Avanos Tecnolgicos

Colunas HPLC
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MERCK EM DARMSTADT 300.000 QUILOS/ANO DE SLICA PARA CROMATOGRAFIA

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MERCK NO MUNDO 31/12/06

01_Altdorf, Switzerland 02_Amsterdam, Netherlands 03_Ardea, Italy 04_Athens, Greece 05_Atsugi, Japan 06_Aubonne, Switzerland 07_Auckland, New Zealand 08_Bangkok, Thailand 09_Bari, Italy 10_Barra do Corda, Brazil 11_Beijing, China 12_Beirut, Lebanon 13_Belgrad, Serbia 14_Bogot, Colombia 15_Boston, USA 16_Bratislava, Slovakia 17_Brisbane, Australia 18_Brussels, Belgium 19_Bucharest, Romania 20_Budapest, Hungary 21_Buenos Aires, Argentina 22_Bunschoten, Netherlands 23_Cairo, Egypt 24_Calais, France 25_Cambridge, Canada 26_Caracas, Venezuela 27_Carlos Spegazzini, Argentina 28_Casablanca, Morocco 29_Chilly-Mazarin, France 30_Chilworth, United Kingdom 31_Coinsins, Switzerland 32_Copenhagen, Denmark 33_Corsier-sur-Vevey, Switzerland 34_Dammam, Saudi Arabia 35_Darmstadt, Germany 36_The Hague, Netherlands 37_Dietikon, Switzerland 38_Dijon, France 39_Dubai, United Arab Emirates 40_Dublin, Ireland

41_Durham, USA 42_Espoo, Finland 43_Mexico City, Mexico 44_Etobicoke, Canada 45_Feltham, United Kingdom 46_Fontenay-sous-Bois, France 47_Fourways, South Africa 48_Frankfurt a. M., Germany 49_Frederiksberg, Denmark 50_Geneva, Switzerland 51_Gernsheim, Germany 52_Gibbstown, USA 53_Goa, India 54_Grafing, Germany 55_Guangzhou, China 56_Guatemala City, Guatemala 57_Hanoi, Vietnam 58_Hauppage, USA 59_Hawthorne, USA 60_Hellerup, Denmark 61_Herzlia-Pituach, Israel 62_Ho-Chi-Minh City, Vietnam 63_Hohenbrunn, Germany 64_Hong Kong, China 65_Hull, United Kingdom 66_Istanbul, Turkey 67_Ivrea, Italy 68_Jakarta, Indonesia 69_Jeddah, Saudi Arabia 70_Karatschi, Pakistan 71_Kaunas, Latvia 72_Kawagoe City, Japan 73_Kilsyth, Australia 74_Kuwait City, Kuwait 75_Lufelfingen, Switzerland 76_Lehrte, Germany 77_Les Berges du Lac, Tunisia 78_Lima, Peru 79_Lisbon, Portugal 80_Ljubljana, Slovenia

81_London, United Kingdom 82_Lorenskog, Norway 83_Lyon, France 84_Madison, USA 85_Madrid, Spain 86_Mailand, Italy 87_Makati-Stadt, Philippines 88_Manlleu, Spain 89_Martillac, France 90_Mainz, Germany 91_Meyzieu, France 92_Milwaukee, USA 93_Mississauga, Canada 94_Modderfontein, South Africa 95_Mollet del Valls, Spain 96_Monaco, Monaco 97_Montevideo, Uruguay 98_Moscow, Russia 99_Mumbai, India 100_Napa, USA 101_Ness-Ziona, Israel 102_Netanya, Israel 103_Newport, United Kingdom 104_Norwood, USA 105_Nottingham, United Kingdom 106_Oakville, Canada 107_Onahama, Japan 108_Osaka, Japan 109_Oslo, Norway 110_Overijse, Belgium 111_Palmerston North, New Zealand 112_Panama City, Panama 113_Paris, France 114_Poole, United Kingdom 115_Potters Bar, United Kingdom 116_Prague, Czech Republic 117_Pyongtaek-Shi, South Korea 118_Quetta, Pakistan 119_Quito, Ecuador 120_Reinbek, Germany

