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Editorial

Las decisionesagropecuario, en investigacinmbitos de Like in other areasandsociety, investmentbased on avaide inversin y desarroof decisions for llo en el sector como en otros agricultural research development are
la sociedad, pasan por disponer de estimaciones sobre el riesgo y los potenciales beneficios de la inversin, as como de anlisis de los impactos obtenidos con la aplicacin por parte del productor, de conocimientos y tecnologas generados. Abordar con xito este tipo de reto requiere contar con sistemas bien desarrollados de investigacin y transferencia de tecnologa, cuya existencia es a su vez, prerrequisito para el adecuado desarrollo del sector agropecuario. Colombia se destaca en el contexto de pases de Amrica Latina y el Caribe por el avance en la conformacin de fondos parafiscales que pueden alimentar la inversin en ciencia y tecnologa para el sector agropecuario. Sin embargo, salvo pocas excepciones, en la mayora de las cadenas productivas no se dispone de recursos para investigacin en la magnitud requerida, y adicionalmente la transferencia de tecnologa ya no dispone de la financiacin requerida. Con excepcin del Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria de Argentina, en general las instituciones de investigacin agropecuaria de la regin muestran debilitamiento o extincin de sus programas de extensin y transferencia de tecnologa. Este es el resultado de la escasa financiacin en los presupuestos institucionales o en los fondos competitivos. Hoy, nicamente se apoya y de forma parcial, la difusin de resultados de proyectos, pero sin posibilidades de seguimiento posterior para verificar la adopcin y evaluar los beneficios. Persiste, pues, en el sector agropecuario una demanda de tecnologa insatisfecha para mltiples productores. La economa de mercado de alguna manera viene presionando cambios en las polticas de financiacin pblica de la transferencia de tecnologa agropecuaria. sta deja de ser un servicio gratuito al productor para convertirse en un servicio mercadeable. En este nuevo contexto, el productor espera recibir un producto o servicio a la medida de sus necesidades. En ese sentido, el enfoque de la transferencia de tecnologa en Corpoica se va ajustando a las nuevas tendencias, adoptando esquemas diversificados de divulgacin masiva, llegando a pblicos ms amplios con creciente soporte de nuevas tecnologas de la informacin y la comunicacin, e incursionando en el mercadeo de tecnologas agropecuarias. En el marco de estas polticas, ofrecemos una nueva edicin de la Revista Corpoica. Nuestro reto es seguir avanzando hacia estndares cada vez ms altos en la calidad de los contenidos y llegar a un nmero cada vez mayor de lectores. Jairo A. Osorio, Ph.D. Director
2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

lable estimations of risks and potential benefits for such investments, as well as on sound analysis of the impact caused by knowledge and technologies previously generated and applied by producers. In order to successfully deal with this challenge, well structured research and technology transfer systems have to be in place, since their very existence is a prerequisite for the agricultural sector to have a more balanced development. Among Latin-American and Caribbean countries, Colombia is recognized for its progress achieved with commodity tax funds. These funds help financing science and technology in agriculture. However, with few exceptions there are not sufficient resources for research while funding for technology transfer programs is virtually non-existing. With the exception of the Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria in Argentina, agricultural research institutions in the region exhibit very weak technology transfer and extension programs. In some cases, these programs have vanished, as consequence of limited institutional budgets or low priority in competitive funds. The only technology transfer activities which are at least partially funded are those related to diffusion and delivery of results, while the follow up assessments of adoption and impact measurement are not considered for financial support. Multiple needs for technology transfer to farmers remain to be fulfilled. Market economy is somehow triggering important changes in policies related to public funding of technology transfer in agriculture. Technology transfer is progressively losing its free service nature, and is becoming a marketable service. Under these circumstances, the producer should receive services or technologies suited to his specific needs. Accordingly, Corpoica is considering these trends to focus its technology transfer strategies on diversified and massive diffusion and communication schemes, greater coverage through the use of information and communication technologies, and increasing efforts on technology marketing. As a part of this institutional policy we offer a new edition of the Revista Corpoica. Our challenge is to advance constantly toward higher quality standards, and reach greater numbers of readers. Jairo A. Osorio, Ph.D. Director

ISSN 0122-8706 Volumen 10 - No. 1 enero - junio, 2009


La Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria se encuentra referenciada e indexada internacionalmente en AGRIS (http://www.fao.org/agris) y en las bases de datos de CABI: CAB Abstracts, CAB Full databases y CAB Health (http://www.cabi.org) y forma parte del ndice Publindex de Colciencias en la categora "B". La versin electrnica de la revista puede consultarse en texto completo en http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/Revistas/Revistas.asp

Contents
Editorial Plant physiology Phenology of pea crop (Pisum sativum L. var. Santa Isabel) in the Bogot plateau at open field and under plastic cover Integrated pest management A laboratory method for rearing Andean potato weevil Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae) Evaluation of Spodoptera complex behavior with the introduction of transgenic cotton in Tolima, Colombia Plant genetic resources Agrobiodiversity genetic resources conservation for the development of sustainable production systems Animal genetic resources Allelic frequencies for SNP variants in the gene Nramp1 in bovine infected with Brucella abortus or classified by resistance to the pathogen Animal physiology Effect of seminal plasma proteins at freezing on ram sperm motility and viability Biophysics resources Evaluation of agroforestry arrangements in cattle exploitations of the micro region Bajo Magdalena Standardization of a complex culture media for multiplication of C50 Rhizobium sp. strain Animal nutrition Effect of the offer of kikuyu grass and oat silage on milk bovine production and quality composition Comparison of three methods for the cryopreservation of Leptospira strains in Liquid Nitrogen Evaluation of three native Colombian yeasts as feed additives for broilers Aims and scope, Editorial policies and Authors guidelines Measurement units, abbreviations and symbols Subscription form

Contenido
1 Editorial Fisiologa vegetal 5-15 Fenologa del cultivo de arveja (Pisum sativum L. var. Santa Isabel) en la sabana de Bogot en campo abierto y bajo cubierta plstica Julio Ricardo Galindo Pacheco, Jairo Clavijo Porras

Manejo integrado de plagas 16-23 Mtodo de cra en laboratorio del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae) Ricardo Prez, Jennifer Garza, Jorge Argelles-Crdenas Evaluacin del comportamiento del complejo Spodoptera con la introduccin de algodn transgnico al Tolima, Colombia Oscar Santos Amaya, Oscar Delgado Restrepo, Jorge Argelles, Elizabeth Aguilera G.

24-32

Recursos genticos vegetales 33-42 Conservacin de recursos genticos de la agrobiodiversidad como apoyo al desarrollo de sistemas de produccin sostenibles Mario Lobo Arias, Clara Ins Medina Cano

Recursos genticos animales 43-50 Frecuencias allicas para variantes SNP en el gen Nramp1 en bovinos infectados con Brucella abortus o clasificados por resistencia al patgeno Fernando Cerquera M., Rodrigo Martnez S., Rubn Toro O., Jaime Tobn C., Jaime Gallego G., Esperanza Rueda

Fisiologa animal 51-59 Adicin de protenas del plasma seminal ovino durante la congelacin del espermatozoide y efectos sobre su motilidad y viabilidad Jaime Antonio Cardozo, Patricia Grasa, Mara Teresa Muio B., Jos lvaro Cebrin P.

Recursos biofsicos 60-69 Evaluacin de arreglos agrosilvopastoriles en explotaciones ganaderas de la microrregin Bajo Magdalena Belisario Roncallo Fandio, Justo Barros H., Ruth Bonilla B., Jos Murillo, Ramiro Del Toro Estandarizacin de un medio de cultivo complejo para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp. Daniel Fernando Rojas T., Mara Fernanda Garrido R., Ruth Rebeca Bonilla B.

70-80

Nutricin animal 81-90 Efecto de la oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena sobre la produccin y calidad composicional de la leche bovina Jos Edwin Mojica R., Edwin Castro R., Javier Mauricio Len C., Edgar Alberto Crdenas R., Martha Luca Pabn R., Juan Evangelista Carulla F. Balance de nitrgeno en pastura de gramneas y pastura de gramnea ms Lotus uliginosus en la sabana de Bogot, Colombia Ligia Denise Torres Higuera, Diego Ortiz Ortega, Jos Luis Rodrguez Bautista, Roco Esperanza Patio Burbano Evaluacin de tres levaduras provenientes de ecosistemas colombianos en la alimentacin de pollos de engorde Natalia Lpez Hernndez, Germn Afanador Tllez, Claudia Janeth Ariza Nieto Objetivos y alcance, Poltica editorial e Instrucciones a los autores Unidades de medida, abreviaturas y smbolos Formato de suscripcin

91-101

102-114

115 119 123

2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

F i s i o lo g a A R t c u lo c I e N t F I co

v e g e ta l

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 5-15

Phenology of pea crop (Pisum sativum L. var. Santa Isabel) in the Bogot plateau at open field and under plastic cover

Fenologa del cultivo de arveja (Pisum sativum L. var. Santa Isabel) en la sabana de Bogot en campo abierto y bajo cubierta plstica
Julio Ricardo Galindo Pacheco1, Jairo Clavijo Porras2
RESUMEN

The assessment of environment effects on plant development is important to identify suitable zones and schedule crop production. In this research, plant development of pea (Pisum sativum L. var. Santa Isabel) was evaluated under Bogot flat highland, Colombia, environmental conditions (2640 m over sea level, 14C, 80% R.H., rainfall of 800 mm/year). Two experiments were done under plastic cover (21C 2,5C, mean SD), and two at open field (13,9 1,2C). Following variables were evaluated: time to emergence, cycle duration from sowing to harvest, total nude number at harvest and flowering nude number at harvest. It was shown that temperature under plastic cover accelerate plant emergency in 10 days and reduce phyllochron from 3,05 to 2,72 day/node, so the flowering time was accelerated between 15 and 20 days. Node rate appearance did not change from the vegetative to reproductive stage. The results confirm the dent-like model of pea plant growth responses to temperature regimes, so the crop growth had a maximum at a plateau in a temperature range which could be between 14C and 21C. Keywords: Phyllochron, degree days, solar radiation, pod number, apparent nodes.

ABSTRACT

La valoracin del efecto del ambiente en el desarrollo de los cultivos es importante para la determinacin de zonas aptas y la planificacin de la produccin. En esta investigacin se realizaron cuatro ensayos para evaluar el desarrollo de las plantas de arveja (Pisum sativum L.) variedad Santa Isabel en condiciones de la sabana de Bogot, Colombia, (2640 msnm, 14C, 80% H.R., 800 mm de lluvia anual), tema sobre el cual no hay informacin. Se realizaron dos ensayos bajo cubierta plstica (21C 2,5C, promedio DE) y dos a campo abierto (13,9C 1,2C). Se evalu el tiempo de la siembra a la emergencia, la tasa de aparicin de nudos en el tallo principal, el inicio de la floracin, la duracin del ciclo de la siembra hasta la cosecha, el nmero de nudos totales en la cosecha y el nmero de nudos con flor. Se encontr que la temperatura bajo cubierta plstica aceler en 10 das la emergencia de las plantas y redujo el filocrn de 3,05 a 2,72 das/nudo, lo cual a su vez adelant el momento de floracin y cosecha entre 15 y 20 das. La tasa de aparicin de nudos no vari significativamente por el cambio de la fase vegetativa a reproductiva. Los resultados contribuyeron a respaldar el modelo dentado de desarrollo vegetal en funcin de la temperatura para arveja, segn el cual el crecimiento es mximo en un rango de temperatura ptima, que se sugiere est entre los 14C y 21C. Palabras clave: filocrn, grados da, radiacin solar, nmero de vainas, nudos aparentes.
INTRODUCCIN

mt, Chemical) (Meier, 2001), el desarrollo fenolgico de la planta de arveja se puede describir con los siguientes estadios: germinacin, desarrollo de hojas, crecimiento longitudinal de entrenudos, aparicin del rgano floral, floracin, formacin y maduracin de vainas, senescencia. Se acepta comnmente que la duracin de cada uno de estos estadios depende en primer lugar de las condiciones de temperatura. Cuando la temperatura es ptima para el desarrollo vegetal, el organismo cumple su ciclo de vida en un mnimo de tiempo. Si la temperatura est por encima o por debajo del ptimo, el desarrollo se hace ms

Segn la escala BBCH (Bundesanstalt, Bundessortena-

Radicado: 4 de marzo de 2009 Aprobado: 27 de abril de 2009

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I.A. Ph.D. Investigador, Corpoica, Bogot, jgalindo@corpoica.org.co I.A. Ph.D. Profesor catedrtico, Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, jairocla@yahoo.com

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lento y puede detenerse, ya sea porque la temperatura es muy baja (igual o inferior a la temperatura base) o porque es muy alta (igual o superior al punto de tolerancia). Se maneja entonces el concepto de grados da (C d) para calcular la edad fisiolgica de los cultivos, acumulando desde la siembra la diferencia entre la temperatura promedio de cada da y la temperatura base, siempre que el promedio no exceda el mximo de tolerancia. Esta aproximacin permite una mejor prediccin de los cambios de estado en el desarrollo vegetal en ambientes con temperatura variable (Miller et al., 2001, Stckle et al., 2003). Segn Miller y colaboradores (2001) la duracin de algunos de los estados fenolgicos de la arveja, contada en grados da (C d) a partir de la siembra, oscila entre 198 y 230 para el estado de dos hojas expandidas, 724 y 835 para una floracin del 50% de las plantas, 1305 y 1451 para que las semillas comiencen a madurar en un 10%, y 1527 y 1686 para la madurez completa. En otras especies de leguminosas se observa tambin que la temperatura es el factor determinante en la fenologa. Butler y colaboradores (2002) observaron que en trbol rojo (Trifolium incarnatum L.) la temperatura es el factor primario que controla la tasa de aparicin foliar, ms que la duracin del fotoperiodo. Dicha tasa de aparicin foliar no fue diferente entre los cultivares de maduracin intermedia y tardos; adems, la relacin que obtuvieron entre la tasa de aparicin foliar y la temperatura se ajust a modelos cuadrticos, que lograron un r2 entre 0,90 y 0,99. Un evento importante en la fenologa de los cultivos es el inicio de la floracin, cuyo momento puede variar de acuerdo con la susceptibilidad del material vegetal a la temperatura y al fotoperiodo. En arveja, algunas variedades requieren nicamente de un fotoperiodo favorable, otras de una conjugacin de temperatura y fotoperiodo; incluso hay algunas que son insensibles al fotoperiodo (Arjona et al., 1977; Wilson y Robson, 2006). En otras leguminosas se observa tambin el efecto conjugado de la temperatura y el fotoperiodo. Jones y colaboradores (1991) desarrollaron un modelo de desarrollo de la floracin de la soya con base en la temperatura y el fotoperiodo. Sin embargo, en condiciones de zona templada, la variacin de temperatura y fotoperiodo generalmente van asociadas. Siddique y colaboradores (2002) obtuvieron que la siembra tarda de la arveja en el Reino Unido se asociaba con das largos y calurosos, condiciones que aceleraron la maduracin de las plantas y condujeron a una cosecha reducida. Roche y colaboradores (1999) probaron diferentes modelos para predecir el inicio de la floracin en arveja, utilizando como factores el fotoperiodo, la temperatura promedio, la latitud y la fecha de siembra. El mejor ajus-

te por mnimo cuadrado medio del error de prediccin (CMEP) se obtuvo incluyendo todos los factores excepto la temperatura. Sin embargo, la latitud y la fecha de siembra estuvieron correlacionadas con la variacin estacional de la temperatura y el fotoperiodo. Genticamente, en arveja la aparicin de la floracin est controlada por seis genes. Tres de ellos (Sn, Dne, Ppd) se asocian con la respuesta de la planta al fotoperiodo. El gen Hr se encarga de prolongar la expresin de los genes asociados con el fotoperiodo, mientras que el gen E reduce en los cotiledones la actividad de los cuatro primeros genes mencionados. El gen Lf, con cuatro alelos, gobierna la sensibilidad de la yema apical para la seal de floracin y determina el nmero mnimo de nudos para iniciar la floracin (Alcalde et al., 2000). Una vez ocurrida la floracin, existe un momento o fase fenolgica en el cual se define el nmero de semillas que produce una vaina. Poggio y colaboradores (2005) estimaron que esta fase comienza con el inicio de la floracin y termina cuando el ltimo nudo floral finaliza la etapa susceptible al aborto de semilla; y encontraron que la duracin de esta fase fue de 200C d con una temperatura base estimada en Tb = 4C. La temperatura adems de afectar el desarrollo fenolgico de la planta, tambin afecta directamente el crecimiento en cuanto altera la respuesta de las enzimas que intervienen en la fotosntesis (Bernacchi et al., 2001; Farquhar et al., 1980; Farquhar et al., 2001). Adems, la actividad de las bacterias simbiticas presentes en las races de arveja tambin se ve afectada. Temperaturas extremas, por encima del ptimo, favorecen la senescencia (Nooden et al., 1997). En el presente artculo se muestra el resultado de la evaluacin del efecto del clima en el desarrollo de la planta de arveja en cuanto a la tasa de aparicin de nudos, el inicio de floracin, el nmero de nudos totales y nudos reproductivos. Los factores climticos evaluados fueron la temperatura, comparando la condicin bajo cubierta plstica con la de campo abierto, y la radiacin incidente. Estos parmetros son tiles para el desarrollo de modelos de simulacin y la planificacin de la produccin con base en la oferta ambiental (Boote, 1995a y 1995b; Goudriaan et al., 1995; Marcelis et al., 1998), de lo cual actualmente no hay informacin para las condiciones colombianas.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Esta investigacin se llev a cabo en el municipio de Mosquera, Cundinamarca (2543 msnm), donde se realizaron cuatro ensayos para la evaluacin del crecimiento del cultivo de arveja: tres en el Centro Agropecuario Marengo (CAM) de la Universidad Nacional de Colombia y uno
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en el Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CNIA) Tibaitat, de Corpoica. Dos de los ensayos se instalaron en condiciones bajo cubierta plstica y dos en campo abierto (figura 1). La siembra del ensayo bajo cubierta plstica del CNIA Tibaitat se hizo a una densidad de 12,5 plantas/m2 y profundidad de siembra de 2 cm, en una parcela de 10 m2. El ensayo bajo cubierta plstica del CAM se sembr a una densidad de 12,3 plantas/m2 y profundidad de siembra de 2 cm, en una parcela de 200 m2. El ensayo en campo abierto del lote 7 del CAM se sembr a 9,1 plantas/m2 y profundidad de siembra de 2 cm, en 2000 m2 de terreno. El ensayo en el lote 8 del CAM se sembr a una densidad de 8,3 plantas/m2 y 3 cm de profundidad, en un rea de 2000 m2. La fertilizacin del cultivo se estableci con base en los resultados del anlisis qumico del suelo y los requeri-

mientos de la planta. Se realizaron prcticas de proteccin del cultivo con agroqumicos contra plagas y enfermedades. Entre las plagas se encontraron especialmente trozadores (Agrotis, Spodoptera) y babosas (Arion sp.), y entre las enfermedades, las causadas por Ascochyta pisi y Fusarium spp., los cuales fueron controlados por medios qumicos. En los ensayos de campo abierto se aplic riego por aspersin cuando hubo perodos secos durante el ciclo del cultivo, y en los ensayos bajo cubierta plstica, se aplic riego por goteo segn necesidad de la planta. Evaluacin del desarrollo Para el seguimiento al desarrollo de los cultivos se marcaron plantas a la emergencia y se evaluaron semanalmente el nmero de nudos visibles, primer nudo del tallo con flor y nmero de nudos en el momento de la cosecha. Para los ensayos de campo, se tomaron 32 puntos ubicados en

Figura 1. Ubicacin de los ensayos de arveja: A. Cubierta plstica tipo tnel en el CNIA Tibaitat, ensayo IT-2004a. B. Cubierta plstica tipo capilla en el Centro Agropecuario Marengo, ensayo IC-2004B. C. Campo abierto lote 8 del Centro Agropecuario Marengo, ensayo L8-2004B. D. Campo abierto lote 7 del Centro Agropecuario Marengo, ensayo L7-2005A. Se aprecia el tutorado de colgadura en todos los casos

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los nodos de una cuadrcula imaginaria de 25 x 25 m, con dos plantas marcadas por punto. Para los ensayos bajo cubierta plstica, se marcaron 12 puntos y dos plantas por punto para hacer el seguimiento respectivo. Evaluacin de variables climticas Se cont con informacin climtica de la Estacin Agrometeorolgica Tibaitat, la ms cercana al Centro Agropecuario Marengo (1,5 km), en cuanto a brillo solar, temperatura, humedad relativa, evaporacin y precipitacin. Tambin se evalu la precipitacin en el lote con ayuda de un pluvimetro artesanal. En la condicin bajo cubierta plstica en el CNIA Tibaitat, se cont con un termmetro de mximas y mnimas (Buttler et al., 2002) adems de la informacin de la estacin meteorolgica mencionada. Con estos registros se pudo establecer el aumento de temperatura bajo cubierta plstica respecto al ambiente exterior. Respecto a la temperatura del suelo, se tuvo en cuenta que segn Soltani y colaboradores (2006), cuando la temperatura del aire es mayor a 3C, la diferencia entre la temperatura del suelo y la temperatura ambiente es muy pequea. Se encontr que por un aumento en un grado de la temperatura en el aire, el suelo aumenta en 1,05C. Por lo tanto, utilizar la temperatura del aire para estimar el tiempo de emergencia en grados da no induce mayor error. La radiacin solar incidente en megajulios por da (MJ d-1), que se requiere para calcular la fotosntesis de la planta, se calcul para cada uno de los ciclos de cultivo con base en las horas da de brillo solar. Para este fin se tom la informacin de la estacin meteorolgica El Dorado (distante a 6,7 km) y se aplic el anlisis de regresin para determinar la relacin de la radiacin solar en funcin del brillo solar. Clculo de los grados da Los grados da o grados da de crecimiento (Miller et al., 2001; Juskiw et al., 2001) se calcularon de la siguiente manera: (Tm > Tb C) (1)

y colaboradores (2001) afirmaron que para los cultivos de estaciones fras en Montana, Estados Unidos, entre los cuales est la arveja, una temperatura base de 0C resulta adecuada. Sin embargo, en las ecuaciones 1 y 2 se asume una respuesta lineal a la temperatura, lo cual se cumple hasta una temperatura mxima dada, variable segn la especie vegetal. Soltani y colaboradores (2006) utilizaron tres tipos de funciones para describir la relacin entre la temperatura y el crecimiento vegetal: segmentada, dentada y curvada asimtrica (tipo funcin beta). En general, cuando se sobrepasa la temperatura ptima para el crecimiento vegetal, un aumento adicional de la temperatura resulta contraproducente y reduce la tasa de crecimiento. Sin embargo, para la funcin dentada, el crecimiento vegetal es mximo para un rango de temperatura en el cual la actividad de las enzimas fotosintticas no se afecta considerablemente, como ocurre en soya, Glycine max L. (Vu et al., 2001). Estimacin del filocrn Con el nmero de nudos formados a travs del ciclo del cultivo para cada punto de muestreo en el cultivo, se estim la tasa de aparicin foliar y el filocrn, es decir, el tiempo que tarda en aparecer una nueva hoja. Se utilizaron das calendario y grados da (Juskiw et al., 2001; Massawe et al., 2003). En los ensayos a campo abierto, cada punto constituy un ambiente diferente, especialmente por las condiciones de suelo, por lo cual se evaluaron separadamente. La tasa de aparicin foliar se estim por mnimos cuadrados en la relacin del nmero de nudos en funcin del tiempo (Brown y Moot, 2004). Los resultados por ensayo se analizaron con estadsticas descriptivas univariadas. Las diferencias de promedios entre ensayos se valoraron por medio de pruebas t, al 5% de significancia. Duracin de los estados fenolgicos El momento de la emergencia del cultivo se determina cuando 50% de las plntulas aparece sobre el suelo. Como el seguimiento del cultivo de arveja se hizo semanalmente, el da de emergencia se estim por regresin, con el intercepto en el eje de las abscisas de la curva de formacin de hojas en el tiempo (Soltani et al., 2006). El inicio de la floracin se asoci con la aparicin del primer nudo con botn floral en el 50% de las plantas observadas. El tiempo de cosecha se defini respecto a la primera recoleccin de vainas, la cual corresponde generalmente a la produccin del tallo principal de las plantas.
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Cuando la temperatura media Tm es disponible, o cuando se dispone de la mxima y mnima: ((Tmax + Tmin )/2>Tb C) (2)

Varios investigadores han utilizado como temperatura base Tb = 0C para calcular los grados da en arveja (Roche y Jeuffroy, 2000; Lecoeur y Sinclair, 2001). Miller

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Anlisis estadstico Para el anlisis estadstico de los resultados se utiliz el paquete SAS, versin 9. Se aplicaron estadsticas descriptivas para los parmetros fisiolgicos, incluyendo promedio, mediana, desviacin estndar (DE), rango intercuartlico (RIC) y prueba de normalidad de ShapiroWilks (SW). La tasa de aparicin de nudos se estim a partir del anlisis de regresin lineal del nmero de nudos en el tallo principal y el tiempo transcurrido en das despus de la siembra. Se aplicaron pruebas de homogeneidad de pendientes para la comparacin de los ensayos. Las pruebas de hiptesis respecto a los parmetros (coeficientes de regresin) o sus diferencias se evaluaron con un nivel de significancia del 5%.
R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

vari en menor proporcin, de 13,92C 1,15C (promedio DE), con una diferencia de un grado entre los dos ensayos, sin que se observara una tendencia significativa a aumentar o decrecer a lo largo del ao. Segn Fedecaf (1986) la temperatura ptima para el crecimiento de la arveja est entre los 15C y 18C, por encima de la cual la curva de crecimiento decrece aunque se sigue produciendo comercialmente hasta los 24C. Estimacin de la radiacin incidente sobre los cultivos Con informacin meteorolgica de la estacin El Dorado se obtuvo la relacin entre horas de brillo solar y radiacin solar. La radiacin solar estimada para los cuatro ensayos fue de 14,58 0,73 MJ m-2 d1 (promedio DE), con la ms alta en el ensayo bajo cubierta plstica del CAM (15,46 MJ m-2 d-1) y la ms baja en el ensayo bajo invernadero del CNIA Tibaitat (13,67 MJ m-2 d-1). Las fluctuaciones obedecieron principalmente a los cambios de nubosidad y no reflejaron ninguna estacionalidad que pudiera afectar diferencialmente los ensayos. Emergencia del cultivo En la tabla 1 se presentan los resultados de la estimacin del da de emergencia y la tasa de aparicin de nudos en el tallo principal de la planta de arveja, para cada uno de los ensayos. Tal como se observa para los cuatro ambientes evaluados, la diferencia ms importante entre la condicin bajo cubierta plstica y la de campo abierto es una aceleracin de la emergencia de las plantas. Por una diferencia de 7C en el ambiente se ganaron 10 das aproximadamente en condicin bajo cubierta.

Diferencias de la temperatura ambiente entre invernadero y campo abierto De acuerdo con los resultados de la evaluacin de la temperatura dentro y fuera del invernadero en condiciones del CNIA Tibaitat, se observ que el efecto de la cubierta plstica hizo aumentar la temperatura promedio en 7C respecto a una temperatura ambiente de 14C. Adems la variabilidad, expresada por la desviacin estndar, aument de la condicin de campo (1,07C) a ms del doble en invernadero (2,53C). La temperatura mxima bajo cubierta plstica aument en dos ocasiones a ms de 40C, lo cual fue adverso para el crecimiento de la planta de arveja. En cambio, en campo abierto la temperatura

Tabla 1. Estimacin del da de emergencia, tasa de aparicin de nudos y nudos totales del tallo principal de la planta de arveja en los cuatro ensayos experimentales
ensayo Cubierta plstica Tibaitat Parmetro Da de emergencia Nudos/d Nudos totales Da de emergencia Cubierta plstica CAM Nudos/d Nudos totales Da de emergencia Campo abierto L8 CAM Nudos/d Nudos totales Da de emergencia Campo abierto L7 CAM Nudos/d Nudos totales unidad da d-1 nmero da d-1 nmero da d
-1

n 10 10 22 12 12 12 32 32 54 32 32 64

Valor parmetro 14,6294 0,3799 22,3000 11,3329 0,3560 26,1667 23,8095 0,3170 22,5000 18,8104 0,3386 24,9219

De 4,4693 0,0347 2,4301 2,4376 0,0292 4,2817 2,9256 0,0187 3,2375 5,2061 0,0349 5,5128

SW 0,8200 0,8601 0,3784 0,9762 0,2682 0,4469 0,0198 0,0993 0,4480 0,0002 0,0004 0,0225

nmero da d-1 nmero

Se observaron diferencias significativas (p < 0,05) en la tasa de aparicin de nudos entre la condicin de campo abierto y bajo cubierta plstica segn la prueba t. DE: desviacin estndar; SW: valor p para la prueba de normalidad de Shapiro-Wilks.

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Tabla 2. Grados da a la emergencia de las plntulas de arveja variedad Santa Isabel para los cuatro ensayos
ensayo Cubierta plstica Tibaitat Cubierta plstica CAM Campo abierto L8 CAM Campo abierto L7 CAM n 10 12 32 32 Promedio 198,93 171,44 316,55 222,34 De 68,2118 85,2281 33,4103 59,6122 Mediana 187,41 191,28 316,26 222,76 Rango intercuartlico 33,7412 128,0606 28,1106 70,7580

En la tabla 2 se presenta para cada uno de los ensayos el tiempo entre la siembra y la emergencia expresado en grados da. Se observa una diferencia significativa en el tiempo de emergencia entre el ensayo a campo abierto en el lote 8 del CAM y los otros tres ensayos, especialmente con el de campo abierto en el lote 7 del CAM. Esta diferencia se explica en parte por la profundidad de siembra, la cual fue mayor en el primero. En el segundo ensayo se redujo la profundidad considerando la condicin de compactacin del suelo. Tal como observaron Soltani y colaboradores (2006) en garbanzo (Cicer arietinum L.), el efecto de la temperatura en la velocidad de emergencia depende de la profundidad de siembra; segn sus resultados, el requerimiento en das fisiolgicos aument en 0,9 das por cada centmetro de aumento en la profundidad de siembra, para un rango entre 2,5 y 14 cm de profundidad. A 5 cm de profundidad de siembra se requirieron 6 das fisiolgicos (94C d). La forma de la curva de respuesta del tiempo de emergencia se describi con una funcin dentada con un mnimo en 4,5C de base, una meseta de temperatura ptima entre 20,2C y 29,3C, y una mxima de 40C, por encima de la cual no hay emergencia. Tasa de aparicin de nudos en el tallo principal Con los datos del nmero de nudos visibles en el tallo principal de la arveja a travs del tiempo, se obtuvo una tendencia lineal positiva, cuya pendiente corresponde a la tasa de aparicin de nudos. De la tabla 1 se deduce que la tasa de aparicin de nudos en promedio para los cuatro ambientes fue de 0,3479 nudos/da, que corresponde a un filocrn de 2,87 das/nudo; pero se observaron diferencias significativas segn se trate de ensayos de campo o bajo cubierta plstica (p < 0,05 segn la prueba t). Esta tendencia se mantiene, mientras est activo el crecimiento del tallo, sin variaciones por efecto del cambio a la fase reproductiva que ocurri alrededor de los 74 das despus de la siembra (figuras 2 y 3). Cao y Moss (1989)

observaron un resultado similar en cebada de primavera (Hordeum vulgare L.), en cuanto que a una temperatura dada la aparicin de nuevas hojas sigui una tendencia lineal en funcin del tiempo, aunque se dieron diferencias en la tasa de aparicin foliar por efecto del genotipo y entre localidades por efecto de la temperatura. Como se puede deducir de la tabla 1, la tasa de aparicin de nudos es ligeramente mayor bajo cubierta plstica respecto a la condicin de campo. En promedio, se formaron 0,368 nudos/d bajo cubierta plstica, y 0,328 nudos/d a campo abierto, que en trminos del filocrn corresponden a 2,72 y 3,05 das, respectivamente. En otras palabras, para formar 24 nudos, en la condicin de invernadero se requieren 65 das, mientras que a campo abierto son 73 das. En la tabla 3 se presenta la estimacin de la tasa de aparicin de nudos expresada en grados da para los ensayos en condiciones de campo abierto. Se observ que la aparicin de un nuevo nudo tarda 42C d y 43C d, en para cada ensayo. En trminos del filocrn, se cuentan 3,15 y 2,95 das, respectivamente. Como no se conoce el rango ptimo de temperatura para la variedad de arveja trabajada, no se utilizaron los datos de los ensayos bajo cubierta plstica. La tasa de aparicin de nudos se mantuvo constante a lo largo del ciclo de cultivo, tanto para la fase de crecimiento vegetativo como para la fase reproductiva, sin importar el desarrollo foliar de la planta. Esto significa que la tasa de aparicin de flores y vainas tambin se mantuvo constante durante la fase reproductiva. Comparando los resultados de la tasa de aparicin de nudos de esta investigacin con las de otros autores tenemos que es superior a la observada por Wilson y Robson (2006) en una investigacin con variedades de

Tabla 3. Tiempo en grados da que tarda la aparicin de nudos (C / nudo) en el tallo de la planta de arveja var. Santa Isabel para dos ensayos en campo abierto (lotes 8 y 7 del CAM)
ensayo Campo abierto L8 CAM Campo abierto L7 CAM n 32 32 Promedio 41,97 42,98 De 2,5761 4,6078 Mediana 42,17 41,96 Rango intercuartlico 3,0475 4,0600

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Figura 2. Nudos aparentes en el tallo principal de la planta de arveja variedad Santa Isabel para cuatro ensayos: A. campo abierto CAM L8. B. campo abierto CAM L7. C. bajo cubierta plstica en el CNIA Tibaitat. D. bajo cubierta plstica en el CAM

arveja australiana, en la que dicha tasa estuvo entre 27,03C y 37,04C d/nudo tomando una temperatura base de 4,5C; adems, encontraron que el ascenso de la temperatura entre 6C y 16C promova la tasa de aparicin de nudos. Por otra parte, fue similar a la mencionada en investigaciones con otras especies leguminosas, como la de Massawe y colaboradores (2003) con nuez bmbara (Vigna subterrnea (L.) Verdc), en la que observaron en 10 materiales genticos que producir una hoja requiere 44,9C d (40,9C - 53,0C d, EE 1,2) acumulados con una temperatura base (Tb) entre 8,1C y 12C. En alfalfa (Medicago sativa L.), Brown y Moot (2004) obtuvieron un filocrn de 37C 7C d, excepto para los fotoperiodos en declinacin desde 15,7 a 11,4 h, en los cuales decreci de 60C a 37C d. Para su anlisis recurrieron a dos temperaturas base: una de 1C para cuando

Figura 3. Tasa de aparicin de nudos en el tallo principal de la planta de arveja var. Santa Isabel, en cuatro condiciones ambientales: dos bajo cubierta plstica (CAM, CNIA Tibaitat) y dos en campo abierto (lotes 8 y 7 del CAM)

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la temperatura ambiente fue menor a 15C, y otra de 5C para temperaturas mayores a 15C. En otras especies se encontraron resultados variables del filocrn. En papa, Fleisher y colaboradores (2006) obtuvieron que el filocrn tard 24,3C d/hoja, con la temperatura base de 4C y el mximo tolerable de 29C. En cebada (Hordeum vulgare L.), Juskiw y colaboradores (2001) observaron que el filocrn promedio en cinco cultivares fue de 69,1C d y en promedio cada planta desarroll 9 hojas. Se observa que la relacin entre la tasa de aparicin foliar y la temperatura sigue una funcin lineal para el rango de temperaturas entre la base y el ptimo. En maz, la tasa mxima de aparicin de hojas fue de 40C d/nudo, a la temperatura ptima de 34C (Kiniry y Jones, 1986; Kiniry, 1991). Esta tasa aument linealmente a partir de la temperatura base de 8C. En nuez Bmbara (Vigna subterranea (L.) Verdc), Massawe y colaboradores (2003) observaron que el valor del filocrn estuvo entre 40,9C y 53,0C, con una relacin lineal entre los 10C y 35C, con diferencias segn el material gentico. Hesketh y colaboradores (1973) demostraron un aumento lineal de la tasa de aparicin foliar de la soya para el rango de temperaturas entre 8C y 30C. Como la relacin entre la tasa de aparicin de nudos y la temperatura es lineal en estos casos, resulta posible estimar la temperatura base para algunas especies considerando los resultados de ensayos experimentales a diferentes temperaturas (Soltani et al., 2006). Salazar (2006) observ que la uchuva (Physalis peruviana L.) responde linealmente al aumento de la temperatura en cuanto a la tasa de aparicin de nudos, y de esta forma pudo estimar una temperatura base de 6,29C para este cultivo. Sin embargo, la linealidad de la respuesta a la temperatura en un intervalo es un supuesto que debe ser verificado para cada especie (Passian y Lieth, 1994). Los resultados en arveja variedad Santa Isabel que se ilustran en la figura 4 muestran que los puntos observados no permiten una extrapolacin adecuada para realizar la estimacin de la temperatura base con el modelo lineal (arrojara valores negativos); por el contrario, pueden plantearse muchas formas de unir estos puntos con diferentes modelos, adems del que se presenta en dicha figura. En algunas especies, la respuesta de la tasa de aparicin de nudos a la temperatura sigue una forma dentada, con un mximo en un rango de temperaturas variable. En condiciones experimentales se puede trazar la curva adecuada aumentado puntos de temperatura, aunque se incluyan temperaturas extremas que no son favorables al crecimiento.

Figura 4. Relacin de la tasa de aparicin foliar y la temperatura del aire (C), en la planta de arveja var. Santa Isabel. Los puntos permiten suponer que la forma completa de la curva es una meseta, en cuya cima se encuentra el rango ptimo de temperatura

Los puntos observados en arveja variedad Santa Isabel se ajustan mejor al modelo dentado, en vez del lineal, aunque el rango ptimo no se puede precisar an. Segn Fedecaf (1986), la temperatura ptima para arveja est entre 15C y 18C. Sin embargo, si este es el caso, la temperatura de 14C estara ms cercana al ptimo, y con 21C se esperara una reduccin mayor en la tasa de aparicin de nudos, lo cual no se cumple con los datos experimentales expuestos. Por lo tanto, es posible que el rango ptimo de temperaturas se extienda ms y posiblemente incluya los 21 C. Meja y colaboradores (2003) aseguran que el rango ideal de temperatura para arveja est entre 15C y 20C. El rango ptimo de temperatura puede variar segn el estado de desarrollo de la planta segn la especie. En haba (Vicia faba L.), Boote y colaboradores (2002) utilizaron como temperatura base 0C para todo el desarrollo de la planta, considerando tres fases: formacin de nudos, floracin a aparicin de la primera semilla y madurez. Las temperaturas ptimas mnima y mxima para una funcin de forma dentada fueron de 27C-30C, 22C-26C y 22C-35C para cada una de las tres fases. La temperatura mxima tolerada por el cultivo fue de 40C, 45C y 45C para cada fase. Inicio de la floracin y desarrollo de vainas El inicio de la floracin en condiciones de campo ocurri en el nudo 17 del tallo principal, con ligeras variaciones entre los dos ensayos: 17,3 y 17,0 para el lote 7 y 8 del CAM, respectivamente (tabla 4). Corresponden a 69,9 y 77,4 das despus de la siembra, y a 965,9 y a 1030 en C d, respectivamente. Los resultados obtenidos indican que el inicio de la floracin en la planta de arveja se asocia con un nmero de nudo
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en el tallo principal. Como el filocrn de la arveja mostr ajustarse a un modelo lineal simple, la prediccin del inicio de la floracin se deduce por el desarrollo de un nmero de nudos determinado. Alcalde y colaboradores (2000), al analizar ocho cultivares heterogneos de arveja cultivados en 11 ambientes contrastantes semicontrolados y naturales, observaron que el nmero del nudo en el que se inici la floracin se correlacion altamente con el tiempo de desarrollo del cultivo en un modelo lineal fototrmico. En condiciones de invernadero del ensayo en el CNIA Tibaitat la floracin comenz en el nudo 16, posiblemente por un ataque de Ascochyta, un hongo que afect severamente las hojas (aproximadamente 80% de incidencia en hojas). Es sabido que las condiciones de estrs antes de la floracin aceleran el desarrollo de las plantas. La productividad en este caso disminuy a un nivel muy inferior a su potencial (1,3 t/ha). Los resultados obtenidos estn dentro del rango observado por Pacheco y Vergara (2005) para una muestra de materiales de arveja. Ellos observaron que el nmero de nudo con la primera flor estuvo entre 12,8 y 19,0. Segn los resultados obtenidos, la variedad de arveja Santa Isabel es de produccin tarda. Algunos ejemplos en variedades tempranas se presentan a continuacin. Jeuffroy y Devienne (1995) observaron que la floracin de la arveja comenz entre los 705C y 860 C d, con una temperatura base de 0C. La tasa de aparicin de nudos en la floracin estuvo entre 35,9C y 70,9C d, para ensayos con diferentes densidades y fechas de siembra. Adems, la progresin del desarrollo en el tiempo mostr una tendencia lineal. Siddique y colaboradores (2002) obtuvieron que desde la aparicin de la primera flor hasta la cosecha transcurrieron entre 43 y 53,2 das, y que el periodo de floracin tard de 13 a 27,2 das. Wilson y Robson (2006) observaron en cinco cultivares de arveja que el nmero de nudo con la primera flor poda variar por efecto del fotoperiodo o la temperatura, con resultados diferentes segn el material gentico. En el cultivar Massey no hubo respuesta al fotoperiodo. Para los cultivares Patea y Trounce, la aparicin del primer nudo con flor fue una funcin lineal del fotoperiodo en el nudo 8. En los cultivares Rovar y Whero se observ una funcin aditiva del fotoperiodo y la temperatura (entre los nudos 8 y 12, respectivamente para cada cultivar). En das, se obtuvo un rango de duracin entre emergencia a floracin de 40 a 111 das, con 388C y 313C d. El nmero de vainas en el tallo principal de la planta de arveja fue similar para los dos ensayos de campo abierto (9,7 y 9,9 vainas/tallo en los ensayos del lote 7 y lote 8
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del CAM, respectivamente), lo cual se explica en parte por la mnima variacin en las condiciones ambientales descritas de temperatura y radiacin solar. El nmero de granos viables por planta se dedujo en 50,14 y 55,04 respectivamente para los ensayos a campo abierto en los lotes 7 y 8 del CAM. El resultado es superior al que se ha informado en variedades de arveja de porte pequeo que soportan altas densidades. Siddique y colaboradores (2002) obtuvieron 6,2 a 6,8 vainas por planta de arveja, 4,1 a 5,4 granos por vaina, para un total de 25,4 y 36,7 granos/planta, a una densidad de siembra de 80 plantas/m2. Las variaciones se debieron principalmente a las diferentes fechas de siembra, 29 en total. Roche y Jeuffroy (2000) obtuvieron que el nmero de semillas por planta estuvo entre 9,73 y 39,01 para 25 ensayos de campo de la arveja cultivar Solara. Lhuillier y colaboradores (1999) obtuvieron 42 semillas/planta con el cultivar Solara; con el cultivar Frisson obtuvieron 57 semillas/planta aplicando 25 kg N/ha y 42 semillas/planta sin aplicar N. El nmero de nudos reproductivos es una caracterstica importante para definir la productividad de un cultivo. De la tabla 4 se deduce que dicho nmero de nudos en arveja fue de 6,2 para el ensayo bajo cubierta plstica en el CNIA Tibaitat y 7,2 para el ensayo a campo abierto en el lote 7 del CAM. En lenteja, Whitehead y colaboradores (2000) observaron que la productividad del cultivo depende del desarrollo de nudos y la proporcin de ellos que son reproductivos. En trigo de invierno (Triticum aestivum L.) Petrczi y Matuz (2002) observaron en cuatro aos de ensayos con tres genotipos que la productividad del cultivo estuvo asociada principalmente con el nmero de hojas y el tamao de la planta. Das hasta la cosecha Segn la tabla 4, en los ensayos en campo abierto en el Centro Agropecuario Marengo la planta desarroll 24,5 nudos en el tallo principal en el lote 7 y, 22,2 nudos en el lote 8; en el ensayo bajo cubierta plstica en el CNIA Tibaitat, desarroll 22,3 nudos. Se comprob que los tallos suspendieron la formacin de nudos nuevos, as: en el ensayo bajo cubierta plstica en el CNIA Tibaitat, a los 73 das despus de la siembra y en el ensayo bajo cubierta plstica del CAM a los 85 das; en cuanto a los ensayos a campo abierto del CAM, a los 95 das en el lote 8, y a los 92 en el lote 7. La madurez comercial de la arveja se dio entre los 93 y 115 das despus de la siembra, a raz de lo cual se realiz el primer pase de recoleccin; que recogi las vainas del tallo principal.

