad, y de gran utilidad en la aplicacin de protocolos de investigacin, como por ejemplo, las que presentan la posibilidad de usar diferentes rotores que permiten el uso de diferentes tubos de centrifugacin (desde tubos de 50 mls hasta tubos de 1000 uls) y a diferentes temperaturas. Hay disponibilidad de equipos de cebtrifugacin que permiten desde microcentrifugacin a mas de 3000 RPMs hasta 5000 RPMs o ultracentrifugas que tienen en promedio 80.000 RPMs y que requieren tubos de titanio. Existen centrifugas con freno o sin freno, y que permiten que el precipitado no se disuelva. Tambien las hay programables para incrementar o descender la temperatura de manera gradual y sutil a medida que la centrigugacin ocurre en el tiempo en el cual la hemos programado. Esto es una gran ventaja para efectos de conservacin y de solubilizacin de algn producto. En el caso de los equipos de agitacin, tenemos los agitadores a diferentes velocidades, con temperaturas graduales, en bao de agua, con platos de agitacin inclinados o fijos. Algunos contienen aros o ganchos de agarre de diferentes calibres para sujetar desde tubos muy peques hasta beakers u otros recipientes. Para el caso de las fuentes de poder, es necesario saber que para la electroforsis de fragmentos de DNA necesitamos fuentes que nos permitan correr someter dichas matrices 100 0 150 volts como maximo, y que si se van a usar para hacer secuencia, se necesita que tengan una posibilidades de mas de 3000 volts. Tambien es til conocer que existen algunas que tienen la posibilidad de hacer varias electroforesis al mismo tiempo, ya que son programables, y tienen diferentes medidores que permiten cuadrar los diferentes tiempos los diferentes voltajes, y amperajes necesarios para optiumizar la resolucin de los fragmentos de DNA, RNA o las protenas que deseamos observar. Para las cmaras de electroforsis, es necesario saber que existen las mini-gel o de tamao pequeo, que permiten hacer geles de hasta 10-12 cms de largo

por 10-12 cms de ancho, hasta las grandes de 50 a 60 cms de largo y de 50 a 60 cms de ancho. . Para esto tambien se debe tener en cuenta, la cantidad de muestras que necesitamos correr en la electroforsis, y el volumen en microlitros que usares para sembrar o depositar en cada pozo. En este aspecto, entonces se hace importante conocer que existen a disposicin diferentes peinetas que tienen diferentes posibilidades para permitirnos fabricar en los geles pozos de siembra un numero variable de estos, y de diferentes volumenes. Esto se hace importante tambien para que el estudiante conozca, cuantas muestras puede analizar en cada electroforsis que realice y racionalizar los gastos de su investigacin. Para los aparatos de medicin de pH, es importante tener en cuenta que el electrodo necesita tener unos estandares de calibracion y que generalmente es preciso solicitar los que tengan tales calibradores. Tener en cuenta esta informacin es importante para optimizar los reactivos que se preparan y obviamente para optimizar los resultados y anlisis. g) Precauciones En este aspecto, es importante que el estudiante conozca: a)Responsabilidades: La persona que recibe el equipo debe de ser muy conocedora del equipo que recibe, y exigir a la casa comercial la entrega del mismo con una demostracin de funcionamiento. Muchas casas comerciales tiene preparados mini-cursos, en los cuales se permite asistir a unas cuantas personas, especialmente a las que les interesa conocer las bondades y precauciones a tener encuenta con tales equipos. h) Cuidados: Se hace importante conocer aqu, que algunos equipos son entregados con controles como es el caso de los equipos de espectrofotometria, y de pH, por ejemplo. En el caso de los equipos de fotodocumentacin, se hace necesario saber si es preciso solicitar filtros amarillos (para acidos nucleicos) o color verde o naranja (para proteinas), dependiendo de lo que queremos registrar. i) Se debe conocer el tiempo de vida media de un aparato, y el tiempo al cual debe realizarse el manteniemiento del mismo, y quien facilitara este soporte tecnico. j) Para todos los quipos, es necesario tener en cuenta el espacio disponible para su instalacin y el suministro de energia, ya que esto es de gran importancia para la vida util de cualquier equipo. k) Se debe hacer un registro de tiempo de uso y de usuario, para llevar un registro de funcionamiento, ya que esto permite hacer mantenimiento en un timepo adecuado y no en el momento en el cual ya el aparato no puede ser reparado. PROCEDIMIENTO Con la informacin anterior:

l) Haga una busqueda en los catalogos que existen en el laboratorio de los equipos que se mencionan en esta guia y que se encuentran subrayados. m) Elabore un presupuesto de tales equipos y describa las condiciones que Usted requiere, y cual ser el objetivo de uso que le dar al mismo. n) Examine los protocolos ANEXOS de extraccin de ADN y de amplificacin del fragmento de 227 pb del gen gen ApoE. NOTA: Para que un resultado tenga validez estadstica en el sentido estricto de la palabra, un resultado,debe ser realizado y obtenido por lo menos una vez mas. PREGUNTAS 1)Que cantidad de cada uno de los reactivos debemos requerir para realizar 150 amplificaciones de muestras pareadas control y de pacientes Alzmeimer de un fragmento de ADN que mide 227 pb? Realice un presupuesto. 2)Que cantidad de cada uno de los reactivos debemos requerir para realizar 220 aislamientos de DNA? Realice un presupuesto 3)Qu cantidad de cada uno de los reactivos debemos requerir para realizar y visualizar 175 polimorfismos con tres enzimas de restriccin HhaI, Hind III, Pst I? Realice un presupuesto PROTOCOLOS ANEXOS

AISLAMIENTO DE ADN POR EL METODO DE EXTRACCION DE SALES O SALTING OUT-B (A PARTIR DE 4 MLS DE MUESTRA DE SANGRE) Preparacin Buffer de Lisis de Eritrocitos (10X): A 20 mls de agua destilada estril se adicionan 6 mls de NH4Cl (concentracin final de 150 mM), 400 uls de KHCO3 (concentracion final de10 mM), 8 uls de EDTA (concentracin final 0.1 mM). Se lleva a 40 mls. Se autoclava. Posteriormente, se prepara la solucin de trabajo adicionando 10 mls de esta solucin de eritrocitos 10X a 90mls de H2O destilada estril. Mantenga a 4oC. Preparacion del Buffer de Ncleos: A 20 ml de agua destilada esteril, y adicione 0.5 mls de Tris-HCl 1M , pH 8.0 (concentracion final de 10 mM), 4.0 mls de NaCl 5M (concentracion final de 400 mM), 200 ls de Na2EDTA 500 mM (concentracion final de 2 mM). Se lleva a 50 mls y se autoclava. Mantenga a 4oC.