121_Ricany-Jazlovice, Czech Republic 122_Riga, Latvia 123_Rio de Janeiro, Brazil 124_Riad, Saudi Arabia 125_Rockland, USA 126_Rome, Italy 127_San Diego, USA 128_Santiago de Chile, Chile 129_So Luis, Brazil 130_So Paulo, Brazil 131_Savannah, USA 132_Schaffhausen, Switzerland 133_Schwalbach, Germany 134_Semoy, France 135_Seoul, South Korea 136_Shah Alam, Malaysia 137_Shanghai, China 138_Singapore, Singapore 139_Sofia, Bulgaria 140_Spittal, Austria 141_Stockholm, Sweden 142_Sydney, Australia 143_Taipeh, Taiwan 144_Taloja, India 145_Tallin, Estonia 146_Taoyuan, Taiwan 147_Tokyo, Japan 148_Tunbridge Wells, United Kingdom 149_Unterschleissheim, Germany 150_Vantaa, Finland 151_Vienna, Austria 152_Wilna, Lithuania 153_Wadeville, South Africa 154_Warsaw, Poland 155_West Drayton, United Kingdom 156_Zagreb, Croatia 157_Zug, Switzerland

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UNIVERSO MERCK

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EQUIPE DE CROMATOGRAFIA Assistncia Tcnica Equipe de Vendas Paulo Fellippe Daniel Teixeira Paulo Fellippe Alexandre Rosolia Douglas Vicco Guilherme Carrara

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ASSESSORIA TCNICA Guilherme Equipamento / Validao Alexandre Equipamento / Rede / Preparativa

Daniel Colunas HPLC Douglas Equipamento / Software

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CONTEDO DO TREINAMENTO

Parte 1: Parte 2: Parte 3: Parte 4: Parte 5:

Introduo a HPLC e princpios bsicos Seleo de colunas e fase mvel Slica Convencional Slica Ultra-Pura Blocos monolticos

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Parte 1 : Introdu Introduo a HPLC e Princ B Princpios Bsicos

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COMO TUDO COMEOU

Medalha Tswett, recebida pela Merck KgaA em 1980.

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A FUNO DA COLUNA

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A ADSORO QUMICA

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CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL

Fase Estacionria Fase Mvel

Polar (Slica) Apolar (Hexano)

AZ

AM

Por que separam?

Amarelo APOLAR: tem mais afinidade pela FASE MVEL e elui primeiro Vermelho POUCO POLAR: tem menos afinidade pela FASE MVEL e elui depois Azul POLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONRIA e elui por ltimo
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FASE NORMAL

mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria polar com a parte polar da molcula da amostra. Fase estacionria: SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2 Fase Mvel: heptano, hexano, ciclohexano, dioxano, metanol mtodo: Separao de componentes no polares para mdio polares (Hidrocarbonetos e cidos carboxlicos) O O O O Si O H O O O Si O H Si O H O CH 2

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CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Fase Estacionria Fase Mvel

Apolar (RP18) Polar (gua)

AM

AZ

Por que separam?

Azul POLAR: tem mais afinidade pela FASE MVEL e elui primeiro Vermelho POUCO APOLAR: tem menos afinidade pela FASE MVEL e elui depois Amarelo APOLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONRIA e elui por ltimo
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FASE REVERSA

mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria no polar (cadeia de hidrocarbonetos) com a fase no polar da molcula da amostra. Fase estacionria: n-octadecil (RP-18), n-octil (RP-8), etil (RP-2), Fenil, -NH2, CN, -Diol, Polimeros hidrofobicos Fase mvel: metanol ou acetonitrila / gua ou tampo, THF ou dioxano.
O O O O Si O O O O Si O Si O CH Si CH H CH Si CH 3 3 3 3

H2O

CH3OH

H2O

CH

OH

CH3OH

H2O

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POLARIDADE DA FASE MVEL

POLAR

APOLAR

gua - Metanol - Acetonitrila - Acetona - THF - Hexano

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POLARIDADE DA FASE ESTACIONRIA

POLAR

APOLAR

Slica DIOL NH2 CN RP8 RPselectB RP18

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CARACTERIZAO
Fase Normal Polaridade da f.e. polaridade da fase mvel ordem de eluio da amostra alta baixa-mdia menos polar primeiro Fase Reversa baixa mdia-alta mais polar primeiro

Aumento da reteno por

Fase Normal Decrscimo da polaridade da FM Aumento da polaridade da molcula da amostra Fase Reversa Aumento da polaridade da FM Decrscimo da polaridade da molcula da amostra
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Parte 2 : Seleo de colunas e Sele fase mvel m

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DESENVOLVIMENTO DE FASES PARTICULADAS

Primeira Gerao (1970): LiChrosorb
- a primeira coluna para HPLC; partculas irregulares; 1 fase reversa RP18

Segunda Gerao (1980): LiChrospher,

Superspher

- partculas esfricas de 4 e 5 m com seletividade otimizada

Terceira Gerao (1990): Purospher

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partculas esfricas.