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Tabla 4. Caractersticas reproductivas de la planta de arveja var. Santa Isabel, en cuatro ensayos de campo, dos a campo abierto (CA) lotes 7 y 8 del CAM y dos bajo cubierta plstica (CP) en el CNIA Tibaitat y en el CAM
ensayo caracterstica Vainas/nudo vulos/vaina CA L7 CAM Granos viables/vaina Vainas totales/tallo Primer nudo con flor ltimo nudo Vainas/nudo Granos viables/vaina CA L8 CAM Vainas totales/tallo Primer nudo con flor ltimo nudo Vainas/nudo Granos viables/vaina CP Tibaitat* Vainas totales/tallo Primer nudo con flor ltimo nudo Vainas/nudo Granos viables/vaina CP CAM Vainas totales/tallo Primer nudo con flor ltimo nudo n 458 157 169 62 62 62 56 24 56 50 50 101 255 20 20 20 56 s.d. 12 12 12 Promedio 1,3079 7,2930 5,1893 9,6613 17,3065 24,4677 1,6731 5,5434 9,9286 16,9800 22,2000 1,2772 4,8118 6,4500 16,1000 22,3000 1,6964 s.d. 7,9167 18,7500 23,0833 De 0,5325 0,8642 1,5196 4,4092 3,1860 4,7657 0,3111 0,8281 3,1442 1,6224 3,0573 0,4499 1,1065 2,5231 1,1192 2,4301 0,4640 s.d. 1,6214 3,2787 1,2401 SW 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0002 0,0850 0,0001 0,3493 0,9699 0,0329 0,0652 0,0000 0,0000 0,7074 0,0541 0,3784 0,0001 s.d. 0,0587 0,0001 0,1701 RIc 1,00 1,00 2,00 4,00 3,00 6,00 0,59 0,94 5,00 2,00 3,00 1,00 2,00 3,75 2,00 3,50 1,00 s.d. 3,00 1,75 1,75

* La productividad en este ensayo se vio severamente reducida por un ataque de Ascochyta, favorecido por la alta humedad durante el ciclo de cultivo.

Los resultados de la duracin hasta la cosecha son ligeramente superiores a los que observaron Pacheco y Vergara (2005) en una muestra de materiales de arveja, quienes obtuvieron la cosecha entre 79 y 99 das despus de la siembra, dependiendo del material de arveja. La duracin del perodo reproductivo en un cultivo es una caracterstica susceptible a variar entre materiales vegetales de leguminosas segn el momento del inicio de la floracin. Annicchiarico (2008) observ que el tiempo hasta la floracin de dos cultivares de arveja, dos de haba (Vicia faba L.), dos de lupino de hoja estrecha (Lupinus angustifolius L.) y dos de lupino blanco (L. albus L.) se relacion inversamente con la produccin de grano en diez ambientes, incluyendo zonas del Mediterrneo y del rea subcontinental de Italia.
CONCLUSIONES

La respuesta fenolgica de la planta a la diferencia de condiciones entre campo abierto y cubierta plstica no permiti una extrapolacin adecuada para estimar la temperatura base del cultivo de arveja. El nmero del nudo en el cual apareci la primera flor no cambi significativamente para las dos condiciones de campo. Sin embargo, la condicin bajo cubierta plstica hizo variar esta caracterstica en un rango mayor respecto a la condicin de campo abierto. La productividad en nmero de vainas en el tallo principal fue similar para los dos ambientes de crecimiento comparados.
AGRADECIMIENTOS

La alta temperatura bajo cubierta plstica respecto a la condicin de campo abierto aceler la emergencia de las plantas, la tasa de aparicin de nudos y acort la duracin del ciclo de cultivo.

Los autores agradecen al profesor Fabio Leiva de la Facultad de Agronoma, Universidad Nacional, Bogot, por el apoyo brindado para la realizacin de este trabajo en su proyecto financiado por Colciencias. Y a Jeannette Amparo Espaol Aragn por su colaboracin en el trabajo prctico de esta investigacin.
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Manejo

i ntegr ado de p l agas

A R t c u lo c I e N t F I co

A laboratory method for rearing Andean potato weevil Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae)

Mtodo de cra en laboratorio del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae)
Ricardo Prez1, Jennifer Garza2, Jorge Argelles-Crdenas3
RESUMEN

The Andean potato weevil, Premnotrypes vorax, is considered one of the most important pests of the potato crops in Colombia. In this work, a laboratory method for rearing P. vorax is described. All developmental stages of the insect can be obtained with this method, for experimental purposes. In addition, adult longevity and fecundity were determined for the establishment of the potential growth of the colony under the evaluated conditions. Adults were kept in plastic boxes, which were provided with a soil layer, potato leaves for feeding and dry straw for oviposition. The dry straw with egg clutches were disinfected and incubated in Petri dishes under controlled conditions of temperature and humidity. The most suitable maintaining conditions for individuals in the period from larva to adult were determined by evaluating two different feed types for larvae, three pupation substrates and three larval densities per tuber. The best conditions were obtained with potato tubers from the parda pastusa variety (> 80 g), on sterilized soil and peat moss in 3:1 ratio, and less those ten larvae per tuber. This rearing method can produce two or three generations per year, with an increase rate close to 17% per generation. This rearing method becomes a useful tool for bioecological studies, and to evaluate control methods for this insect. Keywords: Fecundity, Andean weevil, longevity, pest, survival.

ABSTRACT

El gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax es considerado uno de los insectos plaga ms limitantes del cultivo de la papa en Colombia. En este trabajo se describe un mtodo para la cra de P. vorax en condiciones de laboratorio, con el que se puede obtener individuos de todos los estados de desarrollo para su uso con propsitos experimentales. Adicionalmente, se determin la longevidad y fecundidad de los adultos para establecer el potencial de crecimiento de la cra en las condiciones evaluadas. Los adultos se mantuvieron en recipientes plsticos provistos de una capa de suelo, follaje de papa para la alimentacin y pajillas para la oviposicin. Las pajillas con posturas se desinfectaron y luego se incubaron en cajas de Petri en condiciones de temperatura y humedad controladas. Las condiciones ms adecuadas para el mantenimiento de los individuos durante el perodo larva-adulto se determinaron evaluando dos tipos de alimento para las larvas, tres sustratos para pupar y tres densidades de larvas por tubrculo. Las mejores condiciones se obtuvieron con tubrculos de la variedad parda pastusa (> 80 g), sobre un sustrato de suelo esterilizado y turba en proporcin 3:1 y a una densidad no mayor a diez larvas por tubrculo. Con este mtodo de cra se podran esperar de dos a tres generaciones del insecto por ao con una tasa de incremento cercana al 17% por generacin. Este mtodo de cra se constituye en una herramienta para facilitar la realizacin de estudios bioecolgicos del insecto y evaluar mtodos para su control. Palabras clave: fecundidad, gorgojo de los Andes, longevidad, plaga, supervivencia.
INTRODUCCIN

El gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (HusRadicado: 25 de febrero de 2009 Aprobado: 7 de mayo de 2009

Bilogo. Grupo de Manejo Fitosanitario, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. mperez@corpoica.org.co 2 Biloga. Universidad Militar Nueva Granada. jgarza@javeriana.edu.co 3 I.A. M.Sc. Investigador mster principal, Grupo de Manejo Fitosanitario, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. jarguelles@corpoica.org.co
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tache) (Coleoptera: Curculionidae) es una de las 14 especies del complejo denominado gorgojos de los Andes que atacan el cultivo de la papa. Esta especie se encuentra distribuida en Colombia, Ecuador, Venezuela y Per donde se registra como una de las plagas clave del cultivo (Alczar y Cisneros, 1999). El gusano blanco en su estado adulto se alimenta principalmente de las hojas de la papa, pero el dao de importancia econmica es ocasionado por las larvas, que al alimentarse de los tubrculos hacen galeras que afectan la calidad del producto. Las prdidas
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en rendimiento ocasionadas por el gusano blanco oscilan entre 5% y 50% dependiendo del nivel de poblacin y del manejo del cultivo (Nio et al., 2004). Con el fin de disminuir los daos causados por P. vorax, se han propuesto varios mtodos para su manejo como la utilizacin de barreras vegetales, las prcticas culturales y la aplicacin de bioplaguicidas (Calvache, 1985; Yabar, 1988; Calvache y Posada, 1991; Torres et al., 2004). No obstante, la medida ms utilizada por los agricultores es el uso de insecticidas qumicos como carbamatos, piretroides y organofosforados (Torres et al., 2004). En la mayora de los casos, los insecticidas son aplicados sin justificacin tcnica y slo con el criterio de proteger la cosecha contra el eventual ataque de la plaga (Lpez-vila, 2003). Esta situacin ha originado problemas de contaminacin ambiental, crecimiento de plagas secundarias y efectos nocivos para la salud de los agricultores (Crissman et al., 1994; Yanggen et al., 2003). Frente a este panorama, es necesario el desarrollo de nuevas estrategias para el manejo de la plaga, fundamentadas en un conocimiento slido de los aspectos biolgicos, ecolgicos y del comportamiento del insecto. En este sentido, numerosos estudios referidos a la biologa, ecologa y manejo de P. vorax requieren de protocolos para su cra. Entre los estudios que se beneficiaran del desarrollo de un mtodo de cra para el insecto se cuentan aquellos relacionados con la respuesta del ciclo de vida a condiciones ambientales especficas, estudios relativos a los hbitos y comportamiento reproductivo, y la evaluacin de enemigos naturales. En cuanto al mantenimiento y produccin de una cra del gusano blanco, se pueden sealar dos limitantes de especial relevancia. En primer lugar, la larga duracin del ciclo de P. vorax, ya que se puede prolongar hasta por nueve meses (Calvache, 1986). Esto se traduce en solo una o dos generaciones del insecto por ao, lo que dificulta disponer de una continua provisin de individuos. Por otro lado, la elevada mortalidad que se presenta durante el perodo larva-adulto del insecto limita en gran medida la cantidad de individuos que llegan a la etapa reproductiva (Khne, 2007). En estudios anteriores se han ajustado metodologas para la cra del gusano blanco en condiciones de casa de malla (Torres, 1996). Estas metodologas permiten la obtencin de adultos, pero demandan una considerable cantidad de espacio, labor y recursos. Otros estudios han reportado la cra del insecto en condiciones de laboratorio, pero la descripcin de las metodologas utilizadas no son lo suficientemente detalladas para que puedan ser replicadas en estudios posteriores (Meja, 1995; Garzn et al., 1996; Torres, 1996; Barea et al., 1997; Nio et al., 2004; Khne, 2007). Aspectos bsicos para el mantenimiento de las cras de P. vorax en condiciones de laboratorio como
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tipo de sustrato, niveles de humedad y unidades de produccin empleadas no han sido documentados detalladamente. Adems, las cras sobre dietas artificiales y semiartificiales no han resultado exitosas (Zenner, 1990). Por otra parte, los sistemas de cra en laboratorio desarrollados para otras especies de la subfamilia Entiminae a la que pertenece P. vorax no se adecuan a los hbitos y requerimientos ecolgicos del gusano blanco (Elder et al., 1979; Shimoji y Yamagishi, 2002; Fisher, 2006). Este trabajo tiene por finalidad proponer un mtodo para la cra de P. vorax en condiciones de laboratorio, enfatizando en las condiciones para el mantenimiento del perodo larva-adulto. Adicionalmente, se determin la longevidad y fecundidad de los adultos para establecer el potencial de crecimiento de la cra de P. vorax en las condiciones evaluadas.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

El estudio se realiz en el laboratorio de Ecologa y Comportamiento de Insectos del Centro de Investigacin Tibaitat de Corpoica, localizado en el municipio de Mosquera (Cundinamarca, Colombia) a una altitud de 2550 msnm. Para el establecimiento de la cra de P. vorax en laboratorio, inicialmente se colectaron adultos de la plaga en cultivos de papa del municipio de Motavita (Boyac, Colombia). Las colonias del insecto fueron mantenidas en cuartos de cra a una temperatura de 19C 3C y a una humedad relativa de 50% - 70%. Mtodo de cra en laboratorio Adultos. Se identific el sexo de los adultos colectados en campo y se confinaron en grupos de diez parejas en cubetas plsticas semitransparentes (22 cm de ancho, 22 cm de largo y 10 cm de alto), que contaban con una zona de aireacin en la tapa. Cada cubeta estaba provista de una capa de suelo de 6 cm de espesor, follaje de papa (Solanum phureja cv. yema de huevo) para la alimentacin de los insectos y pajillas para la oviposicin (trozos de tallos secos de gramneas de 3 a 4 cm de largo y 1,5 a 2 mm de dimetro). Cada tres das se asperj el suelo con 40 mL de agua destilada y se renov el alimento. Los recipientes con adultos se mantuvieron bajo un fotoperiodo controlado de 12 h : 12 h (luz : oscuridad). Huevos. Las pajillas se revisaban diariamente y al encontrar posturas en su interior, se desinfectaban sumergindolas durante cinco minutos en una solucin de hipoclorito de sodio al 0,05%. Luego de la desinfeccin, las pajillas con posturas se colocaban individualmente en cajas de Petri de 9 cm de dimetro, cuyo fondo estaba cubierto con papel toalla. Para mantener la hidratacin de las posturas, el papel fue humedecido con 0,3-0,4

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mL de agua destilada (i.e. 5 gotas) cada tres das. En los momentos previos a la eclosin de los huevos, cuando las cpsulas ceflicas de las larvas comenzaron a ser visibles, los bordes de las cajas de Petri se sellaron con papel de vinilo para impedir que las larvas neonatas se escaparan. Las cajas de Petri con las posturas se mantuvieron bajo un fotoperiodo de 12 h : 12 h (luz : oscuridad) y fueron revisadas diariamente para determinar la duracin del perodo de incubacin y el porcentaje de eclosin. Larva-adulto. Evaluaciones previas efectuadas en este trabajo de investigacin demostraron que la manipulacin de los individuos de P. vorax en estado de larva o pupa ocasiona altos niveles de mortalidad. Por esta razn, durante el desarrollo del presente mtodo de cra se realiz el seguimiento de la fase larva-adulto (perodo comprendido entre la eclosin de los huevos y la emergencia de los adultos libres) sin manipular los individuos durante sus estados intermedios. Adems, con el propsito de determinar las condiciones ms adecuadas para el mantenimiento de los insectos durante el perodo larva-adulto, se realizaron tres experimentos. En el primer experimento se evalu el efecto del sustrato de alimentacin para las larvas en la supervivencia y duracin del perodo larva-adulto del insecto. Para ello se probaron dos tipos de alimento para las larvas: tubrculos de Solanum tuberosum var. parda pastusa y tubrculos de Solanum phureja cv. yema de huevo. Para el montaje de las unidades experimentales, se emplearon recipientes plsticos semitransparentes de 12 cm de dimetro por 7 cm de altura. En la base de cada recipiente se dispuso una capa de 4 cm de espesor de un medio para la formacin de la pupa consistente en una mezcla de suelo cernido (tamiz de 0,5 mm de apertura) y turba en proporcin 3:1. Sobre el medio para pupar se coloc un tubrculo (> 60 g) previamente desinfectado por medio de lavado con agua destilada y jabn lavaplatos. Finalmente, el tubrculo fue cubierto con una capa de 1 cm de espesor del medio para la formacin de la pupa. Para la ventilacin de los recipientes, se adapt una malla en la parte superior ajustada con una banda elstica y para mantener las condiciones de humedad, los recipientes fueron asperjados con 40 mL de agua destilada cada tres das. En cada unidad experimental se liberaron 10 larvas neonatas que se desarrollaron sin manipulacin y en condiciones de completa oscuridad. Cada tratamiento se replic diez veces y al final del experimento se registr el nmero de adultos emergidos, el tiempo de duracin del perodo larva-adulto y la relacin de sexos. En el segundo experimento se evalu el efecto del tipo de sustrato para la formacin de la pupa sobre la supervivencia y duracin del perodo larva-adulto. Se evaluaron

tres sustratos: (1) suelo cernido esterilizado, (2) mezcla de suelo cernido sin esterilizar y turba en proporcin 3:1 y (3) mezcla de suelo cernido esterilizado y turba en proporcin 3:1. El suelo fue cernido pasndolo por un tamiz de 5 mm de apertura, y la esterilizacin se efectu en autoclave exponindolo a una temperatura de 120C durante cuatro horas. El montaje de las unidades experimentales se realiz de manera similar a la del primer experimento, pero con tubrculos de S. tuberosum var. parda pastusa y modificando los sustratos para pupar de acuerdo con el tratamiento. Cada tratamiento se replic diez veces y al final del experimento se registr el nmero de adultos emergidos, el tiempo de duracin del perodo larva-adulto y la relacin de sexos. En el tercer experimento se evalu el efecto de la densidad de larvas por tubrculo, para lo cual se probaron tres densidades: (1) seis larvas por tubrculo, (2) diez larvas por tubrculo y (3) 15-20 larvas por tubrculo. El montaje de las unidades experimentales se realiz de manera similar a la del primer experimento, pero con tubrculos de S. tuberosum var. parda pastusa y modificando la densidad de larvas neonatas de acuerdo con el tratamiento. Cada tratamiento se replic diez veces y al final del experimento se registr el nmero de adultos emergidos, el tiempo de duracin del perodo larvaadulto y la relacin de sexos. Los tres experimentos se organizaron segn un diseo completamente al azar. La normalidad y homogeneidad de varianzas de cada una de las variables se comprob con la prueba de Shapiro-Wilk y la de Levene, respectivamente ( = 0,05). Los valores de duracin del perodo larva-adulto, porcentaje de emergencia de adultos y la relacin de sexos se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA). Cuando los datos no se distribuyeron normalmente, se utiliz la prueba no paramtrica de KruscallWallis. Todos los anlisis se hicieron utilizando el paquete estadstico SAS versin 9.1 (SAS Institute, 2005). Determinacin de la longevidad y fecundidad Con el propsito de determinar el potencial de crecimiento de la cra de P. vorax en cuanto a la fecundidad y longevidad de los individuos, se llev a cabo el seguimiento de una cohorte de 90 adultos (45 parejas). Dicha cohorte provino de la primera generacin de los individuos empleados en los tres experimentos mencionados anteriormente. A los adultos recin emergidos (< 24 h edad) se les determin su sexo y posteriormente se les ubic por parejas en recipientes plsticos (12 cm dimetro por 7 cm de alto). Cada recipiente estaba acondicionado con una capa de suelo de 1,5 cm de espesor, hojas y rodajas de tubrculos de S. tuberosum (var. parda pastusa) para la alimentacin
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y tres pajillas para la oviposicin. Para permitir el flujo de aire, los recipientes se cubrieron con muselina asegurada con una banda elstica. Para el mantenimiento de los recipientes, cada tres das se haca la aspersin al suelo de 15 mL de agua destilada y se renovaba el alimento. La recoleccin de las pajillas con posturas se realizaba cada ocho das, reponiendo por nuevas las que eran sustradas. Las pajillas con posturas fueron ubicadas en cajas de Petri para posteriormente hacer el conteo del nmero de huevos. Mediante la observacin peridica de cada uno de los recipientes, se registr la longevidad de los adultos, la fecundidad y la duracin de los perodos de preoviposicin y oviposicin de la hembra.
R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

Ciclo de desarrollo Huevos A partir del seguimiento y anlisis de 81 posturas, se estim un promedio de 15,5 10,8 huevos/postura y una duracin de 21,9 3,2 das para el estado de huevo. Estos resultados son semejantes a los hallados por Zenner y Posada (1968), quienes encontraron grupos de 15 a 30 huevos por postura y una duracin de 21,2 das para el estado de huevo. Con respecto a la fertilidad, se encontr una eclosin de 81,5% 14,8%, que es comparable con los resultados obtenidos por Meja (1995) y Salazar (1996), quienes trabajando en condiciones de laboratorio reportaron valores de 76,2% y 81,8% respectivamente. Estos resultados indican que los mtodos implementados para el mantenimiento de las posturas de P. vorax fueron adecuados y no tienen un efecto negativo sobre la duracin del estado de huevo ni la fertilidad. Adems, se encontr que las condiciones generadas por los mtodos utilizados para el mantenimiento de la humedad y para la desinfeccin de las posturas de P. vorax produjeron una mortalidad de 7,3% sobre el estado de huevo (4,2% debido a desecacin y 3,1% por ataque de hongos). Este valor puede considerarse relativamente bajo comparado con los resultados obtenidos en estudios anteriores, donde se han registrado niveles de mortalidad superiores a 20% (Meja, 1995). Teniendo en cuenta lo anterior, dichos mtodos podran considerarse adecuados para el mantenimiento de las posturas del insecto.

La temperatura de incubacin y las condiciones de humedad de las posturas son dos aspectos de gran importancia para el mantenimiento de las cras del gusano blanco, por lo que se recomienda tenerlos en cuenta para perfeccionar los mtodos de cra. De acuerdo con Molleda (1961), temperaturas por debajo de 5C o por encima de 25C aumentan la mortalidad de los huevos del gusano blanco y disminuyen su fertilidad. Por lo tanto, los individuos en estado de huevo deberan mantenerse a temperaturas entre 10C y 22C, que es el rango donde se han registrado mayores niveles de supervivencia (Garzn et al., 1996). Por su parte, la humedad tambin puede afectar la supervivencia de los huevos de P. vorax. Niveles de humedad altos pueden favorecer las infecciones fngicas o bacterianas y generar la muerte de los individuos, mientras que bajos niveles de humedad pueden ocasionar la muerte debido a la desecacin (Meja, 1995). Los resultados del presente estudio permiten proponer que para el mantenimiento de las condiciones de humedad de las posturas, stas sean ubicadas en cajas de Petri en cuyo fondo se debe colocar papel toalla. Adems, dicho papel debe ser humedecido con 0,3 a 0,4 mL de agua destilada cada tres das. Larva-adulto En la fase larva-adulto se encontraron porcentajes de supervivencia que variaron entre 12% y 35%. Estos valores, aunque bajos, concuerdan con el estudio de Khne (2007) que registr, para Premnotrypes suturicallus Kuschel, una supervivencia inferior a 30% en similares condiciones de laboratorio. En cuanto a la duracin promedio del perodo larva adulto, se encontraron valores que variaron entre 92 y 100 das, los cuales tambin coinciden con los reportes de la literatura (Zenner y Posada, 1968; Calvache, 1986; Gallegos, 1989; Nio et al., 2004). Efecto del tipo de alimento para las larvas. No se encontraron diferencias significativas en la supervivencia (ANOVA; F = 0,8413; gl = 1 y 15; p = 0,3735) ni en la duracin del ciclo (ANOVA; F = 0,3463; gl = 1 y 41; p = 0,5595) entre los individuos expuestos a los dos tipos de alimento. Cuando los individuos se expusieron a tubrculos de S. tuberosum, el porcentaje de supervivencia y la duracin del perodo larva adulto fue 24,4% y 94,1 11,1 das, respectivamente. Para los individuos alimentados con tubrculos de S. phureja, se registr una supervivencia de 35,6% y una duracin del ciclo de 92,3 9,4 das (tabla 1).

Tabla 1. Efecto del tipo de sustrato de alimentacin para las larvas sobre la supervivencia, duracin del perodo larva-adulto y relacin de sexos de P. vorax
tipo de alimento para las larvas Tubrculos S. tuberosum Tubrculos S. phureja Supervivencia del perodo larva-adulto (%) 24,4 18,9 a (12,7 - 36,1) 35,6 31,6 a (12,2 - 59,0) Duracin del perodo larva-adulto (das) 94,1 11,1 a (89,5 - 98,8) 92,3 9,4 a (88,3 - 96,3) Relacin de sexos (macho : hembra) 1,06 : 1 a 1,72 : 1 a

En cada columna, promedios ( DE) seguidos de la misma letra no son estadsticamente diferentes (p < 0,001). Los nmeros entre parntesis representan los intervalos de confianza al 95%.

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En cada columna, promedios ( DE) seguidos de la misma letra no son estadsticamente diferentes (p < 0,001). Los nmeros entre parntesis representan los intervalos de confianza al 95%. Estos resultados indican que los dos tipos de alimento evaluados aportan los requerimientos nutricionales necesarios para el desarrollo de las larvas del gusano blanco. Sin embargo, algunas caractersticas relativas a los tubrculos permiten recomendar la utilizacin de S. tuberosum para el mantenimiento de las cras de P. vorax. Los tubrculos de S. tuberosum presentan un proceso de envejecimiento fisiolgico ms lento que los de S. phureja, lo que hace que los tubrculos duren ms tiempo turgentes y sin brotes. En contraste, los tubrculos de S. phureja tienen una rpida brotacin y alcanzan el estado de senectud con mayor celeridad (Moreno, 2000). Cabe anotar que la brotacin de los tubrculos supone dificultades metodolgicas para la cra, ya que los brotes deben cortarse para evitar que rompan la muselina que cubre los recipientes. Efecto del tipo de sustrato para la formacin de la pupa. No se detectaron diferencias significativas en la supervivencia del perodo larva-adulto entre los diferentes sustratos evaluados (Kruskall-Wallis; H2,27 = 1,7342; p = 0,4202). En el medio de suelo cernido esterilizado (sustrato uno) la supervivencia fue de 20,9%; en la mezcla de suelo cernido sin esterilizar y turba (sustrato dos), fue de 24,4%; y en la mezcla de suelo cernido esterilizado y turba (sustrato tres) se registr una supervivencia de 12,5%. Tampoco hubo diferencias significativas en la duracin del perodo larva-adulto entre los sustratos evaluados (ANOVA; F = 0,4598; gl = 2 y 49; p = 0,6341); las duraciones fueron 95,9 5,3 das en el sustrato uno, 94,1 11,1 das en el sustrato dos y 93,1 3,6 das en el sustrato tres (tabla 2).

Estos resultados indican que los insectos durante el perodo larva-adulto se desarrollan de manera similar en los tres sustratos evaluados. A pesar de no existir diferencias significativas, las observaciones experimentales permiten recomendar el sustrato formado por la mezcla de suelo cernido esterilizado y turba, ya que ste permite una mejor infiltracin del agua, mejorando la retencin de humedad y disminuyendo la aparicin de entomopatgenos. Estas observaciones concuerdan con el estudio de Fisher y Bruck (2004), quienes mencionan la importancia de la esterilizacin de los sustratos empleados en la cra de curculinidos. En varios estudios se han realizado recomendaciones adicionales para la seleccin del sustrato para la formacin de la pupa del gusano blanco. Por ejemplo, Torres (1996) recomienda no utilizar sustratos con arena ya que tienden a perder humedad y compactarse, lo que afecta el desarrollo de la pupa y la emergencia de los adultos. Otras recomendaciones incluyen la utilizacin de mezcla de suelo con cascarilla de arroz o musgo con el fin de mejorar la retencin de humedad de los sustratos (Torres, 1996; Nio et al., 2004). Efecto de la densidad de larvas por tubrculo. No se encontraron diferencias significativas en la supervivencia (Kruskall-Wallis; H2,20 = 2,0418; p = 0,3603) ni en la duracin del perodo larva-adulto (ANOVA; F = 0,5944; g.l. = 2, 32; p = 0,5579) entre las densidades evaluadas. Para las densidades de 6, 10 y 15-20 larvas por tubrculo, se encontraron porcentajes de supervivencia de 25,0%, 12,5% y 13,5%, respectivamente. Por su parte, la duracin registrada para el perodo larva-adulto fue de 100,2 5,3 das, 93,1 3,6 das y 97,1 13,7 das para las densidades de 6, 10 y 15-20 larvas por tubrculo, respectivamente (tabla 3).

Tabla 2. Efecto del tipo de sustrato para la formacin de la pupa sobre la supervivencia, duracin del perodo larva-adulto y relacin de sexos de P. vorax
tipo de sustrato para la formacin de la pupa Suelo cernido esterilizado Suelo cernido sin esterilizar y turba Suelo cernido esterilizado y turba Supervivencia del perodo larva-adulto (%) 20,9 20,7 a (8,7 - 33,1) 24,4 18,9 a (12,7 - 33,1) 12,5 14,9 a (2,2 - 22,8) Duracin del perodo larva-adulto (das) 95,9 5,3 a (93,6 - 98,2) 94,1 11,1 a (89,5 - 98,8) 93,1 3, 6 a (90,9 95,3) Relacin de sexos (macho : hembra) 1,31:1a 1,06:1 a 0,75:1 a

En cada columna, promedios ( DE) seguidos de la misma letra no son estadsticamente diferentes (p < 0,001). Los nmeros entre parntesis representan los intervalos de confianza al 95%.

Tabla 3. Efecto de la densidad de larvas por tubrculo sobre la supervivencia, duracin del perodo larva-adulto y la relacin de sexos de P. vorax
Densidad de larvas por tubrculo 6 larvas 10 larvas 15-20 larvas Supervivencia del perodo larva-adulto (%) 25,0 23,9 a (10,2 - 39,8) 12,5 14,9 a (2,2 - 22,8) 13,5 19,6 a (0 - 30,6) Duracin del perodo larva-adulto (das) 100,2 5,3 a (92,3 - 102,0) 93,1 3,6 a (90,9 - 95,3) 97,1 13,7 a (88,6 105,6) Relacin de sexos (macho: hembra) 0,83:1 a 0,75:1 a 1,10:1 a

En cada columna, promedios ( DE) seguidos de la misma letra no son estadsticamente diferentes (p < 0,001). Los nmeros entre parntesis representan los intervalos de confianza al 95%.

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Segn lo observado, el umbral de dao por P. vorax es bajo ya que cuatro o cinco larvas por tubrculo fueron suficientes para causar 100% de dao en los tubrculos (tubrculos de 60-80 g). Adems, se encontr que independientemente de la densidad inicial de larvas, en ningn caso se presentaron ms de siete adultos emergidos en cada recipiente. De acuerdo con lo anterior y con fines de uso y manutencin de la cra de P. vorax, es recomendable seleccionar una densidad de cinco a diez larvas por tubrculo. De esta forma, se garantiza la supervivencia de un mayor porcentaje de los individuos liberados y se evita la pudricin del tubrculo que a su vez podra conllevar a que las larvas no completen su ciclo. Relacin de sexos. Otro aspecto relevante de los experimentos realizados es que la proporcin sexual no cambi en funcin del alimento (ANOVA; F = 0,6279; g.l. = 1,5; p = 0,4640), el sustrato para la formacin de la pupa (Kruskall-Wallis; H2,7 = 0,3506; p = 0,8392) o la densidad de larvas por tubrculo (ANOVA; F = 0,5753; g.l. = 2, 8; p = 0,5842). La relacin de sexos encontrada vari entre 0,75 y 1,72 machos por cada hembra, la cual coincide con los reportes de la literatura (Khne, 2007). Longevidad y fecundidad La longevidad promedio de los adultos de P. vorax fue de 138 51,7 das para los machos y 154 50,7 das para las hembras. Con respecto a la fecundidad, se encontr que las hembras inician la oviposicin a los 14,4 7,8 das y colocaron entre 0 y 343 huevos para un valor promedio de 101,3 78,6 huevos por hembra. Adems, se registr un perodo de oviposicin de 91,5 43,0 das, tiempo durante el cual las hembras colocaron un promedio de 9,6 5,5 posturas. Durante el registro de la fecundidad, se observ que el mayor pico de oviposicin se present a los 14 das con un promedio de 4,62 huevos/hembra/da (figura 1a). Desde el da 14 hasta el 100, la tasa de oviposicin fue muy irregular con picos y bajadas muy pronunciadas. El da 100, las hembras haban alcanzado 88,5% de la oviposicin total y a partir del da 161 la tasa de oviposicin disminuy progresivamente hasta el 193. Despus del da 193 no se observaron posturas, por lo cual la curva de oviposicin acumulada se estabiliz hasta la muerte de la ltima hembra, que se present en el da 229 (figura 1b). Los valores de longevidad y fecundidad exhibidos por los adultos de P. vorax fueron inferiores a los registrados en algunos estudios biolgicos anteriores (Zenner y Posada, 1968; Meja, 1995). Una posible expliRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 16-23

Figura 1. Fecundidad de la hembra de P. vorax. a. Oviposicin en el tiempo. b. Curva de oviposicin acumulada

cacin de las diferencias encontradas es que las condiciones de temperatura en las que se realiz el ensayo hubieran tenido un efecto negativo en la longevidad y fecundidad de los individuos. En efecto, el presente estudio se realiz a una mayor temperatura promedio (i.e. 19C) con relacin a la temperatura registrada en estudios anteriores. Al respecto, Khne (2007) encontr que para P. suturicallus la longevidad disminuye linealmente con el aumento de la temperatura, mientras que por encima de 17C las hembras expresan menos de 50% de su fecundidad potencial. Sin embargo, el efecto de la temperatura sobre la biologa de P. vorax deber ser comprobado en estudios posteriores. As mismo, en el futuro se debera evaluar la influencia de otros factores como la humedad relativa, la humedad del suelo y la manipulacin de los individuos sobre la biologa, comportamiento y parmetros poblaciones de P. vorax. Esta informacin adems de ampliar el conocimiento acerca de la especie, podra ser utilizada en la optimizacin de su sistema de cra.
CONCLUSIONES

El mtodo propuesto para la cra de P. vorax permite producir huevos, larvas, pupas y adultos para propsitos experimentales, lo cual facilitar los estudios bioecolgi-

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Mtodo de cra en laboratorio del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae)

cos del insecto y la evaluacin de mtodos para su control. Basados en los resultados obtenidos con este mtodo de cra, se podran esperar de dos a tres generaciones del insecto por ao con una tasa de incremento cercana a 17% en cada generacin. Adems, se encontr que la fase ms crtica para el mantenimiento y produccin de la cra del insecto es el perodo larva-adulto, debido a la alta mortalidad de los individuos. Por lo tanto, es deseable seguir profundizando en el estudio de la influencia de factores como la humedad, temperatura y la manipulacin, a fin de mejorar la eficiencia del sistema de cra.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de la Repblica de Colombia y a la Asociacin Hortifrutcola de Colombia por el apoyo financiero para la ejecucin del proyecto Diseo de un sistema de seguimiento y alerta sanitaria para ser utilizado como herramienta en la toma de decisiones de manejo de Premnotrypes vorax y Tecia solanivora, en el sistema de produccin de la papa. A Aristbulo Lpez-vila, Diego Rincn y Carolina Camargo por la revisin crtica y aportes al documento.

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Mtodo de cra en laboratorio del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae)
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A R t c u lo c I e N t F I co

Evaluation of Spodoptera complex behavior with the introduction of transgenic cotton in Tolima, Colombia

Evaluacin del comportamiento del complejo Spodoptera con la introduccin de algodn transgnico al Tolima, Colombia
Oscar Santos Amaya1, Oscar Delgado Restrepo2, Jorge Argelles3, Elizabeth Aguilera Garramuo4

In this study a record and an evaluation of the Spodoptera larvae complex (Lepidoptera: Noctuidae) of commercial transgenic cotton (Cry1Ac) planted in the central area of Tolima, Colombia were registered. During three plant developmental stages: vegetative, reproductive and maturity, 83 commercial plots with areas ranging from 1 to 10 hectares, were evaluated. Spodoptera complex (Spodoptera frugiperda, S. ornithogalli y S. sunia) activity was evaluated in 315 ha, sampling seven plants per hectare, including refuges (12,6 ha), taking into account three different larvae sizes, small < 0.5 cm, medium > 0.5 and < 1.5 cm and large > 1.5 cm, as well as their location in the plant (leaf, flower and structure). There were statistically significant relationships between the larvae incidence (percentage of cotton plants with Spodoptera larvae present) and the different cotton genetic materials, with a significant higher larvae incidence in the transgenic plants (11,98% SE 4,03) than in conventional plants (9,13% SE 3.08) (0,0021*). This tendency was also observed among Spodoptera complex species, both genetic materials and the three plant developmental stages. S. frugiperda prevailed in flowers and capsules, S. ornithogalli in leaves and flowers; and S. sunia in leaves. This pattern was observed in both genetic materials with statistical significance (0.0001*). Larvae of all sizes were recorded in plants of both genetic materials; although there was no statistically significative dependency. Finally, there were small, medium and large S. frugiperda larvae in flowers and capsules, structures where the Bt toxin expression is the lowest in the plant. Keywords: Distribution, Bacillus thuringiensis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera ornitogalli, Spodoptera sunia.

