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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Facultad de Química Departamento de Bioquímica Manual de prácticas de Bioquímica

Facultad de Química

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Facultad de Química Departamento de Bioquímica Manual de prácticas de Bioquímica

Departamento de Bioquímica

Manual de prácticas de Bioquímica experimental (0141)

Semestre 2011-1

Elaborado por: Dra. Sobeida Sánchez Nieto

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

CONTENIDO

Sección 1

Introducción al laboratorio de Bioquímica Reporte científico

Sección 2

Estructura y propiedades de proteínas: Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino Parte I. Extracción y precipitación por salado. Parte II. Purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de concentración de proteínas. Monitoreo del proceso de purificación. B. Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS

Sección 3

Actividad enzimática Parte I. Curvas temporales de actividad enzimática de la lactado deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la concentración de sustrato y de un inhibidor.

Sección 4

Genética

Sección 5

Determinación del tipo de herencia en base a frecuencias fenotípicas y genotípicas Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos Transferencia de material genético I. Conjugación Transferencia de material genético II: Transformación Aislamiento de plásmidos Ensayos de restricción de plásmido Inducción de proteína recombinante

Sección 6

Regulación del metabolismo Parte I: Regulación genética en el operón lac Parte II. Regulación hormonal del metabolismo de la glucosa

Apéndice

Preparación de soluciones

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1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO

Objetivos

Conocer la importancia de realizar un reporte científico.

Conocer las características o partes de un reporte científico: Introducción, hipótesis, objetivo, métodos, resultados, discusión y conclusiones, y referencias.

Conocer cómo se formulan las hipótesis.

Plantear hipótesis.

Aprender a realizar un reporte científico.

Introducción Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son expresados de manera clara y fácil de seguir, difícilmente serán tomados en cuenta. Es de gran valor, tanto para empresas como pare instituciones educativas y de investigación, contar con personal que pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral.

En el desarrollo de las ciencias, la comunicación de las observaciones, resultados y propuestas, es fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte científico. En el reporte científico, no sólo se informa sobre los resultados de una investigación, sino también recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnológicos que pueden ayudar a replantear la dirección de una investigación o llevar a la resolución de un problema en particular.

De hecho, uno de los pasos comunes dentro del llamado método científico es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observación, a través de primero investigar la literatura cercana al tema de estudio (Figura 1.1.). Así como en el reporte, en todos los pasos que conforman al método científico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lógica. Por ejemplo, en el planteamiento de la hipótesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto, estableciendo en una frase corta las variables que se están manipulando o las mediciones que se harán, siempre en términos mensurables. Adicionalmente, la hipótesis incluye aquella información que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigación. Para ayudarnos a construir la hipótesis generalmente se utilizan las preposiciones “si” y “entonces”. Examinemos el siguiente ejemplo:

Si observamos que nuestra garganta nos duele, nos planteamos:

Si tengo dolor de garganta entonces podría deberse a que tengo una infección en la garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el día anterior”.

Sin embargo, la anterior hipótesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir:

Si sé que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera contagiado, y además fui a un juego de fútbol en donde grite mucho, entonces es probable que esto último me causará el dolor de garganta”.

A pesar de que mejoró, la hipótesis no establece como se validará o no la predicción. Se podría

plantear otra diciendo:

Si no tengo fiebre o síntomas de una infección en la garganta, pero sí una inflamación en la garganta, entonces el cultivo de exudado faríngeo y otros estudios clínicos darán negativo para una infección bacteriana o viral, por lo que la

inflamación se deberá a un uso excesivo de las cuerdas vocales.

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La hipótesis es una parte importante en una investigación y como se mostró, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se está investigando, el conocimiento previo y el diseño del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hipótesis con los resultados sé llegan a conclusiones válidas, que permiten replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado.

replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado. Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método

Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método científico. Se observa que las flechas van hacia delante pero también pueden en cualquiera de los puntos regresar. El método científico es un proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron analizados.

Reporte científico Como se comentó con anterioridad, el principal propósito de escribir un reporte científico es el de comunicar la información que ha sido compilada como resultado de la investigación o experimentación y el análisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tópicos pero usualmente se enfocan en transmitir la información con un propósito claro y para una audiencia específica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe también estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector mantenga la atención en él. Generalmente, el valor de una investigación se evalúa a través del reporte, es decir el reporte escrito es el único producto tangible de cientos de horas de trabajo. Debido a que se juzga el trabajo a través de un reporte escrito, éste debe ser de gran calidad.

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Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusión de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuación se da una breve descripción de cada una de las secciones que conforman un reporte científico.

Resumen. Su función es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes más relevantes, una frase sobre el objetivo del experimento, una descripción corta del método que se usó, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo párrafo de 100 a 200 palabras.

Introducción. Contiene la información necesaria para que el lector conozca por qué es importante el reporte, así como de que trata. La información que se utiliza en la introducción va de lo general a lo específico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tópico de la investigación en un área particular de estudio. Después, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura específica) para ayudar a justificar la presente investigación. La introducción finaliza con un párrafo en el que se plantea la hipótesis. En algunos casos se requiere que la parte final de la introducción contenga los objetivos del estudio.

Métodos. El propósito de está sección es describir precisamente los materiales y métodos usados para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda repetir el mismo procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qué se usó un método en particular. La sección de métodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo.

Resultados. En esta sección se describe pero no se explican los resultados; solo presenta los hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algún resultado que es particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La sección de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas puede ser muy útil para mostrar o enfatizar la información en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta útil para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Es esencial que las figuras estén integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que sean referidas inmediatamente después de mencionarlas y deben explicarse. Un error común es mencionar la figura, colocarla y sólo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es decirle al lector en qué dato debe poner atención en la figura, aquello que es significativo y que podría utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del siguiente experimento.

Discusión. La sección de discusión tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o causal. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hipótesis han sido contestadas; c) mostrar cómo los resultados de la investigación se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadísticamente significativos, o si existió algún defecto en el diseño o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas áreas de interés.

Conclusiones. Está sección puede ser incluida como parte de la discusión o bien como una sección aparte. Establece de manera clara y concisa cuál es la relevancia del trabajo y sus implicaciones.

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Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabético, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la información bibliográfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros los formatos que se utilizan.

Actividades sugeridas

1. El profesor proporcionará al menos un artículo de investigación, para que identifiquen en éste las partes de un reporte. Después cada equipo expondrá sus resultados.

2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hipótesis y diseñen un experimento. Se podrán realizar al menos dos formas diferentes de reporte: La primera podría ser un reporte oral al final de esta sesión y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesión.

Cuestionario

1. ¿Qué finalidad persigue el científico al escribir y publicar un artículo científico?

2. Investiga como se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye ¿cuáles son las variables independientes, las dependientes y las control?

3. ¿Qué estructura debe tener una hipótesis?

4. ¿Cuáles son las secciones de un reporte científico?

5. ¿Qué diferencia (s) hay entre la sección de resultados y la discusión?