Solucin de Proteinasa K: A 1 cc de agua destilada estril adicione 0.003 gr de proteinasa K (concentracion final de 1mgr), 100 ls de SDS 10% (concentracin final de1%), 4 uls de EDTA 500mM (concentracin final de 2mM). Siga los siguientes pasos: o) Se toman 5 mls de sangre total y se transfieren a un tubo de centrfuga de 15 mls. Nota: Seguir la colecta de sangre como se recomienda en el protocolo anterior de salting out-A. p) Se centrifuga 15 min a 2500 RPMs q) SE desecha el plasma y se toma la lentejuela de leucocitos con una micropipeta de 1000 uls aspirando con muchisimo cuidado. Si se toman algunos eritrocitos, siga adelante. r) Adicione 10 cc de buffer de lisis de eritrocitos que esta a una temperatura de 4oC. s) Se hace un vortex para mezclar bien haga vortex por 10 seg. t) Se centrifuga a 1800 RPMs por 10 min. u) Se remueve el sobrenadante que se observa de color rojo y se desecha ladeando rapidamente el tubo (salen las celulas rojas lisadas). v) Adicione 5 mls de buffer de lisis de eritrocitos y se mezcla muy bien, preferiblemente con una micropipeta. Haga dos vortex durante 10 seg cada uno. w) Centrifugue por 10 min a 1800 RPMs x) Retire el sobrenadante de la misma manera que en el numeral g. y) Adicione 6 mls de buffer de lisis de ncleos y se da un vortex corto (5 seg) o se resuspende con micropipeta. z) Adicione 0.4 mls de SDS al 10%, 1.0 mls de solucin de proteinasa K. aa) Incubar a 37 oC durante toda la noche. bb) Al dia siguiente, se retira de incubacin y se adiciona 2 ml de NaCl 5 M. cc) Se da vortex por 15 seg. dd) Se centrifuga por 15 min a 2500 RPM a 4 oC. ee) Se retira el sobrenadante y se deposita en otro tubo estril. ff) Se adiciona dos volumenes (con referencia al del sobrenadante obtenido) de etanol absoluto que esta a 20oC y se invierte el tubo varias veces hasta que aparece el DNA ( con apariencia gelationosa, viscosa y transparente) . gg) Se toma con mucho cuidado el DNA, utilizando un tip o una pipeta paesteur, la cual se ha cerrado con calor para que no se adhiera y sea imposible retirar el DNA posteriormente del lumen de la pipeta.\ hh) Se deposita en un tubo eppendorf estril y nuevo, marcado previamente y se deja secar durante un rato (aproximadamente 40 min) al aire libre para que el etanol residual se evapore.

ii) Se adiciona 100 ul de Buffer TE y se resuspende con micropipeta. (En este paso ya no distinguimos la forma viscosa, gelationosa del DNA ya que se solubiliza bien en este buffer. jj) Para una mejor resuspension, preferiblemente se debe de poner a 37 oC durante 35 min. kk) Despues de este tiempo, se resuspende otra vez dando unos pequeos golpecitos al tubo y se guarda a 4 oC.

a) Protocolo de Polimorfismos con Enzimas de Restriccion Hha I, Hind III y Pst I: Siga las siguientes instrucciones: Adicione en un tubo eppendorff, nuevo y estril: *25 ul de producto de PCR *0.5 ul de Hha I (10 U/ul) Gibco *3.0 ul de Buffer de Reaccin * 1.5 ul de Agua deionizad estri * Incube a 37 oC por 3 horas. Adicione en un tubo eppendorff, nuevo y estril: *25 ul de producto de PCR *1.0 ul de Pst I (10 U/ul) Gibco *3.0 ul de Buffer de Reaccin *1.5 ul de Agua deionizad estri *Incube a 37 oC por 3 horas. Adicione en un tubo eppendorff, nuevo y estril: *25 ul de producto de PCR *0.5 ul de Hind III (10 U/ul) Gibco *3.0 ul de Buffer de Reaccin *1.5 ul de Agua deionizad estri *Incube a 37 oC por 3 horas. Visualice en un gel al 3% de agarosa y utilice el marcador de peso X174 Hinf I. (6 ul + 4 ul de Buffer de carga + 1 ul de H2O) A cada muestra que va a ser depositada en los pozos, adicone, Buffer de carga se adiciona 8 ul por cada 30 ul de volumen de muestra

b) Electroforsis del Fragmento de ADN Amplificado 12 ul del amplificado + 3 ul de buffer de carga 60-80 volts 2h 30 min

PRACTICA DE ENFASIS EN GENETICA MOLECULAR No. 2 Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca
PREPARACION DE REACTIVOS

Elaborada por: Patricia E. Vlez Pedro A. Moreno INTRODUCCIN La manipulacin de reactivos y el conocimiento de su utilidad prctica, son condiciones de absoluta importancia para el crecimiento personal no solamente del nuevo investigador, sino tambin para el investigador experimentado, ya que le permite optimizar sus resultados y racionalizar el uso de tales reactivos. Este hecho, le permite adems, realizar modificaciones a protocolos establecidos, adecundolos a las posibles circunstancias con los mejores beneficios.

La presente prctica de laboratorio, est diseada para que el estudiante de nfasis en Gentica Molecular, mediante algunos ejercicios, se entrene debidamente en la preparacin de reactivos, los cuales son a menudo o de condiciones altamente mutagnicas, txicas, o son de delicada manipulacin para evitar su deterioro, y por supuesto con consecuencias costosas, si no se tienen en cuenta o se desconocen tales condiciones.

OBJETIVOS 1. Entrenar al estudiante en el conocimiento de los reactivos ms comnmente utilizados en protocolos de Gentica Molecular. ll) Crear destrezas en el estudiante en la preparacin de los reactivos necesarios en los protocolos de trabajo. mm) Permitir al estudiante la posibilidad del uso de reactivos que pudieran ser reemplazados por otros por situaciones de disponibilidad o de optimizacin de resultados. MATERIALES nn) oo) pp) qq) Protocolo a desarrollar Catlogos de reactivos o fichas tcnicas de los reactivos Calculadora Cuaderno de Notas de Laboratorio o Bitcora de Trabajo con hojas numeradas

OTROS: rr) Reactivos ss) Frascos estriles de diferentes tamaos tt) Parafilm uu) Papel Reynolds vv) Buretas graduadas ww) Agua estril grado molecular xx) Pipetas de 10 mls., 5 mls y 1ml. yy) Micropipetas de 1000 ul., 200 ul., y 20 ul. zz) Tips estriles para 1000 ul., 200 ul, y 20 ul. aaa) Tubos eppendorf nuevos y estriles bbb) Guantes ccc) Mscara protectora o tapabocas

METODOLOGA

Clculos y Manejo de Protocolos ddd) El estudiante usar un protocolo de trabajo para el aislamiento de DNA, la amplificacin y electroforsis del fragmento de un fragmento de un gen determinado que le ser suministrado. eee) El estudiante realizar la preparacin de soluciones de almacenamiento (Stock) y de trabajo de los diferentes reactivos requeridos para los protocolos de trabajo suministrados fff) El estudiante consignar todos sus clculos y todo lo referente a los mtodos de preparacin de tales reactivos. Mtodos de preparacin ggg) El estudiante elaborar rtulos para cada reactivo preparado en donde consignar la informacin necesaria y precisa del mismo de acuerdo al anexo. Los rtulos adhesivos no seran muy adecuados para reactivos que tengan que congelarse a bajas temperaturas. Preferencialmente deben usarse rotuladores de puntas finas y gruesas de tinta indeleble.(ver anexo) hhh) El estudiante tendr en cuenta que la preparacin de tales reactivos, se har necesariamente con agua destilada estril, y otros con agua estril grado molecular, como por ejemplo para la preparacin de soluciones de trabajo de iniciadores o primers, de muestras de DNA, y de enzimas. iii) El estudiante preparar algunas soluciones amortiguadoras o buffers con agua destilada estril, tales como Buffer TAE, TBE, Agarosa, entre otros. Preservacin jjj) Los reactivos preparados tales como DNA, primers, enzmas, buffers de amplificacin, debern preferiblemente ser preparados y manipulados en hielo, y deben congelarse a 20 0C inmediatamente despus de ser utilizados. kkk) La enzima Taq- Polimerasa, debe mantenerse a 20 0C antes y despus de ser manipulada, al igual que las enzimas de restriccin. Estos dos reactivos debern ser descongelados, mediante el suave golpeteo con los dedos ndice y corazn del vial eppendorf. lll) Los reactivos debern estar permanente cubiertos por parafilm (como el caso de los reactivos mencionados en el numeral 7), y/o papel Reynolds. mmm) El estudiante entregar al final de la prctica su Cuaderno de trabajo o Bitcora de Trabajo, el cual debe estar debidamente marcado y fechado por el estudiante. nnn) El resto de los reactivos debern ser guardados a 4 0C. ooo) Los Buffers tales como el TBE o el TAE, que son Buffers de Corrido de electroforsis, debern ser cubiertos completamente con papel metalizado o ser guardados en frascos oscuros (mbar). De igual manera colorantes tales como el Bromuro de Etidio, debern ser guardados de la manera antes mencionada. ppp) Adicionalmente, los estudiantes resolvern las preguntas escritas al final de sta gua. qqq) NOTA: No olvidar las precauciones mencionadas en la prctica anterior referente a las medidas de Bioseguridad que debern ser tomadas.