Quarta Gerao (2000): Purospher STAR

- partculas esfricas de 3 m e 5 m, maior potencial

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TIPOS DE RECHEIO

Fase Reversa:
modificao: RP-8, RP-select B, RP-18, -CN, -Diol, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher, Purospher STAR, Chromolith.

Fase Normal:
modificao: Si, -Diol, -CN, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher STAR , Chromolith.

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ESTRUTURA DO RECHEIO

LiChrosorb

irregular

Tamanho de partcula LiChrospher Superspher Purospher Purospher STAR

esfrico

Chromolith

monoltico
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DIMENSES FSICAS

Hibar

LiChroCART
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Comprimento (mm)

Pr-coluna manuCART

Dimetro (mm)

INFLUNCIA DO DIMETRO INTERNO

Adaptao do fluxo de trabalho: 4.6mm (1 ml/min) para 4.0mm (x ml/min): (2.3)2/ (2)2= 1/x 5.29/4= 1/x 5.29x= 4 x= 0.75 ml/min Economia de 25% de solvente por minuto com separaes equivalentes!

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HOLDER MANU-CART O acoplador manuCART 4 utilizado em colunas com 2 mm, 3 mm, 4 mm e 4.6 mm de dimetro interno. Os cartuchos podem ter 250 mm, 150 mm, 125 mm e 75 mm de comprimento. utilizado para prcolunas de 4-4 e 10-2.

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MONTANDO UM MANU-CART

Montando sem a pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as duas partes da trava voltadas para dentro e as envolva com a rosca 3. Rosqueie o conector de tubulao Montando com pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as partes da trava voltadas para fora 3. Coloque a pr-coluna neste espao vazio formado 4. Rosqueie o conector de tubulao
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A FASE MVEL
A fase mvel interage fsico-quimicamente com as substncias presentes na amostra e com o enchimento da coluna, assim influenciando de forma decisiva na separao. Recomendaes: gua usada deve ter alto grau de pureza, grau HPLC tipo LiChrosolv (vendida pela Merck em embalagens de 1 L), ou gua ultra-purificada por equipamentos (EasyPure RT VWR). A leitura de resistividade indica somente o teor de ons. Para medir o teor de orgnicos na gua podemos utilizar a tcnica de TOC (carbono orgnico total) e elimin-los com o uso de equipamentos de purificao com luz UV (oxida orgnicos a CO2 e H2O). No utilizar reagentes de grau tcnico, p/sntese, resduos de pesticidas, p/anlise, ou UV em anlises com gradiente. Solventes grau HPLC. A maioria dos problemas de anlise e com o equipamento tem origem na fase mvel. Porm... Coluna e Equipamento so sempre culpados!
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FILTRAO DA FASE

gua destilada inadequada. gua deve ser grau HPLC. Livre de bactrias, utilizando uma filtrao de 0,2 m (brevundimonas diminuta). Resistividade de pelo menos 18 megohm/cm. Teor de orgnicos < que 20 ppb Para evitar o entupimento do filtro de 2m basta a membrana de 0,45m.

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MEMBRANAS DE FILTRAO

Membranas de steres de celulose usadas na microbiologia servem somente para filtrao de gua. Membranas de PTFE e celulose regenerada so compatveis com a maioria dos solventes orgnicos e com gua.

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TRANSPARNCIA DA FASE MVEL

Relao de Transparncia Quando a fase mvel no muito transparente, diminui a sensibilidade (pois o detector precisa subtrair o sinal para zerar a absorbncia) e aumenta o rudo. Offset: Indica o quanto o detector teve que compensar a absorbncia da fase mvel para poder zerar a linha de base; enfim indica a qualidade da fase mvel (transparncia).

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GASES DISSOLVIDOS

Fases mveis saturadas com ar podem resultar em bolhas ou problemas na bomba, noise, drift, assim como outros problemas relacionados ao detector.