6. ¿Qué información bibliográfica deben de contener las referencias, si son libros, artículos o catálogos o páginas de internet?

Referencias

Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ:

Oryx Press, 1994.

Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York:

Longman,2000.

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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.

Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.

PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

Objetivos

- Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad.

- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes celulares.

- Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

- Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de purificación de una proteína.

Introducción Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un método para purificar una proteína, como por ejemplo, para que se usara la proteína, cuales son las características propias de la proteína (tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas, no obstante, si hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una proteína toma en consideración lo siguiente:

A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos.

B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.

C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis.

D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento.

E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas.

F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario.

G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos.

H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica.

Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de

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diferente peso molecular. Una purificación posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por

la adición de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán

los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína.

A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar

una proteína.

SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína, microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas 1 , entre otras. La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida.

PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesta la proteína y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solución, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína.

Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugación. La centrifugación aprovecha las propiedades de tamaño, forma y densidad de las

proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado,

el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos

de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación:

relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación: Donde RPM son las revoluciones por minuto de

Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo.

La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en solución y las moléculas ligeras sedimentan.

SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para

1 Células que fueron obtenidas a través de la introducción de un gene que codifica para una proteína distinta a la suya, a través del uso de técnicas de biología molecular. Ver sección 5 del manual.

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eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína pueden interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas tales como cambio de pH, incremento en la temperatura, adición de solventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH 4 ) 2 SO 4 .

Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de iones, fenómeno denominado de “salting in”. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan (“salting out”). El mecanismo de salting-out se basa en la exclusión del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentración de los iones, la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de la proteína y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas, produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy económico, se han diseñado tablas y fórmulas en las que se pueden determinar las cantidades a añadir de (NH 4 ) 2 SO 4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración dada.

Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular.

La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirá reducir la concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis: el costo de la membrana de diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h.

Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25 ® puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elución, las proteínas de alto peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero, después eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde proteínas o moléculas contaminantes.

TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio.

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pI. La carga neta de una proteína es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aniónico que

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contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación de las proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración.

de sales en orden creciente de concentración. Figura 2.1. Separación por cromatografía de intercambio

Figura 2.1. Separación por cromatografía de intercambio iónico. Dependiendo de la carga iónica de los soportes o resinas de cromatografía entonces ocurrirá la interacción con moléculas cargadas positiva o negativamente.

Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD + o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.2). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina a muchos contaminantes.

A
A
B
B

Figura 2.2. Comparación entre las moléculas de Cibacrón blue 3GA y el NAD + . A) Los colorantes de triazina como el Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD + .

En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación con (NH 4 ) 2 SO 4 . En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra mediante filtración en gel, para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad. Posteriormente, en la tercera parte del protocolo se evaluará el rendimiento, al determinar la cantidad total de proteína y por último en la cuarta parte del protocolo se determinará su pureza al realizar la separación de las muestras proteicas y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS.

Material biológico 100 g de carne de res preferentemente filete de ternera

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Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo)

1 Tijeras

1 Espátula

1 Recipiente para hielo

1 Par de guantes de látex

Gasa

1 Vasos de precipitados de 1L

1 Probeta de 250 mL

1 Probeta de 100 mL

4 Botellas de centrífuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos

Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio

2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 mL

1 Recipiente para hielo

2 Vasos de precipitados de 100 mL

1 Espátula

Tubos para microfuga de 1.5 mL Gradilla para tubos de microfuga

1 Caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.

1 Caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.

1 Micropipeta 20-200 L

1 Micropipeta 200-1000 L

1 Bandeja pequeña

1 Barra magnética

1 Agitador magnético

Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo)

Reactivos

Tris 50 mM pH 7.0

(NH 4 ) 2 SO 4 sólido.

Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4C). Mantener las soluciones y suspensión proteica en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el volumen de la solución de homogeneización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los pasos de purificación (Figura 2.3). Ya que estos valores son necesarios para calcular el rendimiento, contenido de proteína y actividad enzimática.

A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos.

1. Cortar en trozos pequeños 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso que acompaña a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto frío hasta su uso).

2. Agregar 3 volúmenes de 50 mM Tris/HCl pH 7.0 frío por cada g de tejido (240 mL) y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente.

3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso

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de precipitados de 1L. NOTA. Puede tomarse una alícuota de está fracción y denominarla Fracción 0.

4. Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fracción 1). Apartar 1 mL de la fracción 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso.

Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.

B. Precipitación con sulfato de amonio ((NH 4 ) 2 SO 4 ) por equipo.

5. Tomar 25 mL de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados.

6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magnético, mientras se añade lentamente sulfato de amonio sólido (8.15g de (NH 4 ) 2 SO 4 por 25 mL del sobrenadante). La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la solución se caliente.

7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 55% con sulfato de amonio.

8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 mL y se centrífuga a 10,000 rpm 4C por 10 minutos.

9. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 mL de la fracción 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a –20C para su posterior uso.

10. Calcular el peso de (NH 4 ) 2 SO 4 para obtener una solución al 75% de saturación, (0.125 g de (NH 4 ) 2 SO 4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente.

11. Una vez disuelto el (NH 4 ) 2 SO 4 , colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 10 min y descartar el sobrenadante.

12. Resuspender el botón en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL.

13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe contener 1000 L, ese volumen se usará en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a

–20C.

SUGERENCIAS:

1. Para evitar la congelación y descongelación innecesaria de las muestras es conveniente que

al final de está sesión se almacenen las muestras en alícuotas y que se etiqueten apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra.

2. Se recomienda sólo descongelar la alícuota una sola vez y después desecharla.

Número

Alícuota almacenada para:

Volumen

12

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de

Determinación

PAGE-SDS

Curva

Obtención de

Desalado

total

Fracción

de proteínas.

temporal de

parámetros

almacenado

actividad

cinéticos.

enzimática.

I

II

III

IV

0

     

 

1

     

 

2

     

 

3

           

4*

     

 

FPA*

     

 

FPB*

     

 

* Fracciones que se obtendrán en la siguiente sesión

Notas y cálculos:

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g Tejido

Moler0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL g Tejido Homogeneizado mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0 Filtrar con gasa Homogeneizado

Homogeneizado

mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0

Filtrar con gasag Tejido Moler Homogeneizado mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0 Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga

Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4C

de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4  C Botón Sobrenadante (SN) mL VOLUMEN TOTAL
de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4  C Botón Sobrenadante (SN) mL VOLUMEN TOTAL
de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4  C Botón Sobrenadante (SN) mL VOLUMEN TOTAL
de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4  C Botón Sobrenadante (SN) mL VOLUMEN TOTAL

Botón

Sobrenadante (SN)

mL

VOLUMEN TOTAL

(FRACCIÓN 1;

mL)

A

mL

SN añadir

g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación)

Agitar

g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar
g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar
g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar
g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar
g (NH 4 ) 2 SO 4 (55% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar

Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4C

Botón

Sobrenadante

(FRACCIÓN 2; mL) Añadir g (NH 4 ) 2 SO 4 (75% saturación) Agitar Recuerda
(FRACCIÓN 2;
mL)
Añadir
g
(NH 4 ) 2 SO 4 (75% saturación)
Agitar
Recuerda que ya está al
55% de la sal
Distribuir en tubos de centrífuga
Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4C

Botón (FRACCIÓN 3) Añadir 1 mL de H 2 0; Volumen total obtenido

Sobrenadante

mL

Figura 2.3 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas.