Protocolo: PCR (Polimerase Chain Reaction) o Reaccion en Cadena de la Polimerasa: Protocolo de Amplificacion del fragmento del gen gen Apo-E de 227:

A continuiacin se daran algunos ajemplos de preparacin de reactivos. Prepare los siguientes soluciones de almacenamiento: Tris-HCl 1M para 500 mls: Pese 60.55 gr de Trizma-base, disuelva la solucin en 400 mls de H2O destilada estril. Adicione muy lentamente 35 mls de HCl (aproximadamente) o hasta cuadrar el pH a 7.6 Si la solucin toma un color amarillo, desechela y obtenga una mejor calidad del Tris. Nota: Aun cunado muchos electrodos miden acertadamente el pH de las soluciones de Tris, pse pueden pedir a las casas comerciales unos calibradores estandares adecuados. El pH de las soluciones Tris es dependiente de la temperatura y decrece aproximadamente 0.03 pH por cada oC que aumenta la temperatura a la cual se encuentra la solucion (dada por la temperatura ambiental). SDS al 10% para 500 mls.: Disuelva 50 gr de SDS grado electroforsis en 400 mls de H2O destilada y estril. Caliente a 68 oC para ayudar a disolver la solucin. Ajuste el pH a 7.2. adicionando unas cuantas gotas de HCl concentrado. Ajuste el volumen a 500 mls con H2O y dispense en alicuotas. Nota: Tenga precaucion cuando maneje el HCl concentrado. No aspire los vapores y use guantes y vestido adecuado. Use mascara cuando pese el SDS. Limpie la balanza sin airear. No permita que los cristales se peguen a las partes internas de la balanza porque la destruye por corrosin ya que es un potente detergente. Esta solucin no necesita esterilizarse. Ejemplo: NH4Cl para 50 mls (1M): 1 mol de NH4CL ----! 53.5 gr Moles de soluto ----------------------- = 1M, entonces, Litros de sln = 2.675 gr NH4CL

Si para 1000 ml --------------! 53,5 gr 50 ml X

Entonces, pese 2,675 grs. y lleve a 50 mls para obtener una concentracin de 1M. Haga los siguientes clculos:

Tris-HCL pH 7.5 (10 mM) Tris-HCl pH 7.6 (1M) MgCl2 (5mM) Na-EDTA (1M) Na2EDTA (500 mM) NaCl (6M) NaCl (5M) SDS 20% SDS 10% Isopropanol a 4oC Trizma Base Etanol a 20oC Buffer TE NH4Cl 1M KHCO3 1M EDTA (0.5 M) PREGUNTAS rrr) Qu frmula debe Usted usar para preparar soluciones con una concentracin final determinada? sss) Si queremos preparar 100 mls de NaCl 6M, que cantidad de NaCl debemos pesar? ttt) Si tenemos que preparar 500 mls de TBE 5X, que cantidad de Trizma base, cido brico y EDTA debemos usar para preparar dicha solucin Stock? uuu) Qu cantidad de EDTA debemos usar para preparar una solucin stock de EDTA 5X? vvv) Que cantidad de SDS debemos utilizar para preparar una solucin stock al 10%? www) Qu cantidad de agua debemos adicionar a una mezcla master de trabajo de 20 ul para amplificar un gen si hemos usado: 1 ul de Taq- Polimerasa 3 ul de DNA 3 ul de MgCl2 10 nM 3 ul de Buffer 10X 2 ul de dNTPs 10 nM ANEXO: Rtulo: El rtulo del reactivo preparado debe de tener los siguientes datos e idealmente debera de usarse un cdigo de color, para que el experimentador sepa que reactivo debe manipularse con proteccin de guantes o no, ya sea por toxicidad o por contaminacin y deterioro del reactivo: Nombre del reactivo Concentracin del mismo Cdigo: Solucin de Trabajo o de Stock

Cdigo del Lote a partir del cual se prepara el reactivo Cdigo secuencial de Lote si se han preparado varios viales o frascos (Ver ejemplo) Nombre de la persona que lo prepar o cdigo de color u otro. Fecha de preparacin. Ver ejemplo a continuacin:

PRACTICA DE GENETICA MOLECULAR No. 1 Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca AISLAMIENTO DE DNA Profesores Patricia E. Velez Pedro A. Moreno Introduccin Desde las ltimas dos decadas los cientficos se han dedicado a analizar los genes humanos, logrando en este tiempo grandes descubrimientos, no solo en el conocimiento del mecansmo de dichos genes, sino tambin en las tcnicas y en las herramientas tecnolgicas utilizadas para realizar dichos anlisis. En este empeo, los investigadores han hecho grandes avances en el abordaje de los anlisis de las secuencias de los genes, de la secuencia de las proteinas, y de sus caracteristicas moleculares que se encuentran encriptados en las dos moleculas maestras de los organismos vivientes, el RNA y el DNA. Por lo anterior, se pretende en esta prctica dar un conocimiento bsico en el aislamiento y manipulacin de una de las molculas de la vida: El DNA. Objetivos 1. Crear destrezas en el estudiante en el aislamiento del DNA. 2. Entrenar al estudiante en la manipulacin del DNA, de los insumos y de los reactivos indispensables en el aislamiento del DNA. 3. Realizar una comparacin entre dos tcnicas de aislamiento de DNA (Ver anexo). Materiales

Material Fungible Tips adaptables a las micropipetas Tubos eppendorf nuevos estriles Pipetas pasteur Tubos para toma de muestra de sangre con EDTA (Becton Dickson /Tapon morado ) de 10 mls. Tubos para centrifuga Corning de 15 mls. Nuevos y estriles. Equipos Microcentrifuga Centrifuga (Temp. Ambiente y a 4 oC) Vortex Incubadora a 37 oC Reactivos Tris-HCL pH 7.5 (10 mM) MgCl2 (5mM) Sucrosa Na-EDTA (1M) Na2EDTA (500 mM) NaCl (6M) NaCl (5M) SDS 20% SDS 10% Isopropanol Trizma Base EDTA Etanol Buffer Ttriton X-100 al 1% NH4Cl 1M KHCO3 1M EDTA (0.5 M) H2O deionizada esteril (preferiblemente miliqure o grado molecular) Otros Micropipetas de 1000 ul, 200 ul, 10 ul Procedimento 1. Se tomaran muestras de sangre de los estudiantes para que cada uno aisle su propio DNA, con el cual hara posteriores prcticas y anlisis genticos. 2. Con las muestras de sangre el estudiante realizar aislamientos de DNA usando las tecnicas de salting out A y B y de Chelex, segn protocolos para hacer estudios comparativos de:

a. Rendimiento o produccin de DNA de las dos tcnicas b. Calidad del DNA c. Anlisis de costo/muestra 3. El rendimiento del DNA se observar mediante anlisis en gel de agarosa, al igual que el de la calidad del mismo. 4. El anlisis de costo/muestra se har analizando los reactivos utilizados segn los protocolos anexos, de acuerdo a los catalogos comerciales de las casas que suministran dichos reactivos. Consideraciones a tener en cuenta al realizar los aislamientos de DNA: 1. USE guantes protectivos para el aislamiento de DNA TODO EL TIEMPO, para evitar se contaminados no solo con las muestras de DNA, sino tambin para manipular con responsabilidad (*) los reactivos usados para dicho proposito. (*): Recuerde, su seguridad es parte de la seguridad de todos!. 2. Recuerde que algunos de los reactivos usados SON ALTAMENTE MUTAGENICOS y otros pueden ocasionar efectos nocivos al ser manipulados inadecuadamente, para tal efecto siga con conciencia las instrucciones de uso suministradas en esta guia para cada uno de los reactivos a usar. 3. Los reactivos utilizados tienen acciones especficas en el proceso de aislamiento del DNA. A continuacin se listara el efecto que cada uno causa en dichos protocolos. A. AGUA DESTILADA: Lisa los globulos rojos. B. BUFFER DE LISIS 1A: Lisa los globulos rojos C. BUFFER DE LISIS 2B: Lisa los ncleos de las clulas PROTEINASA K: Es una enzma proteoltica que es purificada del hongo Tritirachium album . En solucin estable en un rango de pH de 4.0 a 12.5 con un ptimo en 8.0 a una temperatura de 25 oC a 65 oC. La Proteinasa K es estable (al menos durante 365 dias a -20 oC. Aun cuando esta enzma tiene dos sitios de unin para el Ca2+ , en la ausencia de este catin divalente, retiene suficiente actividad cataltica para degradar protenas que generalmente se encuentran en las preparaciones de cidos nucleicos. La Proteinasa K se prepara en una solucin stock de 20 mg/ml en agua esteril y se usa frecuentemente como a una concentracin de trabajo o solucin de trabajo de 50 g/ml en un buffer Tris-HCl a 10 mM, a un pH de 7.5, EDTA a 5mM y SDS al 0.5%. La actividad maxima de la Proteinasa es dependiente de calcio. D. SDS (o Sodium dodecil sulfato): Tambin conocido como Sodio lauril sulfato, es un detergente inico que es til para la ruptura de las membranas biolgicas (membranas lipdicas). Es un componente clave de muchos reactivos que se usan para purificar cidos nucleicos debido a su habilidad de inhibir RNAsas y tiene actividad de deoxiribobucleasas (DNAsas). El SDS se prepara en una solucin

stock de 10 al 20% (w/v) y a menudo se usa a una concentracion de solucin de trabajo de 0.1-0. 5%. La accin de este detergente puede ser significativamente afectada por su pureza. El SDS es fcilmente precipitado en presencia de sales de potasio. E. EDTA: Se adiciona para evitar los agregados de los acidos nucleicos con las protenas mediados por magnesio. F. BROMURO DE ETIDIO: ES UN PODEROSO MUTAGENO. Debe usarse condicIones extremas para su manipulacin en la preparacin de soluciones stock y de trabajo. El Bromuro de etidio debe ser inactivado y descartado con el protocolo de la Amberlita o con el del Carbn activado. El Bromuro de etidio se prepara en una solucin stock de 10 mg/ml en agua y siempre se guarda a 4 oC. Su actividad se debe a que se intercala en el DNA, especialmente en las zonas ricas en A-T. No exceda la concentracin de 0.5 g/ml en el gel, el buffer de corrido, o en el buffer de coloracion. Si se adiciona el bromuro de etidio a la agarosa fundida, la temperatura de esta debe de estar por debajo de los 60 oC antes de adicionarlo. Para la obervacin de las bandas en el gel que corresponden a los fragmentos de DNA en el transiluminador de Ultravioleta, USE SIEMPRE PROTECCION PARA SUS OJOS Y SU PIEL. G. NaCl ( Cloruro de sodio): Este reactivo permite precipitar el DNA que se intercalan en el DNA, dejandolo limpio de ellas, y permitiendo una mayor pureza a la extraccin de este. Generalmente se usa en una solucin Stock de 5 a 6 M, y como solucin de trabajo de 100 mM aproximadamente. H. Isopropanol y Etanol: Precipitan el ADN. I) BUFFER TE: Disuelve y conserva en buen estado el ADN, evitando su degradacion. J)PERCLORATO DE SODIO: Para precipitar el DNA. k)CHELEX: Resina sintetica que precipita al ADN con buena eficiencia. AISLAMIENTO DE DNA POR EL METODO DE EXTRACCION DE SALES O SALTING OUT-A (A PARTIR DE 500 L DE SANGRE) BUFFER DE LISIS I: A 800 ml de agua desionizada (preferiblemente miliqure o grado molecular), adicionar 5 ml de MgCl2 (5 mM), 10 ml de Tris-HCl (pH 7.5, 10 mM), 102,59 gr de Sucrosa, mezclar. Adicione 10 ml de Triton X-100 al 1% y posteriormente, se lleva hasta un (1) Litro. Se debe almacenar en frasco oscuro (para que no se altere por la luz la solucin) y a 4oC. BUFFER DE LISIS II: A 800 ml de agua desionizada (preferiblemente miliqure o grado molecular), agregue 24 ml de Na-EDTA (1M) y 12.5 ml de NaCl (6M) .Ajuste la solucin a un pH de 8.0 CON NaOH, calentando la solucin a 50 oC. Complete el volumen hasta un (1) Litro. Se almacena a temperatura ambiente. Siga los siguientes pasos:

a)Se toman 0.5 ml (500 l) de sangre tomada de una jeriga esteril tubo y se depositan en un tubo eppendorff nuevo. Nota: La sangre se debe heparinizar si no se va a hacer la extraccin inmediatamente (Preferiblemente, no esperar ms de un da). Si se va a usar el ADN para hacer genotipificacin (RFLPs) es preferible usar sangre tratada con EDTA y no con heparina, ya que esta, interfiere con las enzmas de restrIccin y la eficiencia de las mismas se baja) b) Se adiciona a esta, 1000 l de Buffer de lisis I, y se mezcla suavemente el tubo con pequenos golpecitos con el dedo. c) Se centrifuga a 3.500 rpm a temperatura ambiente en una microcentrifuga por 6 minutos. d) Se desacarta el sobrenadante invirtiendo rapidamente el tubo, cuidando de no perder el precipitado. Se resuspende en 60 l de Buffer de lisis 2, 30 l de perclorato y 2 l de SDS (20%). Mezclar suavemente con micropipeta. e) Se da un pulso de vortex durante 10 segundos. f) Se adicionan 30 l de NaCl (6M). g) Se repite el pulso de vortex durante 15 segundos. h) Se centrifuga a 2800 rpm durante 6 minutos. i) Posteriormente, se traspasa el sobrenadante a otro tubo limpio y nuevo. A este sobrenadante, se adicionan 100 l de isopropanol. J) Mezclar por inversion, suavemente, observar y recoger el ADN, con un tip nuevo. Limpiar con etanol el ADN. h) Limpiar con etanol y guardar en 200 l de Buffer TE (pH 7.5) precalentado a 70 oC. K) Diluir y guardar a 4 oC. AISLAMIENTO DE ADN POR EL METODO DE CHELEX (VER ANEXO) AISLAMIENTO DE ADN POR EL METODO DE EXTRACCION DE SALES O SALTING OUT-B (A PARTIR DE 4 MLS DE MUESTRA DE SANGRE) Preparacin Buffer de Lisis de Eritrocitos (10X): A 20 mls de agua destilada estril se adicionan 6 mls de NH4Cl (concentracin final de 150 mM), 400 uls de KHCO3 (concentracion final de10 mM), 8 uls de EDTA (concentracin final 0.1 mM). Se lleva a 40 mls. Se autoclava.