120 100 80 60 40 20 0
Aquecimento Hlio Vcuo Ultrassom

OBS: Aquecimento o modo mais eficiente de remoo de gases dissolvidos, mas inconveniente. Purga com He eficiente por apenas alguns minutos. Vcuo menos eficiente, mas pelo menor custo usado por muitos.

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Parte 3 : Slica Convencional

Page 32

FASES ESTACIONRIAS PARA HPLC

Primeira Gerao (1970): LiChrosorb
- a primeira coluna para HPLC; partculas irregulares; 1 fase reversa RP18.

Segunda Gerao (1980): LiChrospher, Superspher

- partculas esfricas de 4 e 5 m com seletividade otimizada.

Terceira Gerao (1990): Purospher

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partculas esfricas.

Quarta Gerao (2000): Purospher STAR

- partculas esfricas de 3 m e 5 m, maior potencial.

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ESTRUTURA DOS MATERIAIS

10

LiChrosorb

10

LiChrospher Superspher

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SLICA GEL MODIFICADA PARA FASE REVERSA Especificaes

Sorbents Particle size (m) 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 4 4 4 4 4 Pore Pore Spec. size volume surface () (ml/g) area (m2/g) 100 1,0 300 60 0,75 300 100 1,0 300 100 1,25 350 100 1,25 350 60 0,9 360 100 1,25 350 100 1,25 350 60 1,25 350 60 1,25 350 60 0,9 360 100 1,25 350 100 1,25 350 %C Surface Efficiency (N/m) coverage (mol/m2) 3,4 4,21 3,0 4,04 4,44 3,55 3,61 4,09 4,04 4,44 3,55 3,61 4,09 55.000, 20.000 55.000, 20.000 55.000, 20.000 55.000, 25.000 55.000, 25.000 55.000, 25.000 55.000, 20.000 55.000, 20.000 100.000 100.000 100.000 100.000 100.000

LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-select B LiChrosorb RP-18 LiChrospher RP-8 LiChrospher RP-8e LiChrospher RP-select B LiChrospher RP-18 LiChrospher RP-18e Superspher RP-8 Superspher RP-8e Superspher RP-select B Superspher RP-18 Superspher RP-18e

9,5 11,4 16,2 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6

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TAMPO? TRIETILAMINA?

2 3

Vitaminas

Pesticidas

Aromticos 3

3 1 4 5 4 2

5 6 7
14 min

2 5

14 min

14 min

Eluent:

Methanol / 0.01M phosphate buffer pH 3.0 (2:98, v/v) + 2 ml/l triethylamine Flow rate: 2 ml/min Detection: UV 270 nm Sample: 1. Ascorbic acid; 2. Nicotinic acid; 3. Pyridoxol hydrochloride; 4. Niacin; 5. Thiamin hydrochloride

Eluent: Flow rate: Detection: Sample:

Acetonitrile / Water (70:30) 2 ml/min UV 220 nm 1. 4,4-DDOH 2. -Endosulphan 3. 4,4-DDM 4. Heptachlor 5. p,p-DDT 6. o,p-DDT 7. Aldrin

Eluent: Flow rate: Detection: Sample:

Acetonitrile / Water (75:25) 1 ml/min UV 254 nm 1. Benzene 2. Naphthline 3. Fluoren 4. Anthracen 5. Benzanthracen

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DEFINIES

Compostos Inicos: Molcula orgnica que contm um ou mais grupos funcionais capazes de comportar-se como cido ou base na faixa de pH correspondente. cidos ou Bases Fortes: so compostos que ionizam-se completamente na faixa de pH correspondente.

HA B + H+

A- + H+ BH+

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FUNO DE PKA E PH 99 % B
Plotagem em forma de S. Quando um cido (HA) ou base (B) ioniza, torna-se muito menos hidrofbico (mais hidroflico). Como resultado, sua reteno em fase reversa reduz de 10 a 20 vezes.

Ponto central: pH = pKa, metade dos compostos ionizados. pKa 1.5: toda mudana em reteno com origem no pH ocorre nesta faixa. pH < 2.5 ou pH > 5.5: composto est completamente ionizado ou completamente molecular, e a reteno no altera muito nesta faixa.

99 % BH+

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DISSOCIAO DE CIDO

Curva de dissociao do cido benzico (pKa = 4.2).