14

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Cuestionario

1. ¿Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas?

2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué.

3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso, solubilidad y unión a ligandos.

4. ¿Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4C?

5. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como localización subcelular, secuencia primaria de aminoácidos, pI (punto isoeléctrico), actividad enzimática que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria.

6. De acuerdo al pI de la lactato deshidrogenasa que encontraste predice cual será su carga eléctrica cuando la proteína se encuentre en un amortiguador de fosfatos pH 7.0. ¿Qué tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificación y porqué?

7. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína?

8. ¿Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico? Menciona al menos 2 y para que se usan

Referencias

Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.

Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1- 4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.

Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4

Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94.

Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net

Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net

Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

Sitios recomendados para

1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas

http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html página desarrollada por el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres.

2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra.

http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm

http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl

3. calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa.

http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm

15

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD

Objetivos

- Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado y cambio de

la solución amortiguadora de extractos proteicos.

- Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad para purificar una proteína

Material biológico Fracción 3 obtenida en la sección anterior

Material y equipo

1 Columna de cromatografía vacía

1 Columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina

1 Probeta de 50 mL

Tubos para microfuga de 1.5 mL

1 Recipiente para hielo

1 Soporte universal

1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez

Micropipeta de 1000 μL Micropipeta de 200 μL

1 caja de puntas de 1000 μL para micropipeta

1 caja de puntas de 200 μL para micropipeta

Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo)

Reactivos Desalado 2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama de Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega empacada para su uso inmediato.

Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM β- Mercaptoetanol. (Ver preparación en el apéndice)

400 mM PMSF

Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF (1 mM). Se prepara poco antes de su uso. (Se entrega por grupo: Un frasco ámbar con 26 mL del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol, añadir 65 μL de 400 mM PMSF para obtener una concentración final de 1 mM (agitar vigorosamente para disolver el PMSF añadido)

Agua destilada estéril para el lavado de las columnas.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico

Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (ver Apéndice).

Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0.

Amortiguador de elución I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl.

Amortiguador de elución II. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 3.0.

Purificación por cromatografía de afinidad

Matriz para purificación por afinidad. DEAE affi-gel blue gel (ver Apéndice).

Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF El mismo que se uso para el desalado

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Amortiguador de elución A. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF-NAD + , preparado al momento según se indica a continuación: adicionar la solución de Tris-β-Mercaptoetanol- PMSF al frasco que contiene NAD + en polvo, para una concentración final 5 mM (ver apéndice).

Desarrollo experimental

Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular

1.- Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex, como se muestra en la Figura 2.3. 2.- Tomar 1 mL de la fracción 3 y añadirlo a la columna. 3.- Adicionar a la columna poco a poco la mezcla de proteína y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente en 1 minuto o menos). 4.- Desechar el primer mL que eluye de la columna (correspondiente al volumen vacío), agregar a la columna 1 mL de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF y colectar en un tubo de microfuga frío el segundo mL. Esta fracción contiene a la LDH (Fracción 4). Se guardan 100 μL para llevar a cabo la medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el siguiente paso. NOTAS. 1La columna se lava con 10 mL de agua destilada estéril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregarla al profesor. 2No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna para el uso posterior de otro grupo de estudiantes.

estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna para el uso posterior de otro

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Figura 2.3 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad.

La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de la fracción 4.

A. Empacado de la columna para la fase tres de la purificación. Adicionar 1 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar intercambio catiónico o de afinidad. (Dejar drenar hasta obtener 0.5 mL de volumen contenido inicialmente en la columna). Si es necesario colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4°C). Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante; eliminar el eluato.

B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico

1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico.

2. Equilibrar la columna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 1.0 mL de Amortiguador de equilibrio I. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C.

3. Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de la columna con parafilm y adicionar los 900 μL de la fracción 4. Posteriormente tapar la parte superior de la columna y agitar por inversión entre 5 a 10 veces. Destapar la salida y dejar que pase el líquido por la columna desechando éste volumen (Este es el volumen muerto y no contiene proteína). Nuevamente, se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C.

4. Realizar un lavado con 1 mL de Amortiguador de equilibrio I (para eliminar la unión no específica). Alternativamente se centrífuga como se mencionó en los pasos 2 y 3.

5. Solicitar a su profesor el amortiguador de Elución I o II considerando las características de pI de la LDH. Para la elución se adiciona poco a poco 1.0 mL de amortiguador de elución y se recolectan ± 900 μL en al menos 2 fracciones de 450 L cada una (Figura 2.3), las que denominamos, Fracción purificada FPIa y FPIb. Alternativamente se centrífuga como se mencionó anteriormente.

6. Estas fracciones se usaran posteriormente para determinarles proteína, actividad y realizar el corrimiento electroforético.

NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 mL de agua estéril y se guarda la columna lavada para ser reutilizada por otro grupo de estudiantes. Entregar al profesor.

C. Purificación por cromatografía de afinidad.

1. Se utiliza una columna que se empaca con DEAE Affi-gel Blue (ver apéndice)

2. Se equilibra la columna al adicionar poco a poco 1 mL de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-

PMSF (preparado al momento, como se indica en Reactivos o Apéndice I). El volumen que drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4°C. 3. Enseguida se adiciona poco a poco 900 μL de la Fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min

a 4°C o se deja drenar y se elimina la fracción no adsorbida (aproximadamente 900 L, este es el volumen muerto, y no contiene proteína.

4. Añadir 1 mL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la columna.

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 μL de Amortiguador de elución A

(amortiguador adicionado con NAD + ) y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga frío (Fracción purificada A o FPA).

6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de proteína que haya quedado aún unida a la columna (Fracción purificada B o FPB).

NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 10 mL del agua estéril, y entregar la columna lavada al profesor para ser utilizada nuevamente por otro grupo

Cuestionario

1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fracción 3 del protocolo experimental?

2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas?

3. ¿Qué intervalo de fraccionamiento de moléculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones tiene?

4. ¿Qué es el volumen vacío en una columna de filtración en gel?

5. ¿A que se refiere el término volumen muerto en una columna cromatográfica?

6. Investiga la composición de la matriz de intercambio iónico que se uso para purificar a la LDH?.

7. De acuerdo al pI de la LDH y conociendo el tipo de columna de intercambio iónico que estás utilizando, indica que amortiguador de los que están enlistados en los reactivos usarías para su purificación y fundamenta tú respuesta.

8. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de intercambio catiónico?

9. ¿Que debe contener el eluyente para la purificación de la LDH en la cromatografía de intercambio iónico que se propone en este protocolo y porqué?

10. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad y cuál es el componente clave para la purificación de la LDH en está columna?