Posteriormente, se prepara la solucin de trabajo adicionando 10 mls de esta solucin de eritrocitos 10X a 90mls de H2O destilada estril. Mantenga a 4oC. Preparacion del Buffer de Ncleos: A 20 ml de agua destilada esteril, y adicione 0.5 mls de Tris-HCl 1M , pH 8.0 (concentracion final de 10 mM), 4.0 mls de NaCl 5M (concentracion final de 400 mM), 200 ls de Na2EDTA 500 mM (concentracion final de 2 mM). Se lleva a 50 mls y se autoclava. Mantenga a 4oC. Solucin de Proteinasa K: A 1 cc de agua destilada estril adicione 0.003 gr de proteinasa K (concentracion final de 1mgr), 100 ls de SDS 10% (concentracin final de1%), 4 uls de EDTA 500mM (concentracin final de 2mM). Siga los siguientes pasos: xxx) Se toman 5 mls de sangre total y se transfieren a un tubo de centrfuga de 15 mls. Nota: Seguir la colecta de sangre como se recomienda en el protocolo anterior de salting out-A. yyy) Se centrifuga 15 min a 2500 RPMs zzz) SE desecha el plasma y se toma la lentejuela de leucocitos con una micropipeta de 1000 uls aspirando con muchisimo cuidado. Si se toman algunos eritrocitos, siga adelante. aaaa) Adicione 10 cc de buffer de lisis de eritrocitos que esta a una temperatura de 4oC. bbbb) Se hace un vortex para mezclar bien haga vortex por 10 seg. cccc) Se centrifuga a 1800 RPMs por 10 min. dddd) Se remueve el sobrenadante que se observa de color rojo y se desecha ladeando rapidamente el tubo (salen las celulas rojas lisadas). eeee) Adicione 5 mls de buffer de lisis de eritrocitos y se mezcla muy bien, preferiblemente con una micropipeta. Haga dos vortex durante 10 seg cada uno. ffff) Centrifugue por 10 min a 1800 RPMs gggg) Retire el sobrenadante de la misma manera que en el numeral g. hhhh) Adicione 6 mls de buffer de lisis de ncleos y se da un vortex corto (5 seg) o se resuspende con micropipeta. iiii) Adicione 0.4 mls de SDS al 10%, 1.0 mls de solucin de proteinasa K. jjjj) Incubar a 37 oC durante toda la noche. kkkk) Al dia siguiente, se retira de incubacin y se adiciona 2 ml de NaCl 5 M. llll) Se da vortex por 15 seg. mmmm) Se centrifuga por 15 min a 2500 RPM a 4 oC. nnnn) Se retira el sobrenadante y se deposita en otro tubo estril. oooo) Se adiciona dos volumenes (con referencia al del sobrenadante obtenido) de etanol absoluto que esta a 20oC y se invierte el tubo varias

veces hasta que aparece el DNA ( con apariencia gelationosa, viscosa y transparente) . pppp) Se toma con mucho cuidado el DNA, utilizando un tip o una pipeta paesteur, la cual se ha cerrado con calor para que no se adhiera y sea imposible retirar el DNA posteriormente del lumen de la pipeta.\ qqqq) Se deposita en un tubo eppendorf estril y nuevo, marcado previamente y se deja secar durante un rato (aproximadamente 40 min) al aire libre para que el etanol residual se evapore. rrrr) Se adiciona 100 ul de Buffer TE y se resuspende con micropipeta. (En este paso ya no distinguimos la forma viscosa, gelationosa del DNA ya que se solubiliza bien en este buffer. ssss) Para una mejor resuspension, preferiblemente se debe de poner a 37 oC durante 35 min. tttt) Despues de este tiempo, se resuspende otra vez dando unos pequeos golpecitos al tubo y se guarda a 4 oC. Preguntas: 1. Si la proteinasa K se necesita en una solucin de trabajo de 50 ug/ml, cuanto debemos tomar para preparar una solucin de reaccin de 5 mls a partir de una solucin stock de 20 mg/ml? 2. Que reactivo usara usted para mejorar la actividad especfica de la proteinasa K? 3. Para preparar una solucin de reaccin de 5 mls cuanto debemos usar de SDS al 10% de manera que quede a una concentracin de 0. 5%? 4. El Bromuro de Etidio se prepara a una solucin stock de 10 mg/ml, cuanto debemos tomar de esta solucin de manera que podamos tenerlo a una concentracin de 0.5 ug/ml en un gel? 5. Que cantidad de NaCl 6M debemos tomar para una solucin de reaccin de 5 mls, de manera que nos quede a una concentracin final de 100 mM? 6. Cuanto cuesta el aislamiento de una muestra de sangre con el mtodo de salting out (500 ul) y con el mtodo de Chelex? Discrimine cada valor de acuerdo a la cantidad de reactivo usado y haga al final un valor total.

Prctica de Gentica Molecular No. 2 CUANTIFICACION Y CUALIFICACION DEL DNA AISLADO POR EL METODO DE SALTING OUT Y EL METODO DE CHELEX Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca Profesores: Patricia E. Velez Pedro A. Moreno Introduccin Para los anlisis de las muestras de DNA con cualquier propsito, es determinante tener una muestra de buena cantidad y calidad. Para este efecto, se han propuesto protocolos de control de estos importantes parmetros, los cuales se hacen bajo mediciones electroforeticas o espectrofotomtricas. Objetivos 1. Crear destrezas en el estudiante a la medicin de un DNA aislado bajo dos diferentes metodos: calidad y cantidad. 2. Ensenar al estudiante la importancia de tener un DNA de alta calidad para anlisis en Genetica Molecular. 3. Dar conocimiento al estudiante para conocer un DNA de alta calidad y buena cantidad, y proporcionarle los elementos conceptuales para analizar la posible causa de un DNA de baja pureza, lo que le permitir realizar un asilamiento posterior con mayor eficiencia. Procedimiento Para este, se usaran dos mtodos de cuantificacin y cualificacin del DNA:

a. Mtodo de cualificacin por gel: Este se puede analizar en geles al 1.5% de agarosa, en el cual se correra, la o las muestras de DNA con un marcador de peso de tamaos de fragmentos conocidos y preferiblemente grandes de hasta 10.000 pb o mas usando un marcador de peso molecular. Esta permitir ver el peso molecular aproximado del DNA obtenido. El gel ser coloreado con Bromuro de Etidio y seran observadas las bandas al transiluminador. Mediante este mtodo tambin podemos analizar si el DNA se observa degradado (con un smirring o barrido), o si se encuentra fragmentado. b. Mtodos de Cuantificacin por Espectrofotmetro : Esta se realiza tanto para cuantificar RNA o DNA tomando como ventaja la absorbancia que estas dos molculas tienen por la luz ultravioleta. As entonces, de los anlisis de la luz ultravioleta pueden ser usados no solamente para obtener informacin acerca de su concentracin, sino tambin de su pureza. La cuantificacin de las muestras de cido nucleico por este mtodo, se debe a que estos absorben las luz ultravioleta a 260 nm. Esta medida, permite el clculo directo de la concentracin en una muestra: [RNA] ug/ml = A260 X dilucion X 44.19 Donde: A260 = Absorbancia (en densidades pticas) a 260 nm Dilucin = Factor de dilucion (generalmente 200-500) 44.19 = Coeficiente de extincin del RNA NOTA: MUCHOS MANUALES DE LABORATORIO SUGIEREN UN VALOR APROXIMADO DE 40 PARA EL COEFICIENTE DE EXTINCION DEL RNA; EL VALOR DE 44.19 ES MAS PRECISO. [DNA] ug/ml = A260 X dilucin X 50 NOTA: EL COEFICIENTE DE EXTINCION ES LIGERAMENTE DIFERENTE AL DEL RNA . EL TRATMIENTO CON 40 UG/ML DE Rnasa POR 30 MIN A 37 0C, SEGUIDO POR REPRECIPITACION, DEBE REMOVER VIRTUALMENTE TODO EL RNA DE LA MUESTRA. Como la muestra se da en ug/ml NO OLVIDE DIVIDIR POR 1000! Preguntas: 1. Si se tiene un tubo eppendorf con un volmen de 200 ul con 50 ug/ml de DNA en buffer TE, cuanto DNA tendremos si el protocolo dice que tenemos que tomar 1ul de este tubo? 2. Si en una reaccin de secuencia, el protocolo dice que demos tener 300 ng, que volumen debemos tomar del tubo eppendorf antes descrito?

3. Cuando aislamos DNA con los dos protocolos que usamos en la anterior prctica (el de salting out y el de Chelex), estamos midiendo absolutamente DNA? Explique 4. Si tuviera que usar un reactivo para mejorar su calidad del DNA y tenerlo en alta pureza, cal reactivo elegira? Cual sera la razn?

Prctica de nfasis en Gentica Molecular No. 5 y 6 ELECTROFORESIS: PRINCIPIOS Y PARAMETROS Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca Elaborada por: Patricia E. Vlez Pedro A. Moreno Introduccin. La electroforsis es la tcnica por la mediante la cual mezclas de macromolculas cargadas qumicamente, especialmente protenas y cidos nucleicos, son resueltas rpidamente en un campo elctrico. A diferencia de la naturaleza anfotrica de las protenas, en la cual la carga neta es determinada por el pH usada, los cidos nucleicos, muestran una carga neta negativa en cualquier pH usado para electroforsis. De forma particular, la cromatografa electrofortica de los cidos nucleicos ha sido convertida en una herramienta standard por la cual se examinan cualitativa y cuantitativamente las muestras y se realizan ensayos de pureza. La metodologa es eficiente y rpida comparada con otros procedimientos de fraccionamiento de tamaos, como la centrifugacin por gradientes de densidad. El hecho de que los cidos nucleicos puedan ser observados directamente en un gel permite la inspeccin visual del progreso de la separacin, y tambin nos permite asegurarnos de la integridad de la muestra., y en la mayora de los casos, se pueden recuperar las bandas especficas en una gran variedad de formas para una posterior caracterizacin. As, la electroforsis es tambin una poderosa tcnica til para analizar las concentraciones de DNA y RNA (usando tcnica de densitometra, por ejemplo).

Histricamente, las aplicaciones muy tempranas de esta tcnica, involucro la cromatografa macromolecular en sucrosa. Refinamientos posteriores en la metodologa involucraron el uso de geles y finalmente llevaron a la implementacin de la acrilamida, en la cual la estructura del gel por si mismo influencia la migracin caracterstica de las molculas en investigacin. Se estableci rpidamente el uso de geles con grandes poros para hacer electroforsis de cidos nucleicos eficientemente. Se usaron en primer lugar geles de poliacrilamida (2.5%). La agarosa, un polisacrido lineal, que se extrae de las algas marinas, se adicion a los geles de poliacrilamida (Peacock and Dingman, 1968, Dahlberg et al., 1969) para darle a los geles mas consistencia. Tambin, se determin que los geles que estn hechos de agarosa o poliacrilamida favorecan las separaciones para cidos nucleicos, dependiendo del rango del tamao de las molculas en una muestra. Actualmente las dos matrices standard para cromatografa electrofortica de cidos nucleicos en general son los geles de poliacrilamida y de agarosa.

Consideraciones Tericas: Las siguientes tipos de relaciones describen el comportamiento terico de la carga de la molcula en sucrosa. En la prctica actual se han delineado otros parmetros, como factores que afectan el comportamiento de la carga molecular de las especies en una matriz de un gel. Lo que sigue, es la manera de entender, en una forma comprensiva, como la electroforsis trabaja. 1. Cuando una molcula se localiza en un campo elctrico, la fuerza ejercida en el (F) depende de la carga neta de la molcula (q) y la extensin o tamao del campo (E/d) en el cual este se localiza. Por lo tanto: E F = ___ . q d (Ecuacin No. 1)

2. En la anterior E es la diferencia potencial entre los electrodos y d es la distancia entre ellos. Realmente, la fuerza de friccin opone la migracin hacia un electrodo. F es dependiente del radio ( r ) de la molcula y la viscosidad del medio ( ) a travs de la cual se mueve; v , es la velocidad a la cual la molcula migra; 6, es una constante.
F = 6rv (Ecuacin No. 2)

Combinando las Ecuaciones 1 y 2, se puede ver que:

E ___ . q = 6rv d

(Ecuacin No. 3)

Por una expresin algebraica, se puede expresar la velocidad a la cual la molcula se mueve en el campo elctrico as: V= (Eq)/d6r (Ecuacin No. 4)

Notacin No 1: De las ecuaciones 1-4 podemos inferir, que la velocidad a la cual una molcula se mueve es proporcional al tamao del campo y a la carga neta, e inversamente proporcional al tamao de la molcula y a la viscosidad de la solucin. En el conocimiento de los dos parmetros de la electricidad es fundamental para entender la mecnica de la electroforsis. El primer parmetro a tener en cuenta es el de la Ley de Ohm, la corriente elctrica (I, amperios o amps) es directamente proporcional al voltaje (E, volts) e inversamente proporcional a la resistencia (R, ohms). As, entonces: I = E/R (Ecuacin No. 5)

El segundo parmetro, el poder (P, watts) es una medida de la cantidad de calor producido, y puede ser expresado como el producto del voltaje y la corriente, Entonces, tenemos: P = EI (Ecuacin No. 6)

La sustitucin de E con el producto I . R de la Ecuacin No. 5 permite expresar la ecuacin No. 6 como: P = I2 R (Ecuacin No. 7)

En la electroforsis un parmetro elctrico, ya sea el voltaje , la corriente o el poder, se mantiene siempre constante. Las consecuencias de un aumento en la resistencia durante la corrida de un gel (debido al desgaste o baja concentracin de electrolitos, la fluctuacin de la temperatura), difiere en las siguientes formas: a. Cuando se selecciona el modo de corriente constante, en el cual la velocidad es directamente proporcional a la corriente, se genera calor y la velocidad de la molcula se mantiene.

b. Cuando se selecciona el modo de voltaje constante, hay una reduccin en la velocidad de las moleculas cargadas, sin generacin de aumento de calor durante el curso de la corrida. c. Cuando selecciona el modo de poder constante , hay una reduccin en la velocidad de las molculas, pero no esta asociado a cambio de calor. Notacin No. 2: La regulacin de la temperatura es un componente primario en los procesos electroforticos. Esto debe particularmente tenerse en cuenta, cuando se esta corriendo geles de agarosa , en el cual es indispensable mantener el sistema de temperatura. El sobrecalentamiento podra causar una perdida de consistencia del gel en corto tiempo, y causar una prdida de las muestras a anlisis. Las reacciones que permiten el paso de corriente del ctodo al nodo son: Reacciones del ctodo: 2e- + 2H2O -------! 2 OH- + H2 HA + OH - --------! A- + H2O Reacciones en el nodo: H2O ------! 2H+ + O2 + 2eH- + A- --------! HA