Assim, recomenda-se que o pH esteja pelo menos +/- 1 unidade fora do pKa.

Quanto mais afastados estes valores, menores sero os efeitos de pequenas mudanas de composio de fase mvel na reteno.

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TAMPO PARA FASE REVERSA

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MODIFICAO MONOFUNCIONAL DE SIO2

OH Si OH O Si O Si O Si O OH OH OH CH3 CH2

CH2 CH2 CH2

CH2

CH2 CH2 CH2

CH2 CH2

Si CH3

CH2 C6H13 CH2

Modificao monofuncional

O H Si

C3 H O Si C18H37 C3 H

O H

CH3

Endcapping

H Si O O O O Si Si O C3 H Si C18H37 C3 H

O Si Si CH3 CH3 O Si CH3 Si O CH3 O Si O O Si O O CH3 Si

Endcapped

O H

CH3 CH3

Si CH3 C3 H

ODS-1
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TESTE ENGELHARDT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Thiourea Aniline Phenol 2,3 Dihydroxynaphthalene 4 - Ethylaniline Diethylphthalate N, N Dimethylaniline Toluene Ethylbenzene

t0
basic acidic chelating basic neutral basic neutral neutral Chromatographic Conditions:
Column: LiChrospher RP18e 4 mm x 250 mm Mobile Phase: Methanol/Water 58/42 (v/v) Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 C Detection: UV 254nm

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RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM CIDA

Teste Engelhardt
Aromticos

3,4,5

cido nicotnico + derivados

1 4

2 1 2 6 7 9
30 min 30 min

3 8 4 3 2 1
30 min

Eluent:

Methanol / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (50/50, v/v) Flow rate: 1ml/min Detection: UV 254 nm Sample: 1. Anilin 6. N,N-Dimethylaniline 2. Phenol 7. Toluol 3. o-Toloidine 8. Benzoeic acid 4. m-Toloidine methylester 5. p-Toloidine 9. Ethylbenzene

Eluent:

Methanol / 0.7 mM acetic acidr (2/100, v/v) Flow rate: 1 ml/min Detection: UV 260 nm Sample: 1. Iso nicotinic acid 2. Nicotinic acid 3. Iso nicotinic acid amide 4. Nicotinic acid amide

Eluent: Flow rate: Detection: Sample:

Acetonitrile / Water (75/25, v/v) 1 ml/min UV 254 nm 1. Benzene 2. Naphthalin 3. Fluorene 4. Anthracen 5. Benzanthracen

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RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM CIDA

Separao de medicamentos (com eluente cido)
3 Medicamentos 1 betabloqueadores 1 3 DMD-Test

1
2 1 4 5 6
30 min

2 3

3
2

4
30 min

1
30 min

Eluent:

Acetonitrile / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (20/80, g/g) Flow rate: 1ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Barbituric acid 2. Codeine phosphate 3. Atropinium sulfate 4. Papaverine 5. Noscapinium chloride 6. Diphenhydramine

Eluent:

Acetonitrile / 0.02 M KH2PO4 pH 4.7 (25/75, v/v) Flow rate: 2 ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Atenolol 2. Metaprolol 3. Bisoprolol 4. Propranolol

Eluent:

Acetonitrile / phosphate buffer pH 2.3 (31.2/86, g/g) Flow rate: 1 ml/min Detection: UV 220 nm Sample: 1. Diphenhydramine 2. MPPH 3. Diazepam

Page 44

Parte 4 : UltraSlica Ultra-Pura

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PRODUO DE SLICA GEL Mtodo Convencional

Tipo A
M2O - nSiO2

Mtodo Otimizado
Tipo B

[-Si (OH)2 - O Si (OH)2- O -]n

- Si - O - Si - O O O - Si - O - Si - O -

M= Na, K, Fe

Si (OC2H5)4 [-Si (OC2H5)2 - O Si (OC2H5)2 - O -]n

- Si - O - Si - O O O - Si - O - Si - O -

SiO2(Na, K, Fe)

SiO2
Page 46

DIFERENAS

Teor de metais em g/L Sdio LiChrosorb LiChrospher 340-400 150-250 1 Clcio 1300 6-10 1 Magnsio 160-220 4-6 1 Ferro 20-25 20-40 3 Alumnio 15-20 75-140 1

Purospher Purospher STAR

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INFLUNCIA DOS METAIS

Impurezas metlicas da slica pH > 3,0
ons metlicos Grupos silanol
O H

Na + - O
H H

Si

Si

livre

O H

Fe
OH Si O Si OH O O O OH Si O Si O OH

2+

-O Si O Si

Si O H

geminal

H
O O O OH Si O Si

Me
O Si

rix at

Si O H Si O H
vicinal

Page 48

AGENTES QUELANTES

OH OH

OH

Purospher STAR RP-18 e

1.