ABSTRACT

RESUMEN

Se compar el comportamiento de las larvas del complejo Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae) entre lotes comerciales de algodn convencional y genticamente modificado (Cry1Ac) en el Tolima, Colombia. Se evaluaron 83 cultivos de algodn (315 ha) y sus respectivos refugios (12,6 ha) en tres estados de desarrollo: vegetativo, reproductivo y maduracin. En cada visita se seleccionaron al azar siete plantas por hectrea y se registr el nmero de larvas de Spodoptera frugiperda, S. ornithogalli y S. sunia, el tamao (pequeas < 0,5 cm, medianas entre 0,5 y 1,5 cm, y grandes > 1,5 cm) y su ubicacin en la plantas (hojas, flores y cpsulas). En el anlisis de los datos se utiliz una prueba de dependencia no paramtrica de Ji-cuadrado (X2). La dependencia del porcentaje de larvas del complejo Spodoptera por planta fue significativamente mayor (0,0021) en las plantas transgnicas (11,98% SE 4,03) que en las convencionales (9,13% SE 3,08). Este patrn se conserv al analizar los datos por especie y estado de desarrollo de la planta. En ambos materiales genticos se registr una dependencia espacial significativa (0,0001) entre las especies observadas y las estructuras de la planta: S. frugiperda predomin en flores y cpsulas, S. ornithogalli, en hojas y flores y S. sunia, en hojas. No hubo una dependencia significativa entre los materiales genticos y las estructuras vegetales con el tamao de las larvas. Se registraron larvas de todos los tamaos en flores y cpsulas, estructuras donde la expresin de la protena Bt es baja. Palabras clave: algodn genticamente modificado, complejo Spodoptera, Spodoptera frugiperda, Spodoptera ornitagalli, Spodoptera sunia.
INTRODUCCIN

Las especies del complejo Spodoptera en algodn son


Radicado: 2 de abril de 2009 Aprobado: 18 de mayo de 2009

I.A. Candidato a M.Sc. Universidad Nacional, Bogot. santosamaya@gmail.com Ingeniero Agrnomo. Universidad del Tolima, Ibagu. omade@hotmail.com 3 I.A. M.Sc. Investigador asistente C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. jarguelles@corpoica.org.co 4 Biloga. Ph.D. Investigadora asistente C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. eaguilera@corpoica.org.co
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consideradas plagas secundarias en Colombia (Baquero y Lpez, 2002); sin embargo, existe el riesgo que alguna de las especies de este grupo aumente sus poblaciones en los materiales genticamente modificados como respuesta a la reduccin de la competencia interespecfica (lepidpteros sensibles a la toxinas Bt (Cry1Ac) y al mejoramiento en la calidad del hbitat por reduccin en el nmero de aplicaciones de insecticidas.
2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

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Con el fin de registrar el comportamiento de estas especies se hizo un seguimiento de las larvas del complejo Spodoptera spp., en lotes comerciales de algodn en el segundo ao de introduccin de estos materiales genticos en el Tolima. Con la ingeniera gentica ha sido posible insertar genes de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki (Bt) en plantas de algodn (Gossypium hirsutum L.), con el fin de producir protenas que afectan las larvas de lepidpteros y bajar las aplicaciones de insecticidas (Rodrguez et al., 2005). Entre las especies de importancia econmica objetivo de esta tecnologa se destacan el gusano bellotero (Heliothis virescens F. 1777), el gusano del algodn (Helicoverpa zea Boddie 1850), el gusano rosado colombiano (Sacadodes pyralis Dyar 1912), el gusano rosado de la India (Pectinophora gossypiella Saunders 1843) y el gusano de las hojas (Alabama argillacea Hbner, 1823). Otras especies de lepidpteros como las del complejo Spodoptera presentan bajo grado de sensibilidad a esta protena Cry1Ac (Silva, 2005). La adopcin de materiales de algodn genticamente modificado ha sido mundialmente vertiginosa desde su liberacin comercial en 1996. Se calcula que en el 2008 se sembraron 15,5 millones de hectreas de algodn transgnico en el mundo, lo cual representa 12% del rea en algodn (ISAAA, 2009). Colombia adopt la tecnologa Cry1Ac (Bollgard, Monsanto) en el 2003 con 5% del rea algodonera (700 ha) (Martnez et al., 2006) y en el 2008 lleg a las 28.000 ha (Agro-Bio, 2009). En el Tolima, la siembra de algodn genticamente modificado cubri 81,20% del rea algodonera en el 2007 (ICA, 2007), representada principalmente por algodn NuOpal y se report una reduccin de 50% en el nmero de aplicaciones de insecticidas (Serrano, 2007). Con esta tecnologa se espera un ajuste en la comunidad de insectos asociados al algodn como respuesta a la eliminacin o reduccin de las poblaciones de las especies sensibles a la toxina Bt (Cry1Ac) y a la disminucin del nmero de aplicaciones de insecticidas (aumento de la calidad de hbitat). Sin embargo, uno de los riesgos asociados a esta tecnologa es el surgimiento de especies secundarias, que pueden colonizar los nichos que quedan libres por la mortalidad de las especies sensibles a estos materiales transgnicos (Altieri, 2000). Entre las especies potencialmente beneficiadas por tolerancia a los materiales de la primera generacin se reportan las del complejo Spodoptera (Bacheler y Mott, 2003). En el centro de Colombia las especies del complejo Spodoptera asociadas al cultivo de algodn incluyen a S. sunia (Guene, 1852), S. ornithogalli (Guene, 1852) y S.
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frugiperda (Smith, 1757). Estas especies presentaron una sobrevivencia superior al 50% en parcelas experimentales de algodn NuOpal (Cry1Ac, Bollgard, Monsanto) en la costa norte de Colombia (Daz y Montenegro, 2003). Segn Zenner y colaboradores (2008) la susceptibilidad a la toxina de larvas de S. frugiperda y S. sunia colectadas en el Tolima fue prcticamente nula; concluyeron estos autores que el algodn transgnico que se cultiva actualmente en Colombia proporciona un control satisfactorio de las heliotinas pero no del complejo Spodoptera, lo cual corrobora los resultados encontrados por Berrocal y colaboradores (2005) y Adamczyk y colaboradores (1997). Teniendo en cuenta lo anterior, existe el riesgo que S. frugiperda se beneficie a mediano plazo con la entrada de los materiales de algodones transgnicos (Cry1Ac). Generalmente esta especie juega un papel secundario o terciario dentro del grupo bsico de herbvoros de importancia econmica asociados a los cultivos de algodn (Garca et al., 2002); sin embargo, existen registros histricos de grandes irrupciones poblacionales en Estados Unidos con prdidas econmicas considerables, que se remontan a 1777 con repeticiones peridicas en 1912, 1915, 1918, 1920, 1928, 1975 y 1976 (Spark, 1979). En Colombia, esta especie ha seguido un patrn de comportamiento similar con aumentos poblacionales abruptos en Medelln (1914), norte del Tolima (1964), Sucre (1978, 1985, 1986), Crdoba (1979) y en el Sin (1984, 1985) (Baquero y Lpez, 2002). Este comportamiento se ajusta a las predicciones planteadas para individuos que evolucionan en ambientes impredecibles (estrategas r) y para especies que exhiben plasticidad fenotpica. Por un lado, tiene un ciclo de vida corto, madurez sexual temprana, alta inversin energtica en la reproduccin y baja, en el cuidado parental, gran nmero de descendientes (Risch, 1987), amplia distribucin geogrfica (Spark, 1979) y gran capacidad de desplazamiento, que en este caso est apoyada por un sistema de ecolocalizacin nico en invertebrados (Beerwinkle et al., 1994). S. frugiperda es una especie generalista que se encuentra desde el nivel del mar hasta los 2.000 msnm y utiliza ms de 80 hospederos cultivados y silvestres (Westbrook y Sparks, 1986). Adems, esta especie presenta gran variabilidad en ciertas caractersticas del ciclo de vida entre regiones (tropical y subtropical), y aun dentro de las mismas regiones, como respuesta a las condiciones ambientales biticas y abiticas. Entre stas, se ha registrado variabilidad en el nmero de huevos colocados por hembra, la duracin del ciclo de vida e incluso el nmero de instares (Keith, 1988). Adems, en el Tolima presenta biotipos (maz y arroz) que son idnticos morfolgicamente, pero que difieren en su composicin gentica, resistencia hacia insecticidas y Bacillus thuringiensis; el

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biotipo de maz es ms resistente que el biotipo de arroz (Vlez et al., 2008). Por todas las caractersticas anteriores existe el riesgo que al menos una proporcin de la poblacin sobreviva y se ajuste a los cambios ambientales y que en condiciones ptimas aumenten las poblaciones en muy corto tiempo (Spark, 1979). Adems de las caractersticas biolgicas de S. frugiperda, Colombia presenta una alta heterogeneidad biofsica en los agroecosistemas algodoneros y una rotacin permanente de cultivos que garantizan la reproduccin continua de muchas especies de herbvoros. Teniendo en cuenta lo anterior, se plante la necesidad de registrar el comportamiento del complejo Spodoptera ante la entrada del algodn transgnico al campo, como base para tomar medidas preventivas y reducir riesgos ambientales y econmicos. En este artculo se presentan los resultados del primer ao de trabajo (2005-2006) perodo en el que se hizo un registro del comportamiento de las larvas del complejo Spodoptera en cultivos comerciales de algodn en la zona central del Tolima.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

ltimo porcentaje corresponde al refugio). En cada planta se registr el nmero de larvas por especie y se discrimin tanto la ubicacin de la larva (hoja, botn, flor y cpsula) como su tamao (pequeas < 0,5 cm; medianas > 0,5 y < 1,5 cm; grandes > 1,5 cm) y la presencia de posturas. Anlisis estadstico La incidencia de larvas se calcul generando el porcentaje de la variable observada con respecto al total de plantas observadas (( larvas registradas / de plantas revisadas) 100)). Los datos no se ajustaron a una distribucin normal independientemente de las transformaciones realizadas, por lo cual se utilizaron pruebas de dependencia no paramtrica de Ji-cuadrado (X2) para evaluar la dependencia del complejo Spodoptera en funcin de los materiales genticos de algodn revisados y sus estados de desarrollo fenolgico. El anlisis de los datos y los resultados se apoyaron con grficas. Tamao de las muestras De los 83 lotes seleccionados al azar, 73 se sembraron con semilla transgnica Bollgard I (Monsanto) (Cry1Ac) y 10 con semilla convencional. En el primer caso se muestre un rea de 315 ha con sus respectivos refugios y en el segundo, 36 ha. Se revisaron 6.075 plantas transgnicas y 1.467 convencionales, para un total de 7.542 plantas revisadas en el primer semestre del 2005. El desbalance en el tamao de las muestras entre materiales genticos refleja el porcentaje del rea sembrada con semillas transgnicas ese ao en el Tolima que fue de 63,4% aproximadamente (ICA, 2007).
R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

Localizacin El trabajo se realiz en la zona central del Tolima, en los municipios de Espinal, Flandes, Guamo y Surez, donde se concentra 80% de la zona algodonera del departamento (CCI, 2007). Seleccin de fincas Se seleccionaron 83 lotes comerciales de algodn de 1 a 10 ha con una separacin entre s de 3 a 5 kilmetros. Todos los lotes se georreferenciaron y evaluaron hacia la mitad de cada una de las etapas de desarrollo fenolgico del cultivo definidas por la Federacin Nacional de Algodoneros (1986) as: etapa vegetativa, desde la germinacin hasta la aparicin de los primeros botones; etapa reproductiva, desde la aparicin de los primeros botones hasta la aparicin de las primeras cpsulas abiertas; etapa de maduracin, desde la aparicin de las primeras cpsulas abiertas hasta la recoleccin. En cada visita se evalu la incidencia de larvas del complejo Spodoptera (S. frugiperda., S. ornithogalli. y S. sunia.) en 7 plantas por hectrea seleccionadas al azar. Independientemente del tamao de los refugios de los lotes sembrados con materiales transgnicos, se revisaron en cada uno slo siete plantas al azar, ya que usualmente el sistema de siembra que domina en la zona es 96 : 4, o sea 96% de algodn transgnico y 4% de algodn convencional (este

Incidencia de larvas por material gentico La incidencia promedio de larvas del complejo Spodoptera (S. frugiperda, S. ornithogalli y S. sunia) en los 83 lotes evaluados teniendo en cuenta la lectura en los tres estados de desarrollo fue de 11,48% SE 4,00; al discriminar entre materiales genticos se registr un mayor porcentaje de larvas del complejo Spodoptera en plantas transgnicas (11,98% SE 4,03) que en las convencionales (9,13% SE 3,08) (0,0021) (figura 1). Esta relacin mostr dependencia significativa con excepcin de S. ornithogalli (X2 = 0,01) (tabla 1). La tendencia se conserv al discriminar la incidencia de cada especie del complejo Spodoptera por material gentico (figura 2). La mayor incidencia registrada en el algodn transgnico puede deberse a que en los lotes de algodn NuOpal la calidad del hbitat favorece las poblaRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 24-32

Evaluacin del comportamiento del complejo Spodoptera con la introduccin de algodn transgnico al Tolima, Colombia

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por semestre. Adems, se reduce la competencia interespecfica entre insectos herbvoros por la mortalidad de las especies susceptibles a estos materiales como Sacadodes pyralis, Pectinophora gossypiella, Alabama argillacea, Heliothis virescens y Helicoverpa zea. En cuanto al algodn transgnico, existen reportes de menor concentracin de gosipol (Monsanto, 2002), sustancia que protege la planta del ataque de insectos herbvoros (Stipanovic et al., 2008)-, y de mayor fuente de aminocidos, protenas y cidos grasos que podran aumentar la tasa de reproduccin y disminuir el ciclo de vida de dichos insectos herbvoros, propiciando un mayor nmero de generaciones por ciclo del cultivo. Adems, Barragn (comunicacin personal, 2008) ha registrado un follaje ms exuberante y verde en las plantas de algodn NuOpal que en los materiales convencionales en el Tolima, lo que fisiolgicamente representan un mayor nmero de nectarios y y azucares disponibles para los adultos del complejo Spodoptera. Esta situacin pone en riesgo las expectativas de los agricultores de mantener un bajo nmero de aplicaciones de insecticidas en los cultivos de algodn transgnico, ya que se encontr que las especies del complejo Spodoptera y en especial de S. frugiperda catalogada como estratega r (Risch, 1987), se alimentan de las flores y las cpsulas (figuras 1 y 2), de las cuales depende la produccin del cultivo. Estos resultados apoyan lo planteado por Zenner y colaboradores (2008), quienes sugieren que con el tiempo S. frugiperda y S. sunia pueden pasar de ser plagas secundarias a primarias por la baja susceptibilidad que presentan a la toxina Cry1Ac de la variedad Bollgar sembrada en Colombia. Esto se refuerza con los trabajos de Borrero y Zenner (1998), quienes reportaron un incremento de 4,6 veces la CL50 de S. frugiperda, despus de una presin de seleccin de cuatro generaciones en laboratorio sobre una poblacin, con una formulacin comercial de Bt (mezcla de cinco toxinas, incluyendo Cry1Ac). En condiciones de campo, estas especies, que actualmente estn sometidas a una constante presin de seleccin en los sistemas de rotacin algodn-maz con materiales genticamente modificados, pueden acelerar el desarrollo de resistencia a estos materiales genticos. Incidencia de larvas por estado de desarrollo fisiolgico y material gentico
Figura 2. Larva de S. frugiperda en cpsula

Figura 1. Larva de S. frugiperda en flor Tabla 1. Prueba de dependencia (X2 = 0,01) de la incidencia de larvas del complejo Spodoptera sin discriminar los materiales genticos de algodn (NuOpal, Delta Opal) en el centro del Tolima, semestre A, 2005.
Variable Complejo Spodoptera Spodoptera frugiperda Spodoptera ornithogalli Spodoptera sunia
* Diferencia significativa ( = 0,01).

Grados de libertad 1 1 1 1

Valor 9,4763 46.813 0,9437 5,128

Probabilidad 0,0021* 0,0305* 0,3313 0,0235*

ciones del gnero Spodoptera debido a que hay una reduccin en el nmero de aplicaciones de insecticidas de 50%, lo que en el Tolima representa al menos dos aplicaciones
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La incidencia promedio de larvas por planta del complejo Spodoptera (S. frugiperda, S. ornithogalli y S. sunia) aument a medida que avanz el desarrollo fisiolgico de las plantas de algodn en los dos materiales genticos evaluados,

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Evaluacin del comportamiento del complejo Spodoptera con la introduccin de algodn transgnico al Tolima, Colombia

dependencia fue significativa (x2 = 0,01). En trminos generales, S. sunia se presenta con mayor incidencia en el estado vegetativo del cultivo, S. ornithogalli, en el reproductivo y S. frugiperda, en el reproductivo y en maduracin (figuras 5a y 5b). Incidencia de larvas del complejo Spodoptera por estructura Se encontr una dependencia significativa (x2 = 0,01) entre el porcentaje de larvas por especie y su ubicacin en las estructuras de las plantas sin discriminar los materiales genticos y al discriminarlos. Esto significa que hay un patrn espacial definido de cada especie en la planta de algodn: S. frugiperda predomina en flores y cpsulas; S. ornithogalli, en hojas y flores y S. sunia, en hojas (figuras 6a y 6b). Este patrn se mantuvo entre materiales genticos pero se registr una diferencia en el porcentaje de larvas en cpsulas con S. frugiperda y S. ornithogalli. La incidencia de la primera especie fue mayor en las plantas transgnicas que en las convencionales mientras que el porcentaje de la segunda especie fue mayor en las plantas no transgnicas.

Figura 3. Incidencia en porcentaje de larvas del complejo Spodoptera en dos materiales genticos de algodn en la zona central del Tolima, semestre A, 2005

Figura 4. Incidencia en porcentaje de larvas de especies del complejo Spodoptera por material gentico de algodn en la zona central del Tolima, semestre A, 2005

siendo menor la incidencia en el convencional (vegetativo 4,8% SE 2,01; reproductivo 10,4% SE 3,23 y madurez 12,01 SE 3,81) que en el transgnico (vegetativo 7,23% SE 3,15; reproductivo 12,09% SE 3,51 y madurez 15,12% SE 4,81) (figuras 5a y 5b); la dependencia fue significativa (x2 = 0,01). Esto puede relacionarse con la disminucin de la concentracin de la protena especfica Cry1Ac a medida que aumenta la edad de la planta, tal como lo han reportado Olsen y colaboradores (2005), quienes indican que a medida que el cultivo se desarrolla, la concentracin de la protena disminuye, por ende en los primeros estados de desarrollo fonolgico la planta expresar mayor concentracin de la protena Cry1Ac que en los posteriores. Estos autores sealan que dichos cambios disminuyen la eficiencia del control. Este comportamiento de la planta se debe a cambios en el nivel de expresin del gene y/o a la constitucin fisiolgica de la planta y pueden ser inducidos por las condiciones ambientales. Este patrn se conserv tanto en algodn transgnico (NuOpal) como en el convencional (DeltaOpal) y la
Figura 5. Incidencia en porcentaje de larvas del complejo Spodoptera por estados de desarrollo en material de algodn convencional (a) y transgnico (b) en el centro del Tolima, semestre A, 2005

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Tamao de larvas por estructura Aunque no se registr dependencia significativa entre el tamao de las larvas de cada especie del complejo Spodoptera con las estructura de la planta (hoja, flor y cpsula) por material gentico (X2, = 0,01), se presentan las grficas para facilitar el anlisis de los resultados. En las hojas de algodn transgnico y convencional se presentaron todos los tamaos de larvas de estas especies, con excepcin de las larvas grandes de S. frugiperda en algodn convencional (figuras 7a y 7b). En las plantas transgnicas predomin la presencia de larvas grandes y medianas de S. ornithogalli y larvas medianas y pequeas de S. sunia. Estas son las dos especies que predominan en la etapa vegetativa del algodn.

Figura 6. Incidencia en porcentaje de larvas del complejo Spodoptera por estructuras en material de algodn convencional (a) y transgnico (b) en el centro del Tolima, semestre A, 2005

Existe mayor incidencia de S. frugiperda en cpsulas y flores en los dos materiales de algodn, estructuras que junto con el botn floral presentan menor concentracin de Cry1Ac en los materiales genticamente transformados (Zenner et al., 2008). Estos autores evaluaron durante diferentes el desarrollo de la planta la concentracin de la toxina en los tejidos de las estructuras de Bollgard, y encontraron en las hojas cotiledonales la mayor concentracin de la protena especfica Cry1Ac (4,625 ppm) y en la flor sin fecundar la menor (0,65 ppm); las larvas en la flor se observaron antes de la antesis y no despus. Tambin reportan que las menores concentraciones de la toxina se presentan en el botn floral (1,67 ppm) y en la cpsula (1,82 ppm). Estos datos permiten inferir que hay una ventana de escape de las especies respecto a la toxina del algodn transgnico que vara en la planta. La baja concentracin de la toxina en los tejidos hace que el control esperado sea bajo y refuerza los resultados de otros investigadores (Garczynski et al.1991; Bohorova et al. 1997; Zenner et al., 2005; Pardo et al., 2006).
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Figura 7. Incidencia en porcentaje de larvas por tamao del complejo Spodoptera en hojas de algodn convencional (a) y transgnico (b) en el centro del Tolima, semestre A, 2005

En las flores del algodn transgnico y convencional predominaron las larvas pequeas de S. frugiperda, seguidas de las medianas y grandes. S. ornithogalli mantuvo el mismo patrn pero con porcentajes muy bajos (figuras 8a y 8b).

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Figura 8. Incidencia en porcentaje de larvas por tamao del complejo Spodoptera en flores de algodn convencional (a) y transgnico (b) en el centro del Tolima, semestre A, 2005

En las cpsulas tambin predominaron las larvas de S. frugiperda sobre las otras especies con dominio de larvas grandes y medianas en ambos materiales genticos (figuras 9a y 9b). El registro en campo de larvas medianas y grandes en todas las estructuras de algodn transgnico puede ser producto de varios factores. Por un lado, se registra una sobrevivencia natural de larvas del complejo Spodoptera superior al 50% en los materiales de algodn con la tecnologa Cry1Ac, dentro de la cual est el algodn NuOpal sembrado en Colombia (Adamczyk et al. 2001; Adamczyk y Gore, 2004; Daz y Montenegro, 2003). Por otro lado, la expresin de la toxina Cry1Ac vara en los tejidos con el desarrollo de la planta, y entre las estructuras de la misma (Olsen et al., 2005; Zenner et al., 2008). Greenplate y colaboradores (2000) registraron un aumento en la concentracin de la protena desde el primer nudo hasta el noveno, donde alcanza la mxima concentracin, punto a partir del cual empieza a bajar. Se registran concentraciones de 5 ppm en el quinto nudo, 7 ppm en el noveno y llega a 4 ppm en el nudo 17. Estos autores encontraron en los

Figura 9. Incidencia (%) por especies del complejo Spodoptera, por tamao de larvas en cpsulas de algodn convencional (a) y transgnico (b) en el centro del Tolima, semestre A, 2005

tejidos terminales, los botones florales y las cpsulas, concentraciones de 22,3; 14,1 y 17,1 L de Cry1Ac por gramo de peso seco de tejido, respectivamente. Esta variacin en las concentraciones puede aumentar las probabilidades de sobrevivencia de las larvas. En Australia, Gore (2001) registr la mortalidad de Helicoverpa zea en laboratorio al ser alimentadas con diferentes estructuras de las platas de algodn DP5, Boollgard y Bollgard II de DP50. Con los tres materiales se obtuvo el mismo patrn de sobrevivencia: mnima en brcteas, seguida de los botones florales y de ptalos y mxima en las anteras de los botones y de las flores despus de 24, 48 y 72 h de exposicin a los tejidos. Con Bollgars II se registraron los porcentajes ms bajos de sobrevivencia a las 72 horas: 6% con brcteas, 63% y 50% con anteras de botones y flores. Finalmente, el comportamiento alimenticio de las larvas del complejo Spodoptera y el manejo tecnolgico de los cultivos pueden ampliar la ventana de escape que tienen
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actualmente las larvas de S. ornithogally y S. frugiperda en estos materiales. Por un lado, hay un porcentaje no cuantificado de larvas que pasan de las malezas a las plantas de algodn despus del segundo instar (Sundbland 1982), etapa en la que las larvas son poco susceptibles a la toxina Cry1Ac. Por otro lado, la preferencia alimenticia de las larvas de S. frugiperda por las estructuras que tienen la menor concentracin de la toxinas de la planta (flores sin fecundar y cpsulas) potencializan esta ventana de escape. Los puntos anteriores ayudan a explicar la mayor incidencia de larvas del complejo Spodoptera registrada en las plantas transgnicas en la zona del Tolima y permiten identificar los puntos frgiles de esta tecnologa y de su manejo. La entrada masiva de un material gentico de algodn contra lepidpteros (Bollgard I (Monsanto) (Cry1Ac) NuOpal) y la poca experiencia de agricultores, asistentes, tcnicos e investigadores en el tema exigen un plan de capacitacin, seguimiento de plagas y diversificacin de materiales genticos con el fin de reducir riesgos ambientales y econmicos. Aunque la segunda generacin de semillas de algodn transgnico ya est disponible en otros pases y se desarroll para aumentar la resistencia del algodn al complejo Spodoptera, en estos materiales tambin se registra variabilidad en la expresin de las toxinas y la mortalidad de las larvas no es total (Greenplate et al. 2000). La flexibilidad gentica de S. frugiperda y su preferencia por alimentarse en las estructuras con baja expresin de las toxinas Bt (flores y cpsulas) aumentan los riesgos de desarrollar tolerancia a la nueva generacin de algodones transgnicos.
CONCLUSIONES

explicar este resultado, se evidencia el riesgo potencial que tiene este complejo para pasar de plagas secundarias a primarias en algodn Cry1Ac . Se registr un patrn espacial entre las especies observadas y las estructuras de la planta tanto en los materiales de algodn genticamente modificados como en los convencionales: S. frugiperda predomina en flores y cpsulas, S. ornithogalli en hojas y flores y S. sunia en hojas. Se registraron larvas pequeas, medianas y grandes de todas las especies (S. frugiperda., S. ornithigalli y S. sunia) en flores y cpsulas, estructuras donde la expresin de la endotoxina Cry1Ac es ms baja. La interaccin entre la expresin diferencial de toxina Cry1Ac en las estructuras de la planta de algodn NuOpal y los patrones alimenticios de S. frugiperda abren una ventana de escape para esta especie a la endotoxina Cry1Ac y aumenta el riesgo de incrementar la tolerancia reportada experimentalmente en Colombia (50%). La correcta identificacin de las larvas y su tamao, y los patrones alimenticios de cada especie deben tenerse en cuenta en los estudios de seguimiento y evaluacin de plagas en algodn genticamente modificado, as como en la determinacin de los umbrales de riesgo de S. frugiperda en estos materiales.
AGRADECIMIENTOS

Se registr mayor incidencia de las especies del complejo Spodoptera en el algodn transgnico que en el convencional y aunque hay varios factores que interactan para

Los autores expresan su agradecimiento a Conalgodn, por financiar ste trabajo, al doctor Guillermo Snchez Gutirrez por su orientacin; a los 83 agricultores de los municipios de Espinal, Guamo, Flandes y Chicoral que prestaron sus lotes al proyecto y a los tcnicos del C.I. Nataima por su apoyo en los muestreos de campo.

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recu rsos

g e n t i c o s v e g e ta l e s

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A R t c u lo D e R e V I S I N

Agrobiodiversity genetic resources conservation for the development of sustainable production systems

Conservacin de recursos genticos de la agrobiodiversidad como apoyo al desarrollo de sistemas de produccin sostenibles
Mario Lobo Arias1, Clara Ins Medina Cano2
RESUMEN

Human population growth and environmental changes require the availability of genetic diversity for the development of sustainable, efficient and competitive production systems. This means collection, conservation and characterization of the attributes present in the genetic resources of current important taxa and wild related, and promising species with development potential, which is magnified for a current genetic erosion. It requires complementary ex situ and in situ conservation strategies as well as prioritization of the diversity to be included in the process, due to the conservation costs, considering not only economic values, but also social aspects and the access limitations to genetic resources at international level. The current paper includes a revision related to the importance of the conservation of the plant, animal and microorganisms genetic resources, concerned to agrobiodiversity, with some discussion related to this topic, as well as aspects to be considered for the priorities of species and type of materials to be conserved. For such purpose, the premise is that such diversity, after added-value processes, could be used for the development of sustainable agricultural production systems. Keywords: Germplasm bank, genetic erosion, conservation priorities.

ABSTRACT

El crecimiento poblacional y los cambios en el entorno requieren de la disponibilidad de diversidad gentica para el desarrollo de sistemas de produccin sostenibles, eficientes y competitivos. Esto implica colectar, conservar y conocer los atributos de las poblaciones en mantenimiento de especies de valor actual y taxones relacionados, al igual que entidades biolgicas con potencial de desarrollo, lo cual cobra importancia dada la creciente erosin gentica. Esto plantea la necesidad de estrategias complementarias de conservacin ex situ e in situ, dando prioridad a la variabilidad gentica a ser incluida en el proceso, debido a los costos de mantenimiento, y considerar factores no slo econmicos sino tambin sociales, as como los limitantes actuales para acceder a la diversidad internacional. Este artculo presenta una revisin sobre la importancia de la conservacin de los recursos genticos vegetales, animales y de microorganismos de la agrobiodiversidad, e incluye una discusin y algunos aspectos requeridos para la priorizacin de taxones y tipo de materiales que se deben incluir en el proceso. Para ello, se parte de la premisa de que la conservacin de la diversidad gentica sirve para la realizacin de procesos de valor agregado y de utilizacin posterior. Palabras clave: bancos de germoplasma, erosin gentica, prioridades de conservacin.
INTRODUCCIN

Radicado: 4 de febrero de 2009 Aprobado: 27 de abril de 2009

e ha indicado que la biodiversidad contribuye a la productividad, sostenibilidad y estabilidad de los sistemas agrcolas independientemente del nivel de complejidad de stos (Kessler, 2008); por otro lado, hay preocupacin mundial por su prdida acelerada (Firbank, 2005), y se ha predicho una extincin importante de especies hacia el ao 2050 como secuela de los cambios en el clima y en el uso de la tierra (Jenkins, 2003; Thomas et al., 2004). Sobre lo anterior, Faith y colaboradores (2008) afirmaron que entre los aspectos biolgicos del cambio global ninguno es ms importante que la prdida de biodiversidad; por su parte, Harvey y colaboradores (2008) aseveran que en el manejo de los sistemas tropicales, el reto

Ph.D. Investigador titular, Grupo de Recursos Genticos y Mejoramiento de Frutales Andinos. Corpoica, C.I. La Selva, Rionegro, Antioquia. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Medelln. mlobo@corpoica.org.co 2 Investigadora mster asociada, Grupo de Recursos Genticos y Mejoramiento de Frutales Andinos, C.I. La Selva, Rionegro, Antioquia. cmedina@corpoica.org.co
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2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

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Conservacin de recursos genticos de la agrobiodiversidad como apoyo al desarrollo de sistemas de produccin sostenibles

mayor es satisfacer la demanda creciente de productos agrcolas, conservar la variabilidad gentica y los servicios ecosistmicos crticos y mantener el bienestar de las poblaciones rurales. Maxted y colaboradores (1997a) indicaron que en relacin con la conservacin, el reto clave para los cientficos tiene tres facetas: estudiar y clasificar la diversidad biolgica; detener la prdida de los ecosistemas, especies y diversidad gentica, y alimentar una poblacin humana creciente. Posteriormente, Maxted y colaboradores (2002) postularon que la conservacin de la diversidad de plantas es de importancia crtica por los beneficios directos que la humanidad puede derivar de la explotacin de cultivos agrcolas y hortcolas mejorados, as como por el potencial del desarrollo de nuevas medicinas y otros productos, y por el papel que juegan los taxones vegetales en el funcionamiento de los ecosistemas naturales. Hay dos formas de conservar los recursos genticos de la agrobiodiversidad, in situ y ex situ, las cuales no son excluyentes, pues como ha puntualizado Brush (2000), entre otros, se puede desarrollar una estrategia complementaria de estas dos. De acuerdo con el Convenio sobre la Diversidad Biolgica (Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y el Desarrollo, 1992), la primera se refiere a la conservacin de los ecosistemas y los hbitats naturales y el mantenimiento y recuperacin de poblaciones viables de especies en sus entornos naturales y, en el caso de las especies domesticadas y cultivadas en los ambientes en que hayan desarrollado sus propiedades especficas. Cabe sealar que, actualmente, la mayora de la agrobiodiversidad remanente in situ se encuentra en las fincas de semisubsistencia de los pases ms pobres y aun en los jardines caseros de las naciones industrializadas (Brookfield, 2001; Brookfield et al., 2002; IPGRI, 2003). El mismo instrumento define la conservacin ex situ como el mantenimiento de componentes de la diversidad fuera de sus hbitats naturales. Cabe anotar que tambin existe preocupacin por la prdida de agrobiodiversidad, como conjunto, propiciada por el cambio en el uso del suelo y de su cobertura, con una consecuente transformacin de los hbitats (MEA, 2005), lo que proviene en las zonas de cultivo de la reconversin de estas reas (Pascual y Perrings, 2007). Esto ha conducido en muchos casos a deforestacin y desertificacin (Lambin et al., 2001; Perrings y Gadgil, 2003). Lo anterior ha llevado a pensar que la sostenibilidad de las reas agrcolas puede involucrar un continuum de sistemas de manejo, desde explotaciones modernas intensivas hasta sistemas tradicionales (Pascual y Perrings, 2007).

Conservacin de recursos genticos vegetales Con relacin a los recursos genticos vegetales, Brown y Brubaker (2002) sealaron que en el siglo XX se produjo una transicin grande sobre la apreciacin de la diversidad gentica vegetal; esto se inici con el redescubrimiento de las leyes de la herencia postuladas por Mendel y los conceptos de Johanssen que contribuyeron al desarrollo del mejoramiento de plantas, lo cual se sum a una visin del mundo posdarwiniano de que haba suficiente variabilidad gentica y que sta no estaba en riesgo. Luego, de acuerdo con Brown y Brubaker (2002), se fue creando una conciencia de que la variabilidad gentica es limitada; a propsito, Vavilov indic en la dcada de 1920 y Harlan en la de 1930, una prdida mundial de variedades tradicionales de agricultor (Scaracia-Mugnozza y Perrino, 2002). Esto cre la necesidad de conservar, lo que se deriv del hecho de que los recursos genticos constituyen la materia prima para el desarrollo de nuevas variedades por parte de los mejoradores, las cuales son indispensables para satisfacer las demandas de una poblacin creciente y las impuestas por nuevos limitantes derivados de la presin de las plagas, enfermedades y condiciones ambientales cambiantes (Rice, 2007). La percepcin de la prdida de recursos genticos de las plantas propici -en la Conferencia Tcnica de FAO/ IBP sobre exploracin, utilizacin y conservacin de recursos genticos vegetales, reunida a finales de la dcada de 1960- la definicin de una estrategia global de conservacin, la cual se deriv, especialmente, de la preocupacin por la desaparicin de variedades de agricultor y materiales silvestres relacionados, debido a la introduccin de cultivares mejorados en la agricultura moderna. La estrategia de conservacin se vio favorecida por la existencia de tcnicas de almacenamiento ex situ, a largo plazo y en fro (ScaraciaMugnozza y Perrino, 2002); lo que, de acuerdo con Hammer y colaboradores (2003), condujo al establecimiento de colecciones de germoplasma, conocidas como bancos de genes o colecciones ex situ. Al respecto, Charafi y colaboradores (2008) indicaron que la conservacin de los recursos genticos es esencial para preservar los atributos de adaptacin y disponer de genes importantes para el fitomejoramiento. Como secuela de lo precedente, en la dcada de 1970 se produjo un esfuerzo de colecta y conservacin, con estrategias para el mantenimiento de las poblaciones domesticadas (variedades de agricultor, cultivares obsoletos, poblaciones de mejoramiento, variedades mejoradas y materiales especiales) y los silvestres relacionadas con las plantas cultivadas. En el caso de las domesticadas el enfoque fue preservacin ex situ, en bancos de germoplasma y para los silvestres in situ, en reservas naturales (Frankel
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y Soul, 1981). Lo anterior se complementa con el mantenimiento en las fincas de los agricultores de variedades locales, lo que corresponde a la modalidad in situ; con conservacin y aplicacin del conocimiento tradicional y posibilidades de acceso a stas por parte de las comunidades locales (Brown, 2000). Esto ltimo favorece el mantenimiento de materiales diversos, ya que de acuerdo con Smale y colaboradores (2004), la conservacin se canaliza a variedades locales en ambientes diferentes. Magos y colaboradores (2008) anotaron que las especies silvestres relacionadas con los cultivos y las especies cosechadas de esta ndole tambin ameritan acciones de conservacin, ya que corresponden a un conjunto importante de recursos genticos de cada nacin por su potencial de utilizacin, pese a lo cual sus poblaciones naturales estn amenazadas por la prdida y fragmentacin de los hbitats. Lo precedente seala la necesidad de adoptar polticas y acciones de conservacin de los recursos genticos de las especies para la alimentacin y la agricultura. El peligro de erosin gentica y la necesidad de estrategias de conservacin llev a la Comisin de Recursos Genticos para la Alimentacin y la Agricultura de la FAO (1996) a incluir en el Plan de Accin Mundial para la Conservacin y Utilizacin Sostenible de los Recursos Fitogenticos para la Alimentacin y la Agricultura dos captulos dedicados a actividades relacionadas con la conservacin ex situ e in situ. Maxted y colaboradores (1997b) afirmaron que la complementariedad de la conservacin ex situ e in situ es especialmente importante en el caso de las especies relacionadas con las cultivadas (Gepts, 2006; Fowler y Hodgkin, 2004). Por su parte, Andersen y colaboradores (2009) afirman que la planeacin de estrategias ptimas de conservacin para las plantas cultivadas y silvestres es influenciada por factores biolgicos y ambientales que deben considerarse desde el inicio. Por las consideraciones expuestas, que indican la necesidad de conservar para evitar prdidas y tener variabilidad disponible, se han conformado los bancos de germoplasma. En el caso de los vegetales, en dichos bancos se debe mantener bsicamente la diversidad de especies desarrollada por agricultores (variedades locales o de agricultor), una muestra de los cultivares comerciales desarrollados por los mejoradores, los taxones relacionados del complejo silvestre-maleza y la variabilidad de especies potenciales o relegadas que se busca desarrollar o tienen posibilidades de perderse. Adicionalmente, otro componente de estas colecciones son las llamadas variedades obsoletas, que corresponden a cultivares antiguos con posibles combinaciones importantes de atributos genticos. Sin la
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comodidad y la confiabilidad de los bancos genticos, los investigadores tendran que realizar continuamente expediciones en bsqueda de muestras para sus programas de mejoramiento (Plucknett et al., 1992). En los bancos de germoplasma del mundo se encuentran almacenadas aproximadamente 6,1 millones de accesiones (FAO, 1997), pertenecientes a un nmero muy limitado de especies vegetales, y de las cuales la mayor parte, alrededor del 50%, son cultivares o lneas de mejoramiento; una tercera parte corresponde a variedades de agricultor y variedades obsoletas; y con una representacin baja, aproximadamente 15%, son taxones silvestres y arvenses relacionados con las entidades cultivadas (Hammer et al., 2003). En conexin con lo anterior, se ha sealado que uno de los vacos importantes de especies en conservacin est constituido por las especies subutilizadas y relegadas, con nfasis particular en los cultivares primitivos y los silvestres relacionados de los centros de origen, diversidad y cultivo (Hammer et al., 2003). La cobertura de las especies en conservacin presenta desequilibrios en cuanto a la representatividad de la metapoblacin global por taxn o conjunto de taxones. As, 40% de las accesiones en conservacin corresponde a cereales, de las cuales un milln de demes son de las tres entidades biolgicas de mayor consumo: trigo, maz y arroz; 15% a leguminosas comestibles y 10% o menos a cada uno de los grupos que comprenden hortalizas, tubrculos, races, frutales y plantas forrajeras (Hammer et al., 2003). En lnea con lo precedente, Hammer (2003) y Hammer y colaboradores (2003) informaron que las muestras almacenadas, mundialmente, pertenecen aproximadamente a 100 especies vegetales, de cerca de 7.000 empleadas por el hombre para alimentacin y agricultura. A pesar de la conformacin de los bancos de germoplasma, en stos hay una baja representacin de muchas especies e incluso inexistencia de colecciones de otras, con el agravante que la diversidad agrcola contina disminuyendo. En este contexto, Schrder, Begemann y Harrer (2007) informaron que alrededor de las tres cuartas partes de la diversidad gentica de los cultivos usados en agricultura se perdi en el siglo pasado, con una erosin gentica en proceso. Los investigadores agregaron que actualmente 150 cultivos corresponden al alimento de la poblacin humana, y que 12 de stos suministran 80% de las caloras derivadas de los vegetales; con un aporte de 60% por parte del arroz, trigo, maz y la papa. Lo planteado puntualiza la necesidad de conservar la diversidad amenazada, para promover su utilizacin y suplir las necesidades del futuro y, de esta forma, apoyar el cumplimiento de la meta incluida en uno de los objetivos de Desarrollo para el Milenio, a saber: Reducir a la mitad el hambre y la pobreza para el 2015 (IPGRI; GFAR; MSSRF, 2005).

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Los agricultores han conservado la agrobiodiversidad mediante la obtencin de semillas y propgulos vegetativos y su siembra continua; ste es un proceso dinmico, en el que se selecciona e introduce permanentemente variabilidad mediante el libre intercambio de materiales entre comunidades. Lo precedente ha conducido al desarrollo de las llamadas variedades locales, folclricas, primitivas de agricultor, las cuales en concepto de Brown (2000) tienen como ventajas, entre otras, la adaptacin a ambientes marginales y a estrs, con una conservacin vinculada a su utilizacin y con un proceso evolutivo en marcha, como respuesta a cambios ambientales y presiones de patgenos y pestes. La conservacin en los entornos naturales no ha sido un patrimonio exclusivo de los pases en desarrollo, con ejemplos de esfuerzos de esta ndole en naciones desarrolladas; as, en Suiza se han propiciado acciones de conservacin por esta va en la zona alpina, lo cual parti del reconocimiento de la multifuncionalidad de la agricultura en reas montaosas marginales del pas, con apoyo de fondos pblicos y privados para el mantenimiento de variedades locales, agroecosistemas, paisajes naturales, prcticas culturales y comunidades rurales (Bardsley y Thomas, 2004). Tambin se encuentran relictos de materiales primitivos en los pases del norte, como es el caso de los trigos cubiertos en la zona de Asturias, Espaa, aun cuando estn en peligro de prdida y reemplazo (Caballero, Martn y lvarez, 2007). Se ha reportado la presencia de agrobiodiversidad en los llamados huertos caseros de los pases industrializados, caso Hungra, considerados microagroecosistemas que proveen seguridad alimentaria y dietas de calidad (Birol, Smale y Gyovai, 2006). Los huertos citados tambin se encuentran en los pases del trpico y han sido considerados eptome de la sostenibilidad, que suministran alimento a millones de personas, a partir de la explotacin mltiple de especies, pese a lo cual han sido poco estudiados por la ciencia (Kumar y Nair, 2004). Un componente importante de la agrobiodiversidad son las variedades locales o de agricultor manejadas por pequeos productores o grupos de stos. Se han definido como una poblacin o poblaciones dinmicas de una planta cultivada, genticamente diversas, que tienen un origen histrico, identidad propia y no han sido objeto de mejoramiento formal, presentando adaptacin local y asociacin con sistemas tradicionales de produccin (Camacho et al., 2005), por lo cual se les ha relacionado con sitios geogrficos especficos (Jones et al., 2008). Dulloo y colaboradores (1998) indicaron que ningn procedimiento permite conservar adecuadamente la variabilidad gentica de una especie dada o un conjunto de taxones, por lo que se requiere utilizar un conjunto de diferentes tcnicas de mantenimiento, en forma simultnea

y combinaciones de metodologas ex situ e in situ. Tambin informaron que las especies del gnero Coffea se han conservado en campo como bancos de plantas vivas, por presentar semillas intermedias, por lo cual se han desarrollado protocolos complementarios, de otra ndole, derivados de la biotecnologa, que incluyen mantenimiento in vitro, en medios de crecimiento lento y crioconservacin, para la conservacin a corto y largo plazo, lo que es igualmente vlido para entidades biolgicas con semillas recalcitrantes. En este contexto, se ha afirmado que las colecciones de los frutales tropicales con semilla recalcitrante se establecen normalmente como bancos de campo, con material clonal (Tao, 2001). Estos representan combinaciones deseadas de genes y no la variabilidad de las especies, por lo cual habra posibilidades de mantener mayor diversidad gentica mediante la crioconservacin de tejidos o semillas. Lobo y colaboradores (2007) propusieron un modelo de conservacin dinmica de la variabilidad de Annona cherimola (chirimoya) y Annona muricata (guanbana), especies frutales con semilla ortodoxa, que consiste en mantenimiento en campo de un nmero limitado de individuos por accesin -debido a los costos de mantenimiento- y conservacin, a largo plazo, en cuartos fros, de semillas de un mayor nmero de rboles de cada poblacin, como banco base, aspecto que permite mejor representacin de la variabilidad intrapoblacional. Lo anterior se complementa con la obtencin peridica de semillas de polinizacin abierta, provenientes de la coleccin de campo, lo que permite el enriquecimiento gentico, til para procesos de evaluacin y seleccin de nuevos materiales por parte de los investigadores y usuarios del germoplasma. El anterior modelo es aplicable a otros taxones con simiente ortodoxa cuya propagacin se realiza vegetativamente o cuya semilla es difcil obtener o son entidades de ciclo de vida largo; las primeras estn representadas por algunos tubrculos como la arracacha (Arracacia xanthorrhiza) y la papa (Solanum tuberosum) y las segundas, por frutales que incluyen la guayaba (Psidium guajava) y la mora (Rubus glaucus). Se han propuestos sistemas dinmicos de conservacin aun para especies autgamas. As, Porcher, Gouyon y Lavigne (2004) sugirieron un modelo de esta ndole, pues consideran que se debe incrementar la polinizacin cruzada de las plantas autgamas para limitar la prdida de variacin gentica causada por tamaos poblacionales reducidos y para favorecer la emergencia de nuevas combinaciones genticas. Recursos genticos animales El hombre ha conservado grupos de animales vinculados a procesos productivos, lo que condujo a la conformacin de razas. Estos conjuntos seleccionados y domesticados en forma local exhiben alta heterogeneidad, en comparaRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 33-42

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cin con las razas mejoradas. Dado lo anterior, las comunidades nativas las conservan por los efectos positivos de la diversidad en los rendimientos y su estabilidad de un ao a otro (Gliessman, 1998). En este sentido, se ha sealado que entre ms heterogneo sea el hbitat y mayores las fluctuaciones ambientales durante el perodo de crecimiento, ms grandes sern los efectos benficos de la diversidad (Tilman et al., 1999), siendo inherente, de los agroecosistemas tropicales, los cambios ambientales tanto biticos como abiticos durante el ciclo de vida de los animales incluidos en los sistemas de produccin. Aun cuando se ha escrito menos sobre la erosin de los recursos genticos animales, para la alimentacin y la agricultura, sta se ha considerado ms seria que la de los cultivos, ya que el acervo gentico utilizado es mucho ms pequeo y slo existen unas pocas especies silvestres relacionadas (Patisson, Drucker y Anderson, 2007). Adems, de las razas actuales, 70% se encuentra en los pases en desarrollo, donde el riesgo de prdida es considerable (Rege y Gibson, 2003). Entre los factores que amenazan esta diversidad se encuentran: cruzamiento con razas importadas o su reemplazo por stas para mejorar la productividad animal; relegamiento por cambios sociales, sistemas de produccin o demandas por ciertos productos animales; urbanizacin y su impacto en la agricultura tradicional de animales; sequa, conflictos civiles y hambre (Rege y Gibson, 2003). Sobre lo anterior Ruto y colaboradores (2008) conceptuaron que el reemplazo de variabilidad se ha derivado de la falta de competitividad econmica por parte de los conjuntos raciales locales, lo que ha producido preocupacin mundial por las consecuencias en el largo plazo derivadas de la prdida de este tipo de diversidad. Las razas animales poseen mayor variabilidad que cualquier variedad vegetal, lo cual permite intensificar la seleccin dentro de stas como una aproximacin exitosa para mejorar la produccin (Tilman et al., 1999). Sin embargo, la seleccin y el reemplazo de los animales por otros, elegidos por sus atributos, se produce a expensas de la variabilidad gentica, lo cual puede conducir a la prdida de atributos importantes relacionados con resistencia a enfermedades, fertilidad y adaptabilidad a condiciones ambientales, lo que tiene gran significado en el mediano y largo plazo. En el caso de los animales, as como en el de los vegetales, los recursos genticos de las especies productivas pueden ser conservados por las dos vas enumeradas previamente: ex situ e in situ. La primera incluye metodologas tales como la crioconservacin de semen y embriones, y el mantenimiento de animales en localidades designadas; la segunda se refiere a la tenencia de diversas poblaciones
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por granjeros en los agroecosistemas en los cuales las razas o conjuntos de individuos han evolucionado, lo que tiene como ventaja que se mantienen tanto el material gentico como los procesos que originaron la variabilidad (Pattison et al., 2007). Al respecto, Rege (2003) anot que la sostenibilidad de los esfuerzos de mejoramiento, en el largo plazo, depende de un suministro continuo de variacin que puede ser desarrollada y conservada por los encargados del ganado, usando sus prcticas propias de manejo. Sin embargo, se ha sealado que este tipo de conservacin puede tener problemas, ya que los factores que conducen a la adaptacin pueden amenazar la seguridad de las razas de ganado, como ocurre con los casos de guerras y desastres naturales, los cuales pueden conducir a erosin gentica en el tiempo (Pattison et al., 2007). Adicionalmente, en los sistemas de produccin, se realizan cruzamientos de animales seleccionados con otros de razas introducidas, con seleccin posterior de individuos superiores, lo cual conlleva a una prdida de la variabilidad desarrollada localmente. Los animales, al igual que las plantas, estn sometidos a procesos de estrechamiento en su diversidad gentica por destruccin de los hbitats naturales, donde los silvestres y relacionados de las especies utilizadas por el hombre se encuentran, lo cual se ve magnificado por la domesticacin y desarrollo de conjuntos de animales uniformes y por las preferencias de los productores o consumidores por ciertas razas (Tilman et al., 1999). Complementariamente, dado que una gran proporcin de la tierra se utiliza para la ganadera, el cultivo y otras necesidades humanas, los individuos silvestres relacionados con los taxones incluidos en procesos productivos, estn siendo cada vez ms escasos, reducindose el polimorfismo gentico presente en stos, y las oportunidades para incorporar esta variabilidad en los animales utilizados por el hombre. Para los recursos genticos animales la conservacin in situ es una buena alternativa para el mantenimiento y evolucin de la variabilidad gentica, dado su criterio dinmico. Sin embargo, los cambios en el entorno, la oferta de ejemplares de alta capacidad productiva y otros factores como los desplazamientos masivos por fenmenos de violencia han aumentado los riesgos de prdida de diversidad en los agroecosistemas de agricultura tradicional, lugares donde se encuentra una variabilidad intraespecfica importante, lo cual tambin es vlido para las especies y variantes de stas en los recursos genticos vegetales. Lo anterior es un aspecto crtico en Colombia por ser, segn las estadsticas de la ACNUR (ONU, 2008), el pas con mayor nmero de desplazados en el mundo: tres millones de personas.