Estas reacciones describen la electrlisis del agua en el buffer de electroforsis, conduciendo a la produccin de hidrgeno en el CTODO y oxgeno en el NODO. Por cada mol de hidrgeno producido, se produce media mol de oxgeno. Al realizar una observacin directa del nodo, se puede observar la mitad de las burbujas de gas que son observadas en el ctodo. No obstante, aun cuando esto sea cierto, esta no es la mejor manera de asegurarse de que los electrodos han sido conectados adecuadamente, es solamente una forma simple de tener una indicacin de que la corriente esta fluyendo. Eleccin de Matrices: Los geles de poliacrilamida muestran una propiedad de tensin mayor que los geles de agarosa, y ellos ofrecen un mayor poder de resolucin de fragmentos. Los geles de agarosa sin embargo, permiten separar molculas de cidos nucleicos de mayores rangos de tamao. Esto es debido a que los poros de un gel de agarosa son ms grandes, permitiendo una separacin mas eficiente de macromolculas como los cidos nucleicos, las protenas y hasta complejos de protenas. La poliacrilamida por el contrario, tiene los poros mucho ms pequeos, y pueden usarse para separar protenas de tamao muy pequeo y oligonucletidos. Los geles de agarosa, permite la separacin de molculas de

cidos nucleicos de 150 bases a mas de 50.000 bases o 50 Kilobases (Kb.), dependiendo de la concentracin de la agarosa y de la naturaleza precisa del campo elctrico aplicado (constante o por pulso) . Los geles de poliacrilamida por el contrario, son usados rutinariamente para separar cidos nucleicos de tamaos tan pequeos como 5-10 bases hasta 500 a 600 bases. Dependiendo de la concentracin de la poliacrilamida, estos geles pueden usarse para resolver molculas de cidos nucleicos que difieren de tamaos tan pequeos como una base! .Los geles de poliacrilamida pueden ser gelificados de diferentes maneras (horizontales y verticales), los geles de agarosa, son tradicionalmente preparados y gelificados de manera horizontal. Una ventaja clave de trabajar con agarosa es la facilidad con la cual el gel es preparado y manipulado: La acrilamida en la forma no polimerizada es una potente neurotoxina!

Rangos tiles de Geles de Agarosa y Poliacrilamida en la Electroforsis de los cidos Nucleicos

Tipo de Matriz

Porcentaje (w/v) 0.6 % 0.8 % 1.0 % 1.2 % 1.5 % 3.0 % 3.5 % 5.0 % 8.0% 12.0 % 15.0 % 20.0 %

Rango de Utilizacin (bases) 1.000 20.000 600 - 8000 400 - 7000 300 6000 200 -3000 100 400 Pb. 100 1500 80 500 60 400 40 200 25 150 6 100

Agarosa

Acrilamida*

* = Composicin del gel: Acrilamida: N,N-methilene-bis-acrilamida, 19:1

Procedimiento:

El estudiante realizar algunas observaciones en sta gua y en la prctica de electroforsis para fragmentos de DNA amplificados y para este propsito, despus de la prctica responder a las siguientes preguntas: 1. De acuerdo a lo aprendido en la prctica, en referencia a los electrodos, el DNA migra de donde a donde en la matriz de agarosa? 2. Qu implica la aparicin de burbujas en el buffer de corrido? Explique 3. Desde el punto de vista qumico, por que el Buffer TBE (Tris-cido BricoEDTA) es un buen medio para que se produzca una reaccin de electroforsis? 4. En el gel, con referencia a los pozos de siembra, donde estn las molculas ms grandes y las ms pequeas de cidos nucleicos? 5. Si tuviramos que separar fragmentos de DNA de alto peso molecular (10.000 Pb.) cul de las matrices utilizara Usted para separarlos? Por que? 6. Con lo aprendido, si tuviramos que caracterizar un fragmento de 227 Pb., cul de las matrices utilizara Usted? Por qu? 7. De acuerdo a los catlogos de reactivos, con cul peso molecular identificara Usted su fragmento? Escriba marca, cdigo, tamao de los fragmentos que resuelve y cantidad que Usted solicitara a la casa comercial. 8. Describa completamente la electroforsis de los fragmentos amplificados. Realice diagrama de flujo. Dibuje la cmara con el gel y las muestras. Siga las siguientes RECOMENDACIONES PARA LA ELECTROFORESIS

Coloracin del gel: Cuando se desee colorear el gel de, es posible hacerlo, con la misma eficiencia, coloreando directamente una pequena cantidad del buffer de corrida con el cual se hizo la electroforesis. Para llevar a cabo esta, se utiliza un volumen suficiente de manera que el gel quede completamente inmerso en el. Se debe hacer preferiblemente en una cubeta plana, y teniendo en cuenta adicionar la cantidad del bromuro de etidio (10 mgr/ml) en mls proporcional al volumen del buffer usado, y proporcional a la cantidad que hubiera sido usada para colorear directamente el gel. El gel se coloreara despus de 12 minutos de exposicin.

Ventajas: - El buffer podr ser recuperado y envasado en un frasco oscuro debidamente rotulado, para ser posteriormente utilizado en nuevas coloraciones de geles. La recuperacin del buffer, se recomienda hacer utilizando un embudo de vidrio que debera siempre ser utilizado (preferencialmente) para el mismo proposito. -Se pueden colorear hasta dos o tres geles, dependiendo de la amplitud de la cubeta plana usada y del volumen del buffer de corrida usado (TAE o TBE). - Se evitara la evaporacin del bromuro de etidio, que se produce cuando se adiciona al gel directamente, ya que debe hacerse cuando este tiene una temperatura de 70 a 80 C, lo cual evita la exposicin por inhalacin de vapores a dicho agente mutagnico. La solucin de bromuro de etidio recuperada podr ser reutilizada para colorear hasta 15 geles.

PRACTICA DE ENFASIS EN GENETICA MOLECULAR No. 7 Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca AMPLIFICACIN POR PCR Elaborada por: Patricia E. Vlez Pedro A. Moreno

INTRODUCCION Durante los ultimos 15 aos, despues de que Cary Mullis, Premio Nobel de Quimica, enunciara los principio quimicos de su magnifico invento para la Amplificacion de Genes, llamada en ingles PCR (Polimerase Chain Reaction), muchos investigadores han podido abrir la gran compuerta de la in

94 oC 10

94 oC 30 65 oC 30

72 oC 30

70 oC 10 4 oC

ApoE-A TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA ApoE-B ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC

Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin Universidad del Cauca
POLIMORFISMOS GENETICOS: ELECTROFORESIS DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