Referencias

• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4

• Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catálogo 18-1132-29 Pp 94.

• Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net

• Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net

• Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104.

Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com

Sitios recomendados para

1. Aprender sobre cromatografía

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm

2. Realizar una autoevaluación sobre los fundamentos de la cromatografía

http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm

Revisado por los Profesores: Carmen Parra G., Elpidio García R y Diana Sánchez R.

19

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas

Objetivos

Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína.

Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína.

Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína.

Determinar la concentración mediante la detección de la absorbancia a 280nm.

Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico:

Determinación de proteínas por Bradford.

Analizar el progreso de la purificación de una proteína.

Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína:

rendimiento y pureza.

Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.

Introducción Para evaluar de manera cuantitativa el éxito de una purificación de proteínas es necesario conocer dos parámetros el rendimiento y el grado de pureza en cada paso del proceso de purificación.

El rendimiento es un parámetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad

biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación, el 100% corresponde a la actividad

del extracto inicial. Mientras que el grado de pureza se refiere al incremento en pureza, valor que se obtiene de dividir la actividad específica de cada paso entre la actividad específica del paso inicial

de purificación, este índice da el valor de 1 para el extracto inicial.

Para obtener el valor de la actividad específica que se encuentra generalmente expresado en Unidades/ mg proteína -1 es necesario contar con a) una técnica que determine la concentración de proteínas en la muestra, y b) una técnica que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco (Unidades de actividad). En casos raros, la proteína blanco es fácil de detectar, porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (proteína verde fluorescente). Cuando la proteína es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimático específico para determinar si estamos llevando a cabo la purificación de manera adecuada, actividad que se realizará y que se encuentra descrita en la sección 3 del manual. Para las proteínas que no son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biológica de la proteína.

En está sección se realizará la determinación de proteínas de cada una de las fracciones obtenidas durante el protocolo de purificación de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino, paso necesario para determinar la actividad específica de la proteína de interés. Además es necesario conocer la concentración de proteínas ya que llevaremos a cabo el corrimiento electroforético de las muestras.

A continuación se da una breve explicación de las leyes que rigen la espectrometría para

posteriormente describir el fundamento de la determinación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm y por un método colorimétrico como es el método de Bradford. Leyes que rigen la espectrofotometría Cuando un haz luminoso de intensidad P 0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P 0 . La relación entre ambos se denomina transmitancia, T:

T= P/P 0 .

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

20

.

.

.

.

.

.

.

.

(1)

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta.

Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación general:

donde:

-log P/ P 0 = abc

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

(2)

c

es la concentración

b

es la longitud de la celda o paso óptico

a

es la constante de proporcionalidad llamada absortividad

La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que la relación -log P / P 0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:

A = a bc .

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

(3)

Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superíndice así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción (). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de son cm -1 mol -1 L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice.

Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es b. Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción.

Cuantificación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm. El uso de la absorbancia en la región ultravioleta para medir la concentración de proteína es posiblemente el método más simple y rápido, aunque puede producir resultados poco exactos, sobre todo cuando se tiene una mezcla de proteínas y la presencia de los ácidos nucleicos. Sin embargo, las ventajas de emplearlo son que la muestra no se destruye durante la determinación, no es necesario producir una curva de calibración, ni tampoco utilizar más reactivos ni esperar tiempos de incubación. Se necesita contar con un espectrofotómetro que mida en el intervalo de longitud de onda del UV y que se dispongan de cuvetas de cuarzo o metacrilato grado UV o poliestireno grado óptico.

La cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm, depende de la presencia de aminoácidos aromáticos: tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). Un alto orden de estructuración puede modificar la contribución de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del péptido o proteína y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza iónica del medio. El uso más común del ensayo de absorbancia es para monitorear las fracciones provenientes de las cromatografías o cuando se requiere una estimación rápida de la concentración de proteínas aún cuando no sea exacta.

21

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Para calcular la concentración de proteínas de la muestra se usará la ecuación de Lambert y Beer y el coeficiente de extinción molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M -1 cm -1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solución de BSA al 1% (10 mg/mL) y usando la fórmula 4 para determinar la concentración de la muestra.

Concentración

(

 

g

/

L )

Abs

280

nm

(%)

*10

(4)

Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico. La determinación de proteínas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida, barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibración para determinar la concentración de las muestras. El método se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del Lowry (otra técnica colorimétrica para determinar proteínas) que es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el Bradford sólo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda usar vidrio o cuvetas depolipropileno. Al usar cuvetas de polipropileno se facilita su limpieza con un poco de alcohol.

Determinación de proteínas

Material biológico. Fracciones 0 a la 4 y FPA y FPB

Material y equipo

1 Recipiente para hielo

Celdas metacrilato grado UV para espectrofotómetro

Celdas de polipropileno para espectrofotómetro Tubos para microfuga de 1.5 mL

1 Vórtex

Micropipeta de 200-1000 L Micropipeta de 20-200 L Micropipeta de 5 a 10 L

1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta

1 caja de puntas de 200 L para micropipeta

1 piceta con etanol y una con agua bidestilada.

1 gradilla para tubos de microfuga Espectrofotómetro

Reactivos Reactivo de Bradford Solución estándar de albúmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL.

Desarrollo experimental

Determinación de proteínas por el método Abs 280 nm.

1. Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa.

22

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

2. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.

3. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV.

4. Leer la absorbancia las fracciones que te indique tú profesor a la longitud de 280 nm.

5. Calcular la concentración de proteína usando la fórmula 4. Llenar la Tabla 2.1

Tabla 2.1 Concentración de proteína calculada por la Absorbancia a 280nm

Tubo

Absorbancia

Concentración (µg/µL)

F0

   

F1

   

F2

   

F3

   

F4

   

FPA

   

FPB

   

6. Usar este estimado para determinar las diluciones o alícuotas a usar en la determinación colorimétrica de proteínas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 µg de proteína con una absorbancia máxima aproximada de 0.6.

Determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford. Se utilizará una curva estándar de BSA y las muestras se harán por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las mezclas de ensayo.

Para la curva estándar:

7. Etiquetar los tubos de microfuga según se indica en la tabla 2.2, después añadir los reactivos en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con

cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H 3 PO 4 !.

8. Registrar la absorbancia a 595 nm. Importante incubar a temperatura ambiente por al menos 5 minutos. La absorbancia se incrementará con el tiempo por lo que las muestras no deben incubarse por más de 1 h a temperatura ambiente.

Tabla 2.2 Orden de adición de reactivos para la determinación de proteínas del estándar de BSA

Tubo

B

1

2

3

4

5

H 2 O (L)

800

770

760

740

720

700

BSA (L)

0

30

40

60

80

100

Reactivo Bradford (L)

200

200

200

200

200

200

Absorbancia

           

9. Graficar absorbancia del estándar vs cantidad de proteína (g) y obtener los parámetros de regresión.

Para las muestras:

10.

Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa o usar las muestras que descongelaste para la determinación de proteínas por Abs 280nm.