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La diversidad gentica tambin se ha reducido, mundialmente, en los animales incluidos en sistemas productivos; a propsito se seala que el nmero de razas ha declinado sustancialmente en los ltimos 50 aos (Tilman et al., 1999). As, alrededor de 30% de stas, correspondiente a mamferos y aves, conectadas a procesos productivos, estn en riesgo de prdida, como consecuencia de la produccin comercial que ha conducido a uniformidad gentica. Lo anterior ha llevado a formular que es imperativo que la diversidad gentica de razas raras y en peligro y sus ancestros sea preservada como un seguro para las necesidades futuras, especialmente para el control gentico de nuevas enfermedades y parsitos y adaptacin a nuevos ambientes o aquellos que son producto del cambio climtico global en marcha (Tilman et al., 1999). Gibson y colaboradores (2007) indicaron que la conservacin efectiva, tanto in situ como ex situ, de los recursos genticos de los animales empleados por el hombre para la alimentacin implica un aporte sustancial de recursos sociales y econmicos en perodos prolongados de tiempo. Estos recursos sociales y econmicos, a menudo, estn disponibles en el mundo desarrollado, pero no en las naciones en desarrollo, donde se encuentra una gran proporcin de la diversidad gentica, aspecto que conduce a tomar decisiones sobre qu conservar. En ambos tipos de pases es importante asumir la conservacin con base en procesos previos de caracterizacin de la diversidad, para lo cual la caracterizacin fenotpica es una medida indirecta del polimorfismo, que da un estimado crudo de las variantes funcionales de los genes portados por un animal o una poblacin (Gibson et al., 2007). En lnea con lo expuesto, Talle y colaboradores (2005) puntualizaron que la conciencia del valor de los recursos genticos animales ha estimulado el estudio de la diversidad gentica de las razas locales, que puede ser caracterizada usando informacin fenotpica y genotpica para determinar prioridades de conservacin. Se deben considerar, adicionalmente, otros criterios como el peligro de prdida, presencia de atributos de importancia econmica o cientfica, y valores ecolgicos, histricos y culturales. En contexto con la prdida de recursos genticos animales debido a la seleccin de razas mejoradas -que contribuyen en forma directa a suplir las necesidades humanas de una manera ms eficiente- Drucker (2004) seal que el primer desafo de su conservacin es identificar las razones por las cuales la sociedad debe preservar los animales que los manejadores han descartado; lo cual incluye la caracterizacin y cuantificacin de los beneficios sociales potenciales de aquellos que han sido relegados por el mercado. El mantenimiento de este tipo de recursos genticos debe privilegiar especies y conjuntos intraespecficos de cada zona, donde las razas locales son mantenidas

e intercambiadas por un gran nmero de pequeos productores, en contraste con las mejoradas que estn asociadas con hatos grandes y concentracin en el sector (Hoffmann, 2007). La conservacin de esta variabilidad gentica, importante por su adaptacin a las condiciones locales, debe llevarse a cabo en los agroecosistemas en los que ha evolucionado. Esto implica un apoyo monetario para evitar su reemplazo por razas mejoradas cuyo costo potencial, de acuerdo con Pattison y colaboradores (2007), depende ampliamente de su cobertura; esto es, del nmero de conjuntos de animales objeto del programa, de la extensin del rea seleccionada para tal fin y del nmero de productores considerado necesario para un nivel adecuado de seguridad de ste. Los tenedores de estos conjuntos de animales son individuos con tradicin en el rea, que tienen un conocimiento profundo del ambiente natural en que stos prosperan (Pattison et al. 2007). Adicionalmente, los cambios en el entorno han conducido a que la gente joven de las reas donde existen las razas locales no se interese en el manejo de los animales y prefiera migrar a las ciudades, lo cual causa prdida del acervo de conocimientos sobre el ambiente y los animales (Khler-Rollefson, 2003). Lo anterior, sumado a los factores de desplazamiento (ONU, 2008), es una amenaza para la conservacin de estos conjuntos de individuos empleados para alimentacin y otros propsitos, que tienen adaptacin a ambientes especficos diversos. Lo anterior puntualiza la importancia del desarrollo de estrategias complementarias de conservacin in vivo e in vitro. Recursos genticos de microorganismos En los microorganismos, considerando la riqueza casi inconmensurable de este recurso, la conservacin parte de una definicin cuidadosa del tipo de entes biolgicos a ser incluidos en ella. Es importante anotar que la preservacin de estas colecciones generalmente se ha derivado de intereses cientficos y privados, lo cual conlleva a que cuando los investigadores se retiran, las mismas se pierden, aspecto atribuible a la falta de inters y de fondos para continuar con el mantenimiento. Tilman y colaboradores (1999) sealaron que dichas colecciones son producto de toda una vida de trabajo de muchos investigadores, lo que puntualiza que el soporte pblico es esencial para que este recurso biolgico se conserve y est disponible para ser empleado en la agricultura. Estos autores tambin sealan que se ha dado muy poca atencin a la conservacin del germoplasma de microorganismos, el cual representa un enorme recurso gentico para ser utilizado en la agricultura; y est sometido a prdida por factores como la destruccin y fragmentacin de hbitats, la conversin de ecosistemas a agroecosistemas, la erosin de los recursos animales y vegetales
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asociados, y la polucin y aplicacin de agroqumicos en los procesos productivos, entre otros. En contraste con su vulnerabilidad, se ha indicado que ningn ente biolgico permite una mejor conservacin ex situ que los microorganismos (Sampson et al., 1996) y que las colecciones microbiales pueden mantenerse por perodos largos de tiempo, tanto en forma activa, con subcultivos regulares, como anabiticamente en condiciones que aseguran estabilidad durante dcadas (Gams, 2002). Se ha sealado que el mantenimiento de cepas de este conjunto de especies se ha realizado en medios de cultivo, con transferencia serial, durante dcadas, sin cambios fenotpicos o genotpicos obvios (Mller et al., 2005). Segn Day y Stacey (2008) este procedimiento ya no es considerado una prctica estndar para la mayora de especies de esta ndole, lo que se deriva del hecho de que los cultivos activos en crecimiento sufren complicaciones derivadas de la adaptacin al ambiente in vitro, mutaciones genticas, anormalidades cromosmicas, mezcla de accesiones por fallas en la transferencia o el marcado de stas, contaminacin y prdida accidental de los cultivos, por lo cual se consider necesario el desarrollo de mecanismos para detener el crecimiento y reducir los riesgos anteriores. Estos autores indicaron que la conservacin de microorganismos a largo plazo depende de la induccin de las clulas a entrar en un estado metablicamente inactivo, para lo cual las formas ms empleadas comnmente son la congelacin y secado o tratamientos de criopreservacin. Desde el punto de vista operacional, la congelacin y secado se define como un mtodo de deshidratacin de las clulas por desecacin a travs de vaco (Adams, 2007); este procedimiento, conocido tambin como liofilizacin, es ampliamente empleado para conservar cultivos de bacterias y hongos (Tindall, 2007). La criopreservacin es un mtodo empleado crecientemente para la preservacin de microorganismos por parte de los llamados biobancos o centros de recursos biolgicos, los cuales se concentran en grupos discretos de organismos (Day y Stacey, 2008). Al respecto se ha postulado que en condiciones de almacenamiento a temperaturas ultrabajas (inferiores a -135C) no debe ocurrir deterioro del material o ste es muy reducido, y que la viabilidad es independiente del tiempo de almacenamiento. Walters y colaboradores (2004) indicaron que la viabilidad media del material crioconservado se estima en 3.000 aos. Day y Stacey (2008) postulan que hay cuatro premisas fundamentales que deben cumplirse en los biobancos: 1. pureza, esto es, que las accesiones estn libres de organismos contaminantes; 2. autenticidad, lo que corresponde a la idenRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 33-42

tidad correcta de cada material, idealmente, con identificacin taxonmica y nmero de entrada a la coleccin; 3. estabilidad, relacionada con caractersticas funcionales correctas; 4. datos de cualificacin relacionados con cada material preservado. Prioridades de conservacin Dado el nmero elevado de especies, particularmente en el caso de vegetales y microorganismos, y la variabilidad dentro de ellas, es imposible mantener, en el mbito nacional, colecciones de todos los taxones de uso actual o con potencial de empleo futuro. Por ello, se requiere priorizar cules entidades biolgicas deben ser conservadas y los tipos de materiales que deben incluirse. Al respecto Maxted y colaboradores (1997b) subrayaron que los factores a tener en cuenta para seleccionar los recursos genticos que se deben conservar son los siguientes: potencial econmico de uso; peligro de erosin gentica; diversidad gentica; distribucin ecogeogrfica; importancia biolgica y cultural; estado actual de conservacin; costo; factibilidad y sostenibilidad; legislacin, y consideraciones ticas y estticas. Otros temas a tener en cuenta en el diseo de una poltica de conservacin nacional son: 1. La inexistencia de intercambio libre de recursos genticos entre pases, a partir del reconocimiento explcito de la soberana nacional sobre dichos recursos en el Convenio sobre Diversidad Biolgica (Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y el Desarrollo, 1992). 2. En el caso de los vegetales, la promulgacin del Tratado Internacional de Recursos Fitogenticos para la Alimentacin y la Agricultura (FAO, 2001), que cre un sistema multilateral de acceso facilitado a los recursos fitogenticos que estn bajo la administracin y el control de las partes contratantes y son del dominio pblico (lo cual comprende los bancos de germoplasma), de un listado de especies incluidas en su anexo 1. Estas especies se seleccionaron con base en los criterios de interdependencia y seguridad alimentaria, cuyo acceso se concede con fines de utilizacin y conservacin para la investigacin, el mejoramiento y la capacitacin para la alimentacin y la agricultura (FAO, 2001). En concepto de Fowler (2004), el mencionado Tratado Internacional de Recursos Fitogenticos para la Alimentacin y la Agricultura reversa las restricciones del flujo de germoplasma impuestas por el Convenio sobre Diversidad Biolgica y da esperanza de que el dao causado por la falta de acceso facilitado sea subsanado, en el conjunto de taxones incluidos en el sistema multilateral. En el contexto precedente, Cooper (2002) destac que la pieza central del Tratado es el sistema multilateral, el cual garantiza el acceso facilitado a los recursos genticos de las espe-

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cies vegetales ms importantes para la alimentacin y a forrajes para el ganado, lo cual permite el desarrollo de variedades mejoradas para suplir las demandas crecientes de alimentos y abordar tpicos como el cambio climtico global. Este instrumento brinda un elemento para la definicin de especies y conjunto de materiales a conservar por especies. Lo anterior permite conocer a qu se puede acceder del listado y, con base en esto, determinar las poblaciones especficas, de los taxones enumerados en el Sistema Multilateral, que pueden obtenerse sin restricciones a partir de ste, lo que permitira reducir poblaciones en conservacin. Este aspecto debe complementarse con el mantenimiento de aquellas poblaciones que han evolucionado en el pas, en el caso de especies introducidas, de los taxones incluidos en la lista de acceso facilitado, los cuales han desarrollado atributos genticos de adaptacin a las condiciones locales. La necesidad de definir las especies que deben mantenerse vivas ex situ se debe a que las actividades de conservacin tendrn siempre el limitante de la falta de recursos financieros y tcnicos (Abramovitz, 1994). Adems, ya que no todos los taxones son igualmente importantes, significa que el curador est forzado a priorizar las especies objeto de programas de conservacin; por lo cual algunas entidades biolgicas y poblaciones deben seleccionarse para proteccin in situ y para colecta y mantenimiento ex situ, en tanto que otras no; aspecto para el cual es crucial tener alguna nocin del valor de la diversidad representada por dichas especies y poblaciones (Maxted et al., 1997b). La importancia de los recursos genticos para la alimentacin y la agricultura -por lo cual son deseados o valorados-, la clase de materiales a ser colectados y la manera en que son explotados, desarrollados y comercializados son fruto de reflexiones a travs del tiempo y, en particular, de la capacidad de la gente y las instituciones para usar los materiales, de la tecnologa disponible para este propsito y de la naturaleza de los mercados para los cuales se producen (Fowler y Hodgkin, 2004). La conservacin de recursos genticos animales implica costos importantes, ya que el mantenimiento de las razas debe llevarse a cabo en los agroecosistemas en que stas han evolucionado. Para ello se precisa adquirir terrenos y desarrollar la infraestructura necesaria para tal fin, en sitios ubicados en zonas con condiciones ambientales apropiadas para las especies y grupos seleccionados. Esto requiere una definicin cuidadosa de los taxones y los ncleos a conservar con base en consideraciones de peligros de prdida y de necesidad de apoyo a los planes de desarrollo nacionales, como tambin definir los tamaos poblacionales apropiados

y el diseo de una estrategia de apareamiento para mantener en un mnimo la endogamia. Tambin, esto requiere de fondos para la conservacin, como estrategia complementaria, de semen y embriones de las razas en conservacin (Talle et al., 2005) y de individuos de stas no presentes en los sitios de mantenimiento, as como de otras no incluidas en el programa de mantenimiento in vivo, por razones econmicas. Adicionalmente, la agrobiodiversidad en conservacin debe caracterizarse adecuadamente para darle valor agregado y promover su utilizacin en procesos productivos (Lobo, 2008); esto permite conocer la variabilidad de los materiales de las colecciones, determinar necesidades de consecucin de atributos no presentes en la metapoblacin de stas e identificar duplicados, lo que hace ms eficiente el proceso de mantenimiento, por reduccin del nmero de subpoblaciones en conservacin. Al respecto, Engelmann y Engels (2002) indicaron que el nmero de accesiones en un banco de germoplasma tiene un efecto directo en los costos operacionales.
CONCLUSIONES

Existen amenazas de erosin gentica en las especies relacionadas con la agrobiodiversidad. Esto implica la necesidad de acciones de conservacin para apoyar el desarrollo de sistemas de produccin sostenible que permitan afrontar los retos del crecimiento poblacional y de los cambios en el entorno. La agrobiodiversidad debe estar disponible para procesos de investigacin y produccin, por lo cual cobran importancia las colecciones ex situ, las cuales son complementarias a los procesos de conservacin in situ. Los materiales a vincular a las colecciones ex situ o bancos de germoplasma vegetales son principalmente las variedades locales o de agricultor y las especies relacionadas, y los taxones promisorios; as como las variedades obsoletas y una muestra de los cultivares comerciales. En el caso de los animales, los bancos de germoplasma deben constituirse principalmente con las razas nativas y criollas que han evolucionado en el medio ambiente del pas. En cuanto a microorganismos, una vez definidas las categoras y especies a conservar, stas deben privilegiar bsicamente cepas nativas. Dado el costo de la conservacin, las especies y materiales objeto del programa deben priorizarse, lo cual implica conocer el valor y potencial de stos.
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Conservacin de recursos genticos de la agrobiodiversidad como apoyo al desarrollo de sistemas de produccin sostenibles
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recu rsos

genticos an i Males

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A R t c u lo c I e N t F I co

Allelic frequencies for SNP variants in the gene Nramp1 in bovine infected with Brucella abortus or classified by resistance to the pathogen

Frecuencias allicas para variantes SNP en el gen Nramp1 en bovinos infectados con Brucella abortus o clasificados por resistencia al patgeno
Fernando Cerquera M.1, Rodrigo Martnez S.2, Rubn Toro O.3, Jaime Tobn C.4, Jaime Gallego G.5, Esperanza Rueda6

The natural resistance to brucellosis in cattle has been associated to genetic factors mainly to some single nucleotide polymorphism (SNP), located within Nramp1 gen. The current research has studied the effect of nucleotide variants to be found in coding regions and other one located in 3 non translated region of Nramp1 gene, on the animal classification as resistant or susceptible, moreover was identified the main genotypes to be found on the infected animals, confirmed as positives by antibody antibrucella titles. Was established the genotypic and allelic frequencies for five single nucleotide polymorphism in animals from blanco orejinegro (Bos taurus taurus) and zebu breeds (Bos taurus indicus) and serum samples belonging to positive crossbred animals (Bos taurus x Bos indicus). The genotype was defined by the methodology known as single strand conformational polymorphism. To estimate the macrophage capacity to control the bacterial survival, an in vitro assay was performed, which allowed define the phenotype as resistant or susceptible. The results suggest a significant association for SNP4 (p = 0.0506) with the phenotypic variation for resistant or susceptibility, because was found the genotype (BB) at higher frequency in susceptible animals and naturally infected animals, than those resistant animals. Keywords: Brucellosis, disease resistance, blanco orejinegro, zebu, genotype.

ABSTRACT

RESUMEN

La resistencia natural a la brucelosis en bovinos ha sido asociada a factores genticos, principalmente a algunos polimorfismos de nucletido simple ubicados dentro del gen Nramp1. La presente investigacin evala el efecto de variantes tipo polimorfismos de nucletido simple presentes en regiones codificantes y en la regin 3UTR del gen Nramp1, en la clasificacin de los animales como resistentes o susceptibles; adems se determinan los genotipos predominantes en animales naturalmente infectados y comprobados como positivos por la presencia de anticuerpos anti Brucella abortus. Se establecieron las frecuencias genotpicas y allicas para cinco polimorfismos de nucletido simple identificados dentro del gen Nramp1 en animales de las razas blanco orejinegro (Bos taurus taurus) y ceb (Bos taurus indicus) y en muestras serolgicamente positivas provenientes de animales cruzados (Bos taurus x Bos indicus). La determinacin de genotipos se realiz mediante la metodologa polimorfismo conformacional de cadena sencilla. Se realiz un ensayo de desafo infeccioso in vitro, para estimar la capacidad de los macrfagos bovinos para controlar la sobrevivencia bacterial, lo que permiti definir los individuos como resistentes o susceptibles. Los resultados sugieren una asociacin significativa del SNP4 (p = 0,0506) con la variacin para el fenotipo de susceptibilidad, pues se encontr el genotipo homocigoto (BB) en alta frecuencia en animales catalogados como resistentes y el genotipo heterocigoto (AB) en alta frecuencia en animales catalogados como susceptibles y en animales con ttulos de anticuerpos anti Brucella abortus. Palabras clave: brucelosis, resistencia a enfermedades, blanco orejinegro, ceb, genotipo.

Radicado: 3 de diciembre de 2008 Aprobado: 12 de marzo de 2009

INTRODUCCIN

Licenciado en Biologa. Bogot. fcerquera@yahoo.com 2 Z. Ph.D. Grupo de Recursos Genticos y Biotecnologa Animal, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. ramartinez@corpoica.org.co 3 MV. M.Sc. Vecol, Bogot. ortizo98@yahoo.com 4 MV. Grupo de Recursos Genticos y Biotecnologa Animal, E.E. El Nus, San Roque, Antioquia. jtobon@corpoica.org.co 5 MV. Grupo de Recursos Genticos y Biotecnologa Animal, E.E. El Nus, San Roque, Antioquia. jlgallego@corpoicaorg.co 6 MV. M.Sc. C.I. Ceisa, Instituto Colombiano Agropecuario ICA, Bogot. esperanza.rueda@ica.gov.co
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La brucelosis bovina es una enfermedad infectocontagiosa producida por la bacteria Brucella abortus y caracterizada por abortos, retencin de la placenta, orquitis, epididimitis e infertilidad (Harmon et al., 1989; Rodrguez y Crespo, 2002), que ocasiona significativas prdidas en la produccin pecuaria. Segn datos del Instituto Colombiano Agropecuario (2002) en Colombia se calculan prdidas anuales por 42.000 millones de dlares representados en

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la incapacidad de incursionar en el comercio de animales y productos. Los programas de control de la brucelosis normalmente han incluido vacunacin, aislamiento y sacrificio de ganado infectado; sin embargo estos mecanismos han sido costosos y relativamente inefectivos en la erradicacin de la enfermedad (Price et al., 1990); por lo tanto, una alternativa es emplear programas de seleccin de animales genticamente resistentes a la enfermedad, lo cual constituye una estrategia fcil y de bajo costo (Wigley, 2004). El gen inicialmente llamado de la protena-1 del macrfago asociado con resistencia natural (Nramp1, por su sigla en ingls de natural resistance-associated macrophage protein) y posteriormente llamado Slc11A1 (solute carrier family 11) ha sido relacionado con resistencia o susceptibilidad a muchos patgenos intracelulares tales como Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Brucella abortus, Salmonella enterica y Leishmania donovani en un rango diverso de especies de mamferos, incluyendo el ratn y el hombre (Vidal et al., 1995; Bellamy, 1999). Con base en las caractersticas de esta familia de protenas, se ha propuesto que el gen Nramp1 afectara la replicacin intrafagosomal de la bacteria alterando el contenido de cationes divalentes y el pH del fagosoma (Grunenheid et al., 1997). En estudios funcionales se ha demostrado que el gen Nramp1 regula la actividad antimicrobial en macrfagos de ratn, a travs de la expresin de citoquinas como el factor de necrosis tumoral (TNF) e interfern gama (IFN-) (Ables et al., 2001). Tambin se ha reportado que los macrfagos de bovinos genticamente resistentes a un desafo infeccioso in vivo con Brucella abortus (cepa 2308) son superiores en su capacidad para controlar su multiplicacin bacterial intracelular, al igual que de Salmonella dublin y Mycobacterium bovis; este mecanismo es mediado tambin por el gen Nramp1 (Barthel et al., 2001). En bovinos, el carcter de resistencia o susceptibilidad para la brucelosis presenta un control gentico altamente heredable y puede ser incrementado en una generacin de seleccin (Martnez et al., 2005). El gen presenta un polimorfismo en la regin terminal 3 no traducida (UTR), el cual fue reportado por Horin y colaboradores (1999) como una variacin en el nmero de repeticiones de la secuencia GT (guanina-timina), y se ha demostrado una asociacin del alelo GT/13 con resistencia a la enfermedad en bovinos (Barthel et al., 2001) y en bfalos (Boriello et al., 2006; Caparelli et al., 2007). Sin embargo, en los trabajos reportados por Kumar y colaboradores (2005) en bovinos de origen cebuino y cruzados (Bos indicus x Bos taurus) y por Paixao y colaboradores (2007) no se present asociacin significativa

del polimorfismo (3UTR) con resistencia a la brucelosis. Han sido identificados nuevos polimorfismos de este gen, entre ellos uno dentro del intrn X, que es estable y se encuentra distribuido en poblaciones Bos taurus (Coussens et al., 2004) y varios polimorfismos en el exn V e intrones IV y V (Ables et al., 2002). Recientemente, Martnez y colaboradores (2008) identificaron once nuevos polimorfismos de nucletidos simples (SNP), de los cuales cinco se encuentran en la secuencia codificante, uno en la regin promotora y cinco en los intrones. Los reportes citados sugieren un elevado grado de polimorfismo dentro del gen Nramp1 y es posible que alguna de estas variantes est relacionada con resistencia a la brucelosis en la especie bovina. Por lo anterior, objetivo de la presente investigacin fue evaluar el efecto de variantes SNP existentes en regiones codificantes del gen Nramp1 en el estado sanitario tanto de poblaciones no infectadas y serolgicamente positivas a la enfermedad, como de animales resistentes y susceptibles clasificados a partir de un desafo infeccioso in vitro.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Poblacin Se utiliz una poblacin de 187 bovinos constituida por animales de las razas blanco orejinegro (Bos taurus taurus n = 62) y ceb brahman (Bos taurus indicus n = 27), y animales cruzados (Bos taurus x Bos indicus n = 98). Los primeros fueron previamente clasificados como resistentes o susceptibles (por anlisis de desafo infeccioso in vitro); los segundos (cruzados) fueron encontrados serolgicamente positivos a brucelosis, diagnosticados por elisa competitiva, con ttulos altos de anticuerpos anti Brucella abortus, por lo que fueron considerados animales control susceptibles a la infeccin. Genotipado El aislamiento y extraccin de ADN para las muestras blanco orejinegro y ceb se realiz a partir del mtodo de fenol cloroformo isoamil alcohol, de acuerdo con los protocolos estndar (Sambrook et al., 1988). Los sueros de los animales cruzados se procesaron mediante un kit comercial (Purelink; Invitrogen Cat. No CS11040). Los primers fueron diseados usando dos fuentes: la secuencia disponible del ADN de Bos taurus (GenBank Accession Number: DQ493965) y la informacin reportada (Martnez et al., 2008a; Coussens et al., 2004). Se amplificaron por la metodologa de PCR cinco fragmentos del gen, mediante el uso de 0,3 U taq ADN polimerasa (Biotools), 200 M dNTP y 1,5 mM de MgCl2, en condiciones de incubacin inicial de 94C durante 5 min, seguido de
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33 ciclos de 95C durante 1 min, temperatura de 61C durante 1 min, 72C durante 1 min, e incubacin final de 72C durante 4 minutos. Para la deteccin de los polimorfismos, los productos de PCR fueron mezclados v/v con una solucin tampn desnaturalizante para SSCP (95% formamida, 0,6% azul de bromofenol y 0,6% de xylene cyanol) y se desnaturalizaron a 94C durante 5 minutos. Los amplmeros se enfriaron rpidamente sobre hielo y se cargaron en un gel de acrilamida: bis-acrilamida 29:1 al 8% y se sometieron a electroforesis durante 16 horas a temperatura de 10C y a 2 W. Los polimorfismos fueron observados por tincin con nitrato de plata (Bassam et al., 1991, modificado en Barroso et al., 1997). Se determinaron los genotipos para cuatro variantes SNP (descritas por Martnez et al., 2008a) localizadas en regiones codificantes (exones 9, 10, 11, 15) y una localizada en la regin 3 no traducida (UTR) (tabla 1, figura 1). Metodologa desafo infeccioso in vitro La poblacin de animales de las razas blanco orejinegro y ceb utilizada en genotipado por anlisis SSCP fue previamente confirmada como negativa (evaluada por elisa competitivo), por lo cual se le utiliz para evaluar su fenotipo de resistencia a brucelosis, mediante una metodologa de
Tabla 1. Posicin y efecto en la secuencia de nucletidos y aminocidos de los SNP evaluados
SNP SNP3 SNP4 SNP5 SNP6 3UTR Posicin del aminocido en la protena 272 exn 9 321 exn 10 356 exn 11 542 exn 15 Regin terminal cambio de nucletido C/T G/A A/T Delecin GAG GT/13 cambio del aminocido Alanina / valina cido asprtico / asparagina Prolina / alanina Delecin de glutamina ---

desafo infeccioso in vitro, previamente descrita por Price y colaboradores (1990) y utilizada por Qureshi y colaboradores (1996), Martnez y colaboradores (2005, 2008b) y Paixao y colaboradores (2007). Se tomaron 400 ml de sangre de cada individuo y se separaron los macrfagos mediante el procedimiento de gradientes de densidad (Histopaque 1,077; Sigma Chemical St. Louis). Las clulas fueron contadas en cmara de Newbauer y diluidas para colocar 50.000 macrfagos por pozo. Se infectaron los macrfagos adicionando a una placa de 96 pozos 50 l de la dilucin de bacteria (5 x 105 bacterias previamente opsonizadas). Esta mezcla fue centrifugada a 170 x G durante 10 min e incubada durante 1 h a 37C en una atmsfera de 5% de CO2. Posteriormente se aadi medio RPMI-estreptomicina a una concentracin final de 13,5 mg/ml para eliminar la bacteria extracelular antes de la incubacin a 37C durante 30 minutos. Ms tarde se retir este medio de los pocillos y se reemplaz por 200 l de medio RPMI. Diez minutos ms tarde, se reemplazaron 100 l de este medio (para extraer cualquier residuo de estreptomicina) junto con 100 l de medio RPMI suplementado con 5% de suero autlogo (del mismo animal) inactivado con calor. Para obtener los resultados para el tiempo cero (T 0 h), el medio RPMI fue inmediatamente extrado de los valles y 100 l de agua fra estril deionizada fue aadida durante 10 min. Estos 100 l fueron empleados para preparar series de diluciones a 1/5, 1/10 y 1/50. Se adicionaron 100 l por triplicado en placas de Petri que contenan agar selectivo para Brucella abortus (Oxoid, Hampshire, Inglaterra). Las placas de Petri se mantuvieron a 37C en una atmsfera de 5% CO2. Las mismas diluciones fueron realizadas a las 24 y 48 horas. Los recuentos de unidades formadoras de colonia (UFC) se realizaron 4 das despus; con esta informacin se determin el nmero de bacterias a las cero horas (NBT 0) y a las 24 horas (NBT 24) (datos no presentados). El ndice de resistencia se calcul como la raz cuadrada del

Figura 1. Estructura genmica y polimorfismos del gen Nramp1. Los cuadros representan los exones y la lnea conectora corresponde a los intrones. Los SNP se indican segn su posicin en la secuencia DQ493965 y la estructura de la protena. TM: dominio de transmembrana (Tomado de Martnez et al., 2008a)

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porcentaje de la proporcin de unidades formadoras de colonia ledas a 24 horas de las ledas a cero horas (SOB = (NBT24/NBT0) x 100) (ndice descrito por Martnez et al., 2006, 2002; Templeton y Adams, 1992). Posteriormente, los animales se clasificaron como resistentes (R) cuando el valor de SOB < 10 y, susceptibles (S) cuando el valor de SOB > 10, de acuerdo con el control de las clulas sobre la sobrevivencia bacterial (datos no presentados). Estos mismos animales, ya clasificados como resistentes o susceptibles, fueron utilizados para la determinacin de los genotipos para cada SNP. Anlisis de informacin Para los estudios de asociacin se evalu independientemente cada marcador haciendo anlisis de frecuencias allicas y genotpicas, mediante una prueba de X2, haciendo uso del procedimiento FREQ, del programa estadstico SAS. Tambin se determin el efecto significativo de cada variante SNP sobre la probabilidad de clasificar un animal como resistente o susceptible, para lo cual se realiz un anlisis de regresin logstica (Proc logistic) donde se utiliz como variable dependiente la clasificacin de los individuos en funcin de los genotipos. El modelo de regresin logstica puede escribirse como:

La significacin de los coeficientes del modelo se realiz mediante el estadstico de Wald (Lehmann, 1974).
R E S U LTA D O S

En esta investigacin se determinaron los genotipos de cinco marcadores moleculares tipo SNP (polimorfismo de nucletido simple) localizados en regiones codificantes del gen Nramp1, donde se determinaron sus frecuencias genotpicas y allicas en cada uno de los grupos raciales blanco orejinegro, ceb y cruces (Bos indicus x Bos taurus). Adems, se registraron las frecuencias genotpicas y allicas entre animales con fenotipo clasificado como resistente o susceptible a la enfermedad, evaluados a partir de la metodologa de desafo infeccioso in vitro; y como control positivo de animales susceptibles se utilizaron animales persistentemente infectados, determinados por la presencia de ttulos infecciosos de anticuerpos anti Brucella abortus. Al evaluar las frecuencias genotpicas entre razas, se encontr que SNP4 present en la poblacin blanco orejinegro una alta frecuencia del genotipo homocigoto BB (p = 0,7), y en la poblacin ceb se encontr en mayor frecuencia el genotipo heterocigoto AB (p = 0,44) al igual que en los animales con serologa positiva a la enfermedad, donde se present una elevada frecuencia del genotipo heterocigoto AB (p = 0,9). Estos animales fueron incluidos como control positivo de animales susceptibles a Brucella abortus. Para este mismo polimorfismo SNP4 se encontr una alta frecuencia del alelo A en la raza ceb (p = 0,57), similar a lo encontrado en los animales infectados donde se presentaron ambos alelos a frecuencias similares (p = 0,44 y p = 0,56 para los alelos A y B respectivamente), mientras que el alelo B se encontr con mayor frecuencia en la raza blanco orejinegro (p = 0,83) (tabla 2). Cabe resaltar que para el SNP6 se encontraron 6 alelos y 11 genotipos en la raza ceb y, 3 alelos y 4 genotipos en la raza blanco orejinegro. Dada la variedad de genotipos presentes en este polimorfismo y la muy baja frecuencia de muchos de ellos, se disminuy el nmero de indivi-

Donde p es la probabilidad de que ocurra el evento de inters (en este caso la clasificacin de los individuos como susceptibles o resistentes), dado el valor de las variables independientes, que fueron el genotipo para cada variante SNP y el grupo racial. El clculo de la estimacin de la probabilidad de que el animal sea susceptible es:

Tabla 2. Frecuencias genotpicas y allicas de las variantes SNP del gen Nramp1 en las razas blanco orejinegro y ceb, y animales cruzados (con serologa positiva a B. abortus)
Blanco orejinegro SNP AA SNP3 SNP4 SNP5 3UTR 1,00 0,03 0,03 0,00 Genotipo AB 0,00 0,27 0,26 0,11 AA 0,00 0,70 0,71 0,09 A 1,00 0,17 0,16 0,06 Alelo B 0,00 0,83 0,84 0,94 AA 0,54 0,35 0,44 0,3 Genotipo AB 0,42 0,44 0,48 0,46 BB 0,04 0,21 0,08 0,24 A 0,75 0,57 0,68 0,54 Ceb Alelo B 0,25 0,43 0,32 0,46 AA 0,88 0,00 0,05 0,05 Genotipo AB 0,11 0,90 0,43 0,05 BB 0,01 0,10 0,52 0,90 A 0,93 0,44 0,27 0,09 Cruces Alelo B 0,07 0,56 0,73 0,91

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Frecuencias allicas para variantes SNP en el gen Nramp1 en bovinos infectados con Brucella abortus o clasificados por resistencia al patgeno

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Tabla 3. Frecuencias genotpicas y allicas de los SNP del gen Nramp1 para los animales clasificados como resistentes (R), susceptibles (S) a partir del desafo infeccioso e infectados (I), evaluados por ttulos de anticuerpos anti Brucella abortus
Animales resistentes SNP AA SNP3 SNP4 SNP5 3UTR 0,95 0,05 0,06 0,00 Genotipo AB 0,05 0,35 0,39 0,26 AA 0,00 0,60 0,55 0,74 A 0,98 0,22 0,25 0,13 Alelo B 0,02 0,78 0,75 0,87 AA 0,86 0,06 0,12 0,08 Animales susceptibles Genotipo AB 0,13 0,65 0,37 0,12 BB 0,01 0,29 0,51 0,80 A 0,92 0,38 0,30 0,14 Alelo B 0,08 0,62 0,70 0,86 AA 0,88 0,00 0,05 0,05 Animales infectados Genotipo AB 0,11 0,90 0,43 0,05 BB 0,01 0,10 0,52 0,90 A 0,93 0,44 0,27 0,09 Alelo B 0,07 0,56 0,73 0,91

duos por genotipo y por lo tanto la significancia estadstica del modelo; razn por la cual se eliminaron del anlisis que se presenta en esta investigacin. El marcador SNP3 no present variacin en la raza blanco orejinegro, en la que solamente se present el alelo A, diferente a lo encontrado en los animales de la raza ceb, en la que se present el alelo B con una moderada frecuencia (p = 0,25). Por otra parte, el SNP5 present mayores frecuencias del alelo B en las razas blanco orejinegro y animales infectados (p = 0,84 y 0,73 respectivamente), mientras que la raza ceb present en mayor frecuencia el alelo A (p = 0,68). Por ltimo, el marcador 3UTR present ambos alelos a frecuencias similares en la raza ceb, mientras que se encontr en alta frecuencia el alelo B en la raza blanco orejinegro y en los animales infectados. Los animales se agruparon por su clasificacin como susceptibles o resistentes -segn su capacidad para controlar la replicacin bacterial intrafagosomal- o como infectados -segn la presencia de ttulos de anticuerpos anti Brucella abortus que indica que son animales persistentemente infectados, por lo que se catalogaron como animales control susceptibles-. Cuando los animales se agruparon por su clasificacin, se encontr en los catalogados como resistentes, una alta frecuencia del genotipo AA en la variante SNP3 (p = 0,95), y muy baja frecuencia en el genotipo heterocigoto AB (p = 0,05); no se present el genotipo BB. No se encontraron diferencias significativas (p > 0,05) entre las frecuencias genotpicas encontradas en los animales susceptibles, resistentes o infectados. El SNP4 present una alta frecuencia del genotipo BB en animales resistentes (p = 0,60); y bajas frecuencias tanto en los susceptibles (p = 0,29) como en los animales infectados (p = 0,10), con diferencias significativas entre grupos (p < 0,05). En el marcador SNP5 se presentaron los tres genotipos en frecuencias similares y sin diferencias significativas entre grupos (p > 0,05). En el marcador 3UTR tampoco se presentaron diferencias significativas, en el que el genotipo homocigoto BB present mayor frecuencia para animales resistentes, susceptibles e infectados (p = 0,74, p = 0,80 y p = 0,90, respectivamente) (tabla 3).
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En la tabla 4 se presentan los estimados para las variables independientes y la significancia de los coeficientes del modelo, donde se encuentra que solamente el coeficiente para SNP4 tiene un efecto significativo (p = 0,0506) sobre el clculo de estimacin de la variable respuesta, que es la probabilidad de que el animal sea susceptible. Las otras variantes del gen evaluadas no presentaron un efecto significativo (p > 0,05). En este caso, la variante 3UTR aparece con un valor de probabilidad no significativo (p = 0,2840).
Tabla 4. Estimadores para las variables independientes en un anlisis de regresin logstica donde se determina el efecto de variantes SNP sobre la probabilidad de clasificacin de un animal como resistente o susceptible
Parmetro Intercepto Grupo racial SNP3 SNP4 SNP5 3UTR Estimacin 7,0081 0,3005 -0,8405 0,1005 0,000922 -0,0682 Error estndar 13,0073 0,040 1,1289 0,0540 0,0575 0,0637 Ji cuadrado 0,2903 4,0717 0,5544 3,4717 0,0003 1,1477 Valor de p 0,5900 0,3024 0,4565 0,0506 0,9872 0,2840

Las frecuencias genotpicas encontradas en el SNP4 fueron significativamente diferentes entre animales clasificados por su capacidad de control de la sobrevivencia bacterial. Se identificaron 20 individuos como resistentes (determinados por sus valores de sobrevivencia bacterial menor a 10, valores no presentados), en los cuales el genotipo homocigoto BB present la mayor frecuencia (p = 0,60). Como susceptibles se identificaron 69 individuos (determinados por sus valores de sobrevivencia mayores a 10). Los animales con un estado sanitario positivo a la infeccin por Brucella abortus se tomaron como controles positivos de animales susceptibles; en stos, el genotipo heterocigoto AB se encontr con mayor frecuencia (p = 0,65) y el genotipo homocigoto BB, en menor frecuencia (p = 0,29). La frecuencia del genotipo homocigoto AA es muy baja en general. La frecuencia del alelo A en animales resistentes es de 0,22 y la de los susceptibles de 0,38,

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Frecuencias allicas para variantes SNP en el gen Nramp1 en bovinos infectados con Brucella abortus o clasificados por resistencia al patgeno

en contraste con las superiores encontradas en el alelo B (0,78 y 0,62 respectivamente). Lo anterior se debe a que el muestreo inicialmente se realiz al azar y que para el anlisis posterior los individuos se agruparon por su fenotipo de resistencia o susceptibilidad. En el caso de animales que presentaron seropositividad a la infeccin no se encontraron animales con genotipo AA, pero debido a que se present alta frecuencia del genotipo heterocigoto AB, las frecuencias de ambos alelos fueron similares.
DISCUSIN

(2006) y Caparelli y colaboradores (2007) encontraron un efecto significativo del marcador sobre la resistencia o susceptibilidad a la enfermedad en una poblacin de bfalos. Frente a estas diferencias es importante tener en cuenta que la estructura de la variante GT/n presente en los bfalos difiere de la encontrada en los bovinos, por lo cual fue necesario extender el estudio a otras regiones del gen que podran afectar la estructura de la protena y por ende su funcionalidad. La variante denominada SNP4 tambin presenta diferencias significativas (p < 0,05) en las frecuencias genotpicas entre animales resistentes y susceptibles evaluados por desafo infeccioso in vitro, as como tambin de animales con ttulos de anticuerpos anti Brucella abortus; encontrndose en mayor frecuencia el genotipo homocigoto (BB) en animales resistentes y el genotipo heterocigoto (AB) en animales susceptibles o infectados. Para esta misma variante SNP, Martnez (2008) encontr asociacin significativa con el nivel de expresin del gen que codifica para la citoquina del factor de necrosis tumoral (TNF), la cual est relacionada con la apoptosis de macrfagos infectados, mediante la activacin de la ruta las caspasas (Male, 2003) y ste es uno de los principales mecanismos de la defensa contra la brucelosis en bovinos (Wyckoff, 2002). Los resultados muestran que en el SNP4 el genotipo BB se presenta en mayor frecuencia en la raza blanco orejinegro; y en todas las poblaciones se encontr baja frecuencia del genotipo AA, posiblemente debido a problemas de muestreo de la poblacin de estudio. Martnez y colaboradores (2005, 2008b), reportaron mayor control de la sobrevivencia bacterial en la raza blanco orejinegro en comparacin con la raza ceb despus de aplicar la metodologa desafo infeccioso in vitro, una alta frecuencia del genotipo BB, lo cual estara de acuerdo con lo encontrado en la presente investigacin. Este resultado podra estar afectado por las frecuencias allicas encontradas en cada raza y se requerira de estudios adicionales para comprobar estos hallazgos. Estas diferencias pueden ser argumentadas desde lo publicado por Paixao y colaboradores (2005) quienes involucran el trmino presin selectiva como factor que puede garantizar la posibilidad de encontrar alelos asociados a resistencia en razas no especializadas. Como es el caso del ganado blanco orejinegro, que para este carcter es una raza que no ha sido sometida a procesos de seleccin fuertes por el hombre (Lpez et al., 2001). Adicionalmente en este trabajo se encontr una mayor variabilidad para el SNP6 (11 genotipos y 6 alelos en la raza ceb y 4 genotipos y 3 alelos en la raza blanco oreRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 43-50

El gen Nramp1 es uno de los principales candidatos para resistencia natural a brucelosis en bovinos (Templeton et al., 1990; Feng et al., 1996; Horin et al., 1999; Barthel et al., 2001) y bfalos (Borriello et al., 2006; Capparelli et al., 2007). En este gen se han encontrado variaciones tipo microsatlite (Horin et al., 1999) y polimorfismos tipo SNP en regiones codificantes y no codificantes (Ables et al., 2002; Coussens et al., 2004; Martnez et al., 2008a), por esto es interesante encontrar posibles asociaciones entre las variaciones presentes en el gen y la resistencia a enfermedades. En esta investigacin se encontr efecto significativo del marcador SNP 4 sobre la variable respuesta que es la resistencia o susceptibilidad a Brucella abortus (p = 0,0506). Este polimorfismo reportado inicialmente por Martnez y colaboradores (2008a) corresponde a un cambio de una guanina por una adenina en el exn 10 del gen, que provoca en la protena un cambio de cido asprtico por asparagina; esta variante tambin se ha encontrado en otras especies como Ovis aries, Mus musculus y Homo sapiens (Martnez et al., 2008a), por lo que podra tratarse de la mutacin que explicara la capacidad del macrfago para controlar la replicacin de la bacteria. Los presentes resultados coinciden con lo reportado por Martnez y colaboradores (2008b), quienes encontraron una asociacin significativa entre el marcador SNP4 y el control de la sobrevivencia bacteriana in vitro. No se encontr efecto significativo de las otras variantes del gen Nramp1 con el estado sanitario de los animales, entre ellas la variante correspondiente a la regin 3UTR, lo que coincide con los trabajos publicados por Kumar y colaboradores (2005) y Paixao y colaboradores (2007), quienes reportan que el alelo GT/13 de la regin 3UTR no proporciona suficiente evidencia de resistencia a la brucelosis incluso en condiciones de homocigosis. Sin embargo, los resultados obtenidos por Barthel y colaboradores (2001) demuestran que esta variante presente en esta regin 3UTR afecta crticamente la expresin del gen y, por lo tanto, la replicacin intrafagosomal de la bacteria. Adems, recientemente Boriello y colaboradores

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jinegro). Esta diversidad genotpica es mayor a la reportada previamente por Martnez y colaboradores (2008b), quienes encontraron slo un genotipo homocigoto para la raza blanco orejinegro y tres genotipos heterocigotos para la raza ceb. Por lo tanto, se recomienda explorar una poblacin ms grande de individuos para encontrar una distribucin uniforme de los genotipos y obtener la secuencia de las variantes polimrficas de este fragmento para confirmar lo hallado en la presente investigacin.
CONCLUSIONES

gro, y mayor frecuencia del genotipo heterocigoto (AB) en animales ceb y animales detectados como infectados evaluados por niveles de anticuerpos anti Brucella abortus. Este polimorfismo tambin muestra diferencias considerables en el desafo infeccioso in vitro, presentndose en mayor frecuencia el genotipo BB en animales resistentes y el genotipo AB en animales susceptibles. No se encontr efecto significativo de la regin 3UTR con resistencia a la enfermedad.
AGRADECIMIENTOS

Se encontr efecto significativo de los genotipos para el marcador SNP4, con el estado de resistencia o susceptibilidad y un genotipo predominante en los animales infectados; para este polimorfismo se detect mayor frecuencia del genotipo homocigoto (BB) en animales blanco orejine-

Los autores expresan su agradecimiento a Colciencias por el apoyo financiero, segn proyecto 201-2005 y al Instituto Colombiano Agropecuario ICA, por el aporte de sueros positivos a brucelosis.