Elaborada por : Patricia E. Vlez V. Pedro A. Moreno

INTRODUCCION La Genetica es una especialidad de la Biologa que pretende conocer las diferencias y semejanzas entre los seres vivientes. Durante el anlisis de la molecula de ADN, existe una interesante estrategia de anlisis que nos permite distinguir las diferencias intrinsecas existentes entre los seres vivientes (humanos, animales y plantas, por ejemplo). Dicha estrategia,

comprende el uso de Enzimas de Restriccion, que permiten visualizar los polimorfismos de ADN, o llamados Fragmentos de Restriccion de Longitud Polimrfica (RFLPs, por sus siglas en ingles). Estas enzimas, que reconocen cortes especificos, dependiendo de su afinidad de corte en el ADN, producen fragmentos diferenciales, permitiendo observar con ellas las diferencias y semejanzas entre dos seres vivientes. En el presente Laboratorio, se pretende que el estudiante aborde el tema de los polimorfismos, siguiendo los parametros teoricos aprendidos en clase, y con la cual se pretende profundizar y acercar al estudiante a esta indiscutiblemente til herramienta de anlisis. OBJETIVOS 1. Adiestrar al estudiante en la manipulacin y utilidad de las enzimas de restriccion. 2. Entrenar al estudiante en el reconocimiento de los polimorfismos de las enzimas de restriccion. MATERIALES Enzima de Restriccion Hha I (10U/ul) Marcador de Peso Molecular -X174 Buffer de enzima de Restriccion para reaccion Agua Deionizada Agarosa al 3% Camara de Electroforesis Fuente de poder Buffer TAE Bromuro de Etidio (10 mgr/ml) Camara de Fotografia Transiluminador Papel vinilo Micropipetas (1000 ul, 200 ul, 50 ul) Puntas (1000 ul, 200 ul, 50 ul) Fragmento de ADN amplificado del Gen Apoe METODOLOGIA

1-Adicione en un tubo eppendorff, nuevo y estril: *25 ul de producto de PCR *0.5 ul de Hha I (10 U/ul) Gibco *3.0 ul de Buffer de Reaccin * 1.5 ul de Agua deionizad estri

* Incube a 37 oC por 3 horas. 2-Visualice en un gel al 3% de agarosa y utilice el marcador de peso -X174 Hinf I. (6 ul + 4 ul de Buffer de carga + 1 ul de H2O) 3-A cada muestra que va a ser depositada en los pozos, adicione, Buffer de carga se adiciona 8 ul por cada 30 ul de volumen de muestra 4-Electroforsis del Fragmento de ADN Amplificado 12 ul del amplificado + 3 ul de buffer de carga 60-80 volts 2h 30 min
PREGUNTAS uuuu) De lo anterior, defina que es para Usted, con sus propias palabras, qu es un polimorfismo gentico? vvvv) Analice la grafica (fotografa), y explique los polimorfismos observados en esta. wwww) Por qu considera Usted que la reaccin enzimatica debio hacerse a 37 oC? xxxx) Por qu usamos marcadores de peso molecular para visualizar los polimorfismos?

PRACTICA DE GENETICA MOLECULAR No. Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educacin. Universidad del Cauca FOTODOCUMENTACION

Introduccin Desde los primeros albores de la Biologa y la Genetica Molecular, ha sido de primordial y gran importancia, el registrar de manera fidedigna y clara todos los resultados, no solamente de los avances en la tecnicas de investigacin, sino tambin de los resultados obtenidos con el uso de tales desarrollos tecnologicos. Por lo anterior, y en vista del inters que se tiene hoy por hoy en el anlisis de los fragmentos de secuencias de DNA y de RNA, se precisa del conocimiento de tales estrategias de registro de datos, que incluyen la fotodocumentacion. La presente practica, pretende proveer al estudiante de unas importantes consideraciones que seran de gran utilidad para el registro de los resultados de sus practicas de genetica molecular, en especial para el registro de muestras de acidos nucleicos y de proteinas. Objetivos 1- Impartir al estudiante los conocimientos esenciales acerca de la fotodocumentacion de resultados obtenidos en las practicas de Genetica Molecular. 2. Adiestrar al estudiante al manejo de los equipos de fotodocumemtacion. 3. Proporcionar al estudiante las normas de seguridad que debe tomar en cuenta para el registro de sus resultados o la documentacion de los mismos.

Materiales Guia de Laboratorio Camara de Fotografia Polaroid Type 667 Peliculas o cartuchos de fotografia Polaroid Type 667 Filtros color anaranjado oscuro No. 22 o amarillo oscuro No. 15 Papel vinilo Procedimiento. Primera parte Se tomaran en cuenta las siguientes consideraciones: La electroforesis de geles contiene informacion critica para una interpretacion correcta de datos derivada de los componentes de un diseno experimental. La informacion arrojada por la elecroforesis de los acidos nucleicos puede ser invaluable. Debido a que los geles se deterioran rapidamente, sin mencionar el hecho de que los colorantes utilizados se deteriorar aun mas rapidamente que los geles, un registro fotografico (un electroforetograma) es la nica opcion real que povee un registro a largo plazo de los resultados para futuros anlisis, presentaciones y publicaciones escritas. Existe una variedad de sistemas fotograficos para la documentacion de muestras de acidos nucleicos en un gel. Estos sistemas comparten algunas caracteristicas: Un gel coloreado con bromuro de etidio (u otro colorante) es irradiado con luz ultravioleta desde abajo y el contenido del acido nucleico y la distribucion del mismo en el gel es registrado por una imagen instantanea (ver la figura N. 1) Tipicamente, las fotografias que se toman de manera instantanea son registradas por peliculas a blanco y negro o en color. La camara mas ampliamente usada es la camara polaroid, la cual ofrece ventajas portatiles y versatiles para la toma de los registros en cuanto a la adaptacion a numerosos filtros estandar y a la disponibilidad de diferentes tipos de peliculas de amplio espectro de sensibilidad y de color. Con todo esto, el DNA o el RNA contenido en el gel es irradiado desde abajo en un transiluminador ultravioleta (UV) standard de laboratorio que tenga hasta un rango de 300 a 320 longitudes de onda UV. Una camara (estatica o portatil) se coloca por encima del gel y el electroforetograma se hace de acuerdo a los parametros detallados (Ver segunda parte del procedimiento) Para estos propositos, es preciso utilizar camaras instantaneas de fotodocumentacion que acepten varios formatos de de peliculas instantaneas y producen claros y brillantes electroforetogramas usando los hoods (o embudos)

que se acomodan a los geles de diferentes dimensiones y manetiene la correcta distancia entre la camara y el gel. Existe una camara para estos propositos que es la Polaroid DS-34 que ha sido mejorada y es ampliamente versatil, y es comparativamente un instrumento de bajo costo.

Uso de los Filtros: Para fotografiar muestras de ADN se debe utilizar un filtro de color amarillo, y para fotografiar proteinas, un filtro de color verde. PREGUNTAS: 1. Analice las siguientes fotografias y haga comentarios sobre las diferentes exposiciones a las cuales fueron tomadas. 2. Determine, con argumentos, cual de las fotografias considera Usted es la que mejor permite hacer los analisis de los fragmentos de ADN. 3. De lo aprendido en clase, diga, por que el ADN, teido con bromuro de etidio fluoresce cuando se expone al transiluminador.

GENETICA EN CIFRAS

Sintesis o Replicacin del ADN: 1)Se sintetizan 50 nucleotidos / seg en Eucariotas Se sintetizan 500 nucleotidos/ seg en Procariotas 2)El cuerpo humano tiene aproximadamente 100.000.000.000 de clulas en total aproximadamente 3) 1 gr.de DNA equivale a 109 celulas

BIBLIOGRAFA SMITH y WOOD Biologa Molecular y Biotecnologa. Editorial Addison-Wesley Iberoamericana. 1998. STRYER L.ubert Bioqumica. Editorial Revert. 1995 SMITH y WOOD Biologa Celular. Editorial Addison-Wesley Iberoamericana. 1997 HORTON et al. - Bioqumica. Editorial Prentice Hall. 1993 MADIGAN, MARTINKO, PARKER Biologa Microorganismos. BROCK. Editorial Prentice Hall. 1997 de los