11.

Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.

12.

Hacer las diluciones de cada una de las fracciones, según indicaciones de su profesor. Cada muestra diluida se determinará por duplicado. Anotar la dilución empleada en la Tabla

2.2

23

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

13. Numerar los tubos según se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volúmenes de proteína que te indique el profesor, registrarlos y completar la tabla. Una vez llena la tabla añadir los reactivos según se indica.

14. Usar el tubo B como blanco

Tabla 2.3. Determinación de la concentración de proteína de las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de la purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. F corresponde a Fracción y conc a que la muestra se usará concentrada.

Tubo

1

2

3 4

 

5 6

 

7

8

9

 

11

10 13

12

 

14

H 2 O

(L)

                   

780

760

780

760

cbp 800 L

F0

(L)

   

 

   

 

 

 

 

F1

(L)

     

 

 

   

 

 

F2

(L)

 

     

 

   

 

 

F3

(L)

 

   

 

   

 

 

 

F4

(L)

 

   

 

   

 

 

FPA

conc

 

   

 

 

   

20

40

 

 

(L)

FPB

conc

 

   

 

 

   

20

 

40

(L)

Reactivo

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

200

Bradford

(L)

Absorbancia

                           

15. Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva estándar, para calcular el contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula:

Contenido de proteína

(

g

Abs

b

)  

595 nm

m

* F

Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilución de cada muestra.

16. El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo, obteniendo la concentración de proteína en µg/µL.

17. Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para cada fracción.

18. Determinar la cantidad de proteína total que se obtuvo de cada una de las fracciones de los diferentes pasos de purificación, para ello multiplicar el volumen total de la fracción por el promedio obtenido en el punto 7, colocar los datos en la Tabla 2.4.

Tabla 2.4. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificación de la LDH

Fracción

Promedio

Volumen total en la fracción (L)

Proteína total en la fracción (g o mg )

g proteína/L

0

     

1

     

2

     

3

     

4

     

FPA

     

FPB

     

24

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Cuestionario

1. De acuerdo al fundamento de los dos métodos de cuantificación de proteínas aplicados en está práctica ¿cuáles son las principales diferencias entre ambos métodos?

2. Compara los resultados de concentración que obtuviste con los dos métodos empleados en la práctica.

3. ¿Qué desventajas tiene determinar la concentración de proteína por Abs 280 con respecto al Bradford en muestras que tienen una cantidad variada y diferente de proteínas, como en nuestras fracciones de la purificación de la lactato deshidrogenasa?

4. ¿Puedes usar otra proteína como estándar que no sea BSA? Si es así ¿porqué y cuál?

5. ¿Qué sustancias pueden interferir en cada uno de los métodos empleados y si se puede como evitas su interferencia?

6. Investiga el intervalo de concentración que detectan cada uno de los métodos.

7. ¿Porqué es necesario construir una curva de calibración en la determinación colorimétrica de proteínas por Bradford?

8. Da el fundamento de otro método para determinar proteínas.

Referencias

Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.

Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.

Páginas web que se pueden consultar:

Http://www.histosoft.com/services/background/colorimetric-assay-html

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. B. Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS

Objetivos

Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína.

Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína.

Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una proteína.

Analizar el progreso de la purificación de una proteína.

Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína:

rendimiento y pureza.

Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.

Introducción La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida es una herramienta analítica indispensable y rutinaria en un laboratorio de Bioquímica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar una mezcla compleja de proteínas, evaluar la pureza de una proteína durante el proceso de aislamiento y provee algunos valores aproximados de las características fisicoquímicas de las proteínas como la composición de subunidades, punto isoeléctrico, tamaño y carga.

En la electroforesis la migración de las partículas o moléculas cargadas ocurre cuando se establece un campo eléctrico. La velocidad de la migración depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado y la carga neta de las moléculas a separar. Si el reservorio de la solución que se encuentra en contacto con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las proteínas se encontrarán cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo eléctrico migrarán al ánodo. La migración diferencial de las proteínas dependerá no sólo de su tamaño sino también de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína y se uniforman las cargas de las proteínas, llevando a que la migración sólo dependa de su peso molecular.

Existe una gran variedad en la composición de los geles, que responde a las necesidades de separación de diferentes mezclas de proteínas. En este caso se utilizará a la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificación de una proteína. El gel de poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monómeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N’-metilen bisacrilamida para formar una red. La tetrametiléndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerización y el ión persulfato (S 2 O 8 - ) realiza la función de catalizador con la formación de radicales libres. Las proteínas pequeñas viajan más rápido que las de mayor tamaño, porque el tamaño del poro entorpece el paso de las proteínas de mayor peso molecular.

Material biológico Fracción 0 o 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción PA Fracción PB

Material y equipo

2 vasos de precipitados 25 mL

1 Pipeta Pasteur con bulbo

Tubos para microfuga de 0.5 mL

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

1 Recipiente para hielo

1 Micropipeta de 2-10 µL

1 Micropipeta de 20-200 µL

1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta

1 Recipiente de plástico/gel para la tinción.

1 Cámara para electroforesis

1 Fuente de poder

1 juego de placas de vidrio

1 Peine

1 juego de separadores Pinzas para sujetar las placas

Reactivos

Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% N’N’metilen-bisacrilamida.

2

M Tris /HCl pH 8.8

0.5 M Tris/HCl pH 6.8

20% SDS

TEMED

10% Persulfato de amonio

Agua destilada

Isopropanol o butanol

Mezcla de estándares de peso molecular de proteínas.

Amortiguador de muestra *

Amortiguador de corrida *

Solución teñidora *

Solución desteñidora * *La composición de las soluciones se encuentra en el apéndice.

Desarrollo experimental

Preparación del gel de poliacrilamida-SDS.

1.

Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las pinzas.

2.

Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.5).

3.

Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, añadiendo al final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solución (USAR GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA).

Tabla 2.5. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS.

Reactivos

Gel separador

Gel concentrador

30% Acrilamida + 0.8% Bisacrilamida

2 mL

0.66

mL

2

M Tris/HCl pH 8.8

1 mL

0.5 M Tris/HCl pH 6.8

 

0.6

mL

10% SDS

50

L

50

L

H

2 O

1.94 mL

3.67

mL

TEMED*

2

L

2.5

L

10% Persulfato de amonio*

40

L

40

L

Volumen total

5

mL

5 mL

*Añadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.

27

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

4. Añadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio.

5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con agua, con la finalidad de disminuir la tensión superficial y que no se forme un menisco en la parte superior del gel.

6. Se espera a que polimerice la acrilamida, no más de 20 minutos.

7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel

8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2.

9. Se añade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior para formar los depósitos en los que colocaremos la muestra.

10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.

11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cámara de electroforesis.

12. Añadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.

12. Añadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios. Figura 2.5. Pasos a seguir para la

Figura 2.5. Pasos a seguir para la preparación de un gel de poliacrilamida-SDS.

Preparación de muestras

13. Ya que conoces los g proteína/L, calcular cuál es el volumen necesario para tener 25 g de proteína. Con los datos llenar la tabla 2.6.