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F i s i o lo g a A R t c u lo c I e N t F I co

aniMal

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Effect of seminal plasma proteins at freezing on ram sperm motility and viability

Adicin de protenas del plasma seminal ovino durante la congelacin del espermatozoide y efectos sobre su motilidad y viabilidad
Jaime Antonio Cardozo1, Patricia Grasa2, Mara Teresa Muio B.3, Jos lvaro Cebrin P.4

The aim of the study was to evaluate the cryoprotective effect of seminal plasma proteins on ram sperm motility, membrane integrity and the changes in the profile of ram sperm membrane proteins induced by cryopreservation. Fresh ejaculates from 8 mature Rasa aragonesa rams were used. Sperm motility and cell viability was assessed. The freezing procedure was based on the method described by Fiser et al. (1987). Proteins extracted from fresh and frozen-thawed semen were subjected to the Two-dimensional polyacrilamide gel electrophoresis. A significant improvement in the quality of frozenthawed sperm was obtained after addition of seminal plasma proteins (p < 0.05). Comparative two-dimensional polyacrilamide gel electrophoresis analysis between fresh and frozen semen, either with or without seminal plasma proteins in the cryopreservation medium, revealed that eight protein spots were lost in frozen-thawed sperm. The concentration of one sperm membrane protein spot of low Mr (spot 2) was higher (p < 0.05) in proteinadded frozen sperm. Correlations found between certain protein spots sperm motility and viability suggests that these proteins could play important roles in the maintenance of sperm integrity and functionality. In conclusion, the addition of seminal plasma proteins to freezing extender improved frozen-thawed ram sperm integrity quality and cryopreservation of ram semen produced variations in the sperm membrane protein composition. Keywords: 2D PAGE, ram sperm, seminal plasma, freezing, sperm membrane proteins.

ABSTRACT

RESUMEN

Este estudio se adelant para evaluar el efecto de la adicin de protenas del plasma seminal de cordero en la criopreservacin sobre la motilidad e integridad de la membrana espermtica, y los cambios en el perfil electrofortico de las protenas de la membrana espermtica inducidos por la criopreservacin. Se usaron eyaculados de ocho corderos adultos de la raza rasa aragonesa, se les determin su viabilidad y motilidad espermticas y posteriormente se sometieron a un procedimiento de congelacin. Las protenas se separaron por el mtodo de electroforesis en geles de acrilamida en dos dimensiones. Se obtuvo un mejoramiento significativo (p < 0,05) en la calidad del semen congelado, cuando se adicionaron protenas del plasma seminal. El anlisis bidimensional comparativo entre el semen fresco y el congelado evidenci la prdida de 8 puntos de protena en el espermatozoide descongelado. La concentracin de un punto de protena de membrana espermtica, de bajo peso molecular (punto 2), fue ms alta (p < 0,05) en el espermatozoide descongelado al que se adicionaron protenas del plasma seminal. Se encontraron correlaciones entre algunos puntos de protena y la motilidad y viabilidad espermticas, lo cual sugiere que pueden jugar papeles importantes en el mantenimiento de la integridad y funcionalidad del espermatozoide. Se puede concluir que la adicin de protenas del plasma seminal en la congelacin mejora la integridad del espermatozoide descongelado, y que la criopreservacin del semen de cordero produce variaciones en la composicin de las protenas de membrana. Palabras clave: 2D PAGE, espermatozoide ovino, criopreservacin, protenas de la membrana espermtica.
INTRODUCCIN

Radicado: 14 de noviembre de 2008 Aprobado: 3 de febrero de 2009

La fertilidad del semen ovino congelado es baja, cuan-

Investigador Ph.D. Asistente, Laboratorio de Microbiologa Molecular, Centro de Biotecnologa y Bioindustria (CBB), Corpoica. jcardozo@corpoica.org.co 2 Investigador Ph.D. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Espaa. patgrasa@unizar.es 3 Profesor Investigador Ph.D. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Espaa. muino@unizar.es 4 Profesor Investigador Ph.D. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, Espaa. pcebrian@unizar.es
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do se usa en inseminacin artificial (Salamon y Maxwell 2000; Yoshida, 2000). Se sabe ampliamente que el espermatozoide ovino es ms sensible al estrs trmico por fro que el de otras especies como el bovino, el conejo o el hombre (Fiser y Fairfull, 1989; Watson, 2000). El proceso de criopreservacin y descongelacin induce severos cambios al espermatozoide mamfero (Medeiros et al., 2002) debidos

2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

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a estrs trmico, mecnico, qumico y osmtico (Holt et al., 1992; Holt y North, 1994; Watson, 1995), entre los que se encuentan cambios morfolgicos en la organizacin, fluidez, permeabilidad y composicin lipdica de la membrana del espermatozoide (Hammerstedt et al., 1990; Thomas et al., 1998; Bailey et al., 2000; Januskauskas et al., 2003; Guillaume et al., 2004) y la correspondiente reduccin en la fertilidad del eyaculado (Ricker et al., 2006). La prdida de viabilidad y motilidad espermticas no explican totalmente la reduccin de la fertilidad del semen congelado y se ha sugerido que puede deberse parcialmente a la prdida de protenas de la membrana del espermatozoide necesarias para la fertilizacin (Lessard et al., 2000). La membrana plasmtica del espermatozoide sirve de barrera estructural y de interfase de comunicacin con el medio ambiente extracelular (Harvey et al., 2001), y transmite seales bioqumicas originadas de interacciones entre el ligando y el receptor, del medio exterior al interior de la clula (Olden et al., 1985). Por lo tanto, la membrana plasmtica del espermatozoide es un elemento fundamental para el xito de la fecundacin. La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE, por sus iniciales en ingls) se ha usado para la separacin y anlisis de protenas del plasma seminal (PPS) de toro (Desnoyers et al., 1994; Mortarino et al., 1998; Jobim et al., 2004), caballo (Brandon et al., 1999), carnero (Souza et al., 2004; Jobim et al., 2005; Cardozo et al., 2006), cerdo (Sanz et al., 1993) y hombre (Bohring et al., 2001; Pixton et al., 2004); y tambin para la separacin y anlisis de las protenas de la membrana del espermatozoide humano (Naaby-Hansen et al., 1997) y del cerdo (Haden et al., 2000). Sin embargo, el perfil de protenas por 2D-PAGE de la membrana del espermatozoide del carnero sometida a congelacin/descongelacin no ha sido an estudiado. Este estudio se realiz para evaluar el efecto crioprotector de las protenas del plasma seminal en la motilidad e integridad de la membrana del espermatozoide del carnero, y en los cambios en el perfil 2D-PAGE, de las protenas de la membrana del espermatozoide inducidos por la congelacin.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

(ANGRA) y estuvieron alojados en el servicio de experimentacin animal de la Universidad de Zaragoza en condiciones nutricionales uniformes. Teniendo en cuenta los resultados positivos sobre la viabilidad de los espermatozoides del carnero en relacin con el periodo de abstinencia y las sucesivas eyaculaciones, encontradas por Ollero y colaboradores (1996), los machos se sometieron a un perodo de abstinencia de dos das entre ensayos y solamente se utilizaron los segundos eyaculados en cada ensayo. Para evitar las diferencias individuales, se utiliz la mezcla de los segundos eyaculados de los animales (Ollero et al., 1996), mientras que para determinar las diferencias en la congelacin de las muestras de semen de los carneros, se utilizaron los eyaculados por separado. Evaluacin del semen La concentracin espermtica se calcul en duplicado en cmara de Neubauer (Marienfeld, Lauda-knigshofen). La motilidad espermtica se evalu subjetivamente por estimacin visual con un sistema de microscopia (aumento 100x), unido a un equipo de televisin (Evans y Maxwell, 1987). El porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva se estim a incrementos de 5%, y fue realizado por la misma persona durante todo el estudio. La viabilidad celular (integridad de la membrana) se evalo de acuerdo con el mtodo de Harrison y Vickers (1990), para lo cual se utiliz una tincin fluorescente compuesta por diacetato de carboxifluoresceina y yoduro de propidio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); el anlisis se realiz en un microscopio de fluorescencia marca Nikon. Se contaron hasta un total de 100 espermatozoides, teniendo en cuenta que aquellos positivos a la fluorescena se tien de color verde y tienen su membrana intacta; y aquellos positivos a yoduro de propidio se tien de color rojo y tienen su membrana daada. Estos anlisis se realizaron tanto con semen fresco como con semen congelado. Obtencin de las protenas del plasma seminal El plasma seminal se obtuvo por centrifugacin de un ml de semen a 7500 x G durante 5 minutos a 4C. El sobrenadante se separ y se centrifug nuevamente, en iguales condiciones a la primera centrifugacin, y este nuevo sobrenadante se filtr a travs de una membrana de 0,22 m y se coloc a -20C hasta su anlisis. Las protenas del plasma seminal se obtuvieron por filtracin del plasma a travs de microconcentradores Microsep con corte a un peso molecular de 3 kDa (Filtron Tech. MA, Estados Unidos). La centrifugacin se realiz por un tiempo mnimo de 6 h, a 3000 x G, y a 4C. La
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Coleccin del semen y preparacin del espermatozoide Los experimentos se realizaron con semen fresco proveniente de 8 carneros (raza rasa aragonesa) de 2 a 4 aos de edad, obtenido con vagina artificial. Los animales utilizados pertenecen a un genotipo espaol, cuyas hembras presentan un corto anestro estacional entre los meses de mayo y agosto. Los animales pertenecan a la Asociacin Nacional de Criadores de la Raza Rasa Aragonesa

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muestra de protenas concentrada obtenida se diluy con 5 volmenes de un medio que contena 0,25 M sucrosa, 0,1 mM EGTA, 4 mM fosfato sdico pH 7,5, 10% (v/v) de un tampn de Hepes (50 mM glucosa, 100 mM Hepes, 20 mM KOH) diluido 10 veces y se centrifug nuevamente. Las protenas se recuperaron y se guardaron a -20C. La concentracin de protenas se determin por el mtodo de Bradford (Bradford, 1976). Procedimiento de congelacin El procedimiento de congelacin se bas en el mtodo descrito por Fiser y colaboradores (Fiser et al., 1987). El semen se diluy a una concentracin final de 4 x 108 cells/ml en la fraccin I del diluyente, llamada FI, (Tris, D (+) fructosa, cido ctrico anhidro, penicilina G, dihidroestreptomicina, agua destilada) pH 7,5, del medio de Fiser. Las protenas del plasma seminal se adicionaron directamente al FI, en una concentracin de 25 mg/ml. A las muestras control no se les agreg aditivo alguno. Posterior a la dilucin, las muestras se colocaron en un bao con control de temperatura programable (PolyScience-Minitub), permitiendo que la temperatura descendiera de 36C a 5C, a una tasa promedio de enfriamiento de 0,4 C/min. Tan pronto se alcanz la temperatura de 5C, se agreg la fraccin II (citrato trisdico x 2H2O, TES, glicina, lactosa mono hidrato, rafinosa 5x H2O, D (+) fructosa, dextrano B, agua destilada) del medio de Fiser. Las muestras se mantuvieron a esta temperatura por un tiempo de 2 horas (fase de equilibrio) antes de proceder a su congelacin. Posteriormente, las muestras se empacaron en pajillas plsticas de 0,25-ml, las cuales se colocaron en un soporte hecho de tefln y se introdujeron en un biocongelador programable controlado por computador (Microdigitcool 250-IMV Technologies, France) para su congelacin. La tcnica de congelacin utilizada emple tres pasos como sigue: de 5C a -12C, a una tasa de 5C min-1; de -12C to -40C, a una tasa de 20C min-1, y finalmente, de -40C to -120C, a una tasa de 30C min-1. Una vez que se complet el protocolo de congelacin, las pajillas se retiraron del congelador y se guardaron directamente en nitrgeno lquido a -196C. En todos los casos la concentracin final de las pajillas fue de 100 millones de espermatozoides/pajilla. El proceso de descongelacin de las pajillas se efectu en un bao de Mara a 60C durante 4 segundos. Extraccin y precipitacin de las protenas de membrana del espermatozoide Las muestras de semen fresco y descongelado (5 x 108 espermatozoides) se resuspendieron en 2,5 ml de
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solucin fosfatada buferada (PBS); posteriormente se centrifugaron (7.500 x G, durante 5 min) a temperatura de saln y se descart el sobrenadante. El precipitado obtenido en ambos casos se resuspendi nuevamente en 2,5 ml de PBS y se centrifug (7.500 x G, 5 min) a temperatura de saln. Este procedimiento se realiz dos veces. Finalmente, el precipitado obtenido se disolvi en 100 l de un medio de extraccin de protenas que contena 2% dodecil sulfato sdico (SDS), 28% sucrosa, 12,4 mM tetra metil etilen diamina (TEMED) y 185 mM TrisHCl, pH 6,8 - 7 (Roldan y Harrison, 1988), y se incub durante 5 min a 100C. La suspensin final se centrifug nuevamente a 7.500 x g, durante 5 min y se recuper el sobrenadante. Las protenas (de las muestras de membrana espermtica y del medio de congelacin) se precipitaron por el mtodo del acido tricloroactico/acetona (TCA)/ acetona (Grg et al., 2004). La precipitacin se efectu de la siguiente forma: el sobrenadante se resuspendi en 9 volmenes de una solucin compuesta por 10% TCA, 0,12% DTT en acetona, preenfriada a -20C. La precipitacin se realiz durante toda la noche a -20C. Posteriormente, la suspensin se centrifug a 12.000 x G, durante 30 min a 4C. El precipitado se lav con una solucin de acetona preenfriada (-20C) que contena 0,12% ditio treitol (DTT) y se centrifug a 12.000 x g, 30 min; el sobrenadante se descart y el precipitado se sec al vaco, resuspendindose posteriormente en un tampn de muestra, al que se adicion 10% de un coctel inhibidor de proteasas y fosfatasas (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El contenido de protena se determin por el mtodo de Bradford (Bradford, 1976), y la muestra se almacen a -20C hasta su anlisis. Electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE) La muestra de protenas de membrana se prepar para la electroforesis de la siguiente forma: 82 g de la muestra de protenas se diluyeron en 125 l de un tampn de muestra compuesto por: 5 M urea, 2 M tiourea, 2% [Propano sulfonato de 3-(3-(colamidopropil) dimetil-amonio)-1] (CHAPS), 2 mM Tributil fosfina (TBP), 2% sulfobetaina (SB-310), 40 mM hidroximetil amonio (TRIS), anfolitos Bio-LyteTM 3/10, 0,2% (Bio-Rad, Hercules), azul de bromofenol 0,0002%, y 5 l de estndar 2D-PAGE (Pierce, Perbio Science, Reino Unido). Las muestras se sometieron a la 2D-PAGE tal como fuera descrito por OFarrell (1975). El isoelectroenfoque (IEF), o primera dimensin, de las protenas se realiz utilizndose tiras de 7 cm, en gradiente de pH inmovilizado

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de 4-7 (IPG; pH 4-7; Bio Rad, Hercules). Las tiras se colocaron toda la noche en el canal de una bandeja de rehidratacin que contena la solucin descrita anteriormente. El isoelectroenfoque se realiz en el Protean IEF Cell (Bio-Rad, Hercules) a 18,000 V y 20C. Posteriormente, la tiras se equilibraron durante 15 minutos en 2,5 ml de un tampn de equilibrio (I) cuya composicin era 6 M urea, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 20% glicerol, y 2% (p/v) DTT. A continuacin se descart este primer tampn de equilibrio y se reemplaz por 2,5 ml de un segundo tampn (II), que contena 6 M urea, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 20% glicerol, y 2,5% (p/v) Iodoacetamida. Finalmente, la segunda dimensin se realiz sobre un gel de poliacrilamida en gradiente de concentracin lineal 9%-20% (SDS-PAGE), emplendose un Miniprotean II (Bio-Rad, Hercules). Despus de finalizada la segunda dimensin, los geles se tieron con Sypro-Ruby Protein Gel Stain (Molecular Probes) y se escanearon en un documentador de geles gel doc System equipado con un software para anlisis molecular (Bio Rad, Hercules). Las imgenes de los geles en dos dimensiones se analizaron con el programa PD-QuestTM 2-D (Bio-Rad, Hercules), para determinar el contenido relativo de los puntos de protena. Se asign un sistema de numeracin correlativo en funcin del peso molecular de los puntos de protena, a cada punto de protena. Los datos se usaron para estimar la cantidad relativa de cada punto de protena y para crear un mapa de las protenas presentes en cada muestra. Diseo experimental y anlisis estadstico Los experimentos se realizaron durante la estacin de apareamiento. La investigacin se dise para establecer los cambios en el perfil 2D-PAGE de las protenas de la membrana plasmtica del espermatozoide por efecto de la adicin de protenas del plasma seminal en el protocolo de congelacin, e igualmente establecer el efecto sobre los valores de motilidad y viabilidad espermtica del semen posterior a la descongelacin. En cada uno de los experimentos 2D-PAGE, se utilizaron aproximadamente 3 x 108 clulas tanto de semen fresco como de semen congelado. En cada experimento se analizaron los mapas electroforticos de las protenas de membrana del espermatozoide proveniente de semen fresco (control), de semen congelado al que no se le adicion protenas de plasma seminal y de semen congelado al que se le adicion protenas del plasma seminal. El experimento se replic tres veces y se realizaron tres electroforesis por cada experimento. Los datos de concentracin de las protenas y de motilidad y viabilidad espermticas obtenidos se transformaron por logaritmo y se analizaron bajo un modelo completamente al azar:

Yijk= + i + Eij Donde: Yij = concentracin relativa de cada protena = media total i: = efecto de la adicin de las protenas de plasma seminal Eij = error experimental Se realiz un anlisis de varianza y una prueba Tukey para comparacin de medias. Los valores de probabilidad menores de 0,05 se consideraron estadsticamente significativos. As mismo, se analiz la correlacin entre los parmetros de calidad espermtica y la concentracin de las protenas de membrana por el mtodo del coeficiente de Pearson. Los anlisis estadsticos se realizaron por el procedimiento del modelo lineal general del sistema SAS (SAS system, 1999). Los resultados se muestran como el promedio ( SEM) de 3 muestras replicadas.
R E S U LTA D O S

Efectos de la adicin de protenas del plasma seminal al momento de la congelacin en los valores de motilidad y viabilidad del semen eyaculado Los resultados obtenidos evidenciaron un incremento significativo (p < 0,05) en los porcentajes de motilidad espermtica por efecto de la adicin de las protenas del plasma seminal (22% 1,22% para el control vs. 40% 2,74% para el tratamiento con protenas del plasma seminal). As mismo, se evidenci un significativo incremento en los valores de viabilidad espermtica (p < 0,05) de los eyaculados tratados con protenas del plasma seminal al momento de la congelacin (20,9% 2,11% para el control y 38,8% 3,69% para el grupo tratamiento). Efectos de la adicin de PPS durante la congelacin en los perfiles electroforticos de las protenas de la membrana plasmtica del espermatozoide del carnero En la figura 1 se muestran los mapas referenciales 2D PAGE de las protenas obtenidas de la membrana plasmtica del espermatozoide fresco, congelado sin PPS y congelado con PPS (figuras 1A, 1B y 1C). As mismo, se muestra el mapa referencial de las protenas procedentes del medio de congelacin (yema de huevo). Mapas 2D-PAGE similares se obtuvieron para cada tipo de muestra, con una gran reproducibilidad (90%) y baja variabilidad (5%) en la presencia de puntos de protena. El anlisis de las imgenes permiti detectar 196 puntos de protena en la membrana de espermatozoiRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 51-59

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Figura 1. Mapas electroforticos bidimensionales de las protenas de membrana plasmtica del espermatozoide provenientes de: (A) semen fresco; (B) semen descongelado sin PPS; (C) semen descongelado con PPS; (D) protenas provenientes del medio de congelacin. Los valores aproximados de los marcadores de peso molecular se relacionan a la izquierda y los de punto isoelctrico, en la parte superior de las imgenes * Puntos de protena perdidos durante la congelacin. ** Puntos de protena provenientes del plasma seminal.

des provenientes de semen fresco (figura 1A), 209 en espermatozoides procedentes de semen congelado sin PPS (figura 1B) y 207 en espermatozoides de semen congelado con PPS (figura 1C). Las protenas encontradas presentaron puntos isoelctricos (pI) entre 4,4 y 6,3, y pesos moleculares (Mr) entre 14,1 y 70,6 kilodalton (kDa).
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El anlisis de las imgenes permiti as mismo identificar 82 puntos de protena, encontrados exclusivamente en muestras de semen congelado; 32 de los cuales se encontraron solamente en las muestras congeladas a las que no se les agreg PPS, mientras que otros 18 puntos slo se encontraron en muestras congeladas a las que se les agreg PPS (datos no presentados).

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Como se enunci anteriormente, se realiz una prueba de correlacin entre los parmetros de motilidad y viabilidad espermtica, y los valores de concentracin de los puntos de protena de membrana del espermatozoide procedente de semen fresco. Dicha prueba evidenci la existencia de correlacin entre cinco de estos puntos y la motilidad espermtica (p < 0,01), y entre el punto 16 y la viabilidad (p < 0,01). Se observ igualmente que ocho puntos de protena de la membrana se pierden durante el proceso de congelacin (tabla 1).
Tabla 1. Coeficientes de correlacin (r; p < 0,01) entre los puntos de protena de la membrana del espermatozoide de semen fresco de carnero y los parmetros de calidad espermtica.
Nmero estndar asignado al punto de protena Mr (kDa) Punto isoelctrico Motilidad espermtica (r) viabilidad espermtica (r)

cuando se adicionan protenas del plasma seminal ovino. Los resultados benficos de la adicin de las protenas del plasma seminal en el mejoramiento de la motilidad y viabilidad espermtica posdescongelacin ya se han reportado anteriormente (Ollero et al., 1997a, 1997b, 1998b). En cuanto a los estudios electroforticos 2D-PAGE, se evidenci en los anlisis comparativos la existencia de diferencias cuantitativas en el nmero de puntos de protena de membrana detectados en cada tipo de muestra (semen fresco, congelado sin protenas del plasma seminal y congelado con protenas del plasma seminal). La prdida de ocho puntos de protena en el espermatozoide congelado detectada en el anlisis indica que estos polipptidos deben haberse perdido como resultado del dao inducido por el proceso de congelacin-descongelacin. Resultados similares fueron reportados en semen congelado de toro, analizado por SDS-PAGE (Ollero et al., 1998a). La alta cantidad de protenas extradas de las muestras congeladas podra deberse a que la incubacin con el detergente de extraccin empleado hubiera removido otras protenas. Este incremento en el nmero de protenas extradas puede ser interpretado como el resultado del dao ocasionado a la membrana por la congelacin, lo cual provocara una mayor sensibilidad de la membrana del espermatozoide a la accin del detergente, como fue reportado anteriormente (Ollero et al., 1998a). En este sentido, se ha reportado la desestabilizacin (Steponkus y Lynch, 1989) y la permeabilizacin de la membrana plasmtica, con prdida de protenas integrales de membrana y componentes intracelulares vitales para el funcionamiento del espermatozoide (Watson et al., 1992), en respuesta al proceso de congelacin-descongelacin.

1 2 3 4 5 6 7* 8* 9* 10* 11* 12 13* 14 15 16 17* 18* 19

14,8 14,9 15,1 15,6 15,7 15,7 21,1 25,2 29,2 33,9 34,0 39,1 42,3 46,94 47,05 50,80 51,1 56,8 57,32

6,1 5,8 5,1 4,6 4,8 5,0 5,8 5,9 6,2 4,9 5,9 6,2 6,1 6,17 6,14 6,11 5,7 6,1 4,86 0,96 0,95 0,91 0,88 0,95 0,95

* Puntos de protena perdidos durante el proceso de congelacin.

Finalmente, el anlisis de las imgenes de los mapas electroforticos evidenci que el contenido del punto de protena identificado con el nmero dos (tabla 1, figura 1C) fue mayor en el esperma proveniente de semen congelado al cual se le adicion PPS (p < 0,05). Tanto el peso molecular como el punto isoelctrico de este punto coinciden con el de un punto de protena procedente del plasma seminal (dato no mostrado).
DISCUSIN

Los resultados evidencian un alto contenido del punto de protena identificado con el nmero dos, en espermatozoides provenientes de semen congelado al cual se le adicionaron protenas del plasma seminal. Tanto su peso molecular como su punto isoelctrico evidencian su correspondencia con un punto de protena procedente del plasma seminal con idnticos valores; de lo cual se puede inferir que la alta concentracin de este punto de protena se debe a la adsorcin de esta protena a la superficie del espermatozoide. Observaciones de otros investigadores han evidenciado que las protenas del plasma seminal se adsorben a la superficie de la clula espermtica, modificando las caractersticas funcionales del espermatozoide deteriorado y reproduciendo aqullas de la clula viva (Garca-Lpez, 1996; Ollero et al., 1997; Barrios et al., 2000). Es posible que aquellos puntos de protena que slo se encontraron en las muestras de semen congelado y en cuyo medio de congelacin no se adicionaron PPS correspondan a protenas provenientes de la yema de huevo
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El presente estudio evidenci un significativo mejoramiento de la calidad espermtica del semen congelado

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usada en el medio de congelacin. De otra parte, no todos los puntos de protena encontrados en las muestras congeladas coincidan con puntos del medio de congelacin, razn por la cual se podra sugerir que algunos de estos puntos de protena pueden ser protenas integrales de membrana que fueron extradas como consecuencia del dao ocasionado a la membrana por la congelacin. Las correlaciones encontradas entre ciertos puntos de protena y la motilidad y viabilidad espermtica sugieren que estas protenas pueden desempear importantes papeles en el mantenimiento de la funcionalidad del espermatozoide. El punto de protena identificado con el nmero 16 parece ejercer un efecto protector sobre la integridad de la membrana espermtica, la cual es esencial para el mantenimiento de la funcionalidad del espermatozoide y es requerida para la capacitacin, reaccin del acrosoma y la unin del espermatozoide al oocito (Yanagimachi, 1994).
CONCLUSIONES

La congelacin del semen de carnero produce variaciones en el perfil de protenas de la membrana del espermatozoide. La identificacin de protenas de la membrana del espermatozoide envueltas en el proceso de fertilizacin puede ayudar en la formulacin de mejores protocolos de congelacin del semen. La importancia fisiolgica de estos descubrimientos justifica la realizacin de ms estudios para identificar, caracterizar y elucidar el papel particular de cada protena en la fisiologa del espermatozoide.
AGRADECIMIENTOS

La adicin de PPS mejor la integridad del espermatozoide de carnero sometido a congelacin.

Este trabajo fue respaldado por recursos de CICYTFEDER AGL 2004-02882, INIA RZ03-035, CICYT-FEDER AGL 2005-02614 y DGA A-26/2005. J. Cardozo fue financiado por Corpoica, Colombia. Los autores agradecen a ANGRA por el suministro de los sementales y a Santiago Morales por la coleccin de las muestras de semen.

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Adicin de protenas del plasma seminal ovino durante la congelacin del espermatozoide y efectos sobre su motilidad y viabilidad
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recu rsos

b ioFsicos

A R t c u lo c I e N t F I co

Evaluation of agroforestry arrangements in cattle exploitations of the micro region Bajo Magdalena

Evaluacin de arreglos agrosilvopastoriles en explotaciones ganaderas de la microrregin Bajo Magdalena


Belisario Roncallo Fandio1, Justo Barros Henrquez2, Ruth Bonilla B.3, Jos Murillo4, Ramiro Del Toro5

The integrated arrangements of production areproposed as a viable option of production from the environmental, technological, social and economical points of view in order to face the degradation of the natural resources, the loss of the productive capacity of soils and the low incomes of the producers. Arrangements were evaluated with agricultural species (beans and corn), forage grasses (Botriochloa pertusa and Panicum maximum) and leguminous plants (Leucaena sp.), and dual purpose cattle under the following treatments: monoculture of B. pertusa; Leucaena sp. associated with B. pertusa; Leucaena sp. associated with P. maximum cv. Tanzania. The chemical, physical and biological characteristics were determined in their order using laboratory and field methodologies. In the study with Phaseolus vulgaris, a design of divided plots was used in the first semester, and in the second one, a randomized blocks design with four treatments and three repetitions per treatment. In the study with Zea mayz two evaluations were realized using a randomized blocks design with five treatments and three repetitions per treatment. The milk production was evaluated by an over-change design. A conservationist effect of the soils was show in the agroforestry arrangements; it was obtain an effect of the variety (p < 0.05) of the typical shrubby beans over the yield. There is an influence of the cultures over the increase of height of Leucaena sp. It was show an significant increase (p < 0.05) in the production and composition of the milk. The integrated arrangements showed higher production in dry matter. Keywords: Legume, grasses, edaphic fauna, dry matter, milk quality.

ABSTRACT

Los arreglos integrados de produccin se proponen como una opcin viable de produccin desde la ptica ambiental, tecnolgica y socioeconmica para encarar el deterioro de los recursos naturales, la prdida de la capacidad productiva de los suelos y los bajos ingresos de los productores. Se evaluaron arreglos con especies agrcolas (frjol y maz), gramneas forrajeras (Botriochloa pertusa y Panicum maximum) y leguminosas (Leucaena sp.), y ganadera de doble propsito bajo los siguientes tratamientos: monocultivo de B. pertusa; Leucaena sp., asociada con B. pertusa; Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania. Las caractersticas qumicas, fsicas y biolgicas se determinaron en su orden por mtodos de laboratorio y de campo. En la evaluacin con Phaseolus vulgaris se utiliz en el primer semestre un diseo de parcelas divididas y en el segundo un diseo de bloques al azar con cuatro tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. En el estudio con Zea mayz se realizaron dos evaluaciones utilizando un diseo de bloques al azar con cinco tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. La produccin de leche se evalu segn un diseo de sobrecambio. Se evidenci un efecto conservacionista de los suelos en los arreglos agrosilvopastoriles; se obtuvo un efecto de la variedad (p < 0,05) del frjol tipo arbustivo sobre el rendimiento. Existe una influencia de los cultivos sobre el incremento en altura de Leucaena sp. Se present un mejoramiento significativo (p < 0,05) en la produccin y composicin lctea. Los arreglos integrados presentaron mayor produccin de materia seca. Palabras clave: leguminosas, gramneas, fauna edfica, materia seca, calidad de leche.
INTRODUCCIN

RESUMEN

Radicado: 30 de marzo de 2009 Aprobado: 23 de abril de 2009

En la microrregin Bajo Magdalena el mal manejo

MV. M.Sc. Investigador principal. E.E. Motilonia, Corpoica, Codazzi, Cesar. broncallo@corpoica.org.co I.A. M.Sc. E.E. Motilonia, Corpoica, Codazzi, Cesar. jualbahe@hotmail.co 3 Biloga Ph.D. Investigadora principal. Laboratorio de Microbiologa de Suelos, CBB, C.I. Tibaitata, Corpoica, Mosquera, Cundinamarca. rbonilla@corpoica.org.co 4 I.A. Especialista en Riego y Drenaje. E.E. Motilonia, Corpoica, Codazzi, Cesar. josemurillosolano@hotmail.com 5 MV.Z. M.Sc. Investigador. Plato, Magadalena. ramirodeltororamos@yahoo.es
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de los suelos por parte de los productores ha causado un impacto negativo sobre los recursos naturales, especialmente el suelo, el agua y la biodiversidad; debido a lo anterior se ha reducido gradualmente la respuesta productiva de los diversos sistemas ganaderos, en especial en reas establecidas tradicionalmente en monocultivos de gramneas, modelo tecnolgico implementado en la
2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

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regin durante varias dcadas. Como alternativa se han planteado esquemas productivos que involucran asociaciones, policultivos e integracin de sistemas de produccin (Restrepo et al., 2007; Acosta y Rebuffo, 2008) Los arreglos integrados son enfoques conceptuales dirigidos fundamentalmente hacia el mejor uso de los suelos y permiten la obtencin diversificada de productos y servicios que procuran garantizar la sostenibilidad, en contraste con el enfoque tradicional que concibe los componentes (rboles, cultivos y pastos-animales) de manera independiente. La amplia diversidad de especies agrcolas, arbreas y pasturas genera un panorama muy amplio para explorar, siendo innumerables las posibilidades de disear arreglos. En el establecimiento integrado de rboles, pasturas y ganadera se resaltan diversas preocupaciones de los productores, siendo las ms frecuentes entre otras: el lucro cesante de la tierra ocasionado por el relativo bajo ndice de crecimiento de las arbreas; la ubicacin ptima espacial y temporal de las especies que intervienen y la eleccin de las especies. En lo referente al lucro cesante del suelo, se han planteado diversas opciones para reducir el tiempo sin generacin de ingreso, destacndose los siguientes: trasplante de plntulas con mayor altura, proteccin con alambre de pas o electrificado, uso de cosechadoras de forraje, siembra de especies arbreas no palatables, establecimiento de cultivos, uso de biofertilizantes para promover el crecimiento, o diferentes combinaciones de stas. Sin embargo, muchas alternativas propuestas no han sido suficientemente estudiadas. El objetivo del presente trabajo fue adelantar procesos investigativos para obtener informaciones que permitan contribuir con la orientacin adecuada sobre el establecimiento de arreglos agrosilvopastoriles ajustados a las realidades biolgicas, tecnolgicas, sociales y econmicas de la microrregin Bajo Magdalena; la inclusin del componente agrcola tuvo como finalidad estimar los rendimientos agrcolas mientras la arbrea obtena el crecimiento adecuado para la introduccin de animales.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

2) acacia forrajera (Leucaena sp.) asociada con kikuyina (Botriochloa pertusa); 3) acacia forrajera (Leucaena sp.) asociada con guinea (Panicum maximum cv. Tanzania). Se utiliz un rea de 18 hectreas, dividida en 6 potreros de 3 ha cada uno, y se asignaron 6 hectreas para cada tratamiento. La acacia forrajera fue establecida a una distancia de 3 x 4 metros. Evaluaciones realizadas Caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas de los suelos Se determinaron las caractersticas fsicas de textura, densidad aparente, porosidad e infiltracin, en tres niveles de profundidad (0 - 30, 30 - 40 y 40 - 60 cm), por medio de los mtodos de laboratorio y de campo. Se realizaron evaluaciones en la fase inicial, la intermedia y la final del experimento. Para el anlisis se tomaron tres muestras por tratamiento en cada nivel de profundidad. Los rangos de los horizontes se determinaron con base en un anlisis visual del perfil del suelo, realizado en tres calicatas, previo a la toma de la muestras. Para las propiedades qumicas se utilizaron los mtodos descritos en el manual No. 47 del programa de suelos del ICA (1989). Los recuentos poblacionales de bacterias, actinomicetos y hongos se determinaron por el mtodo de las diluciones seriadas segn Novo (1983), para lo cual se utilizaron tres medios de cultivo diferentes: rosa de bengala para el recuento de hongos; topping para el recuento de bacterias, y almidn amoniacal para el de actinomicetos. La poblacin microbiana se evalu al final del experimento; debido a la topografa semiondulada del terreno y para efectos del estudio, el rea se subdividi en tres niveles descritos como zonas alta, media y baja. La macrofauna se analiz aplicando la metodologa del programa Tropical Soil Biology and Fertility (TSBF) (Lavelle, 1994; Anderson e Ingram, 1989). Produccin de materia seca y valor nutricional La cantidad de materia seca producida se determin con el mtodo de Haydicok y Schow (1975) antes de la entrada de los animales al potrero y a la salida de los mismos. La composicin qumica de la materia seca del forraje se analiz segn diferentes mtodos, a saber: el contenido de protena cruda con el mtodo de Kjeldahl (AOAC, 1995); la fibra en detergente cida (FDA) con el de Van Soest y colaboradores (1991); la lignina, con el de Van Soest y Wine (1968); y la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) con el mtodo de Tilley y Terry (1963). Rendimiento de los cultivos La evaluacin con los cultivos se realiz en la fase de establecimiento con el fin de determinar la posibilidad de hacer un mejor uso del suelo y generar ingresos en el corto plazo. Simultnea a la siembra de acacia forrajera se sem-

Localizacin El presente estudio se realiz en la finca Melo, localizada en el municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia. La regin posee precipitacin media anual de 1.100 mm, con distribucin bimodal, promedio anual de 29C de temperatura y 70% de humedad relativa. En el experimento se evaluaron los siguientes tratamientos: 1) testigo: monocultivo de kikuyina (Botriochloa pertusa);
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braron cultivos de frjol (Phaseolus vulgaris) y maz (Zea mayz) en los espacios entre surcos. Se tom informacin para estimar la influencia del cultivo sobre el crecimiento de acacia forrajera, para lo cual se realizaron dos experimentos en cada semestre con ambas especies. Con frjol se realizaron dos evaluaciones. En la primera se incluyeron las variedades caupica M-11, ICA provinciano, ICA calamar y las lneas LCPM 34 y LCPM 40, en dos densidades de siembra: 60 x 30 cm y 80 x 30 cm; se utiliz un diseo de parcelas divididas, en las cuales las parcelas principales correspondan a las variedades y las lneas; y las subparcelas, a las densidades de siembra. En la segunda evaluacin, realizada en el segundo semestre del ao, se emplearon las variedades seleccin Palmira, ICA calamar e ICA provinciano en una distancia de siembra de 60 x 30 cm; se utiliz un diseo de bloques al azar con cuatro tratamientos y tres repeticiones por tratamiento, siendo los tratamientos los siguientes: T1 testigo, consistente en la ausencia de cultivo; T2, variedad seleccin Palmira; T3, variedad ICA calamar y T4, variedad ICA provinciano. Con maz tambin se realizaron dos evaluaciones, una por semestre. Se incluyeron las variedades ICA V-156, ICA V-109, criollo blanco y puya amarillo sembradas a una distancia de 1,0 x 0,50 m. Se aplic un diseo experimental de bloques al azar con cinco tratamientos y tres repeticiones por tratamiento, siendo los tratamientos los siguientes: T1 testigo, con ausencia de cultivo; T2, variedad ICA V- 156; T3, variedad ICA V- 109; T4, variedad criollo blanco y T5, variedad puya amarillo. Produccin y composicin de la leche Se utilizaron vacas de doble propsito en fase inicial de lactancia, de dos y tres partos y con cruce racial pardo suizo x ceb. Como grupo experimental se seleccionaron ocho vacas, las cuales conformaron la carga fija y con ellas se estim la produccin de leche (tres veces por

semana) y la composicin de la leche (slidos totales, grasa y slidos no grasos). Estas variables se evaluaron durante dos etapas consecutivas, empleando un diseo de sobrecambio (change-over). La capacidad de carga se determin teniendo en cuenta la oferta de forraje en los aforos realizados, utilizando los animales que conforman la carga fija y otras vacas lactantes, las cuales se incluan o excluan en los potreros segn la disponibilidad de materia seca. Se establecieron seis potreros de 3 ha cada uno, en los cuales se pastore segn un sistema rotacional con 7 das de ocupacin y 35 de descanso. En cada potrero se tom la informacin de produccin y composicin lctea los tres ltimos das de ocupacin.
R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