OH

OH

Purpurin

Quinizarin

2.

Chromatographic conditions: Mobile phase: buffer Flow rate: Detection: Temperature: Sample: Methanol / 20 mM Phosphate pH 3,0; 75:25 (v/v) 1.0 ml/min UV 254 nm 30 C 1.) Purpurin 2.) Quinizarin

10

RP-18 convencional

2.

10
Page 49

OTIMIZAO DA MODIFICAO FUNCIONAL

Modificao bifuncional de SiO2
OH Si OH O Si OH O Si OH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 Si CH2 CH2 CH2 CH2 C6H13

CH3

O Si

OH CH3 OH Si O O Si OH O

Si O Si Si O CH3 O CH3 Si O Si O CH3 O O Si CH3 Si O Si O CH3 OH Si OH

Modificao bifuncional

ODS-2
Page 50

INFLUNCIA DA DESATIVAO

RP-18 convencional
1
.

CH3

20

40

Purospher
1 2

RP-18 e

Piridina (1)

2-Metilpiridina (2)

Chromatographic Conditions:
Mobile phase: Flow rate: Detection: Temperature: 40
Page 51

Methanol / Water 55:45 (v/v) 1.0 ml/min UV 254 nm 35 C

20

PROCAINAMIDAS
Aplicao
3

Purospher RP-18e

Column: LiChroCART 125-4 Purospher RP-18 e, 5 m Mobile phase: Methanol / 0.02 M Phosphate buffer pH 7.6 40:60 (v/v)

0 1 2

7,5 3

15

Flow rate: Detection:

0.5 ml/min UV 254 nm 30 C 1.) Uracil 2.) Procainamide 3.) N - Acetylprocainamide

Slica RP-18 tipo A

Temperature: Sample:

7,5

15

Page 52

TESTE ENGELHARDT

3 6 1 7 2 5

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Thiourea Aniline Phenol 2,3 Dihydroxynaphthalene 4 - Ethylaniline Diethylphthalate N, N Dimethylaniline Toluene Ethylbenzene
8

t0
basic acidic chelating basic neutral basic neutral neutral Chromatographic Conditions:
Column: Purospher RP18e 4 mm x 125 mm Mobile Phase: Methanol/Water 55/45 (v/v)
9

Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: ambient Detection:

12

24 min

UV 254nm
Page 53

APLICAES COM SLICA ULTRA-PURA

Page 54

QUARTA GERAO DE COLUNAS

Purospher STAR HPLC Columns

- vantagens e comparao com sorbentes clssicos

Page 55

QUARTA GERAO DE COLUNAS

Primeira Gerao (1970): LiChrosorb
- a primeira coluna para HPLC; partculas irregulares; 1 fase reversa RP18.

Segunda Gerao (1980): LiChrospher, Superspher

- partculas esfricas de 4 e 5 m com seletividade otimizada.

Terceira Gerao (1990): Purospher

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partculas esfricas. - Excelente simetria de picos.

Quarta Gerao (2000): Purospher STAR

- partculas esfricas de 3 m e 5 m, maior eficincia de separao. - Seletividade completa - Maior estabilidade de pH: 1.5 a 10.5.
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QUARTA GERAO DE COLUNAS

Caracterizao cromatogrfica Modificao monomrica e polimrica dos silanis

ODS-3
Page 57

QUARTA GERAO DE COLUNAS

As colunas a base de slica normal resistem a um pH entre 2-7,5. Abaixo do limite de pH, ocorre hidrlise dos silanis desativados. Acima do limite de pH, temos a solubilidade da slica.