14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calculó en un tubo de microfuga y a ese volumen añadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable también, si los volúmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al añadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total.

28

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Cabe señalar que los pozos tienen una capacidad máxima de 30 L por lo que la mezcla proteína:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen.

15. Realizar también una mezcla de estándares de peso molecular. Usar 7 µL del estándar y mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra.

Tabla 2.6. Preparación de muestras para su corrimiento electroforético.

Fracción

Concentración de

L para 35 g

Amortiguador de

Estándar

proteína

muestra (l)

(g/L)

0

     

1

     

2

     

3

     

4

     

FPA

     

FPB

     

Estándar

23 L

7L

Adición de muestras y corrida

16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se obtuvieron las fracciones y colocando al final el estándar, PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS MOLECULARES DE LOS ESTÁNDARES (Figura 2.6).

LOS PESOS MOLECULARES DE LOS ESTÁNDARES (Figura 2.6). Figura 2.6 Aplicación de las muestras en los

Figura 2.6 Aplicación de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.

17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.

18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o según se desee.

19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.

20. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H 2 O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente.

29

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

21. Tomar una foto al gel teñido.

22. De acuerdo a los resultados señalar el o los pasos de purificación en donde se produjo el mayor enriquecimiento en la proteína de interés, la lactato deshidrogenasa.

Cuestionario

1. Con la información de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis, realizar la curva de log. movilidad electroforética (Rf) vs log. peso molecular.

2. Determinar el Rf en el que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa.

3. De acuerdo a la anterior información señale en la foto del gel en donde se localizaría la LDH.

4. En cuál de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH.

5. Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH, la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico.

6. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de

afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo tú equipo y los otros equipos cuál sería el resultado si primero realizan la cromatografía de intercambio catiónico y luego la de cromatografía de afinidad.

7. ¿Qué cantidad de proteína enriquecida en LDH se obtuvo en la fracción purificada de tú columna

8. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas obtenida en el proceso cromatográfico final?

9. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa, utilizando semillas de girasol.

A) Busca cual es la función de la proteína

B) En que material biológico se encuentra

C) En que compartimento subcelular se encuentra

D) Busca la información estructural y/o fisicoquímica de la proteína.

E) Diagrama de flujo del protocolo de purificación propuesto, indicando en cada paso en donde se queda tú proteína.

Referencias

Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current protocols in protein science 3.4.1-3.4.29.

Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4

Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net

Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

Problemas resueltos de purificación de proteínas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO.

Objetivos

- Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos.

- Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico.

- Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y grado de pureza o enriquecimiento).

Introducción Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción y no se consumen o modifican durante ésta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioquímicas celulares no podrían proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reacción se encuentra entre 10 6 a 10 12 veces con respecto a la reacción en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reacción en la que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes (especificidad de grupo).

La enzima, al ser una proteína, tiene una estructura geométrica característica y la porción de la enzima que específicamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro catalítico o sitio activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminoácidos son suficientes para efectuar la catálisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de éste no se cataliza la reacción. El cofactor es un ión metálico como el Fe 2+ , Zn 2+ , Mo 2+ . Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molécula orgánica con características no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo catalítico. Éste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD + , como la enzima que nos ocupará en ésta sección experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prostético.

Diseño de un ensayo enzimático Durante el aislamiento y purificación de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la enzima, así como evaluar sus características cinéticas. Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza, es decir: A) cuales son las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la estequiometría completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima.

Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un método para identificar y monitorear cualquier cambio físico, químico o biológico que ocurre durante la conversión del sustrato a producto. Se pueden utilizar distintas técnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto como la espectrofotometría, la fluorometría, la titulación ácido-base y el conteo radiactivo. La elección de alguna de ellas depende esencialmente de las características estructurales del sustrato y/o producto, así como de la química de la reacción.

31

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Si un ensayo enzimático involucra el seguimiento de la concentración del sustrato o producto durante un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cinético. Por otro lado, cuando se realiza la determinación de la concentración del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reacción, ya que cualquier desviación de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la reacción pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentración de sustrato, la desnaturalización de la enzima y a la inhibición causada por el producto de la reacción. Pero, hay que aclarar que la velocidad inicial de una reacción ocurre en los primeros minutos de la reacción, una relación lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va más allá del 5% de la concentración inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimática, es fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales.

Lactato deshidrogenasa de mamífero. El nombre científico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD + oxidoreductasa (EC 1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad física intensa, cuando la tensión de oxígeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversión de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el O 2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversión de NADH a NAD + . La regeneración del NAD + permite que el flujo de la vía glucolítica continúe. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato Lactato cuando la demanda de energía cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.

los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables. Figura 3.1. Reacción que cataliza la

Figura 3.1. Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reducción del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.

La LDH es un tetrámero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazón y la M que predomina en el músculo y el hígado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrámeros con estequiometrías distintas:

H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reacción pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas.

En la práctica se determinará la actividad de la LDH de músculo esquelético de bovino, enzima que contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En está parte del protocolo se medirá a diferentes tiempos la reacción en el sentido de Piruvato Lactato, utilizando como fuente de enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificación de la LDH de la sección II del manual.

El ensayo de actividad está basado en la detección del cambio de absorción del NADH y el NAD + . El NADH es una molécula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD + no. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se detectará como una disminución en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reacción el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD + .

Material biológico. Fracciones obtenidas durante la purificación de la LDH (sección 2 del manual)

32

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Material y equipo Celdas de plástico Tubos de microfuga Parafilm

1 Recipiente para hielo

1 Micropipeta de 200-1000 L

1 Micropipeta de 20-200 L

1 Micropipeta de 2-10 L

1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta

1 caja de puntas de 200 L para micropipeta

1 Vórtex Espectrofotómetro (por grupo)

Reactivos

1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0

10 mM Piruvato de sodio

4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el amortiguador de fosfatos para su disolución. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de 1.0, si no es así volver a pesar y medir. El NADH no se puede almacenar disuelto, por lo que al final

la sesión experimental se desecha el reactivo.

Desarrollo experimental.

Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa. Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fracción 3, que es la fracción que usarán para obtener los parámetros cinéticos de la enzima. Para obtener las curvas de actividad se determinará la dilución óptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que concluyan con esa fracción y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesión, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad a la fracción 1 y/o la fracción purificada A o B.

Las mezclas de reacción se realizarán directamente en las celdas de plástico. Se usará agua para ajustar a 0 el espectrofotómetro.

1.

Descongelar la proteína y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera dilución de la fracción 3, se recomienda 1:50.

2.

Se etiquetan 5 celdas.

 

3.

A

cada una de las celdas se les añadirán los siguientes componentes:

 

515 L

100 mM Amortiguador de fosfatos

29.3 L

10 mM Piruvato

210.7 L

H 2 O

4.

Todas las celdas se mantienen en el hielo. Adicionar a una de la celdas 50 L de 4 mM NADH

e

inmediatamente agregar 10 L de la muestra de enzima diluida o la cantidad indicada por

los profesores.