Caractersticas qumicas, fsicas y biolgicas de los suelos Caractersticas qumicas Los suelos de la finca Melo se clasifican como ligeramente cidos y poseen bajos contenidos de materia orgnica. Para el cultivo de gramneas presentan niveles medios de fsforo y potasio; el magnesio, calcio y sodio se encuentran disponibles en trminos altos. Las caractersticas qumicas al final del experimento en general permanecieron invariables, no revelando cambios sustanciales debido al efecto de los tratamientos (tabla 1). Caractersticas fsicas Las propiedades fsicas iniciales del suelo presentaron en todos los horizontes textura franco arcillo-arenosa, con promedios de densidad aparente de 1,60 g/cm3, porosidad de 38,0% e infiltracin bsica de 20,6 mm/h (tabla 2). Estos valores indican un estado fsico de compactacin no crtico para la produccin de pasturas, y de acuerdo con este diagnstico se recomend la labranza mnima para la

Tabla 1. Anlisis de las caractersticas qumicas del suelo de la finca Melo, ubicada en el municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
evaluacin Inicial Final pH 5,9 5,8 Materia orgnica (%) 0,8 0,9 Fsforo (ppm) 21,5 20,5 meq/100 g de suelo ca 6,9 6,8 Mg 5,3 5,3 K 0,3 0,2 Na 1,2 1,3

Tabla 2. Caractersticas fsicas iniciales del suelo encontradas en la finca Melo, ubicada en el municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Profundidad (cm) 0-30 30-40 40-60 textura (%) A 61 59 67 l 10 15 6 Ar 29 26 27 Densidad aparente (g/cm3) 1,56 1,66 1,60 Porosidad (%) 40 36 38 Infiltracin (mm/h) 20,6 20,6 -

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Tabla 3. Caractersticas fsicas del suelo un ao despus de establecidos los tratamientos en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Profundidad del suelo (cm) tratamientos 0-30 Propiedad inicial Acacia + guinea Acacia+ kikuyina Kikuyina 1,56 1,51 1,53 1,54 Densidad aparente (g/cm )
3

Porosidad (%) 40-60 1,60 1,56 1,58 1,60 0-30 40 42 41 41 30-40 36 36 37 37 40-60 38 40 39 39

30-40 1,66 1,61 1,63 1,63

preparacin del suelo (Murillo, 2002). Sin embargo, por razones de textura del suelo con alto porcentaje de arena (59% a 67%), la topografa semiondulada del terreno y la buena infiltracin, se opt por no implementar labranza. En la fase intermedia del experimento, un ao despus de establecidos los tratamientos, cuando los potreros an no se haban pastoreado, no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos (p > 0,05) en las variables estudiadas (tabla 3). Sin embargo, se observ una tendencia de mejoramiento en las caractersticas fsicas del suelo, expresada en menores valores de la densidad aparente y mayor porosidad en los diferentes horizontes evaluados, principalmente en el tratamiento Leucaena sp., asociada con Panicum maximum cv. Tanzania y en menor grado en la Leucaena sp., asociada con Botriochloa pertusa; en el testigo las propiedades permanecieron estables. Este efecto puede atribuirse a la mayor densidad de las races de la gramnea P. maximum cv. Tanzania y a la penetracin radical de la Leucaena sp., lo cual posiblemente ocasion la expansin de los espacios porosos del suelo. Por estas mismas razones los valores de porosidad estuvieron en concordancia con los registrados en la densidad aparente, donde tampoco se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos (p > 0,05), observndose la misma tendencia de mejoramiento en ambas propiedades. En la fase final del experimento, un ao despus de ser sometidos los potreros a pastoreo, se encontraron diferen-

cias significativas (p < 0,05) en el primer nivel de profundidad (perfil de 0-30) en las variables densidad aparente y porosidad, las cuales aumentaron y disminuyeron, respectivamente, comparados con los potreros en la etapa sin carga. Lo anterior indica que el pisoteo de animales compacta los suelos con mayor intensidad en el perfil de 0-30. En este perfil, se encontraron diferencias significativas (p < 0,05) en el tratamiento kikuyina (B. pertusa) de la etapa sin pastoreo, en relacin con el mismo tratamiento en la etapa con carga animal. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas (p > 0,05) en los tratamientos de Leucaena sp., asociada con P. maximum y en Leucaena sp., asociada con B. pertusa. La menor compactacin en los tratamientos que involucra a Leucaena sp., se puede atribuir a la mayor densidad de sus races y a la cobertura que proporciona al suelo, lo cual amortigua el impacto del pisoteo de los animales. Similares resultados fueron obtenidos por Pinzn y Amzquita (1991) en estudios realizados con Brachiaria decumbens y guaduilla (Homolepis aturensis) (tabla 4). Caractersticas biolgicas Microorganismos En todos los tratamientos, los resultados presentaron mayor recuento microbiano en las zonas bajas en relacin con las medias y altas. En general, las zonas medias registraron mayores cantidades de microorganismos en relacin con las altas; mayor presencia bacteriana se observ

Tabla 4. Caractersticas fsicas finales del suelo de la finca Melo, ubicada en el municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Profundidad del suelo (cm) Tratamientos 0-30 Acacia + guinea sin carga Acacia + kikuyina sin carga Kikuyina sin carga Acacia + guinea con carga Acacia + kikuyina con carga Kikuyina con carga 1,51 c 1,53 bc 1,54 c 1,67abc 1,70 ab 1,73 a Densidad aparente (g/cm )
3

Porosidad (%) 40-60 1,56 a 1,58 a 1,60 a 1,62 a 1,65 a 1,62 a 0-30 42 c 41 bc 41 c 36 abc 35 ab 33 a 30-40 38 a 37 a 37 a 36 a 36 a 35 a 40-60 40 a 39 a 38 a 38 a 37 a a

30-40 1,61 a 1,63 a 1,63 a 1,67 a 1,66 a 1,70 a

* Promedio en la misma columna con letras similares no difiere estadsticamente, segn test de Tukey (p < 0,05).

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Tabla 5. Poblacin de bacterias, actinomicetos y hongos, y porcentaje de humedad de suelos de zonas alta, media y baja cultivados en arreglos agrosilvopastoriles (Tenerife, Magdalena)
uFc/g suelo Arreglos Identificacin Alta Leucaena sp. + P. maximum Media Baja Alta Leucaena sp. + B. pertusa Media Baja Alta B. pertusa Media Baja Humedad (%) 3,6 2,3 5,4 1,3 1,7 1,9 2,4 3,4 3,5 Bacterias x106 0,37 0.63 10,80 0,18 0,47 4,91 3,79 0,32 5,49 Actinomicetos x106 2,84 3,50 5,44 3,40 3,05 3,54 4,20 5,43 5,80 Hongos x102 3,21 3,07 3,27 3,30 3,56 3,64 4,20 3,31 3,27

en las zonas bajas de los tratamientos Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania (1,08 x 107), respecto a Leucaena sp. asociada con B. pertusa (4,91 x 106) y al monocultivo de B. pertusa (5,49 x 106). La misma tendencia se observ cuando se determin la densidad poblacional de los actinomicetos (tabla 5). Este comportamiento se puede explicar por el mayor contenido de humedad presente en suelos de las zonas bajas. En trminos cuantitativos la relacin entre bacterias y actinomicetos se mantuvo estable, y mostr un amplio predominio sobre los hongos. Macrofauna El corto seguimiento realizado a la macrofauna del suelo no permiti analizar los efectos de los tratamientos sobre la misma. Las situaciones encontradas son ms atribuibles a los aspectos topogrficos y de profundidad del suelo. La mayor distribucin poblacional de la macrofauna se encuentra localizada en las zonas bajas, siendo de 96,6%, 83,3% y 83,5% en los tratamientos Leucaena sp. asociada con P. maximum cv. Tanzania, Leucaena sp., asociada con B. pertusa y monocultivo de B. pertusa, respectivamente; este efecto puede atribuirse al mayor contenido de humedad (tabla 6).
Tabla 6. Distribucin porcentual de la macrofauna segn nivel topogrfico en la finca Melo, ubicada en el municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Tratamientos Acacia + guinea Acacia + kikuyina Kikuyina (testigo) Distribucin poblacional (%) Zona alta 3,4 16,7 16,5 Zona baja 96,6 83,3 83,5

Tabla 7. Distribucin porcentual de la macrofauna segn la profundidad del suelo ubicada en la finca Melo de Tenerife, Magdalena, Colombia
Tratamiento Acacia + guinea, % Acacia + kikuyina, % Kikuyina (testigo), % Profundidad del suelo 0-10 cm 95,5 89,6 92,9 10-20 cm 3,4 6,3 4,7 20-30 cm 1,1 4,1 2,4

As mismo, los insectos exhiben la mayor representatividad entre las clases de la macrofauna. Es relevante la presencia de cantidades importantes de individuos pertenecientes a la clase Oligochaeta y al orden Haplotoxida (lombrices de tierra) en los tratamientos Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania (10,1%) y Leucaena sp., asociada con B. pertusa (4,1%) (figura 1). Dentro de la clase Insecta, el orden Isoptera presenta la mayor representatividad variando su distribucin porcentual de 77,4% a 87,3% (figura 2).

De otra parte, en el perfil de 0 - 10 cm de profundidad se concentra la ms alta poblacin de la macrofauna edfica en todos los tratamientos (tabla 7).

Figura 1. Distribucin porcentual por clase de la macrofauna edfica presente en los diferentes tratamientos en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia

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Rendimiento agrcola Se observ mayor precocidad en las variedades caupica M-11 e ICA provinciano y en las lneas LCPM 34 y LCPM 40 (70 das a cosecha) en relacin con la variedad ICA Calamar (79 das a cosecha); sin embargo, los mayores rendimientos (p < 0,05) fueron obtenidos con esta ltima, siendo los promedios de produccin de 1215 y 1145 kg/ha en las distancias de siembra 60 x 30 cm y 80 x 30 cm, respectivamente. Los resultados no revelaron una interaccin positiva entre materiales y distancia de siembra; no obstante se present una tendencia a mejorar los rendimientos en los materiales evaluados en la distancia de siembra de 60 x 30 cm, excepto la lnea LCPM 34 (tabla 8).
Tabla 8. Produccin de Phaseolus vulgaris (kg/ha) con variedades y lneas establecidas en dos densidades de siembra en arreglos agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Materiales Caupica M-11 ICA Provinciano ICA Calamar LCPM-34 LCPM-40 Densidad 60 cm x 30 cm 624,5 b* 520,5 b 1215,0 a 520,5 b 590,5 b 80 cm x 30 cm 347,0 c 277,5 c 1145,0 a 763,5 b 416,5 b

Figura 2. Distribucin porcentual de los rdenes de la clase Insecta presente en los diferentes tratamientos en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia

Rodrguez y colaboradores (2000), al evaluar el comportamiento de la macrofauna del suelo en el sistema de ceba de toros con utilizacin de Leucaena sp., observaron un incremento significativo de la biomasa de los individuos en el tratamiento de pastizal nativo con 100% de acacia forrajera, en el que adems se crearon las condiciones ms favorables para la actividad de la biota, al existir mayor grado de humedad del suelo. Snchez y colaboradores (2000) encontraron una densidad promedio de 81,12 individuos/m2. Los rdenes de la macrofauna de mayor densidad y biomasa correspondieron a Haplotaxida (lombrices de tierra), Stylommatophora (caracoles y babosas) e Isopoda (cochinillas de humedad) y a la clase Diplopoda (ciempis y milpis). La distribucin de los organismos fue diferente entre los estratos y existi un predominio de individuos en el primer estrato. En el rea de monocultivo de gramneas se registr una densidad de 26,4 individuos / m2. Organismos identificados en el presente trabajo tales como los de las clases Oligochaeta, Gastropoda, Diplopoda, y de los rdenes Isopoda, Isoptera, Coleoptera e Hymenoptera son importantes fragmentadores de hojarasca (Adl, 2003, citado por Hou et al., 2005). Laossi y colaboradores (2008) concluyeron que la densidad de la fauna est afectada por la calidad de la hojarasca y que tiene mayor influencia la calidad que la cantidad; as mismo, plantean que la biomasa de las plantas tiene un efecto positivo sobre la diversidad de la macrofauna del suelo y la densidad. De otra parte, diversos estudios han concluido que la diversidad de la fauna del suelo no est asociada con la diversidad de plantas (Salomn et al., 2004; Wardle et al., 2006), lo cual se atribuye a que muchas especies de la fauna del suelo son genricas en trminos de preferencia de alimentos y hbitat (Wardle et al., 2006; Laossi et al., 2008); en general, la literatura ofrece resultados contradictorios acerca de la preferencia alimenticia de los detritvoros.
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* Promedio en la misma columna con letras similares no difiere estadsticamente, segn el test de Tukey (p < 0,05).

En la evaluacin realizada en el segundo semestre del ao, los resultados no revelaron diferencias significativas (p > 0,05) entre los tratamientos; no obstante la variedad ICA Provinciano present rendimientos superiores en 43,3% con respecto a las otras dos variedades (tabla 9). Padilla y colaboradores (2000), al evaluar el efecto del intercalamiento de Vigna unguiculata y Zea mayz, con Leucaena leucocephala cv. Per y Panicum maximum cv. Likoni, concluyeron que las plantas/m2, altura y ramas/ plantas y t/ha de materia seca de la acacia forrajera no se afectaron por la siembra de guinea, maz y frjol, indicando que no existi competencia entre estas especies. La mejor opcin obtenida fue el intercalamiento de tres surcos de frjol en el mes de mayo en el momento de la siembra de la acacia forrajera, seguida de la siembra de tres surcos de guinea en julio, por hacer un aporte en cantidad y calidad
Tabla 9. Produccin de Phaseolus vulgaris (kg/ha) con variedades sembradas en el segundo semestre en sistemas agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, magdalena, Colombia
Variedad Seleccin Palmira ICA calamar ICA provinciano Produccin (kg/ha)* 833,0 833,0 1194,0

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de biomasa total producida. Los rendimientos de frjol obtenidos fueron de 0,45 a 0,75 t/ha de grano. Estimando costos de produccin por hectrea en $1.507.000 con este sistema y con base en un promedio en rendimiento de 1194 kg/ha, el sistema genera un ingreso adicional de $403.400/ha; la siembra de frjol puede realizarse en ambos semestres durante el primer ao de establecida la arbrea (tablas 10 y 11).
Tabla 10. Costos de produccin de 1 ha de frjol para grano en arreglo agrosilvopastoril, en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Actividad Semilla, kg Adecuacin del terreno (corte de malezas con machete y azadn) Siembra Mantenimiento del cultivo (control de malezas con machete) Control de plagas (insecticida y aplicacin) Cosecha en vaina Beneficio del grano Empaques Transporte Total Valor ($) 57.000 200.000 140.000 220.000 100.000 500.000 200.000 60.000 70.000 1.507.000

Analizando el crecimiento de Leucaena sp., durante 90 das despus de transplantadas al sitio definitivo, donde fueron intercalados cultivos de frjol y maz, se observ mayor altura de estas plantas en relacin con las establecidas en cultivos puros. Los resultados registraron promedios de incrementos en altura, superiores de 20,5 cm y 29,0 cm de la acacia forrajera (Leucaena sp.) asociada con frjol y maz, respectivamente, en relacin con las no asociadas; este efecto positivo puede atribuirse al control de malezas adicionalmente realizado a los cultivos. De otra parte, se obtuvo un incremento de altura superior en 41,5% de la Leucaena sp. asociada al maz con respecto al frjol, lo cual puede explicarse posiblemente por el tipo de crecimiento erecto de la gramnea y a la diferencia en el sistema radical de estas especies, reduciendo la competencia por los nutrientes (tabla 12). Posiblemente la arbrea y el frjol poseen races que ocupan los mismos sectores del perfil del suelo (Pezo e Ibrahim, 1999), siendo mayor la competencia por los nutrientes. Produccin de materia seca del forraje y composicin botnica de la pradera Evaluaciones realizadas en el perodo comprendido entre agosto y noviembre, enmarcadas en la poca de mxima precipitacin, registraron promedios de produccin de materia seca mayor en el arreglo Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania (13,7/ha), comparado con el arreglo Leucaena sp. asociada con B. pertusa (3,6 t/ha) y con el monocultivo de B. pertusa (2,0 t/ha). Las producciones de forraje en el tratamiento Leucaena sp. asociada con P. maximum cv. Tanzania fueron superiores en 280% y 585% respecto a las presentadas en los arreglos Leucaena sp. asociada con B. pertusa y al monocultivo de B. pertusa, respectivamente, de lo que se infiere la posibilidad de incrementar notablemente la capacidad de carga. En la composicin botnica se observ un aporte mayor del componente gramnea (91,6%) en el arreglo Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania. En trminos porcentuales, este arreglo fue superior al tratamiento Leucaena sp. asociada con B. pertusa en 20,8% y a B. pertusa, en 17,5%. Es relevante el aporte de la Leucaena sp., en la composicin botnica del tratamiento Leucaena sp., asociado con B. pertusa (tabla 13); tambin es relevante el mejoramiento logrado con la incorporacin de P. maximum en el arreglo, en cuanto a oferta de biomasa.

Tabla 11. Ingreso por hectrea obtenido con el cultivo de frjol para grano en arreglo agrosilvopastoril en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena, Colombia
Ingreso Semilla producida (1194 kg) vendida para consumo Costo total Ingreso Valor ($) 1.910.400 1.507.000 403.400

Crecimiento de las arbreas Altura de la acacia forrajera En la fase de vivero Leucaena sp. present una altura promedio de 11,1 cm, 24,9 cm y 38,3 cm a los 30, 60 y 90 das despus de la siembra, registrando promedios de crecimiento de 11,1 cm, 13,8 cm, 13,4 cm en los intervalos de 0 a 30, 30 a 60 y 60 a 90 das, respectivamente.

Tabla 12. Promedio de incremento en altura de la acacia forrajera intercalada con frjol y maz 90 das despus del transplante en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena
Tratamientos Frjol Promedio de incremento de altura (cm) 91,7 13,8 testigo 71,2 18,7 Diferencia 20,5 Maz 123,2 31,0 testigo 94,3 24,0 Diferencia 29,0

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Tabla 13. Produccin de materia seca y composicin botnica de potreros en arreglos agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena
Arreglo Materia seca (t/ha) Composicin botnica (%) Gramnea leguminosa Malezas

Produccin y composicin lctea Produccin lctea En la tabla 15 se incluyen los parmetros analizados en dos ciclos de pastoreo rotacional con 7 das de ocupacin y 35 de descanso. Se aprecia en ambos ciclos de pastoreo mejores expresiones de los parmetros evaluados en el tratamiento Leucaena sp. asociada a P. maximum cv. Tanzania. En el primer ciclo de pastoreo se obtuvo mayor produccin de leche por hectrea durante el perodo evaluado en el arreglo Leucaena sp., asociada a P. maximum, con una produccin de 1255,8 L; superior a la obtenida con los arreglos Leucaena sp., asociada con B. pertusa (378 L) y B. pertusa (344,4 L). La mayor capacidad de carga se registr con el arreglo Leucaena sp., asociada con P. maximum en ambos ciclos de pastoreo (4,7 y 5,5 cabezas/ha), superior a la obtenida con el sistema de gramnea modal de la zona -kikuyina en monocultivo(1,3 y 1,3 cab/ha) y el arreglo Leucaena sp. asociada con B. pertusa (1,3 y 1,8 cab/ha). Similar tendencia se observ en el segundo ciclo de pastoreo, en el cual se registr una produccin de leche/ ha de 1213,8 L durante el ciclo, superior a la obtenida con los arreglos Leucaena asociada a B. pertusa (483,0 L) y B. pertusa (289,8 L), respectivamente. En el valle del Cesar en potreros conformados por mezclas de las gramneas kikuyina (B. pertusa) y angleton (D. aristatum) asociadas con acacia forrajera se obtuvo un incremento de la produccin de leche por vaca por da de 41,8% en

Acacia + guinea Acacia + kikuyina Kikuyina

13,7 3,6 2,0

91,6 64,0 74,1

1,0 6,8 0,0

3,9 29,0 18,9

Valor nutritivo del forraje Los anlisis qumicos de los materiales revelaron mayor contenido de protena cruda (p < 0,05) de la gramnea P. maximum cv. Tanzania en relacin con la B. pertusa asociada con Leucaena sp. La protena cruda tambin present tendencia al incremento en ambas gramneas (P. maximum y B. pertusa) al pie de la acacia forrajera respecto a las localizadas en la mitad de la calle, efecto atribuido posiblemente a la presencia del rbol. As mismo, es relevante el menor contenido de protena cruda y la baja digestibilidad de B. pertusa en monocultivo (tabla 14). Ribaski e Inoue (2000) obtuvieron resultados similares y concluyeron que el forraje de pasto buffel (Cenchrus ciliaris) bajo la copa de rboles de trupillo (Prosopis juliflora, SW) present mejor valor nutritivo, caracterizado principalmente por los mayores porcentajes de protena cruda y aumento de la digestibilidad in vitro de la materia seca, especialmente del material ms cercano al fuste de los rboles.

Tabla 14. Valor nutritivo de los forrajes en arreglos agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena
Arreglo Guinea pie de rbol Guinea mitad calle Kikuyina pie de rbol Kikuyina mitad calle Kikuyina monocultivo P.c. (%) 13,6 a 12,9 a 7,7 b 6,9 b 3,7 c F.D.A. (%) 19,1 b 15,8 b 20,0 b 18,8 b 28,7 a lignina (%) 3,0 b 3,6 b 6,1 ab 6,5 ab 8,5 a Digestibilidad (%) 49,3 a 51,8 a 51,7 a 51,7 a 46,6 b

* Promedio en la misma columna con letras similares no difiere estadsticamente, segn test de Tukey (p < 0,05).

Tabla 15. Produccin de leche con vacas en pastoreo en arreglos agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena
Parmetro Promedio de produccin, L/vaca/da Capacidad de carga, cab/ha Produccin/ha, L/ha Produccin perodo/ha, L/ha 6,30 1,3 8,2 344,4 Primer ciclo (42 das) A 6,93 1,3 9,0 378,0 B 6,37 4,7 29,9 1255,8 c 5,30 1,3 6,9 289,8 A 6,40 1,8 11,5 483,0 Segundo ciclo (42 das) B 5,25 5,5 28,9 1213,8 c

A: potrero de kikuyina. B: potrero acacia-kikuyina. C: potrero de acacia-guinea cv. Tanzania.

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relacin con potreros de solo gramneas (Roncallo et al., 2000). Composicin lctea Los anlisis de composicin lctea registraron contenidos de grasa, slidos no grasos y slidos totales en los sistemas agrosilvopastoriles superiores al obtenido en el monocultivo de B. pertusa. La leche en los arreglos Leucaena sp., asociada con P. maximum cv. Tanzania y Leucaena sp. asociada con B. pertusa presentaron contenidos de slidos totales superiores en su orden de 1,23 y 1,09% en relacin con el obtenido en el monocultivo de B. pertusa; as mismo, los contenidos de grasa fueron superiores en 0,68 y 0,71%, respectivamente; este efecto puede atribuirse al mayor suministro de nutrientes aportados por los arreglos agrosilvopastoriles (tabla 16).
Tabla 16. Composicin lctea en arreglos agrosilvopastoriles en la finca Melo, municipio de Tenerife, Magdalena
Grasa (%) Acacia + kikuyina Acacia + guinea Kikuyina 4,53 a* 4,50 a 3,82 b Slidos no grasos (%) 8,73 b* 9,02 a 8,46 c Slidos totales (%) 13,37 a* 13,51 a 12,28 b

CONCLUSIONES

Es evidente el efecto conservacionista de los arreglos agrosilvopastoriles en lo que respecta a las caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas del suelo, el cual es visible en las variables densidad aparente y porosidad en el perfil de 0-30 cm de profundidad y poblacin microbiana. En sistemas agrosilvopastoriles, cuando se cultiva el frjol tipo arbustivo existe un efecto de la variedad sobre el rendimiento; el cultivo genera un beneficio econmico importante. Los cultivos establecidos en el primer ao benefician el incremento de la altura de la acacia forrajera (Leucaena sp.); el efecto del maz es mayor en relacin con el del frjol. La produccin de materia seca (t/ha) fue superior en el arreglo acacia+guinea (Leucaena sp. + P. maximum) y acacia+kikuyina (Leucaena sp. + B. pertusa) en relacin con la kikuyina (B. Pertusa). El valor nutricional de la kikuyina es favorecido por la presencia de la acacia forrajera. La produccin y la composicin lctea en los sistemas agrosilvopastoriles presentaron incrementos significativos en relacin con el grupo testigo.

* Promedio en la misma columna con letras similares no difiere estadsticamente, segn test de Tukey (p < 0,05).

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A R t c u lo c I e N t F I co

Standardization of a complex culture media for multiplication of C50 Rhizobium sp. strain

Estandarizacin de un medio de cultivo complejo para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp.
Daniel Fernando Rojas T.1, Mara Fernanda Garrido R.2, Ruth Rebeca Bonilla B.3

The indiscriminate use of chemical fertilizers, its process of production and its application had increased the costs of agricultural production and the environmental problems because of the pollution of air, soil and water sources. The alternative is the use of biological fertilizers as an economical and clean tool in order to sustainable management of ecosystems. However, in the escalation processes of a biofertilizer the costs of production could increase due to the type of formulation and the culture media used for the multiplication of the bacteria. This research, by using statistical designs sequentially, presents the standardization of an economical culture media used to multiply the strain C50 of Rhizobium sp. From eight nutritional sources, five were selected taking as criteria the low economical costs and the availability of above mentioned nutritional sources; from these five sources, three of them influenced the development of the strain significantly. The optimized composition of the alternative culture media included glycerol, molasses, glutamate, yeast extract and salts. There were no significantly differences in the growth of the strain C50 in the alternative culture media compared with the traditional one (yeast extract mannitol); nor in viability of the strain growth on traditional media culture compared with the alternative one, when it was inoculated on peat. The inoculants conserved its quality in refrigeration during 30 days. The strains J01, T14 and C2 showed a better rate of growth on the alternative culture media; it was not show significant differences in the counts between the strains J01 and T14; whereas, the strain C2 growth better in the alternative culture media. Keywords: Rhizobia, Plackett-Burman design, fractional factorial design, Box-Behnken design.

ABSTRACT

El uso indiscriminado de fertilizantes qumicos y su proceso de obtencin y aplicacin ha incrementado los costos de produccin agrcola y los problemas ambientales debido a la contaminacin del aire, el suelo y las aguas. Se ha planteado como alternativa la aplicacin de fertilizantes biolgicos como una herramienta econmica y limpia para el manejo sostenible de los ecosistemas. Sin embargo, en los procesos de escalamiento de un biofertilizante pueden incrementarse los costos de produccin debido al tipo de formulacin y a los medios de cultivo empleados para la multiplicacin de las bacterias. Esta investigacin, con base en el uso secuencial de diseos estadsticos, presenta la estandarizacin de un medio de cultivo econmico para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp. De ocho fuentes nutricionales se seleccionaron cinco, teniendo como criterios los menores costos econmicos y la disponibilidad de dichas fuentes; de estas cinco, tres influyeron significativamente sobre el desarrollo de la cepa. La composicin optimizada del medio alterno incluy glicerol, melaza, glutamato, extracto de levadura y sales. No se presentaron diferencias significativas en el crecimiento de la cepa C50 en el medio alterno comparado con el tradicional (levadura-manitol), ni en la viabilidad de la cepa crecida en el medio tradicional respecto al alterno, cuando se inocul sobre turba. El inoculante conserv su calidad en refrigeracin durante 30 das. Las cepas J01, T14 y C2 mostraron buen ndice de crecimiento sobre el medio alterno; no se presentaron diferencias significativas en los recuentos entre las cepas J01 y T14, mientras que la cepa C2 creci mejor en el medio alterno. Palabras clave: rizobios, diseo Plackett-Burman, diseo factorial fraccionado, diseo Box-Behnken.
INTRODUCCIN

RESUMEN

Radicado: 4 de mayo de 2009 Aprobado: 28 de mayo de 2009

En suelos tropicales, el elemento ms limitante en

Microbilogo Industrial. Laboratorio de Microbiologa de Suelos, CBB, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. dfrojas@corpoica.org.co 2 MA.V. M.Sc. Investigadora mster asistente. CBB, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. mgarrido@corpoica.org.co 3 B. Ph.D. Investigadora principal. Laboratorio de Microbiologa de Suelos, CBB, C.I. Tibaitat, Corpoica, Mosquera. rbonilla@corpoica.org.co
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el desarrollo de las plantas es el nitrgeno (Franco y Dbereiner, 1994), y para la solucin de este problema se emplean indiscriminadamente fertilizantes de sntesis qumica con el objetivo de mejorar la produccin de los cultivos (Marn et al., 2003). Sin embargo, su uso est limitado por el alto costo y los efectos adversos sobre el
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Estandarizacin de un medio de cultivo complejo para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp.

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medio ambiente, causando contaminacin de aguas subterrneas, eutrofizacin, erosin y, en general, cambios en la estructura fsico-qumica del suelo y una drstica disminucin de la biota edfica (Justic et al., 1995; Rabalais et al., 1996; Tejada et al., 2005). Dentro del concepto de agricultura sostenible surgen tecnologas limpias como es la biofertilizacin con bacterias fijadoras de nitrgeno, la cual se plantea como una alternativa segura, efectiva y, sobre todo, econmica para recuperar la productividad de los suelos (Mahecha, 2002; Sylvia et al., 2005). En los sistemas ganaderos tropicales se propende por el uso de plantas leguminosas debido a que muchas de ellas tienen el atributo de asociarse con un grupo de microorganismos denominados conjuntamente rizobios con los cuales establece una relacin simbitica, mediante la cual la bacteria provee a la planta de compuestos nitrogenados y la planta a sta de compuestos carbonados. Esta simbiosis se lleva a cabo dentro de una estructura especializada denominada ndulo, rgano capaz de llevar a cabo el proceso de fijacin. Existen evidencias que en cultivos de soya y otras leguminosas esta asociacin puede proveer hasta 100% la fertilizacin qumica nitrogenada (Gage, 2004). Sin embargo, muchas veces el proceso de produccin de bioinoculantes basado en este tipo de bacterias es costoso debido al medio de cultivo empleado para su multiplicacin; razn por la cual, buscar alternativas representa un foco central en el proceso de investigacin para la produccin de biofertilizantes bacterianos (Rebah et al., 2007). El diseo de medios de cultivo econmicos para el crecimiento de microorganismos para la disminucin de costos en la produccin de bioinoculantes es de gran importancia debido a que se crean condiciones favorables para su adopcin. As mismo, existen algunos mtodos estadsticos que son utilizados como herramientas efectivas que permiten obtener una rpida aproximacin hacia los factores clave que afectan el crecimiento celular (Ren et al., 2008). El uso de diseos experimentales tanto para la estandarizacin como para la optimizacin de medios de cultivo est bien documentado (Altaf et al. 2007; Gao y Gu, 2007; John et al., 2007; Lofty, 2007). No obstante, la aplicacin de estos diseos debe hacerse de forma lgica y subsecuente para lograr una buena aproximacin a las concentraciones que maximizan el efecto sobre la variable de respuesta (Ren et al., 2008) teniendo en cuenta las diferencias fisiolgicas que puedan presentar los microorganismos de inters. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar un medio de cultivo complejo haciendo uso de productos y subproductos agroindustriales para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp., la cual es capaz de nodular la leguminosa forrajera Leucaena leucocephala y, adems, probar la efectividad del medio sobre otras cepas de rizobios que nodulan leguminosas de importancia econmica.
Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 70-80

M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Descripcin y mantenimiento de los microorganismos utilizados Las cepas C50 y T14 de Rhizobium sp., y la cepa J01 de Bradyrhizobium sp., utilizadas en el presente estudio provinieron del Banco de germoplasma de microorganismos con potencial biofertilizante del Laboratorio de Microbiologa de Suelos del Centro de Biotecnologa y Bioindustria CBB- Corpoica C.I Tibaitat. La cepa C2 capaz de nodular la leguminosa forrajera Clitoria ternatea fue obtenida en estudios previos adelantados por los autores en el mismo laboratorio. Se us la cepa C50 para todos los ensayos relacionados con el diseo del medio de cultivo. Todas las cepas fueron propagadas en medio levadura-manitol-agar (LMA) a 28 2C (Vincent, 1970). La cepa C50 fue conservada en glicerol 30% a -20C, y las otras cepas se mantuvieron en tubos con medio LMA inclinado a 4 2C y descritas fenotpicamente (descripcin macro y microscpica). El medio levadura-manitol (LM) tiene la misma composicin del LMA sin adicin de agar. Estandarizacin del inculo Se tomaron 100 mL de inculo de la cepa C50 crecida a 28 2C y 150 rpm (condiciones estndar) durante 20 h, las cuales se centrifugaron a 6000 rpm durante 10 min y se resuspendieron en solucin salina estril (SS) (NaCl 0,85%) a un cuarto de su volumen. La concentracin de la suspensin de clulas fue ajustada a 2 g de clulas/L (peso seco) empleando SS estril y utilizada en todos los diseos estadsticos a razn del 1% del volumen del medio. Obtencin y caracterizacin de las fuentes de crecimiento Las seis fuentes de crecimiento: glicerol, sacarosa, melaza, glutamato, extracto de levadura y extracto de soya, y las sales grado analtico- fueron provistas por el Laboratorio de Microbiologa de Suelos del CBB Corpoica. El contenido de nitrgeno y carbono total de las fuentes fue determinado en el Laboratorio de Qumica de Suelos del C.I. Tibaitat, Corpoica. Determinacin de la concentracin celular La concentracin celular (UFC/mL) fue determinada por medio de la tcnica de recuento en placa sobre medio LMA, realizando diluciones seriadas en base diez desde 10-3 hasta 10-10. El tiempo de incubacin fue de 24 h para las cepas C50 y T14, 120 h para J01 y 144 h para C2, y se aplic una temperatura promedio de 28 2C.

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Estandarizacin de un medio de cultivo complejo para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp.

Estrategia experimental, mtodos estadsticos y software Se emplearon diferentes diseos estadsticos subsiguientes para seleccionar y optimizar, de forma preliminar, la concentracin de varias fuentes de crecimiento sobre la multiplicacin de la cepa C50. El proceso incluy primero la identificacin de los sustratos influyentes (diseo Plackett-Burman), para as enfocar la investigacin sobre un subconjunto de sustratos crticos del medio (Plackett y Burman, 1946) (tabla 1). Posteriormente, se aplicaron dos diseos factoriales fraccionados para acercarse al ptimo de la respuesta de la bacteria en cuanto a produccin de clulas sobre el medio de cultivo y, finalmente, se gener un diseo de superficie de respuesta para optimizar las concentraciones que maximizaban la respuesta: Box Behnken (Box y Behnken, 1960). Para los ensayos de viabilidad se us la prueba de ANOVA y el test de Tukey con una confianza del 95%.
Tabla 1. Fuentes de crecimiento, codificacin y niveles para el diseo Plackett-Burman
Factores Glicerol Sacarosa Melaza Glutamato Extracto de levadura Extracto de soya Cloruro de amonio Sales Variables C1 C2 C3 N1 N2 N3 N4 S Nivel bajo (-1) (g/l) 1,26 1,58 0,99 0,09 0,10 0,13 0,03 0,50 Nivel alto (+1) (g/l) 3,78 4,75 2,96 0,21 0,23 0,30 0,07 0,10

concentracin de peso seco de biomasa usando la curva de peso seco y se ajust as el cultivo a 2 g de clulas/L de suspensin. La suspensin resultante se emple en todos los tratamientos generados en cada uno de los diseos estadsticos subsecuentes a razn del 1% del volumen. Cintica de crecimiento en el medio de cultivo alterno y el tradicional Un inculo con volumen final de 250 mL fue preparado a partir de una suspensin de 2 g de clulas/L y a razn de 1% en medio tradicional (LM) y alterno (Rojas, Garrido, Bonilla RGB) con relacin y condiciones de incubacin estndar; el ensayo se realiz por triplicado. La cintica fue determinada mediante peso seco ( = 540 nm). Evaluacin del medio alterno sobre el crecimiento de otras cepas de rizobios Un cultivo crecido de las cepas T14 de Rhizobium, J01 de Bradyrhizobium y la cepa C2 de 48, 120 y 144 horas, respectivamente, fue inoculado a razn del 1% en 25 mL de medio LM y RGB, y se incubaron durante los mismos perodos de tiempo. Posteriormente, se estim la poblacin celular mediante la tcnica de recuento en placa sobre medio LMA, realizando diluciones seriadas en base diez. Se usaron las condiciones de incubacin estndar. Cada ensayo se realiz por triplicado y se emple una prueba t con 95% de confianza para el anlisis de los datos obtenidos. Prueba de estabilidad preliminar sobre soporte (turba) Se inocularon 400 g de turba en bolsas de polietileno de alta densidad con 100 mL de un cultivo de 20 h de la cepa C50 crecida en LM (tratamiento 1) y RGB (tratamiento 2). Las bolsas inoculadas se incubaron a 28 2C durante 24 h se refrigeraron a 4 2C. Se hicieron recuentos a los 0, 15 y 30 das de refrigeracin. El ensayo const de dos tratamientos y cinco repeticiones, como control negativo se inocul el soporte con medio estril. Para este ensayo se emple un diseo completamente aleatorio. Anlisis econmico Se realiz un anlisis de los costos de produccin del medio de cultivo a volumen de un litro teniendo en cuenta el costo de los reactivos empleados.
R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

Los diseos experimentales usados y los anlisis estadsticos realizados fueron generados, ejecutados y analizados mediante el software estadstico Statgraphics Plus (versin 5.1, Statistics Graphical Corporation, USA). Como control en cada uno de los diseos se emple el medio LM. Estandarizacin del inculo para los ensayos del medio de cultivo Se adicion el preinculo a razn de 1% del volumen efectivo de trabajo, correspondiente al contenido de un vial (1 mL), sobre un erlemeyer de 500 mL con relacin 1/5 y se llev a incubacin a 28 2C y 150 rpm (condiciones estndar) durante 20 horas. Posteriormente, el cultivo se centrifug a 6000 rpm durante 10 min y se resuspendi a un cuarto de su volumen inicial con solucin salina estril (NaCl 0,85%). Se tomaron 3 mL de la suspensin y se determin la absorbancia con el fin de calcular la

Descripcin fenotpica de las cepas Las caractersticas macroscpicas de las cepas del estudio coincidieron con la descripcin registrada por KuykenRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 70-80

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Tabla 2. Descripcin macroscpica de las cepas


Descripcin macroscpica Cepa tamao de las colonias (mm) 3 2-3 2 1 Formacin de cido o lcali1/ Ac Ac Ac Al tiempo de crecimiento R R L L color de las colonias T T BL BL transparencia T T O O elevacin C C C C Forma de las colonias R R R R Formacin de moco P P P A Borde Li Li Li Li

Rhizobium sp. C50 Rhizobium sp. T14 Bradyrhizobium sp. J01 C2

1/: Descripcin de las cepas en LMA + azul de bromotimol. Ac: cida, Al: alcalina, N: neutra, R: rpido, L: lento, T: transparente, BL: blanca/lechosa, T: translcida, O: opaca, C: convexa, R: redondas, P: presente, A: ausente, Li: liso.

dall (2005) y Kuykendall y colaboradores (2005) (tabla 2). Microscpicamente todas las cepas se describieron como bacilos gram-negativos. Determinacin del contenido de carbono y nitrgeno total en las fuentes de crecimiento Los resultados de los anlisis qumicos en relacin con las concentraciones de carbono y nitrgeno total de las fuentes usadas se encuentran relacionados en la tabla 3. Estos
Tabla 3. Contenido de carbono y nitrgeno total en las fuentes de crecimiento
Fuente Glicerol Sacarosa Melaza Glutamato Extracto de levadura Extracto de soya NH4Cl % carbono 52,9 42,1 67,5 35,4 84,8 72,1 0 % nitrgeno < 0,01 < 0,01 0,16 8,27 7,52 5,88 0,26 c/N 52,9 42,1 421,9 4,3 11,3 12,3 0

clculos fueron empleados para obtener las cantidades a utilizar de cada una de las fuentes utilizadas sin alterar la relacin carbono-nitrgeno del medio LM estndar para el crecimiento de rizobios (Vincent, 1970). Fase de tamizaje: diseo Plackett-Burman (Diseo P-B) El diseo P-B fue usado para identificar las variables que tenan efecto significativo sobre el crecimiento celular. Se analizaron ocho variables, los niveles: alto (+) y bajo (-) se seleccionaron de acuerdo con los criterios de aumento en la concentracin celular y costo econmico. Los resultados del diseo P-B que se implement con 12 tratamientos y dos niveles de cada variable se presentan en la tabla 4. Ninguno de los factores tuvo un efecto estadsticamente significativo (p > 0,05) sobre el crecimiento de la cepa C50 (tabla 5), por lo tanto, la seleccin de fuentes de crecimiento se realiz de acuerdo con parmetros de costo econmico y disponibilidad en el mercado. Se seleccionaron dos fuentes de carbono (glicerol y melaza), dos de nitrgeno (glutamato y extracto de levadura) y sales.

Tabla 4. Diseo Plackett-Burman con ocho factores y resultados


corrida 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Factores codificados c1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 c2 +1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 -1 c3 -1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 N1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 -1 N2 +1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 N3 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 N4 +1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 S -1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 Recuento observado 3,39X1010 2,18X10 5,47X10 4,49X10 7,55X10
10

Recuento predicho 4,322X1010 2,369X1010 2,690X1010 4,566X1010 8,159X1010 4,296X1010 4,680X1010 6,641X1010 6,990X1010 4,974X1010 3,431X1010 6,607X1010

3,63X1010
10

7,25X1010
10

5,61X1010
10

8,64X1010 4,78X1010 1,78X10


10

4,96X1010

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Tabla 5. Efectos y anlisis de variables por mtodo estadstico


Fuente C1 C2 C3 N1 N2 N3 N4 S GL1/ 1 1 1 1 1 1 1 1 Efecto estimado -10,44X10 1,01X10
9 9

Suma de cuadrados 9,82X10 9,17X10 1,93X10 7,22X10 5,67X10


20 18

Radio F 0,56 0.01 1.21 0,11 0,81 0.00 0,07 3,21

Valor p 0,4625 0,9431 0,2816 0,7429 0,3765 0,9984 0,8510 0,0846

15,40X109 -4,64X10 -2,83X10


9

2,13X1021
20

-12,60X109
7

1,43X1021
15

3,81X109 -25,10X10
9

1,30X1020
21

1/: GL: Grados de libertad. El error estndar fue de 4,20X1010. Las concentraciones de cada fuente se encuentran consignadas en la tabla 1.