Purospher - 2.0 a 7.5 Purospher Star - 1.5 a 10.5

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QUARTA GERAO DE COLUNAS

Teste de Tanaka
A: k (Pentyl benzene) 9.59 B: (Pentyl-/ Butyl benzene) F 0,0 1.51 C: (Triphenylene/ o-Terphenyl) 1.63 Capacidade de D: (Caffeine/ Phenol) troca inica (E,F) 0.44 E: (Benzylamine/ Phenol; pH7.6) 0.23 0,0 E F: (Benzylamine/ Phenol; pH2.7) 0.02

Capacidade (A) A 9,0

6,0

Hidrofobicidade (B)
1,6

0,3

3,0 0,6
1,4 0,8

1,5

0,4

1,2 1,0

1,8 2,4 C

0,6

0,2

Seletividade Estrica (C)

Capacidade dos silanis (D)

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QUARTA GERAO DE COLUNAS

Purospher STAR RP-18e, 5m

A
9,0

Competitor-Z
A 10 F
F

Competitor-S
A 10
F

Competitor-P
A 10

6,0

0,0
0,3

1,6

3,0 0,6
1,4 0,8

1,5

0,4
0,0

1,2 1,0

1,8 2,4 C

E
0,6

0,2

Competitor-L A
10 F B
F

Competitor-N
A 10

Competitor-I A
10 F
B

Competitor-D
A 10 B F

C E

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QUARTA GERAO DE COLUNAS

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QUARTA GERAO DE COLUNAS

Colunas de 3m para separaes rpidas com alta performance. Tocoferis
LiChroCART 55-4 Purospher STAR RP-18e, 3 m
4

LiChroCART 250-4 Purospher RP-18e, 5 m

1 3

2 1

0,0

5.0

10.0

0,0

15.0

30,0

Mobile phase: Flow rate: Detection: Temperature: Sample:

Methanol / Water 95:5 (v/v) 1.0 ml/min UV 280 nm 40C - Tocopherol (1), - Tocopherol (2), - Tocopherol (3), - Tocopherol Acetate (4)
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QUARTA GERAO DE COLUNAS

Dvidas em Colunas Particuladas para HPLC? Comentrios?

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Parte 5 : Monol Blocos Monolticos

Page 64

BLOCO MONOLTICO

Descubra a nova era cromatogrfica!

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BLOCO MONOLTICO

1.51463.0001 Chromolith Flash RP-18e (25 x 4.6 mm) 1.51450.0001 Chromolith SpeedROD RP-18e (50 x 4.6 mm) 1.02129.0001 Chromolith Performance RP-18e (100 x 4.6 mm)
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BLOCO MONOLTICO Estrutura porosa bimodal definida

Vista de seco axial do bloco monoltico

Mesoporos: 13 nm

Macroporos: 2m
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Page 68

BLOCO MONOLTICO

Bastes monolticos de slica

Envoltos por polmero

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BLOCO MONOLTICO

Page 70

BLOCO MONOLTICO
Tipo de slica: Tamanho da partcula: Tamanho do mesoporo: rea Superficial: Volume de poro: Modificao: % de Carbono: Cobertura Superficial: Estabilidade de pH: Porosidade Total: Alta pureza bloco monoltico 130 (13 nm) 300 m2/g 1 ml/g RP-18 endcapped 18 % 3.6 mmol/m2 2 7.5 >81%
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Tamanho do macroporo: 2 m

BLOCO MONOLTICO
Chromolith X colunas de material particulado 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8
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Retropresso oferecida (bar)

Coluna X: Coluna S: Coluna Z:

5m 5m 5m

Chromolith Performance

Fluxo (mL/ min)

BLOCO MONOLTICO

1. Retropresso muito menor

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BLOCO MONOLTICO
2 1 3 4 5

Chromolith Performance RP-18e 100 mm x 4.6 mm 5 -Bloqueadores

1 mL/min - 17 bar
Mobile Phase Flow rate Detection Sample Acetonitrile/ 0.1% TFA in water (20(80; v/v) 1-9 ml/min 222 nm 1. Atenolol 2. Pindolol 3. Metoprolol 4. Celiprolol 5. Bisoprolol

5 mL/min - 85 bar

9 mL/min - 153 bar

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BLOCO MONOLTICO
2 1 3 4 5 1 3 2 4

1 mL/min - 17 bar

0.0

1.5

9 mL/min - 153 bar 5 mL/min - 85 bar

12
9 mL/min - 153 bar
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BLOCO MONOLTICO 1. Retropresso muito menor = anlises mais rpidas

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BLOCO MONOLTICO
Tocol
0 0.1

Alpha.tocopherol

Alpha.tocopherol
0.2

Tocol

0.1

0.2

0.3 min

0.3 min

Chromolith Speed ROD 7 ml/min

Chromolith Speed ROD 10 ml/min

Cortesia de Dr. Thomas E Gundersen AS Vitas, Noruega

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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises mais rpidas 2. Comprimento da coluna no limitado pela presso

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BLOCO MONOLTICO
6

Picos mal resolvidos???