 

5.

Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversión dos veces y se lee inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la primera absorbancia

leída una vez que se añadió enzima es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas

y hacer una dilución mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir menos la muestra.

33

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El ensayo de actividad se realizará a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotómetro.

Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificación de proteínas. Anotar la fracción y su dilución.

Tiempo F3 F F F F F F F F (min) dilución dilución dilución Dilución
Tiempo
F3
F
F
F
F
F
F
F
F
(min)
dilución
dilución
dilución
Dilución
Dilución
Dilución
Dilución
Dilución
Dilución
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.0

7. Realizar una gráfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta. Se sugiere colocar todas las fracciones en una misma gráfica.

8. Para calcular la actividad total de la enzima se utiliza la siguiente ecuación:

Actividad

Abs m

*

min

Vol ensayo mL

.

*

F

1

1

cm

*

b

cm

M

mmol min

1

Donde:

m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min : es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 10 3 M -1 cm -1 . b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm V ensayo : es el volumen total del ensayo. F: es el factor de dilución de la proteína

9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la práctica de purificación de proteínas llena la Tabla 3.2.

10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad específica hay que dividir la actividad total entre los mg totales de proteína en la fracción. Para obtener las veces de purificación o Grado de pureza se divide la actividad específica de cada una de las fracciones entre la fracción

34

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

inicial. Para la obtención del rendimiento se considera que el 100% es la actividad total recuperada en la fracción inicial en relación con la actividad total recuperada en cada paso de purificación.

Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino.

Procedimiento

Proteína total en la fracción (mg)

Actividad total

Actividad enzimática específica (mmol min -1 mg -1 )

Veces de

Rendimiento

mmolmin —1

purificación

Homogeneizado (F1 o F0)

     

1

100

Sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio 45% (F2)

         

Botón obtenido de la pp con sulfato de amonio 70% (F3)

         

Primera Fracción que salió de la cromatografía* (FPA)

         

Segunda Fracción que salió de la cromatografía* (FPB)

         

Anotar cual cromatografía se realizó de intercambio iónico o de afinidad.

11.Analizar los resultados.

Cuestionario

1. ¿Por qué se usó H 2 O como blanco para calibrar el espectrofotómetro en la práctica?

2. Realiza el análisis dimensional de la fórmula que se propone para calcular la actividad de la enzima.

3. ¿Cuáles son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima?

4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una curva temporal de aparición de productos.

5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el que la proteína se enriqueció más. ¿Por qué?

6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad ¿en qué pasos de la purificación se eliminan más contaminantes?.

7. ¿Cuál es la utilidad de realizar una tabla de purificación en la que se toma en cuenta la actividad de la enzima?

Referencias

Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190. Localización

QP514.2

Kopperschläger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.

Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización QP514.2

Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43

Pardo-Vázquez JP. Cap 10. Cinética enzimática. En Bioquímica de Laguna. El Manual Moderno, SA de CV., 2002,

pP185

Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localización QP514.2

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.

Objetivos:

- Determinar la concentración de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad máxima.

- Entender el significado de los parámetros cinéticos Vmax y Km.

- Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando diferentes gráficos de la ecuación linealizada de Michaelis-Menten.

- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa

- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parámetros cinéticos de la enzima.

Introducción El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros.

Curva de velocidad en función de la concentración de sustrato. Tanto en una reacción catalizada por una enzima como en una reacción química, se espera que la velocidad de la reacción de conversión de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentración de los reactantes que participan en la reacción, es decir si se duplica la concentración de cualquiera de los sustratos la velocidad de la reacción también se duplica. A una reacción así se denomina reacción de segundo orden y se representa como una línea recta con pendiente positiva y diferente de cero.

Pero en una reacción que es catalizada por una enzima, sólo a concentraciones bajas del o los sustratos se obtiene una reacción de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad es independiente de la concentración de sustrato, debido a que no hay más enzima que lleve a cabo la reacción. La reacción a concentraciones altas de sustrato se llama reacción de orden cero y también se representa como una línea recta pero con pendiente casi igual a cero.

En resumen, en una reacción catalizada por una enzima la variación en la concentración del o los sustratos presenta diferentes órdenes de reacción. Para un gran número de enzimas la gráfica que se produce se puede describir mediante la expresión matemática de una hipérbola rectangular. Como en cualquier expresión matemática se expresan en ella la relación entre las variables junto a 1 o más constantes. El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llevó a describir la ecuación de la hipérbola rectangular, ahora conocida como ecuación de Michaelis-Menten, con ella es posible predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la ecuación se describe así:

v

V

max



s

Km

s

Donde las dos variables de la ecuación son la velocidad (v) y la concentración de sustrato (s). Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis- Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad teórica máxima de una reacción. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Los valores de Km y

36

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Vmax son característicos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llevó a cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína que responde modificando su estructura y carga eléctrica cuando los componentes de la solución cambian.

Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima también llamados parámetros cinéticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una línea recta por lo que la interpolación es difícil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemáticas que producen una línea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la más popular la de Lineaweaver-Burk y que es la ecuación que a continuación se muestra:

y que es la ecuación que a continuación se muestra: Como se observa en el ejemplo

Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten son expresiones matemáticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretación son útiles para obtener los valores de Km y Vmax.

Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas. Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula. La interacción de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima.

Inhibidores competitivos. Son moléculas que tienen una similitud estructural y química al sustrato de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona más sustrato y el inhibidor es reversible, el aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición. El inhibidor afecta exclusivamente el valor de la Km de la reacción catalizada por la enzima (Figura 3.2).

la Km de la reacción catalizada por la enzima (Figura 3.2). Figura 3.2. Efecto de los

Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima.

37

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2).

Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la gráfica que se produce con un inhibidor de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en este último.

En la práctica se determinarán las constantes cinéticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de músculo de bovino, para la reacción en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la concentración de enzima, el pH y la temperatura de reacción. También se determinará el tipo de inhibición que un ácido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a través de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentración de inhibidor su efecto en las constantes cinéticas de la reacción catalizada por la enzima.

cinéticas de la reacción catalizada por la enzima. Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor

Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usará en la práctica, el oxamato.

Material biológico Fracción 3 obtenida en la práctica de purificación.

Materiales y equipo 10 celdas de plástico Tubos para microfuga

1

Recipiente para hielo

1

Vaso de precipitados de 25 mL

3

Tubos de ensayo 13x100mm

1

Micropipeta de 1000 L

1

Micropipeta de 200 L

1

Micropipeta de 10 L

1

Micropipeta de 50 L

Puntas para micropipeta de diferentes capacidades

1 Vortex

Parafilm Espectrómetro (por grupo)

Reactivos

1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0

38

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

10 mM Piruvato de sodio

10 mM Oxamato de sodio

4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.

Desarrollo experimental.

Efecto de la concentración de sustrato.

1. Numerar las celdas.

2. En una celda de plástico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se añaden 50 L de NADH 4

mM y 10 L de la muestra de enzima diluida, fracción 3 obtenida en la práctica de purificación.