El anlisis de regresin gener la siguiente ecuacin lineal: Y = 4,978X1010 5,223X109 * C1 + 5,047X108 * C2 + 7,703X109 * C3 2,321X109 * N1 6,303X109 * N2 1,416X107 * N3 + 1,905X109 * N4 1,255X109 * S (1) Fase de mejoramiento: diseo factorial fraccionado 1 (DFF1) Se aplic un diseo factorial fraccionado sobre las fuentes seleccionadas en el diseo P-B usando las mismas concentraciones (tabla 6).
Tabla 6. Efectos y anlisis de variables por mtodo estadstico
Corrida Factores codificados1/ c1 c3 N1

No hubo diferencia estadsticamente significativa entre los recuentos del DFF1 y los del P-B, por lo tanto la eliminacin de los sustratos no afect la viabilidad celular y se descarta cualquier tipo de interaccin entre los compuestos seleccionados y los omitidos del medio de cultivo. En el DFF1 dos fuentes, el glutamato y el extracto de levadura, presentaron un efecto significativo sobre el crecimiento celular (p < 0,05) (tabla 7). Esto se puede atribuir a que el glutamato no slo representa una fuente de grupos amino, sino tambin a que puede actuar como intermediario metablico para la sntesis de otros aminocidos o de bases nitrogenadas, compuestos esenciales para el desarrollo celular (Matheus et al., 2002). Por otra parte,

N2

Valor observado2/

Valor predicho

1 2 3 4 5 6 7 8

-1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1

+1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1

-1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

-1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1

-1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 -1

2,50X109 2,79X10
10

-1,22X1010 4,29X1010 1,73X1010 2,68X1010 5,63X1010 4,77X1010 2,12X1010 6,94X1010

2,56X109 1,20X1010 7,11X1010 3,27X10


10

3,62X1010 8,44X1010

1/: En g/L las concentraciones ajustadas fueron: C1 nivel alto (+) = 5,67; nivel bajo (-) = 1,89; C3 nivel alto (+) = 4,44, nivel bajo (-) = 1,48; N1 nivel alto (+) = 0,43, nivel bajo (-) = 0,18; N2 nivel alto (+) = 0,47, nivel bajo (-) = 0,20; S nivel alto (+) = 0,50, nivel bajo (-) = 0,10. 2/: Resultado de tres mediciones.

Tabla 7. Efectos y anlisis de variables por mtodo estadstico


Fuente C1 C3 N1 N2 S Gl 1 1 1 1 1 efecto estimado 1,54X10
9

Suma de cuadrados 1,42X10


19

Radio F 0,02 3,73 6,32 5,39 0,51

Valor p 0,8998 0,0713b 0,0230ab 0,0338ab 0,8722

-23,3X109 30,3X109 28,0X10


9

3,26X1021 5,52X1021 4,71X10


21

8,65X109

4,49X1020

a: variables con efecto significativo sobre la multiplicacin de la cepa con confianza 95%. b: variables con efecto significativo sobre la multiplicacin de la cepa con confianza 92,5%. R2 corregido = 0,60.

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el extracto de levadura representa no slo una fuente de compuestos nitrogenados sino tambin de elementos traza, cofactores enzimticos, vitaminas y cidos nucleicos, entre otros, que favorecen el desarrollo de la bacteria (Takahashi et al., 2006; Edens et al., 2002). Las fuentes de carbono y de sales evaluadas no tuvieron efecto significativo (p > 0,05) sobre el crecimiento de la cepa C50, por lo tanto en los diseos posteriores se utiliz el nivel inferior (-1) de cada una de las fuentes (tabla 7); la melaza tuvo un efecto significativo negativo, por tanto fue empleada para los estudios posteriores en el nivel inferior. El anlisis de regresin gener la siguiente ecuacin lineal: Y = 3,368X10 1,165X10 * C3 + 7,716X10 * C1 + 1,517X10 * N1 + 1,401X1010 * N2 + 4,328X109 * S (2)
10 10 8 10

g a disminuir an ms la concentracin de esta fuente. Por otra parte, el glutamato nuevamente ejerci un efecto positivo sobre el crecimiento mientras que el aumento en la concentracin de extracto de levadura no favoreci el desarrollo celular. Este efecto negativo se explica porque la concentracin de extracto de levadura pudo haber superado el lmite de tolerancia de la cepa, lo cual provoc distorsin en las clulas, y por consiguiente una disminucin en la viabilidad celular dentro del medio de cultivo, lo cual ha sido confirmado por diversos estudios que demuestran que existe una relacin ntima entre estas variables (Skinner et al., 1976). El anlisis de regresin gener la siguiente ecuacin lineal: Y = 4,582X1010 2,288X1010 * C3 + 1,615X1010 * N1 2,007X1010 * N2 (3) Fase de optimizacin: diseo Box Behnken Los diseos de superficie de respuesta dan un acercamiento preliminar a las concentraciones que optimizan la variable dependiente: concentracin celular. En la evaluacin de las 15 corridas para la optimizacin de tres parmetros individuales, la mxima concentracin celular se obtuvo cuando la melaza se encontr en el nivel inferior y el extracto de levadura y el glutamato se encontraban en el superior. Los datos fueron analizados con el mtodo de anlisis de regresin mltiple usando Statgraphics Plus 5.1; la siguiente ecuacin polinomial fue derivada para representar la produccin de biomasa como una funcin de las variables independientes analizadas.

Fase de mejoramiento: diseo factorial fraccionado 2 (DFF2) Se modific la concentracin de glutamato, extracto de levadura y melaza en el mismo sentido del efecto estimado para la variable (tabla 8). El anlisis estadstico del DFF2 revel que las tres fuentes tuvieron un efecto significativo sobre la variable de respuesta (p < 0,05), el glutamato tuvo un efecto positivo sobre el crecimiento celular mientras que el extracto de levadura y la melaza tuvieron un efecto negativo (tabla 9). La melaza nuevamente tuvo el mismo efecto, lo cual obli-

Tabla 8. Diseo de superficie de respuesta: Box Behnken y resultados con niveles factor
corrida 1 2 3 4 5 Factores codificados1/ c3 -1 1 0 1 -1 N1 1 1 0 -1 -1 N2 -1 1 0 -1 1 Factores no codificados (g/l) c3 1,48 2,96 2,22 2,96 1,48 N1 0,66 0,66 0,54 0,42 0,42 N2 0,46 0,73 0,59 0,46 0,73 Valor observado2/ 1,06X1011 1,99X1010 4,22X10 3,34X10
10

Valor predicho 1,05X1011 1,90X1010 4,58X1010 2,69X1010 3,25X1010

2,78X1010
10

1/: En g/L: C1 = 1,89 y S = 0,10 se dejaron constantes. 2/: Resultado de tres mediciones.

Tabla 9. Efectos y anlisis de variables por mtodo estadstico


Fuente C3 N1 N2 GL 1 1 1 Efecto estimado -4,57X10
10

Suma de cuadrados 6,28X10


21

Radio F 10,85 5,40 8,34

Valor p 0.0093a 0.0452a 0.0179a

3,23X1010 -4,01X1010

3,12X1021 4,83X1021

a: variables con efecto significativo sobre la multiplicacin de la cepa con confianza 95%. R2 corregido = 0,76.

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Y = 4,802X1010 + 1,567X1010 * N1 + 1,077X1010 * N2 1,999X1010 * C3 + 1,319X1010 * N12 + 2,542X1010 * N1 N2 2,301X1010 * N1C3 8,498X109 * N22 7,125X109 * N2C3 + 3,168X109 * C32 (4) Las superficies de respuesta fueron graficadas usando el software Statgraphics Plus 5.1 para estudiar los efectos de los parmetros y sus interacciones sobre la produccin de biomasa (tabla 10). Los grficos de superficie de respuesta tridimensionales son presentados en las figuras 1, 2 y 3. Se obtuvo un incremento en la concentracin celular cuando el glutamato y el extracto de levadura se encontraban en el nivel superior (figura 1). Los resultados descritos estn acordes con los obtenidos por Meade y colaboradores (1985), quienes en un fermentador de 200 L llevaron a cabo la multiplicacin de una cepa de Rhizobium leguminosarum bv viciae usando un medio de cultivo basado en levadura grado industrial y obtuvieron despus de 40 h recuentos superiores a 2 X 109 UFC/ mL. La interaccin entre estas fuentes ejerci un efecto

positivo sobre el aumento en la biomasa (p < 0,05) (tabla 10), lo cual pudo deberse a que algunos de los cofactores enzimticos presentes en el extracto de levadura provocan un mejor metabolismo tanto cataltico como de sntesis del glutamato, lo que repercute en una mayor obtencin

Figura 2. Grfico de superficie de respuesta entre las variables melaza y glutamato. El mximo efecto se da cuando la concentracin de extracto de levadura est en el nivel superior y la de melaza en el inferior. Confianza 95%

Figura 1. Grfico de superficie de respuesta entre las variables glutamato y extracto de levadura. El mximo efecto se da cuando la concentracin de glutamato y extracto de levadura estn en el nivel superior. Confianza 95% Tabla 10. Efectos y anlisis de variables por mtodo estadstico
Factor C3 N1 N2 C3 X N1 N1 X N2 C3 X N2 N1 X N1 N2 X N2 C3 X C3 GL1/ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Efecto estimado -3,99X10 2,15X10
10

Figura 3. Grfico de superficie de respuesta entre las variables extracto de levadura y melaza. El mximo efecto se da cuando la concentracin de glutamato est en el nivel superior y la de melaza en el inferior. Confianza 95%

Suma de cuadrados 9,59X10 2,78X10


21

Radio F 8,40 5,16 2,44 5.57 6.80 0.53 1,69 0,70 0,10

Valor p 0,0066 a 0,0297 a 0,1280 0,0244 a 0,0136 a 0,4714 0,2027 0,4086 0,7570

3,13X1010
10

5,89X1021
21

-4,60X1010 5,08X1010 -1,42X1010 2,63X10


10

6,35X1021 7,75X1021 6,09X1020 1,92X10 1,11X10


21

-1,69X1010 6,33X10
9

8,00X1020
20

1/: GL: grados de libertad. a: variables con efecto significativo sobre la multiplicacin de la cepa con confianza 95%.

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de energa y de intermediarios metablicos clave para la sntesis de biomolculas, y por tanto mayor productividad en biomasa (Matheus et al., 2002). Sin embargo, la interaccin entre ambas fuentes de crecimiento con la melaza provocaron un efecto negativo sobre la variable respuesta (figuras 2 y 3); adems, el efecto individual de sta tambin fue negativo (p < 0,05) (tabla 10), por lo tanto se deduce que la presencia de melaza afecta el crecimiento celular. Efecto que puede atribuirse a la presencia de residuos txicos como pesticidas, hidrocarburos o metales pesados, que pueden haber llegado a la fuente en el transcurso de su proceso, y que pueden afectar el crecimiento celular por bloqueo de la maquinaria enzimtica de la clula, dao en las membranas, alteracin conformacional o estructural del material gentico, inhibicin de rutas metablicas, entre otras (Atlas y Bartha, 2002; Delorme et al., 2003). No obstante, aunque el efecto result ser significativo (p < 0,05), los recuentos son altos, luego es posible que estos compuestos se encuentren en bajas concentraciones (tabla 10). Cintica de crecimiento de la cepa C50 sobre los medios de cultivo alterno y tradicional La composicin del medio de cultivo alterno RGB descrito en trminos de g/L es el siguiente: glicerol 1,89, melaza 0,67, glutamato 0,90, extracto de levadura 0,60 y sales 0,10. Con ste y el medio LM se realizaron las cinticas de crecimiento de la cepa C50 (figura 4).

Tabla 11. Parmetros cinticos


Parmetro Tiempo de duplicacin Velocidad especfica de crecimiento Valor lM 2,676 h 0,259 h-1 RGB 4,472 h 0,155 h-1

complejos como la melaza que crean la necesidad a las clulas de expresar una mayor variedad de enzimas catalticas que puedan llevar a cabo la degradacin de estos sustratos, lo que repercute en mayor gasto energtico por parte de la clula y en consecuencia, menor velocidad de crecimiento. El crecimiento de la cepa C50 sobre el medio LM fue normal y las fases de crecimiento presentaron el comportamiento caracterstico; en contraste, en el medio RGB se presentaron varias diauxias, tanto en la fase exponencial como en la estacionaria, lo que de manera directa refleja la presencia de sustratos complejos. Una diauxia, conocida como el metabolismo de dos sustratos, es frecuentemente observada cuando dos o ms fuentes de carbono son usadas en el mismo medio (Tsuji et al., 1997). Adems de la diauxia entre la hora 15 y 17, se observaron una serie de diauxias entre la hora 36 y la 63. Es posible que el metabolismo en la fase estacionaria de crecimiento haya sido sostenido por la melaza, lo cual es evidente por las fluctuaciones presentadas, lo que refleja cambios sucesivos en la fuente de carbono que se est metabolizando. Esto confirma lo asegurado por Oliver y colaboradores (1999), quienes afirman que uno de los inconvenientes que se generan del uso de medios de fermentacin complejos es la presencia de una serie de diferentes formas de compuestos dentro del mismo macronutriente dando lugar a patrones de crecimiento crpticos. El medio RGB tard 25 horas en llegar a la fase estacionaria mientras que el LM, slo 17 horas, lo cual puede ser explicado por los argumentos mencionados anteriormente acerca de la complejidad bioqumica del medio alterno. La cantidad de biomasa del medio LM siempre fue ms alta que la del RGB, sin embargo no hubo diferencias estadsticamente significativas (p > 0,05) entre los recuentos de ambos medios en la fase estacionaria. Es posible que el medio LM induzca la produccin de exopolisacridos los cuales afectan la turbidez del medio de cultivo. Estabilidad en turba La evaluacin de viabilidad celular tanto en el medio alterno RGB como en el tradicional LM sobre el soporte slido (turba) mostr que no hubo diferencia estadsticamente significativa entre los recuentos (p < 0,05) inicial, a los 15 y a los 30 das de la refrigeracin (figura

Figura 4. Cintica de crecimiento de la cepa C50 de Rhizobium sp. en medio LM () y en medio alterno RGB (). La cuantificacin se realiz por peso seco

Se realiz la linealizacin de las fases exponenciales de crecimiento para obtener los parmetros cinticos: tiempo de duplicacin (td) y velocidad especfica de crecimiento (x) (tabla 11). Los resultados muestran que la velocidad de crecimiento en el medio LM fue aproximadamente dos veces mayor que en el medio alterno RGB. Esto se pudo deber a que dentro de la composicin del RGB hay sustratos
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Figura 5. Estabilidad de los microorganismos en el soporte con el medio de cultivo tradicional y el alterno. En blanco el medio LM y en negro el RGB; no hubo diferencia estadsticamente significativa entre los recuentos de los diferentes tratamientos ni en los diferentes tiempos

Figura 6. Crecimiento de las cepas J01, C2 y T14 sobre el medio alterno y el tradicional. Cada recuento es el equivalente de tres mediciones. El asterisco representa diferencias significativas (p < 0,05)

5). En el RGB, la prdida de viabilidad a los 30 das fue cercana al 50% y en el medio LM de casi 60%, lo cual significa que los recuentos no disminuyeron ninguna unidad logartmica. Segn la prueba de comparacin de muestras mltiples de Tukey HSD con 95% de confianza, no existe diferencia estadsticamente significativa entre la prdida de viabilidad en el medio alterno y el tradicional. Esto se pudo deber a que el medio RGB presenta una alta variedad de nutrientes (Khavazi et al., 2007), en especial fuentes de carbono atribuidas a la presencia de melaza y extracto de levadura, principalmente, lo que hace que el metabolismo bacteriano sea ms lento debido a que el microorganismo debe sintetizar una mayor diversidad de enzimas para el mantenimiento celular (Matheus, 2002; Edens et al., 2002); sumado a esto, la baja temperatura provoca un frenado parcial de la actividad celular (Matheus et al., 2002), por lo tanto el efecto conjunto puede provocar el mantenimiento de la cepa en el soporte por un perodo prolongado de tiempo. Evaluacin del medio RGB sobre otras cepas de rizobios No hubo diferencias estadsticamente significativas (p > 0,05) en el valor de la concentracin celular (UFC/mL) en ambos medios de cultivo, el tradicional y el alterno, cuando se trabaj con la cepa T14 de Rhizobium sp., que nodula trbol ni en la cepa J01 de Bradyrhizobium sp., que nodula soya (figura 6). Este resultado demuestra de manera preliminar, que el medio RGB es apto para el crecimiento de otras cepas de rizobios. Las cepas de Rhizobium sp., en general, tienen una alta variedad enzimtica, lo que les permite metabolizar un amplio rango de sustratos (Stowers, 1985; Kuykendall et al., 2005); esto corrobora los datos obtenidos con la cepa T14 la cual present recuentos levemente mayores sobre el medio RGB que sobre el LM. Las cepas del

gnero Bradyrhizobium sp., por su parte, presentan menor variedad metablica, dado que no son capaces de degradar compuestos como disacridos, trisacridos o algunos monmeros de carbohidratos (Stowers, 1985; Kuykendall, 2005); de esta forma, su multiplicacin requiere la adicin de fuentes de carbono ms especficas. Sin embargo, la cepa J01 present recuentos celulares similares en los dos medios de cultivo, lo cual demuestra que las fuentes de crecimiento presentes en el medio RGB son aptas para su crecimiento. Por otra parte, existi una diferencia estadsticamente significativa (p < 0,05) entre los recuentos de la cepa C2 en el medio LM y en el RGB (figura 6), favoreciendo as el crecimiento de sta sobre el medio alterno. La concentracin fue aproximadamente cuatro veces mayor en el medio RGB, lo cual es de gran importancia para el desarrollo del proyecto financiador, ya que el arreglo silvopastoril que se defini dentro de ste incluye plantas de Leucaena leucocephala y Clitoria ternatea, noduladas por las cepas C50 y C2, respectivamente. En consecuencia, para la produccin de un bioinoculante basado en estas cepas de rizobios, se puede inferir que el medio RGB es adecuado para llevar a cabo el crecimiento de ambas, con lo cual se puede llegar a disminuir los costos de produccin del biofertilizante rizobiano. Anlisis de costos El costo de produccin de un litro del medio LM fue $2.784,30 mientras que un litro de RGB cuesta $68,41; por lo tanto, la reduccin de costos fue aproximadamente del 98% con la utilizacin del medio alterno. Esto contribuye a una disminucin importante en los gastos de produccin de un biofertilizante basado en esta cepa de rizobio, lo cual deriva en una disminucin del precio del producto y por consiguiente en reduccin de costos en la fertilizacin nitrogenada, generando beneficios a los productores.
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CONCLUSIONES

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La estrategia de usar diseos estadsticos de manera subsiguiente permiti estandarizar un medio de cultivo complejo para la multiplicacin de la cepa C50 de Rhizobium sp. Criterios de costo econmico y disponibilidad en el mercado permitieron la seleccin de cinco fuentes de crecimiento, de las cuales tres mostraron influir de forma estadsticamente significativa sobre el crecimiento de la cepa. El anlisis estadstico basado en el diseo BoxBehnken permiti hallar las concentraciones que maximizaban la respuesta. El medio RGB tard 8 horas ms que el LM para lograr el mximo valor de biomasa, sin embargo la disminucin en los costos de produccin del medio fue cercana al 98%

y no hubo diferencia estadsticamente significativa entre los recuentos de ambos medios. El medio fue apto para el crecimiento de cepas de rizobios de crecimiento lento, intermedio y rpido, las cuales difieren metablicamente. Finalmente, el medio mantuvo la poblacin celular sobre turba en el primer mes de evaluacin; por tanto, el medio representa de manera preliminar una opcin para disminuir los costos de produccin de un inoculante basado en esta cepa.
AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria Corpoica-, al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural MADR-, a la Gobernacin del Cesar y a la Cooperativa Lechera del Cesar Coolesar- por su financiacin.

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nutricin A R t c u lo c I e N t F I co

aniMal

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Effect of the offer of kikuyu grass and oat silage on milk bovine production and quality composition

Efecto de la oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena sobre la produccin y calidad composicional de la leche bovina
Jos Edwin Mojica R.1, Edwin Castro R.2, Javier Mauricio Len C.3, Edgar Alberto Crdenas R.4, Martha Luca Pabn R.5, Juan Evangelista Carulla F.6

The effects of the offer of kikuyu grass and oats silage on production and compositional quality of milk was evaluated using 18 Holstein cows in early and mid lactation, between 2 and 4 births, with a live weight (LW) of 585 kg and a milk production of 22.0 L/d. The experiment was carried out at Marengo Agricultural Center of the National University of Colombia. Three offers of silage (dry matter, DM); 0%, 0.7% y 1.4% of LW) were evaluated complemented with kikuyu grass in grazing to reach a total offer of 4%. The animals were supplemented daily with a balanced supplement. Kikuyu grass intake was estimated using chromium (external marker) and acid detergent indigestible fiber (internal marker). Kikuyu intake decreased (p < 0.001) to increase the proportion of silage in early and mid lactation cows. The milk production was affected by interaction kikuyu-silage offer, lactating stage and time of sampling (p < 0.01). Protein (0.2 units) (p < 0.05) and casein (0.35 units) concentration (p < 0.05) increased in early lactation cows offered oat silage at a level of 0.7% LW milk, while an offer of 1.4% LW decreased protein concentration (0.15 units) and slightly increased casein concentration (0.05 units) (p < 0.05). Milk fat tended to increase as oat silage was offered in the diet (p < 0.1). Keywords: Forage offer, intake, grazing, lactating cow, milk fat, milk protein, silage.

ABSTRACT

RESUMEN

Se evalu la oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena sobre la produccin y calidad composicional de la leche; utilizando 18 vacas Holstein entre 2 y 4 partos en primer y segundo tercio de lactancia con un peso vivo (PV) de 585 kg y una produccin de leche de 22,0 L/d. El experimento se realiz en el Centro Agropecuario Marengo de la Universidad Nacional de Colombia. Se evaluaron tres ofertas de ensilaje (materia seca; MS); 0%, 0,7% y 1,4% del PV, complementados con kikuyo en pastoreo hasta alcanzar una oferta total del 4%. Los animales se suplementaron diariamente con un alimento balanceado. Se estim el consumo de kikuyo utilizando xido de cromo (marcador externo) y la fibra en detergente cido indigerible (marcador interno). El consumo de kikuyo disminuy (p < 0,001) al aumentar la oferta de ensilaje para vacas de primero y segundo tercio. La produccin de leche estuvo afectada por la interaccin de la oferta kikuyo-ensilaje, tercios de lactancia y das de medicin (p < 0,01). Al ofrecer ensilaje de avena (0,7% PV) se increment la concentracin de protena (0,2 unidades) (p < 0,05) y casena en leche (0,35 unidades) (p < 0,05), mientras una oferta de ensilaje de 1,4% PV disminuy la concentracin de protena (0,15 unidades) e increment levemente la concentracin de casena (0,05 unidades) respecto al kikuyo solo en vacas de primer tercio de lactancia (p < 0,05). Ofertas de ensilaje de avena tienden (p < 0,1) a aumentar la concentracin de grasa en leche. Palabras clave: consumo, grasa lctea, oferta forrajera, pastoreo, protena en leche, silos, vaca lechera.
INTRODUCCIN

Radicado: 25 de febrero de 2009 Aprobado: 27 de abril de 2009

La calidad composicional de la leche proveniente de


los sistemas de produccin lechera intensiva (trpico alto) y, en particular, los niveles de protena se pueden considerar bajos al compararlos con la leche obtenida en otros pases (Cern y Correa, 2005) o con la de las regiones del trpico bajo colombiano. La nutricin es uno de los principales factores que afectan la calidad composicional de la leche (Fredeen, 1996; Stockdale, 1994b). Los sistemas de alimentacin en

MVZ. M.Sc. Investigador master asistente, Grupo Pecuario, Estacin Experimental Motilonia (Agustn Codazzi, Csar) Corpoica jmojica@corpoica.org.co 2 Z. M.Sc. Investigador master asistente, Grupo Pecuario, Estacin Experimental Motilonia (Agustn Codazzi, Csar) Corpoica, ecastro@corpoica.org.co 3 Z. Grupo de Investigacin en Nutricin Animal, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, jmleonc@unal.edu.co 4 Z. M.Sc. Docente titular Pastos y Forrajes, Universidad Nacional de Colombia, eacardenasr@unal.edu.co 5 Ph.D. Docente Departamento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia, mlpabonr@unal.edu.co 6 Ph.D. Docente y Decano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, jecarullaf@unal.edu.co
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lecheras especializadas de la sabana de Bogot se basan en el uso de especies herbceas como el pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), que representan el 80% de las pasturas presentes (Crdenas, 2000). La estacionalidad en la produccin de leche como consecuencia de cambios climticos es una caracterstica de estos sistemas, por lo tanto hay variacin en la oferta de nutrientes durante el ao (Observatorio Agrocadenas, 2006). El uso de ensilajes es una alternativa para disminuir estas variaciones y asegurar una oferta de nutrientes ms o menos constante. El efecto de la suplementacin con ensilajes en vacas en pastoreo produce respuestas variables sobre la composicin de la leche. Se reportan incrementos en produccin de leche, concentracin y produccin de protena con la utilizacin de ensilaje de maz (OBrien et al., 1997). Sin embargo, otros estudios demuestran poco efecto sobre la concentracin de protena en la leche de vacas alimentadas con ensilaje de ryegrass y trbol blanco (Thomas et al., 1982). Esto sugiere que la respuesta animal est afectada por la calidad nutricional del ensilaje, como lo confirma un estudio donde se evalu la produccin de leche en vacas Holstein en confinamiento suplementadas con ensilaje de girasol y de maz, las cuales presentaron mayor produccin de leche, de protena y de slidos totales con el segundo material ensilado (Silva et al., 2004). Algunas investigaciones sugieren que en pastoreo la respuesta en produccin y composicin de leche a la suplementacin con ensilajes depende no slo de la calidad del ensilaje sino tambin de la disponibilidad y de la especie forrajera en la pastura (Davidson et al., 1982; Bryant y Donelly, 1974). Se presentan incrementos en produccin de leche cuando la oferta es restringida (Davidson et al., 1982) y disminucin en la produccin cuando la oferta de ensilaje y la disponibilidad de forraje en pastoreo es alta (Bryant y Donelly, 1974). Adicionalmente, se ha postulado que la introduccin de ensilaje de maz en un sistema de alimentacin basado en pasturas con altos contenidos de protena produce un efecto sinrgico que mejora la respuesta productiva de los animales debido a una disminucin en el consumo total de protena (Holden et al., 1995). Sin embargo, se ha identificado que el efecto sobre la produccin diaria de leche no siempre es positivo y que podra estar ms asociado con una mayor duracin de la lactancia (Campbell et al., 1978). El cultivo de avena forrajera (Avena sativa) es una especie utilizada tradicionalmente en forma de ensilaje como alternativa de suplementacin en la poca de verano en lecheras especializadas en la sabana de Bogot. Barahona y colaboradores (2003) realizaron un estudio en Colombia (sabana de Bogot y Nario) para evaluar diferentes nive-

les de inclusin de una mezcla de ensilaje (cebada, avena y vicia) en vacas Holstein en pastoreo; reportaron un nivel ptimo de utilizacin de ensilaje cuando ste se inclua hasta 75% en la dieta, con niveles aceptables y rentables de produccin de leche. Sin embargo, este estudio carece de un anlisis composicional de la leche en los niveles de inclusin de ensilaje utilizados. En este trabajo se evalu el efecto de diferentes niveles de inclusin de ensilaje de avena en vacas Holstein en pastoreo de kikuyo (Pennisetum clandestinum) bajo suplementacin manteniendo un nivel de oferta total de 4% sobre el consumo, la produccin y calidad composicional de la leche.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Localizacin El experimento se realiz en el Centro Agropecuario Marengo de la Universidad Nacional sede Bogot, Colombia, ubicado a 4 42 de latitud norte y 74 12 de longitud oeste con una altitud de 2650 msnm y temperatura promedio de 13C con fluctuaciones entre 0C y 20C y una humedad relativa de 80% a 85%. En la zona se presentan heladas en los meses de enero, febrero y principios de agosto, la precipitacin anual promedio es de 528,9 mm, con distribucin bimodal del perodo lluvioso; uno entre los meses de abril y mayo y el otro desde septiembre hasta noviembre (Gonzlez et al., 1997). Tratamientos Se evaluaron en total seis tratamientos; derivados del producto de la interaccin de tres niveles de ofertas de pasto kikuyo y ensilaje de avena con base en una oferta constante de forraje de 4 kg de MS/100 kg de peso vivo (PV) (tabla 1) y dos fases de lactancia (primer y segundo tercio) con tres repeticiones en cada tratamiento. Animales experimentales Se seleccionaron 18 vacas Holstein con un peso promedio de 585 kg 48,4, entre dos y cuatro partos, en el primer y
Tabla 1. Relaciones evaluadas de oferta forrajera de pasto kikuyo y ensilaje de avena
Relacin 1 2 3 oferta forrajera (kg MS/100 kg PV) Kikuyo 4,0 3,3 2,6 ensilaje avena 0,0 0,7 1,4 oferta total de forraje (kg MS/100 kg PV) 4,0 4,0 4,0

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segundo tercio de lactancia. Se crearon tres grupos homogneos de animales con similares producciones de leche y das en lactancia; cada uno de los grupos tena tres vacas en primer tercio y tres en segundo tercio de lactancia para un total de seis vacas. Los grupos fueron asignados aleatoriamente a cada una de las tres ofertas de kikuyo-ensilaje. Perodo experimental La duracin del perodo experimental fue de 21 das; los primeros 7 das se utilizaron como fase de ajuste de los animales al suplemento, los 7 das siguientes de ajuste a la oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena y los ltimos 7 das fueron utilizados como el perodo de medicin. Manejo del pastoreo y suministro de ensilaje Para el pastoreo se utiliz una pastura de kikuyo con un rea aproximada de 3 ha dividida en tres reas de 1 ha cada una, en las cuales se asignaron al azar cada grupo de vacas descrito anteriormente. La edad de rebrote fue de 60 das. Para medir la produccin de forraje verde se realizaron cortes a una altura de pastoreo de 10 cm por delante de la cuerda elctrica utilizando un marco plstico de 1 m2 siguiendo la metodologa de Toledo y Schultze Kraft (1982). Se tomaron muestras de forraje para anlisis de materia seca cada dos das a partir del perodo de acostumbramiento y para el anlisis de la composicin qumica, a los das 14, 17 y 20 das del perodo experimental. La produccin de forraje promedio fue de 2000 kg 146 de MS/ha. Mediante el uso de cuerda elctrica, se ajust diariamente el rea de pastoreo en metros cuadrados de superficie de pasto kikuyo en cada grupo experimental correspondiente a las ofertas de 4,0%, 3,3% y 2,6%, moviendo dos veces diarias la cuerda elctrica: despus del ordeo de la maana y la tarde. El ensilaje de avena fue suministrado en el campo en dos raciones diarias: una despus de cada ordeo utilizando un comedero por cada dos animales. La composicin qumica de las fuentes alimenticias utilizadas en el experimento se puede apreciar en la tabla 2. Variables evaluadas Consumo de alimento Se estim el consumo voluntario del pasto kikuyo por medio del uso de marcadores externos e internos. Como marcador externo se utiliz el cromo, adicionndolo al suplemento (6 g de xido de cromo/kg de suplemento) y se asumi una recuperacin del marcador del 100%. En cada animal, se tomaron muestras de las heces por va rectal luego del ordeo de la maana desde el da 15 y hasta el da 21 del perodo experimental; posteriormente fueron
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Tabla 2. Ingredientes del suplemento, composicin qumica y energa neta de lactancia (ENL) del kikuyo, ensilaje de avena y suplemento alimenticio
Kikuyo Ingredientes % Maz molido Torta de soya Salvado de trigo Palmiste expeller Harina de pescado Melaza Premezcla minerales Carbonato de calcio xido de cromo Composicin qumica Protena cruda %1/ Nitrgeno soluble B22 B32 C2 Fibra detergente neutro % Extracto etreo % DIVMS %5/ ENL (Mcal Kg/MS)6/
4/ 3/ 2/ 2/

ensilaje avena ---------------------------7,0 58,7 54,1 15,9 2,8 22,6 67,2 50,1 2,4 58,1 1,33

Suplemento 40,1 17,4 32,2 1,8 1,0 5,0 0,1 1,8 0,6 18,6 18,6 13,2 65,7 9,9 5,7 22,8 6,5 3,6 86,0 1,80

---------------------------17,6 37,6 36,7 33,4 20,0 8,9 57,1 31,9 2,8 66,6 1,57

Nitrgeno no proteico

Fibra detergente cido %3/

1/: Kjeldahl (AOAC, 2005). 2/: Fracciones de protena expresadas como porcentaje de la protena cruda (Licitra et al., 1996). 3/: Van Soest et al., 1995. 4/: Extraccin con ter (AOAC, 2005). 5/: Tilley y Terry (1963). 6/: Estimacin ENL, (NRC Dairy Cattle, 2001). DIVMS: Digestibilidad in vitro de la materia seca.

congeladas a 4C y trasladadas al laboratorio, donde fueron secadas en horno con aire forzado a 60C durante 48 horas y luego fueron molidas pasando por un tamiz de 1 mm. El cromo en las muestras de heces y el suplemento fue analizado en un espectrofotmetro de absorcin atmica (Shimadzu, modelo AA680) por medio de la metodologa de Williams y colaboradores (1962). Con este marcador se estim la produccin de heces segn la frmula reportada por Church (1988) y Berchiellie y colaboradores (2006). Como marcador interno se utiliz la fibra en detergente cido indigerible (FDAi) (Waller et al., 1980) para determinar el coeficiente de indigestibilidad utilizando la produccin de heces. Debido a que el suplemento y el ensilaje de avena aportaron contenidos de FDAi, se corrigieron estos aportes en los contenidos de FDAi en las heces para la estimacin del consumo del pasto kikuyo. El consumo de suplemento se determin pesando diariamente la oferta y el rechazo en cada animal en el ordeo de la maana y de la tarde, y el consumo de ensilaje

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se midi en cada grupo experimental pesando la cantidad ofrecida y el rechazo en los comederos en los das 8, 15 y 20 del perodo experimental. El suministro de ensilaje se realiz en el campo en la hora de la maana y de la tarde, destinando un comedero para dos animales en cada grupo experimental. Produccin y calidad composicional de la leche Se registr la produccin individual y se analiz la calidad composicional de la leche a los 0, 14 y 21 das del perodo experimental. La produccin de leche se midi en el ordeo de la maana y de la tarde. Se tomaron muestras de leche en cada ordeo y posteriormente se mezclaron en partes iguales. Estas muestras fueron conservadas con dicromato de potasio en una concentracin de 600 ppm y fueron congeladas a -20C en refrigerador hasta la realizacin de los anlisis de calidad composicional. Parmetros de fermentacin ruminal Se tomaron muestras de fluido ruminal el ltimo da del perodo de medicin por medio de una sonda ororuminal, seleccionando tres animales al azar en cada grupo experimental, tomando dos muestras por animal; una muestra se utiliz para medir el pH con un potencimetro (Orion thermo electron modelo 8102) y la otra fue acidificada con cido sulfrico al 80%, hasta disminuir el pH por debajo de 2,5 para evitar la prdida del nitrgeno amoniacal. Las muestras fueron congeladas a 4C hasta su anlisis en laboratorio. Anlisis qumicos Forrajes y ensilaje Se determinaron la materia seca (AOAC, 2005), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente cido (FDA) (Van Soest et al., 1995), protena cruda por el mtodo de Kjeldahl (AOAC, 2005), nitrgeno soluble, nitrgeno no proteico, nitrgeno ligado a fibra en detergente cido (NIDA), nitrgeno insoluble en detergente neutro (NIDN) (Licitra et al., 1996) y grasa total por extraccin con ter (AOAC, 2005). Adicionalmente, en el ensilaje se determin el pH por medio de potencimetro (Orion thermo electron modelo 8102). Fluido ruminal Se determin el nitrgeno amoniacal por el mtodo de Kjeldahl (nicamente destilacin) y concentracin de cidos grasos voltiles por cromatografa de gases (Shimadzu modelo GC14A) (Erwin et al., 1961) y pH con potencimetro (Orion thermo electron modelo 8102). Leche Se determin la concentracin de slidos totales (AOAC, 2005), protena cruda por el mtodo de Kjeldahl (AOAC,

2005), urea (Fawcett y Scott, 1960), casena por precipitacin en el punto isoelctrico (AOAC, 2005) y grasa por el mtodo de Gerber (AOAC, 2005). Heces Se determin el contenido de cromo por espectrometra de absorcin atmica (Shimadzu, modelo AA680) (Holden et al., 1994) y fibra cida indigerible por el mtodo de Waller y colaboradores (1980). Anlisis estadstico Para el anlisis de las variables de produccin y calidad composicional de la leche se utiliz un modelo completamente al azar con arreglo factorial 2 x 3 (dos tercios de lactancia y tres ofertas de kikuyo-ensilaje) en medidas repetidas en el tiempo, donde cada variable tuvo como covariable su valor inicial. Se analizaron efectos fijos: de la oferta kikuyo-ensilaje, del tercio de lactancia, del da de medicin y de las interacciones oferta kikuyo-ensilaje x tercio de lactancia, oferta kikuyo-ensilaje x da de medicin y oferta kikuyo-ensilaje x tercio de lactancia x da de medicin empleando el procedimiento MIXED de SAS 9.0 (Steel y Torrie, 1980). La unidad experimental fue cada animal ubicado en el grupo experimental donde se tenan animales en primer y segundo tercio de lactancia. La comparacin de medias se realiz con la prueba de Tukey con un nivel de significancia del 5%. Para el anlisis del consumo voluntario de las fuentes alimenticias se utiliz un modelo completamente al azar con arreglo factorial 2 x 3 (dos tercios de lactancia y tres ofertas de kikuyo-ensilaje). Se analiz el efecto de la oferta kikuyo-ensilaje, del tercio de lactancia y la interaccin oferta kikuyo-ensilaje x tercio de lactancia, empleando el procedimiento GLM de SAS (SAS 9.0). La comparacin de medias se realiz por medio de la prueba de Duncan con un nivel de significancia del 5%. Para el anlisis de las variables de fermentacin ruminal se utiliz un modelo completamente al azar empleando el procedimiento GLM (SAS 9.0) y la comparacin de medias se realiz con la prueba de Duncan con un nivel de significancia del 5%.
R E S U LTA D O S

Consumo El consumo de pasto kikuyo, expresado como kg/da o como % de PV, fue mayor cuando no se ofreci ensilaje y, disminuy a medida que la oferta de ensilaje aument (p < 0,001). Sin embargo, el consumo total de forraje (pasto kikuyo + ensilaje de avena) no fue diferente (p > 0,05) (tabla 3).
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Tabla 3. Consumo de materia seca, protena cruda, fibra en detergente neutro y energa de vacas alimentadas bajo diferentes relaciones de oferta de pasto Kikuyo y ensilaje de avena (Promedio error estndar)
Relacin oferta pasto Kikuyo:ensilaje de avena (K:e)1/ Primer tercio 4,0 : 0,0 CMS, kg/d Kikuyo Ensilaje Suplemento Total Kikuyo, % PV Forraje, % PV Total, % PV CPC, kg/d Kikuyo Ensilaje Suplemento Total Total, % PV CFDN, kg/d Kikuyo Ensilaje Suplemento Total Forraje, % PV Total, % PV CENL, Mcal/d Kikuyo Ensilaje Forraje Suplemento Total 29,61,8a ---29,61,8 10,72,8 40,32,4 23,00,4b 4,00,0b 27,00,4 10,11,5 37,11,7 18,71,0b 9,00,0a 27,71,0 11,90,6 39,61,4 27,22,9a ---27,22,9 8,11,4 35,32,3 21,03,1b 4,00,0b 25,03,1 8,02,6 33,02,6 21,72,5b 9,00,0a 30,72,5 6,72,4 37,40,75 *** *** NS NS NS NS ---NS * NS NS ---NS NS NS 11,00,7a ---1,30,3 12,30,6 1,90,19 2,20,1 8,20,1b 2,00,0b 1,30,2 11,50,3 1,80,03 2,00,02 6,60,3b 4,50,0a 1,50,07 12,70,4 1,90,07 2,20,08 10,11,1a ---1,00,2 11,11,0 1,80,2 1,90,2 7,51,8b 2,00,0b 1,00,3 10,52,1 1,60,2 1,80,3 7,70,9b 4,50,0a 0,80,3 13,00,6 1,90,08 2,00,05 *** *** NS NS NS NS NS ---* NS NS * NS ---NS NS NS NS 3,30,2a ---1,11,5 4,41,4 0,80,1a 2,60,04b 0,20,0b 1,00,2 3,80,2 0,70,01a 2,10,1b 0,50,0a 1,20,05 3,80,15 0,70,02b 3,00,3a ---0,80,1 3,80,3 0,70,05a 2,40,6b 0,20,0b 0,80,3 3,40,8 0,60,1ab 2,40,3b 0,50,0a 0,70,3 3,60,08 0,50,02b *** *** NS NS ** * NS *** NS NS NS NS NS 18,91,1a ---5,91,5 24,81,4 3,40,3 3,40,3 4,41,1 14,70,2b 3,00,0b 5,60,8 23,30,9 2,60,05 3,10,06 4,10,09 11,90,6b 6,70,0a 6,60,3 25,20,8 2,10,06 3,30,1 4,50,2 17,41,9a ---4,50,8 21,91,5 3,00,4 3,00,4 3,80,3 13,42,0b 3,00,0b 4,51,4 20,91,8 2,20,44 2,80,4 3,50,6 13,81,6b 6,70,0a 3,71,4 24,30,5 2,10,2 3,20,2 3,80,15 *** *** NS NS NS NS NS NS ---* NS NS NS *** NS ---NS NS NS NS NS 3,3 : 0,7 2,6 : 1,4 4,0 : 0,0 Segundo tercio 3,3 : 0,7 2,6 : 1,4 K:e P tercio K:ex tercio

1/: kg MS/100 kg PV. *p < 0,1; **p < 0,05, ***p < 0,01; NS = no significativo. Letras en la misma fila en cada tercio de lactancia indican diferencias significativas (p < 0,05).