Column Chromolith SpeedROD RP-18e 50-4.6mm Mobile A: Acetonitrile phase B: Water Gradient Time/min %A %B 0,0 10 90 3,0 50 50 4,5 50 50 Flow rate 4 mL/min Detection UV 220 nm Temp. ambient Inj.Volume 10 L Sample 1. Prednisolone 2. Cortisone 3. Nortestosterone 4. Estradiol 5. Testosterone 6. Corticosterone 7. Estrone 8. Progesterone

2 1

5 8 7 4

0,0

2,0

4,0 min
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BLOCO MONOLTICO
6 Column 2 colunas Chromolith Performance RP-18e 100-4.6mm Mobile A: Acetonitrile phase B: Water Gradient Time/min %A %B 0,0 20 80 7,0 90 10 Flow rate 3 mL/min Detection UV 220 nm Temp. ambient Inj.Volume 10 L Sample 1. Prednisolone 2. Cortisone 3. Nortestosterone 4. Estradiol 5. Testosterone 6. Corticosterone 7. Estrone 8. Progesterone

2 1

3 5 7 4 8

0,0

3,5

7,0 min
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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises mais rpidas 2. Comprimento da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo de picos

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ACESSRIOS

1.51467.0001 Acoplador para Chromolith

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BLOCO MONOLTICO
Column Chromolith Performance 1x Chromolith Performance 2x Chromolith Performance 3x Chromolith Performance 4x Chromolith Performance 5x Particulate 5 m Competitor X Particulate 5 m Competitor Z Particulate 5 m Competitor L Particulate 3.5 m Competitor X Particulate 3.5 m Competitor Z Particulate 3.5 m Competitor L Length (mm) 100 200 300 400 500 250 250 250 150 150 150 Back pressure (bar) 30 60 90 120 150 320 210 220 330 260 400 Plate Number N (Anthracene) 10.000 19.000 27.000 35.000 41.000 16.000 17.500 18.500 11.500 14.000 19.000
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[dimetro: 4.6 mm, fase mvel: acetonitrila/gua (60/40; v/v), fluxo: 3 mL/min, temperatura: 25 injeo: 10 L de antraceno (10 g/mL)]. C,

BLOCO MONOLTICO

1 metro de coluna: 10X Chromolith Performance

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BLOCO MONOLTICO
6 5 7

14 x Chromolith Performance

100-4.6mm = 1.4 metro

2

3 4

108 000 N/coluna !!!

117 bar
1

ACN/ gua (80/ 20; v/v)

30

60 min

1. Tiuria, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. Etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno

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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises muito mais rpidas 2. Tamanho da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo 3. Bloco monoltico de slica muito resistente

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BLOCO MONOLTICO 1. Presso muito menor = anlises muito mais rpidas 2. Tamanho da coluna no limitado pela presso = melhor resoluo 3. Bloco monoltico de slica muito resistente = maior vida til

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PR-COLUNAS

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TEMPERATURA MXIMA
4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 No. of injections
[temparature: 45 mobile phase: acetonitrile/water (60/40; v/v); flow rate: 2 mL/min, injection volume: 10 L] C;
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C apacity factor k'

Progesterone Anthracene

BLOCO MONOLTICO

Website da Chromolith: www.chromolith.com chrombook.merck.de

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BLOCO MONOLTICO

Especificaes USP28 L1 L3 L7 L8 L10 L20

Recheio RP-18 Si RP-8 NH2 CN Diol

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ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROM

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BLOCO MONOLTICO

Dvidas sobre Blocos Monolticos? Comentrios?

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MUITO OBRIGADO PELA ATENO!

(...) No fim, tudo d certo... Se ainda no deu certo, porque no chegou ao fim.
Trecho retirado de O Encontro Marcado (Fernando Sabino).

(11) 9940-0807 (11) 3346-8558 daniel.c.teixeira@merck.com.br

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