Tabla 3.3. Efecto de la concentración de sustrato.

 

Solución

1

2

3

4

5

6

*Concentración final de piruvato (mM)

0.06*

0.09*

0.15*

0.25*

0.36*

0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0

515

515

515

515

515

515

H 2 O c.b.p. 815 L (L)

235.1

232.7

227.8

219.6

210.7

200

10 mM Piruvato (L)

4.9

7.3

12.2

20.4

29.3

40

4 mM NADH (L)

50

50

50

50

50

50

ENZIMA

(diluida*) (L)

10

10

10

10

10

10

*Usar la dilución apropiada de enzima, preguntar a su profesor.

3.

Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversión.

4.

Ajustar el espectrofotómetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 340 nm.

5.

Los

valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).

Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.

Tiempo

 

Piruvato (mM)

 

(seg)

0.06

0.09

0.15

0.25

0.36

0.5

30

           

60

           

90

           

120

           

150

           

180

           

210

           

240

           

270

           

300

           

39

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la práctica anterior.

7. Posteriormente se grafican:

A) Actividad vs concentración de sustrato (gráfica de Michaelis-Menten);

B) La actividad de acuerdo a la ecuación de Lineweaver-Burk y

C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff.

8. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos

anteriores.

Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Al igual que en la sección anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5).

Tabla 3.5. Composición de medio de reacción para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa.

 

Solución

1

2

3

4

5

6

*Concentración final de piruvato (mM)

0.06*

0.09*

0.15*

0.25*

0.36*

0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0

515

515

515

515

515

515

H 2 O c.b.p. 815L

235.1

232.7

227.8

219.6

210.7

200

10

mM Oxamato (L)

27.2

27.2

27.2

27.2

27.2

27.2

10

mM Piruvato (L)

4.9

7.3

12.2

20.4

29.3

40

4 mM NADH (L)

50

50

50

50

50

50

ENZIMA

(diluida) (L)

10

10

10

10

10

10

1. Se adiciona en una celda de plástico los reactivos de acuerdo a los volúmenes y el orden que se encuentra en la Tabla 3.5.

2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6).

Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.

Tiempo

 

Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM

 

(seg)

0.06

0.09

0.15

0.25

0.36

0.5

30

           

60

           

90

           

120

           

150

           

180

           

210

           

240

           

270

           

300

           

40

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

3. Obtener la pendiente y calcula la actividad enzimática por mg de proteína.

4. Realizar los siguientes gráficos: A) Actividad vs concentración de sustrato; B) La gráfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff.

5. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos anteriores.

6. Determinar el tipo de inhibición que oxamato ejerce sobre la LDH.

Cuestionario

1. ¿Por qué es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima?

2. Diseña un protocolo diferente al presentado en está sección para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa.

3. ¿Cuál fue el blanco de la reacción?

4. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de primer orden?

5. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de orden cero?

6. ¿ En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de orden cero orden mixto?

7. ¿Qué significado tiene?

8. Define Km e indica qué unidades tiene.

9. Define Vmax e indica qué unidades tiene.

10. ¿Qué tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.

11. ¿Cuáles son los inhibidores naturales de la LDH de músculo?

12. ¿En el humano que tejidos contienen LDH?

13. ¿Qué es el ciclo de Cori y como participa la LDH en el ciclo?

Referencias

Mathews C. 1992. Bioquímica,

QP514.2

2da edición,

Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización

Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43

Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localización QP514.2

Sitios recomendados para

1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax

http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la página pulsar la tecla kinetics_model.xls, después regresa a la página inicial y contesta las preguntas que se te hacen.

http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm

NOTAS Y CÁLCULOS

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

4. GENÉTICA

DETERMINACIÓN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS.

Objetivos:

Entender los principios de la transmisión de los caracteres hereditarios.

Explicar y usar la terminología relevante: dominante, recesivo, portador, mutación, heterocigoto, homocigoto, síndrome, alelo y locus.

Resolver problemas aplicando las leyes de Mendel: Determinación de frecuencias

Distinguir entre enfermedades autosomales y ligadas al sexo.

Introducción La descripción morfológica o funcional de un organismo vivo en cualquier momento dado de su desarrollo es el fenotipo de ese organismo. Mientras que el genotipo se define como el conjunto de instrucciones o genes, contenidos en su material genético heredable; es decir, la información contenida en las secuencias de su ácido desoxirribonucleico (DNA), que se transmite de generación en generación entre los miembros de una especie. Este conjunto de instrucciones es una amplísima, pero finita, predeterminación de las posibilidades fenotípicas de un organismo. Por otro lado, existen los factores epigenéticos, tales como las influencias o eventos que no están escritos en el material genético heredable de los seres vivos, pero que modifican los fenotipos. Los fenómenos epigenéticos como por ejemplo el ambiente, pueden determinar, en un momento dado, el modo en que se expresan las instrucciones genotípicas y por lo tanto, el fenotipo del individuo.

Una característica del genotipo es su heredabilidad. Los mecanismos implicados fueron publicados por Gregor Johann Mendel en 1866. Él identifico ciertos rasgos fenotípicos que se transmiten de manera predecible en plantas de chícharos y Propuso que estos caracteres están determinados por factores genéticos que segregan independientemente, es decir, que se heredan de padres a hijos en forma de unidades de herencia individuales, los genes.

Los estudios de Mendel se basaron realizando cruzas entre individuos de líneas puras que diferían en un par de caracteres de fácil identificación fenotípica y la observación del aspecto de la primera generación híbrida (F 1 o primera generación filial, formada por plantas monohíbridas). Posteriormente, cruzó las plantas híbridas entre sí y obtuvo la segunda generación filial (F 2 ). Contó el número de individuos de la F 2 , que presentaron cada uno de los caracteres utilizados que podrían ser comparados, tales como color de las flores, el color y textura de la testa de las semillas y la longitud de los tallos.

Mendel, a partir de sus experimentos, concluyó que los chícharos tienen una dotación genética doble. Es decir, que son organismos diploides, en los que existen dos copias o alelos del gen causante de un rasgo fenotípico. En los organismos diploides cada copia alélica proviene de cada uno de los progenitores. Mendel, también postuló que, frecuentemente, una de estas copias en particular puede ser dominante sobre su contraparte heredada del otro progenitor. Cuando en la descendencia se encuentra un alelo recesivo del gen y uno dominante, el fenotipo observado en esta combinación heterocigota, corresponderá al tipo dominante. Para la aparición de un fenotipo recesivo es indispensable la transmisión, por ambos progenitores, de una combinación homocigota de alelos recesivos. Obviamente, la combinación homocigota de las variantes alélicas dominantes resultará en un fenotipo dominante. Las interpretaciones que Mendel dio a sus observaciones han resultado correctas para un tipo de herencia que hoy llamamos Mendeliana, precisamente por manifestarse de la manera en que Mendel lo descubrió. En este caso un rasgo fenotípico está determinado por la combinación de dos copias alélicas de un gen, cada una de ellas en distinto grado de dominancia,