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3.

1 Lugar y poca del experimento

El experimento se realiz en el laboratorio

de fitopatologa del departamento de

Proteccin Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias (FCA) de la Universidad Nacional de Asuncin (UNA), ubicado en el campus de dicha institucin en la ciudad de San Lorenzo, Paraguay en el mayo de 2012.

3.2 Materiales

Se utilizaron diez

cepas de hongo Trichoderma spp y

tres

cepas de hongos

fitopatgenos de suelo Fusarium, Macrophomina y Sclerotium rolsfii, aislados de cultivos de ka'a he' Trichoderma spp Cepas Cepa 1 (C1) Cepa 2 (C2) Cepa 3 (C3) Cepa 4 (C4) Cepa 5 (C5) Origen Parcela en Caacup Parcela en Caacup Parcela en Caacup Parcela en Caacup Parcela de empresa Kemagro Mariano Roque Alonso Cepa 6 (C6) Parcela de empresa Kemagro Mariano Roque Alonso Cepa 7 (C7) Cepa 8 (C8) Cepa 9 (C9) Cepa 10 (C10) Parcela en Chore Parcela en Capiat Parcela en Capiat Obtenida de la coleccin de hongos del Centro de Investigacin Hernn Bertoni

3.2.1 Multiplicacin de cepas

Para obtener una cantidad adecuada de cultivos, para los experimentos, se proceder a realizar un repique de las distintas cepas de hongos que se utilizo, incluyendo a las cepas de Trichoderma

De los cultivos ya aislados y puros se procedio a extraer una pequea porcin y transferirlas a placas de Petri estos repiques a su vez fueron de nuevo utilizados hasta obtener la cantidad de hongos requerida para el experimento. (Loredo y Mena 2009)

3.3 Tratamientos

Se realizaron tres experimentos, de antagonismo de compatibilidad, el cual conto con once tratamientos con cinco repeticiones de cada uno a excepcin del testigo que consto con tres repeticiones, cada cepa de trichoderma spp se uso con cada uno de los hongos fitopatogenos Tratamientos Repeticiones T1; uso de la cepa de Trichoderma spp C1 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatgenos de hongos T2; uso de la cepa de Trichoderma spp C2 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatgenos de hongos T3; uso de la cepa de Trichoderma spp C3 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatgenos de hongos T4; uso de la cepa de Trichoderma spp C4 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T5; uso de la cepa de Trichoderma spp C5 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T6; uso de la cepa de Trichoderma spp C6 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T7; uso de la cepa de Trichoderma spp C7 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T8; uso de la cepa de Trichoderma spp C8 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T9; uso de la cepa de Trichoderma spp C9 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T10; uso de la cepa de Trichoderma spp C10 Cinco repeticiones para cada cepa con los tres hongos fitopatogenos de hongos T11; uso de las diez cepas de trichoderma Tres repeticiones para cada cepa de como testigo Trichoderma spp Para el ensayo de compatibilidad las tres cepas que resulten ms eficientes en las pruebas de antagonismo se utilizo para este ensayo, en el cual los tratamientos consto de la cepa

de trichoderma spp x 5 productos x 2 dosis x 5 repeticiones ms las 3 cepas como testigo cada una con tres repeticiones.

En el experimento in vivo se utilizo las tres cepas de trichodermamas eficientes cada una inoculada en un tabln de suelo de un metro cuadrado con los tres patgenos ms un tabln sin antagonista inoculado solo con fitopatogenos como testigo, se realizo cinco repeticiones.

3.4 Diseo experimental

En el primer experimento la unidad experimental que se utilizo fueron las placas de Petri se utilizo diseo completamente al azar con once tratamientos de cinco repeticiones a excepcin del testigo que tuvo tres repeticiones.

En la prueba de compatibilidad la unidad experimental fueron las placas de Petri se utilizo diseo completamente al azar con cuatro tratamientos y cinco repeticiones con excepcin del testigo que tuvo tres repeticiones.

Para el experimento a campo se utilizo un diseo de bloques al azar.

3.5 Aislamiento de hongos a partir de las muestras de plantas enfermas

Este procedimiento consisti en aislar cepas de hongos fitopatgenas presentes en las plantas para hacerlas crecer en un medio de cultivo

Primeramente se desinfecto mediante una solucin de hipoclorito de sodio al 2%, diluida con 5 partes de agua destilada, se lavo el material con agua corriente y posteriormente se seco el tejido vegetal fue cortado en trozos de 0.3 a 0.5mm estos fueron desinfectados y transferidos a palcas de Petri con PDA en Incubadoras (Puo et al 2011). Luego se procedi a separar las cepas de los patgenos para producir cultivos puros, mediante cortes en las puntas de los micelios en los bordes de las colonias en crecimiento mediante agujas de diseccin, la identificacin se realiz mediante manuales especializados.

3.6 Prueba de Antagonismo de Trichoderma y hongos fitopatgenas

Para evaluar la actividad antagnica de las cepas de trichoderma se utilizo la tcnica de Cherif y Benhamaou segn es mencionada por Michels, et al (2009), en el extremo de cada placa de Petri se coloco un disco con micelio de hongo fitopatogeno y en el otro extremo un disco de cepa de trichoderma, se puso a incubar luego se tomaron lecturas cada 24 hs para determinar el nmero de das al primer contacto entre las hifas de los dos hongos.

Posteriormente se utilizo la clasificacin propuesta por Bell et al. (1982), donde 1 = Trichoderma sobrecrece completamente al patgeno y cubre totalmente lasuperficie del medio, 2 = Trichoderma sobrecrece las dosterceras partes de la superficie del medio, 3 = Trichoderma yel patgeno colonizan cada uno aproximadamente la mitad de la superficie y ningn organismo parece dominar al otro, 4 =el patgeno coloniza las dos terceras partes de la superficiedel medio y parece resistir a la invasin por Trichoderma y 5= el patgeno sobrecrece completamente a Trichoderma yocupa la superficie total del medio.

De las cepas de Trichoderma se seleccion, tres que presentaron mejor capacidad antagnica, con estas se utilizo el mtodo de papel celofn, para determinar la presencia de metabolitos antifngicos no voltiles.

Este mtodo consiste en cortar el papel celofn en crculos del dimetro de las palcas de Petri, el papel fue esterilizado previamente, cada recorte fue colocado en las placas con medio de cultivo PDA, sobre este luego se inoculo colocando sobre el papel un fragmento de la cepa de trichoderma seleccionada, que se puso luego en la incubadora.

3.7 Anlisis estadsticos

Los datos obtenidos fueron sometidos al anlisis de Varianza (ANAVA) se aplico el test de Tukey al 5% de probabilidad.

Variable a evaluar en el primer experimento fue el grado de colonizacin de la placa de Petri por parte del antagonista as como del fitopatgeno.