Con base en el consumo de pasto kikuyo se estim un mayor remanente terico en las praderas de mayor oferta de ste y menor oferta de ensilaje (0,8; 0,9 y 0,5 kg MS/100 kg PV de kikuyo para las ofertas de kikuyo-ensilaje de 4,00,0; 3,3-0,7 y 2,6-1,4 kg MS/100 kg PV, respectivamente). Los consumos de suplemento fueron iguales entre las diferentes ofertas de pasto kikuyo-ensilaje, pero se present mayor consumo de suplemento en vacas en primer tercio de lactancia en comparacin con vacas en segundo tercio (6,0 vs. 4,2 kg/d, respectivamente) (tabla 3). El consumo de protena cruda proveniente del pasto kikuyo fue mayor (p < 0,01) a medida que se increment
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la oferta de pasto kikuyo, y el consumo de protena cruda proveniente del ensilaje de avena fue mayor a medida que se ofreci una mayor oferta de ensilaje en las diferentes ofertas de pasto kikuyo-ensilaje (p < 0,01). El consumo de protena cruda aportado por el suplemento y la protena total consumida fue igual, pero cuando esta ltima se expres como porcentaje del peso vivo de los animales se present un consumo mayor a medida que aument la oferta de pasto kikuyo y disminuy la oferta de ensilaje (p < 0,05); tambin se observ un consumo mayor de protena total (p < 0,05) en vacas en primer tercio de lactancia comparado con las vacas en segundo tercio (0,73 % PV vs. 0,60% PV respectivamente; p < 0,05). Comparado con la oferta de pasto kikuyo solo, el consumo total de protena

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se redujo en 500 g/vaca/d en la oferta de pasto kikuyo de 3,3 kg MS/100 kg PV y ensilaje de avena de 0,7 kg MS/100 kg PV y se redujo en 400 g/vaca/d en la oferta de pasto kikuyo de 2,6 kg MS/100 kg PV y ensilaje de avena de 1,4 kg MS/100 kg PV; sin embargo, esta diferencia no fue significativa estadsticamente (p > 0,05) (tabla 3). Similar a lo ocurrido con el consumo de protena, el consumo de FDN y de ENL aportado por el pasto kikuyo y el ensilaje de avena aument (p < 0,01) con la mayor oferta de cada uno de estos forrajes. Sin embargo, el consumo de estos dos nutrientes proveniente del forraje (pasto kikuyo y ensilaje de avena), de la dieta total y del suplemento no fue diferente (p > 0,05) (tabla 3). Produccin y calidad composicional de la leche La respuesta al incremento de ensilaje de avena y disminucin de pasto kikuyo en ofertas constantes de forraje sobre

la produccin de leche no fue claro debido a que hubo interaccin significativa (interaccin oferta kikuyo-ensilaje x tercio x da; p < 0,01) (tabla 4). Mientras al incrementar la oferta de ensilaje de avena se present una disminucin en la produccin de leche en vacas de primer tercio en los das 7 y 14 y en vacas de segundo tercio en el da 7, en estos ltimos animales la produccin de leche aument al incrementar la oferta de ensilaje en el da 14 (figura 1). Los slidos totales respondieron en forma diferente dependiendo del tercio de lactancia (p < 0,01) y del da de medicin (p < 0,01); la concentracin fue menor en vacas de primer tercio de lactancia que en las de segundo tercio (tabla 4) y mayor en el da 14 en comparacin con el da 7. En vacas de primer tercio de lactancia la concentracin de protena fue mayor en la oferta de pasto kikuyo con la menor oferta de ensilaje de avena (kikuyo 3,3 - ensilaje 0,7 kg MS/100 kg PV) y kikuyo solo (kikuyo 4,0 kg MS/100 kg PV) en comparacin con la oferta de pasto kikuyo aso-

Tabla 4. Promedios ajustados de produccin y calidad composicional de la leche bajo diferentes relaciones de oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena en vacas Holstein (promedio error estndar)
Relacin oferta kikuyo:ensilaje (K:e)1/ 4.0: 0.0 D7 Leche, kg/d Primer tercio Segundo tercio Promedio Slidos,% Primer tercio Segundo tercio Promedio Protena, % Primer tercio Segundo tercio Promedio Casena, % Primer tercio Segundo tercio Promedio Grasa, % Primer tercio Segundo tercio Promedio NUL, mg/dl Primer tercio Segundo tercio Promedio 18,81,6 18,01,7 18,41,1 15,61,2 16,71,8 16,11,0 15,50,8 15,61,0 15,60,7 14,40,8 14,30,9 14,40,6 15,20,8 16,10,8 15,70,6 14,91,1 15,80,7 15,40,7 ------* ------NS ------** ------NS ------NS ------NS ------NS 3,20,03 3,50,09 3,30,1 3,00,1 3,70,2 3,40,2 3,60,2 3,70,2 3,60,1 3,20,1 4,00,3 3,60,2 3,20,2 3,60,2 3,40,1 3,60,2 3,80,1 3,70,1 ------* ------*** ------NS ------NS ------NS ------* ------NS 2,00,03 2,30,1 2,10,1a 2,10,03 2,30,1 2,20,1a 2,50,1 2,40,2 2,40,1a 2,30,03 2,20,07 2,20,1a 2,20,2 2,10,1 2,10,1a 2,00,1 2,20,1 2,10,1a ------** ------NS ------NS ------NS ------NS ------NS ------NS 2,80,1 3,20,2 3,00,1a 2,90,1 3,00,2 3,00,1a 3,00,1 2,90,2 3,00,1a 3,10,1 3,30,2 3,20,1a 2,60,2 2,80,1 2,72,8 2,80,2 3,00,1 2,90,1b ------** ------** ------* ------NS ------NS ------NS ------NS 11,00,1 11,40,1 11,20,2 12,10,2 12,60,3 12,30,2 11,10,2 11,30,3 11,20,2 12,10,2 12,60,3 12,30,2 10,80,3 11,40,4 11,10,2 12,10,4 12,20,3 12,20,2 ------NS ------*** ------*** ------NS ------NS ------NS ------NS 21,43,3 20,72,8 21,02,7 23,03,0 19,22,4 21,12,9 22,62,8 20,51,4 21,62,1 22,53,1 19,61,1 21,12,1 20,91,2 19,62,5 20,22,4 19,41,3 20,53,0 20,02,6 ------* ------*** ------NS ------* ------NS ------NS ------*** D14 D7 3.3:0.7 D14 D7 2.6:1.4 D14 K:e t D P K:ext K:exD txD K:extxD

*p < 0,1, **p < 0,05, ***p < 0,01, NS = no significativo. 1/: kg MS/100 kg PV.

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las ofertas evaluadas, con excepcin de la oferta de pasto kikuyo con mayor oferta de ensilaje en vacas de primer tercio de lactancia. En todas las ofertas evaluadas en vacas de segundo tercio de lactancia dicha concentracin fue mayor al da 14 respecto al da 7. Al incrementar la oferta de ensilaje de avena y disminuir la oferta de pasto kikuyo se observ una tendencia a la disminucin en la concentracin del nitrgeno ureico en leche (p < 0,1). ste fue afectado por el da de medicin (p < 0,01) y present menor concentracin en el da 14 en comparacin con el da 7 (tabla 4). Parmetros de fermentacin ruminal El efecto del incremento en la oferta de ensilaje de avena y disminucin en la oferta de pasto kikuyo no afect el pH (p > 0,05), las concentraciones de cidos grasos voltiles (AGV) y la concentracin de nitrgeno amoniacal en el fluido ruminal (tabla 5). Sin embargo, la concentracin ruminal de nitrgeno amoniacal de los animales ubicados en la oferta de kikuyo 3,3 - ensilaje 0,7 kg MS/100 kg PV y kikuyo 2,6 - ensilaje 1,4 kg MS/100 kg PV fue menor que en la oferta con solo pasto kikuyo (4 kg MS/100 kg PV) (tabla 5).
DISCUSIN

Figura 1. Produccin de leche en vacas de primer y segundo tercio de lactancia a los das 7 y 14 de medicin con diferentes ofertas de ensilaje de avena

ciado a la mayor oferta de ensilaje de avena (kikuyo 2,6 ensilaje 1,4 kg MS/100 kg PV). En vacas de segundo tercio de lactancia fue ms evidente la menor concentracin de protena al incrementar la oferta de ensilaje de avena y reducir la oferta de pasto kikuyo (kikuyo 2,6 - ensilaje 1,4 kg MS/100 kg PV) (tabla 4). Al incrementar la oferta de ensilaje de avena y disminuir la de pasto kikuyo, la concentracin de casena fue mayor en la oferta de pasto kikuyo solo y pasto kikuyo con 0,7 kg MS/100 kg PV de ensilaje; comparadas con la oferta de pasto kikuyo con mayor cantidad de ensilaje (1,4 kg MS/100 kg PV) (tabla 4). La concentracin de grasa de la leche fue mayor en vacas de segundo tercio en comparacin con las de primer tercio y present tendencia al incremento a medida que aument la oferta de ensilaje de avena y disminuy la de pasto kikuyo (p < 0,1). La interaccin tercio de lactancia con da de medicin (p < 0,1) afect dicha concentracin de grasa, la cual fue menor al da 14 respecto al da 7 en

Este trabajo explor el efecto de diferentes niveles de ensilaje de avena en vacas en pastoreo de pasto kikuyo manteniendo una oferta constante de forraje (4,0 kg MS/100 kg PV) sobre la produccin y calidad composicional de la leche. Se observ mayor efecto sobre la produccin de leche en vacas de primer tercio de lactancia que en vacas de segundo tercio, lo que indica mayor sensibilidad ante la variacin en la dieta debido a mayores requerimientos nutricionales en vacas de primer tercio en comparacin con las de segundo tercio.

Tabla 5. Concentraciones de nitrgeno amoniacal (mg/dL), pH y cidos grasos voltiles (AGV) en el fluido ruminal de vacas pastando tres relaciones de oferta de pasto kikuyo + ensilaje de avena (promedio error estndar)
Relacin oferta kikuyo:ensilaje1/ 4,0 : 0,0 Nitrgeno amoniacal (mg/dl) pH AGV Total (mmol/l) Acetato % (A) Propionato % (P) Butirato % Isobutirato % Relacin A/P
1/: kg MS/100 kg PV. NS = No significativo.

3,3 : 0,7 18,32,4 6,760,02 121,414,5 67,91,2 18,40,5 12,60,6 1,00,05 3,70,18

2,6 : 1,4 15,51,9 6,810,02 123,536,7 67,81,6 19,00,4 12,10,1 1,10,04 3,60,2

P NS NS NS NS NS NS NS NS

19,12,0 6,820,02 89,33,8 67,32,1 20,52,3 11,00,4 1,20,06 3,40,4

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Respecto al uso de forrajes conservados, el ensilaje de pasto como dieta nica ha reportado efectos positivos sobre la produccin de leche (Strauch, 1996, citado por Hargreaves et al., 2001). Se present mayor produccin de leche en vacas alimentadas con pasto kikuyo asociado con menor cantidad de ensilaje de avena, pero fue estadsticamente similar a la produccin de leche en vacas alimentadas con pasto kikuyo solo, lo cual indica que el valor nutricional del ensilaje con inclusin de 0,7 kg MS/100 kg PV no afecta la respuesta animal, posiblemente debido a un efecto sinrgico del ensilaje y el pasto kikuyo en el rumen. Sin embargo, el aumento en produccin de leche se logr nicamente en la oferta de 0,7 kg MS /100 kg PV de ensilaje de avena y un incremento en la cantidad de ensilaje hasta 1,4 kg MS/100 kg PV disminuy la produccin de leche. Posiblemente en esta ltima oferta, el mayor consumo de ensilaje de avena en comparacin con la oferta de pasto kikuyo solo afect negativamente el balance de nutrientes de la dieta manifestndose en un descenso en la produccin de leche. Se han realizado diversos trabajos para evaluar el efecto de la inclusin de ensilaje sobre la produccin y/o calidad composicional de la leche, en los cuales se emple maz (Holden, 1995; Moran y Stockdale, 1992; OMara et al., 1998), pasto ryegrass (Mackle et al., 1999), una mezcla de cebada, avena y vicia forrajera (Barahona et al., 2003), y ensilaje de maz con ensilaje de avena (Lassiter et al., 1958). La mayora de estos trabajos reporta un aumento en la produccin de leche, pero el efecto sobre la concentracin de protena no es consistente entre ellos. La disminucin en la produccin de leche por inclusin de ensilaje de maz adicionado en dietas basadas en el pastoreo de gramneas se ha atribuido a una deficiencia de protena en la dieta (Moran y Stockdale, 1992; Stockdale, 1994a). En nuestra investigacin se observ que al aumentar la cantidad de ensilaje de avena (1,4 kg MS/100 kg PV) se present una disminucin en la produccin de leche. Este resultado concuerda con el obtenido por Lassiter y colaboradores (1958), quienes compararon la oferta de ensilaje de avena y ensilaje de maz, cada una con 77% del forraje total consumido por los animales, en dietas complementadas con heno de alfalfa y encontraron menor produccin de leche cuando se alimentaron con ensilaje de avena, lo cual se asoci con un menor consumo total de forraje y con el menor valor nutritivo de ese ensilaje en comparacin con el ensilaje de maz. Por su parte, Holden y colaboradores (1995) investigaron la oferta de ensilaje de maz y tambin encontraron disminucin en la produccin de leche. En nuestro estudio, utilizando dietas basadas en pastoreo de kikuyo, el mayor nivel de ensilaje evaluado corresponde a un rango entre 33% y 36% del forraje consumido por los animales. Con estos niveles de ensilaje se observaron efectos negativos sobre la produccin de leche, lo cual posiblemente se asocia con el bajo valor nutricional del ensilaje de avena en comparacin con el pasto kikuyo, ya

que el consumo total de materia seca proveniente de los forrajes fue similar (tabla 3). El efecto positivo sobre la produccin de leche y la concentracin de protena en sta se ha asociado con un mayor consumo de materia seca por parte de los animales, que conlleva a mayor consumo de energa (Auldist et al., 2000; Bargo et al., 2002; Escobar y Carulla, 2003). En nuestra investigacin, el consumo tanto de kikuyo como de ensilaje de avena fue mayor a medida que aument la oferta de cada uno. Sin embargo, el consumo total de materia seca y de energa neta de lactancia fue similar en las diferentes ofertas de kikuyo y ensilaje a pesar del efecto de sustitucin del ensilaje sobre el pasto kikuyo. Con base en lo anterior, el consumo total de materia seca o de energa similar observado en las diferentes ofertas de kikuyo y ensilaje evaluadas en nuestro estudio estuvo acorde con la falta de modificacin en la produccin de leche. La concentracin de protena y casena posiblemente estuvo afectada por el consumo total de protena cruda, especialmente cuando fue expresada como porcentaje del peso vivo de los animales. Adicionalmente, se ha encontrado que el comportamiento de la concentracin de protena en la leche al suministrar los diferentes ensilajes en los animales es dependiente del tipo de ensilaje y de su interaccin con la pastura, base de la alimentacin (Bryant y Donelly, 1974; Davidson et al., 1982). Al suministrar ensilaje de maz (2,3 kg MS/vaca/d), Holden y colaboradores (1995) observaron una reduccin en la concentracin de protena en la leche de vacas que pastaban azul orchoro. Moran y Stockdale (1992) suministraron dos ofertas de ensilaje de maz (de 3 y de 8 kg MS/vaca/d) a vacas que pastaban ryegrass y Paspalum y encontraron que la concentracin de protena fue ms alta en la segunda oferta (8 kg MS/vaca/d) que en la primera (3 kg MS/vaca/d); al mismo tiempo, constataron que la concentracin de protena en las dietas con ensilaje fue menor en comparacin con el consumo de pasto como dieta nica. Finalmente, OMara y colaboradores (1998) evaluaron tres niveles de inclusin de ensilaje de maz (33%, 66% y 100%) a una dieta basada en ensilaje de ryegrass, y encontraron mayor concentracin de protena en las dietas con ensilaje de maz en comparacin con el ensilaje de pasto ryegrass como dieta nica; por otro lado, la menor oferta de ensilaje de maz present la ms baja concentracin de protena respecto a las otras dos (66% y 100%). Para evaluar la produccin y calidad composicional de la leche, Bangani y colaboradores (2000) suministraron dietas isoproteicas, modificando las cantidades de heno de alfalfa y la concentracin de protena de un alimento balanceado, a animales que consuman ensilaje de avena a voluntad y observaron que a medida que se redujo el consumo de ensilaje y se increment el consumo de alfalfa, la produccin de leche y concentracin de protena tendi a incrementarse. En nuestra investigacin se present
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mayor concentracin de protena con el menor nivel de ensilaje de avena (0,7 kg MS /100 kg PV) en comparacin con la pastura sola de kikuyo, pero se redujo con la mayor oferta (1,4 kg MS /100 kg PV) (tabla 4). El cambio en la concentracin de protena en la leche generalmente se acompaa con cambios similares en la concentracin de casena (De Peters et al., 1992). En este estudio, la mayor concentracin de protena y casena se obtuvo en la oferta de pasto kikuyo con 0,7 kg MS/100 kg PV de ensilaje de avena (15,8% y 8,7% de incremento en protena y casena, respectivamente), respecto a la oferta de pasto kikuyo solo. Diversos trabajos han reportado incrementos en la concentracin de casena, (Cristian et al., 1999, citado por Walker et al., 2004; Mackle et al., 1999), cuando las vacas se suplementan con ensilaje en dietas basadas en pasto. En un estudio sobre vacas lecheras alimentadas con ensilaje y suplementadas con lupino, semilla de algodn y heno Walker y colaboradores (2004) encontraron un incremento de 7% en la concentracin de casena, lo cual se atribuy a un incremento en energa metabolizable y no a un incremento en protena metabolizable. En la presente investigacin, la dieta de pasto kikuyo con ensilaje de avena (de 0,7 kg MS/100 kg PV) posiblemente mejor el balance proteico-energtico en el rumen, lo cual se pudo reflejar en un incremento en la concentracin de protena y casena en la leche. Este efecto puede estar influenciado por la cantidad de ensilaje, ya que se observaron menores concentraciones de protena y casena en la leche de los animales suplementados con la mayor oferta de ensilaje (1,4 kg MS/100 kg PV), lo cual posiblemente se asoci con un menor consumo de protena debido a una menor concentracin de protena cruda en esta dieta. Se ha reportado que la respuesta al consumo de energa de la dieta sobre la concentracin de protena de la leche vara segn el estado de lactancia. Coulon y Rmond (1988) encontraron que el incremento en concentracin de protena lctea debido a un mayor consumo de energa metabolizable es ms marcado en vacas en segundo o ltimo tercio de lactancia en comparacin con las vacas de primer tercio (0,05 vs. 0,03 g protena/kg por cada MJ EM). A pesar de que en este estudio no se evaluaron animales en los mismos estados de lactancia, se observ una mejor respuesta en la concentracin de protena en la leche de vacas de primer tercio en comparacin con vacas de segundo tercio (tabla 4), lo cual indica que posiblemente las vacas en primer tercio de lactancia requieren de un mejor balance de nutrientes para optimizar la concentracin y produccin de protena en la leche en comparacin con las vacas de segundo tercio. La concentracin de grasa se afecta en menor medida cuando se modifican los niveles de oferta de forraje
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(OBrien et al., 1997; Auldist et al., 2000). A pesar de que los niveles de oferta total de forraje fueron constantes, los niveles de pasto kikuyo y ensilaje fueron modificados, y se observ una tendencia a incrementar la concentracin de grasa al aumentar los niveles de ensilaje de avena; sin embargo, no se observ variacin en los niveles de acetato en el lquido ruminal, los cuales estuvieron posiblemente afectados tambin por el consumo de pasto kikuyo y el suplemento. El efecto de la inclusin de ensilaje ha sido positivo sobre la concentracin de grasa en leche en explotaciones donde la especie forrajera que se maneja tiene niveles bajos de fibra particularmente sobre el ryegrass (Carulla y Pabn, 2006). Las concentraciones de nitrgeno amoniacal en rumen y de nitrgeno ureico en leche disminuyeron a medida que se incrementaron los niveles de ensilaje (tabla 5), posiblemente como consecuencia de mayor incorporacin del nitrgeno en la protena microbial, lo cual modific el balance energtico-proteico en estas dietas (Holden et al., 1995; Stockdale, 1994a, 1994b). A pesar de que la suplementacin con ensilaje de avena de 1,4 kg MS/100 kg PV mostr niveles normales de nitrgeno ureico en leche y fue igual entre los tercios de lactancia, la tendencia fue a que se presentaran menores concentraciones en vacas de primer tercio de lactancia en comparacin con las vacas de segundo tercio.
CONCLUSIONES

La suplementacin con ensilaje de avena en vacas que pastaban kikuyo tiene efectos variables segn el nivel de inclusin en la dieta. Una oferta de ensilaje de avena de 0,7 kg MS/100 kg PV incrementa la concentracin de protena y casena (0,2 y 0,35 unidades, respectivamente). Una oferta de ensilaje de 1,4 kg MS/100 kg PV complementada con pasto kikuyo sobre una oferta final de 4,0 kg MS/100 kg PV, disminuye la concentracin de protena (0,15 unidades) e incrementa levemente la concentracin de casena (0,05 unidades) en vacas de primer tercio de lactancia respecto a la oferta con pasto kikuyo solo. Ofertas de pasto kikuyo con ensilaje de avena de 0,7 y 1,4 kg MS/100 kg PV tienden a aumentar la concentracin de grasa.
AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Divisin de Investigacin de la Universidad Nacional de Colombia por la financiacin de esta investigacin.

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A R t c u lo c I e N t F I co

Nitrogen balance in grass and grass plus Lotus uliginosus pastures in the west region of the Bogot savanna, Colombia

Balance de nitrgeno en pastura de gramneas y pastura de gramnea ms Lotus uliginosus en la sabana de Bogot, Colombia
Edwin Castro R.1, Jos E. Mojica R.2, Javier Len3, Martha Pabn4, Juan Carulla5, Edgar Crdenas6

This study determined the nitrogen balance in two types of template pastures: a mixed pasture of two grass kikuyu (Pennisetum clandestinum) and tall fescue (Festuca arundinacea) pasture and the associated tall fescue grass and legume bird foot trefoil (Lotus uliginosus), in an area of 1 ha, with a completely randomized design with cow as the experimental unit and pasture treatment. Five Holstein cows were used for each treatment for an experimental period of 14 days. Was determined the biomass production (g MS/m2), nitrogen amount in the pasture, supplement outlets in feces, urine and milk, and the value of efficiency of nitrogen use by animals. In animal balance was best efficiency in nitrogen use in the associated pasture in front of the mixed pasture, and changes in the excretion routes, with a greater output of nitrogen in the urine of mixed pasture fed and in more milk in the associate pasture fed. In situ nitrogen balance in the pasture was conducted, using a simulation model, which used the values determined in this trial and showed that the N balance was positive for the associated pasture in front of the mixed pasture, which indicates less need for external nitrogen in the pasture associated. Associated pasture grass legume most improved the efficiency of nitrogen use in cattle for milk and presented a positive balance in the pasture. Keywords: Tall fescue, kikuyu, legume, dairy cattle.

ABSTRACT

En esta investigacin se determin el balance de nitrgeno en dos tipos de pasturas de clima fro: una pastura mixta de dos gramneas -kikuyo (Pennisetum clandestinum) y festuca alta (Festuca arundinacea)- y pastura asociada de la gramnea festuca alta ms la leguminosa trbol pata de pjaro (Lotus uliginosus), en un rea de 1 ha cada una, con un diseo al azar con la vaca como unidad experimental y la pastura como tratamiento. Se emplearon cinco vacas Holstein para cada tratamiento durante un perodo experimental de 14 das. Se determin la produccin de biomasa (g MS/m2), cantidad de nitrgeno en la pastura, suplemento, salidas en heces, orina y leche, y el valor de eficiencia de uso del nitrgeno por los animales. En el balance del nitrgeno en el animal, se observ mejor eficiencia en su uso en la pastura asociada comparada con la pastura mixta, y cambios en las vas de excrecin, siendo mayor la salida en orina de los alimentados con pastura mixta y mayor en leche en los alimentados con la asociada. El balance de nitrgeno en la pastura in situ se realiz con un modelo de simulacin, empleando los valores determinados en este ensayo, y se observ que fue positivo para la pastura asociada frente a la mixta; esto indica menor necesidad de nitrgeno externo en la pastura asociada. La pastura asociada mejor la eficiencia de uso del nitrgeno en ganado para leche y present un balance positivo en el sistema de pastura. Palabras clave: festuca, kikuyo, leguminosa, ganado de leche.
INTRODUCCIN

RESUMEN

La sabana de Bogot y los valles de Ubat y Chiquinquir


Radicado: 2 de marzo de 2009 Aprobado: 20 de mayo de 2009

Z. M.Sc. Investigador mster asistente, EE Motilonia, Corpoica, Codazzi, Cesar. ecastro@corpoica.org. 2 MVZ. M.Sc. Investigador mster asistente, EE Motilonia, Corpoica, Codazzi, Cesar. jmojica@corpoica.org.co 3 Z. Universidad Nacional, Bogot. jmleonc@unal.edu.co 4 Q. Ph.D. Docente Universidad Nacional de Colombia, Bogot. mlpabon@unal.edu.co 5 Z. Ph.D. Docente Universidad Nacional de Colombia, Bogot. jecarullaf@uanl.edu.co 6 Z. M.Sc. Docente Universidad Nacional de Colombia, Bogot. eacardenasr@unal.edu.co
1

se ubican dentro de la zona agroecolgica de trpico alto andino colombiano, cuyas caractersticas microclimticas particulares favorecen la produccin especializada de leche. Esta produccin dedica 300.000 hectreas a reas de pastos, conformadas en 80% por kikuyo (Pennisetum clandestinum) y en menor proporcin por raigrs (Lolium sp.), avena (Avena sativa), azul orchoro (Dactylis glomerata), falsa poa (Holcus lanatus), trboles (Trifolium spp.) y alfalfa (Medicago sativa) (Barreto, 1999). El pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) es la fuente ms barata de alimentacin y ms extendida en el tr-

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pico alto andino colombiano. Est adaptado a altitudes que varan entre 1.700 y 2.800 msnm; con excelentes rendimientos en forraje de buena calidad, poca exigencia de agua y fertilizantes (Lotero, 1993). Sin embargo, su persistencia y alta produccin de biomasa se ve limitada durante el ao, debido a la susceptibilidad a las heladas y a plagas como el chinche de los pastos (Collaria scenica). El gnero Lolium spp., tambin es susceptible a C. scenica y plagas como la roya (Puccina spp.), pero no se ve afectado ostensiblemente su rendimiento de biomasa area mientras se d un buen manejo de riego y fertilizacin. Los forrajes nativos se caracterizan por su baja produccin de forraje y calidad y tambin se ven afectados por las pocas secas y heladas (Crdenas, 2000). Recientemente se han caracterizado nuevos forrajes como alternativa para los sistemas de produccin lechera de clima fro en Colombia, buscando establecer un manejo ptimo de la fertilizacin y disminuir el uso de insumos agrcolas de acuerdo con las necesidades de la pradera, haciendo nfasis en el uso de asociacin gramnea-leguminosa, lo cual trae efectos benficos en la conservacin y productividad de las praderas y disminuye la aplicacin de fertilizantes nitrogenados (Crdenas, 2003; Castro, 2004). El uso de fertilizantes nitrogenados se toma como referencia del impacto ambiental que puede determinar el tipo de pastura o sistema de manejo utilizado, debido a que se asocia el uso de dichos fertilizantes con la eutrofizacin de acuferos superficiales (JICA, 2000; Crdenas, 2003), lo cual sera lesivo si se tiene en cuenta que Colombia es un pas reconocido por la abundancia de sus recursos hdricos y por ende la gran diversidad biolgica que alberga (IDEAM, 1998). El impacto ambiental generado por los fertilizantes nitrogenados ya ha sido documentado hace algn tiempo, por volatilizacin de compuestos derivados de la fertilizacin o por lixiviacin de alguno de sus componentes (Whitehead, 1995; JICA, 2000; Crdenas, 2003; Murgueitio, 2003). Debido a que no todo el nitrgeno (N) que se aplica es utilizado por las plantas, gran parte de este elemento se pierde por lixiviacin e ingresa en forma de nitrito a los ros y aguas subterrneas ocasionando problemas a largo plazo de contaminacin e impacto sobre salud pblica o por volatilizacin en forma de xido nitroso aumentando el efecto invernadero de la atmsfera (Whitehead, 1995; Kohn et al., 1997; Meyer, 2000). De otro lado, los actuales precios internacionales del petrleo han incrementado los precios de la urea haciendo insostenible este sistema productivo. Aunque en realidad no se han realizado cuantificaciones efectivas de este impacto, lo que ha sido limitante para asumir el reto de iniciar los procesos de reconversin ambiental y social que requiere la ganadera de leche en Colombia (Murgueitio, 2003).

Dados estos antecedentes, se decidi determinar el balance de nitrgeno en el animal como valor de eficiencia en produccin de nitrgeno en leche y el balance de nitrgeno en el sistema de pastura, adaptando el modelo de Thomas y colaboradores (1992) recomendado para el trpico bajo.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Localizacin del experimento El ensayo se realiz en el Centro Agropecuario Marengo (CAM), localizado en la vereda San Jos, municipio de Mosquera, Cundinamarca, localizado a 4 42 de latitud norte y 74 12 de longitud oeste; a 2.540 msnm de altitud; con temperatura promedio de 13C que flucta entre 0C y 20C; precipitacin anual promedio de 680 mm con distribucin bimodal, con periodos lluviosos entre los meses de abril y mayo y otro desde septiembre hasta noviembre, con presencia de heladas durante los meses secos. La zona presenta una humedad relativa entre 80% y 85% (Gonzlez et al., 1997). Los suelos pertenecen a la serie Tibaitat, los cuales se han formado a partir de materiales heterogneos con influencia variable de cenizas volcnicas. Presentan baja evolucin, son generalmente profundos, bien drenados y de fertilidad moderada. Preparacin del terreno El rea del experimento se prepar con un mes de anticipacin a la siembra, mediante un pase de cincel a 50 cm de profundidad y dos pases de rastra. rea del experimento El rea total del experimento fue de 20.000 m, con 2 parcelas de 10.000 m, donde se sembraron por medio de material vegetativo gramneas en surco alternadas a 30 cm entre plantas y a 30 cm entre surcos; para el caso de la pradera asociada se emple esta misma densidad pero alternando un surco de gramnea con uno de leguminosa. Nivel de fertilizacin Se emple una fertilizacin recomendada para el establecimiento de las pasturas mixtas de gramneas en clima fro segn Silva (1996) y Bernal (1984). Fertilizacin de pastura mixta (mezcla de gramneas) Quince das antes de la siembra se aplicaron 300 kg de cal dolomita; al momento de la siembra 30 kg fsforo, 25 potasio, 12 kg magnesio, 30 de boro y 12 kg azufre; a los 15 y 30 das despus de la siembra, 50 kg nitrgeRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 91-101

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no, todos estos valores por hectrea. Para el mantenimiento se realiz una aplicacin de N despus de cada pastoreo. No se consider la necesidad de usar riego, puesto que se sembr en poca de lluvias, adems, los materiales evaluados fueron seleccionados por ser poco exigentes en agua. Fertilizacin para la asociacin de gramnealeguminosa Se aplicaron las mismas cantidades de fertilizantes, omitiendo la aplicacin de nitrgeno, para aprovechar el papel de la leguminosa en el sistema de pastura. Tratamientos Se emplearon dos tipos de pasturas: mixta (Pennisetum clandestinum y Festuca arundinacea) y asociada (Festuca arundinacea + Lotus uliginosus). Composicin nutricional de las pasturas y del suplemento Se emple un suplemento elaborado a base de maz molido, torta de soya y salvado de trigo, caracterizado por ser su bajo contenido de grasa; se incluy xido de cromo (Cr2O3) como marcador externo al 0,6% para garantizar una concentracin adecuada que llevara a niveles detectables del marcador en las heces con el fin de determinar el consumo de forraje. El suplemento contena 18% de protena cruda (PC) y 1,85 Mcal energa neta de lactancia (ENL), suministrado a razn de 1 kg por cada 4,2 litros de leche sobre la base forrajera, que corresponda a los dos tipos de pasturas del ensayo: mixta y asociada de gramnea-leguminosa (tablas 1 y 2). Variables medidas en el animal Fueron tomadas durante el perodo experimental de 14 das; los 7 primeros das fueron de acostumbramiento al suplemento y a la pastura y los 7 das restantes se tomaron los datos de los tratamientos. Se estimaron valores de eficiencia en el uso del nitrgeno en funcin de la

Tabla 1. Composicin del suplemento alimenticio empleado en el experimento


Materias primas Maz molido Torta de soya Salvado de trigo Palmiste expeller Harina de pescado Melaza Premezcla minerales Carbonato de calcio xido de cromo Proporcin (%) 40,1 17,4 32,2 1,8 1,0 5,0 0,1 1,8 0,6

digestibilidad, metabolicidad y productividad. De este modo las variables que se estudiaron fueron relacionadas con entradas y salidas de nitrgeno, con base en el estudio de Betancur y Trujillo (2003) en vacas Holstein en Antioquia. Animales empleados Por cada tratamiento se emplearon cinco animales de peso promedio de 580 kg, entre 2 y 4 partos, en segundo tercio de lactancia (100 200 das posparto), con producciones similares de leche (20,3 L/da). Esto garantiz la homogeneidad de los animales. Consumo de alimento Se estim el consumo voluntario de forraje por medio de marcadores externos e internos. Como marcador externo se emple el xido de cromo (Cr2O3) dentro de la formulacin del suplemento a razn de 6 g/kg. Se tomaron muestras de heces por va rectal en cada animal en las horas de la maana desde el da 7 hasta el da 14 del perodo experimental, las cuales fueron congeladas a 4C y posteriormente secadas en horno con aire forzado a 60C, durante 48 horas y molidas en un tamiz de 0,5 mm. El cromo en las muestras de heces fue analizado por espectrometra de absorcin atmica (Holden et al.,

Tabla 2. Composicin nutricional de las pasturas y el suplemento alimenticio


composicin Protena cruda % Fibra detergente neutro % Fibra detergente cido % Extracto etreo % Digestibilidad in vitro de materia seca ENL (Mcal kg/MS)1/
1/: ENL (Mcal kg/MS): estimacin de energa neta de lactancia = 0,024 x (TDN%). National Research Council, Dairy Cattle, 2001.

P. clandestinum 16,1 59,1 28,9 65,7

F. arundinacea 18,2 58,4 34,2 66,2

L. uliginosus 28,2 38,7 23,9 68,9

Suplemento 18,0 22,8 6,7 3,9 86,2 1,85

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1994). Se estim la produccin de heces (PH) por animal/ da empleando la siguiente frmula:

Mediciones y supuestos del modelo descrito por Thomas y colaboradores

La cantidad de biomasa es el punto de partida, ya que expresa la produccin de la pastura. El porcentaje de N de la pastura expresa la cantidad de nitrgeno producido por unidad de rea, ya sea en kg N o ton N/ha. Cantidad marcador indigerible (Waller Se analiz la fibra detergente cidaconsumido (g/da) Los animales retienen solamente 10% del nitrgeno Cantidad marcador consumido (g/da) PH (gMS/da) PH (gMS/da) Concentracin de como marcador heces (g/gMS) ingerido, el resto lo excretan en heces u orina; cuando et al., 1980), la cual se utiliz marcador en las interno en Concentracin de marcador en las heces (g/gMS) Cantidad marcador consumido (g/da) el suplemento y las heces para estimar la digestibilidad se usa en clima fro se adapta pues los animales retiePH (gMS/da) Concentracin marcador en el alimento (%) (g/gMS) nen entre 20% y 25%. (Dig) de la% Concentracin de marcador en las heces dieta, empleando la siguiente frmula: ig = Concentracin marcador en heces (%) La ganancia de peso vivo contiene entre 2% y 2,5% de N; en el caso de produccin de leche de animales adulConcentracin marcador en el alimento (%) tos se adapta, pues depositan entre 2,8% 3,2% de N en ig % = Concentracin marcador en el alimento (%) Concentracin marcador en heces (%) ig % = la leche (Whitehead, 1995). Concentracin marcador en heces (%) Coeciente Indigestibilidad ID =el alimento (%) Concentracin marcador en 1-Dig De la excrecin de N, solamente 30% es retomado por las ig % = Finalmente, Concentracin marcador en cada animal se el consumo voluntario para heces (%) plantas, el resto se pierde por volatilizacin y lixiviacin. estim empleando laIndigestibilidad ID = 1-Dig siguiente frmula: Mximo 40% del N de la hojarasca es retomado por las Coeciente Coeciente Indigestibilidad ID = 1-Dig plantas. Produccin de heces Consumo (kgMS/da) El 50% del nitrgeno del forraje es reciclado internaCoeciente Indigestibilidad de digestibilidad Coeciente ID = 1-Dig mente, es decir, removilizado de hojas viejas a tejidos Produccin de heces nuevos en formacin. Produccin de heces Consumo (kgMS/da) Consumo (kgMS/da) Coeciente de digestibilidad Con excepcin de las excretas, las prdidas de N son Coeciente de digestibilidad Produccin de heces pequeas; cuando no se aplica nitrgeno estn balanceaConsumo (kgMS/da) das por las entradas de la atmsfera (Thomas et al., 1992). Coeciente de digestibilidad Variables medidas en la pastura Las leguminosas fijan cerca de 90% de sus requerimientos.

PH (gMS/da)

Cantidad marcador consumido (g/da) Concentracin de marcador en las heces (g/gMS)

Balance de nitrgeno en cada pastura: se compar el ciclaje del N in situ en las pasturas a evaluar versus el modelo de simulacin recomendado por Thomas y colaboradores (1992). Tambin se establecieron correlaciones entre las variables relacionadas con la excrecin de nitrgeno en cada pastura. Mediciones realizadas para el balance in situ Produccin de biomasa y concentracin de N en las pasturas a evaluar con el mtodo Kjeldahl (AOAC, 1984). Concentracin de N en la dieta de los animales, mtodo Kjeldahl (AOAC, 1984). Produccin leche y concentracin de N en la misma a travs de las pasturas a evaluar, mtodo Kjeldahl (AOAC, 1984). Concentracin de N en orina, para lo cual se emple la creatinina como indicador del volumen producido (Valadares et al., 1999). Se tomaron muestras de orina por estimulacin vulvar, se acidificaron con HCl para mantener el pH por debajo de 2,0 y se almacenaron a -20C para posterior anlisis (Bargo et al., 2002). La determinacin de creatinina se realiz por medio del kit comercial Sigma kit 555-A (Sigma Chemical Co.). Excrecin de N en heces, calculado a partir de la cantidad de heces determinada con xido de cromo (Holden et al., 1994).

Anlisis estadstico Para las variables produccin de biomasa y contenido de nitrgeno de las pasturas se determin nicamente en cada pastura sin comparacin estadstica, porque no hubo rplica para tal caso. Para las variables relacionadas con el balance de nitrgeno en el animal se emple un modelo de completamente al azar. Donde se tuvo como unidad experimental cada vaca y como tratamiento la pastura, tomando como covariables para cada caso las mediciones del da 0. Se emple el PROC MIXED del paquete estadstico SAS y la prueba de comparacin de medias de Duncan (SAS, 1996). Yij = + j + (xij X) + ij Donde: : j: (Xij X): ij: media general efecto de los tratamientos ajuste de la covariable error experimental

R E S U LTA D O S

Balance y eficiencia del nitrgeno en el animal Se determin el contenido de materia seca y de nitrgeno de cada uno de los suplementos, as como del forraje para
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valorar el nitrgeno ingerido total. Este valor se obtuvo de la medicin de la cantidad de suplemento y del forraje consumido. Se estim la produccin de materia seca y el nitrgeno digeridos, y se registraron las cantidades de leche, heces y orina que las vacas produjeron y las cantidades de nitrgeno relacionadas. Variables relacionadas con el consumo de alimento y entradas de nitrgeno en el animal En cuanto al consumo de alimento (tabla 3) se observaron diferencias (p < 0,05) en las dos pasturas. El consumo fue mayor en la pastura mixta de gramneas frente a la asociada, tanto en el consumo con base en el peso vivo (3,62% y 4,57% respectivamente) como en kg MS/vaca de forraje y total ingerido. En el caso del nitrgeno total ingerido por los animales en cada pastura no hubo diferencias (p > 0,05). Variables relacionadas con excrecin de heces y digestibilidad En cuanto a la produccin de heces (tabla 4) (PHEC), no hubo diferencias para los dos grupos (p > 0,05), contrario

a lo sucedido con el contenido de nitrgeno (NH) en las heces de cada grupo de vacas, donde fue mayor en las heces de las vacas que estaban en la pastura asociada (2,62%), frente a las de la pastura mixta (2,37%), determinando as diferencias para la cantidad de nitrgeno excretado en las heces (p < 0,05) con 216,68 g/v/d en la pastura asociada frente a 183,98 g/v/d en la pastura mixta probablemente asociado con la presencia de taninos de la leguminosa en la dieta (Bermingham et al., 2001; Molan et al., 2001; Rogosic et al., 2008). Para el caso del nitrgeno absorbido (NAP), la digestibilidad aparente (DAN) y la relacin de nitrgeno en heces del ingerido total (NH/ NTI) no se presentaron diferencias en los animales de cada pastura (p > 0,05), aunque se observ mayor digestibilidad aparente en la pastura mixta de gramneas. Variables relacionadas con la produccin de orina y metabolismo del nitrgeno Para el caso de la produccin de orina (POR) (tabla 5), no se presentaron diferencias (p > 0,05) entre los dos grupos de animales en cada pastura, contrario al contenido de nitrgeno en la orina (NO) que fue mayor (p < 0,05) en los animales de la pastura mixta con 0,75%, frente a los

Tabla 3. Consumo de alimento y entradas de nitrgeno en una pastura asociada gramnea leguminosa y una mixta de gramneas
Variables1/ CMSF kg/vaca/da NIF g/vaca/da CMSS kg/vaca/da NIS g/vaca/da CMST kg/vaca/da CMS % PV NIT g/vaca/da Pastura asociada Promedio 15,74 b 495,43 5,70 167,04 21,44 b 3,62 b 662,47 De 1,06 0,03 1,03 0,02 1,14 0,36 0,04 19,66 a 509,34 5,70 164,16 25,36 a 4,57 a 673,50 Pastura mixta Promedio De 1,82 0,04 0,67 0,01 1,99 0,58 0,05 Significancia2/ ** NS NS NS ** * NS

1/: CMSF: consumo de forraje en Kg MS/da. NIF: nitrgeno ingerido del forraje en g/da. CMSS: consumo de suplemento en kg/da. NIS: nitrgeno ingerido del suplemento en g/da. CMST = CMSF + CMSS: consumo total de materia seca en kg/da. CMCT/PV: ingestin de materia seca como porcentaje del peso vivo. NTI: nitrgeno total ingerido en g/da. 2/: Medias seguidas por letras iguales en la misma fila no son significativamente diferentes segn prueba de Duncan (p > 0,05). * (p < 0,05) ** (p < 0,01) *** (p < 0,001). NS: no significativa.

Tabla 4. Produccin de heces y excrecin de nitrgeno en una pastura asociada gramnea leguminosa y una mixta de gramneas
Variables1/ PHEC, kg/vaca/da NH,% NH, g/vaca/da NAP, g/vaca/da DAN,% NH/NTI,% Pastura asociada Promedio 8,24 2,62 a 216,68 a 445,78 67,06 32,93 De 0,92 0,15 0,02 0,06 5,76 5,76 7,74 2,37 b 183,98 b 489,52 72,56 27,43 Pastura mixta Promedio De 0,19 0,14 0,01 0,05 2,37 2,37 Significancia2/ NS * * NS NS NS

1/: PHEC: produccin de heces en kg/da. NH: nitrgeno en las heces g/da. NAP = NTI - NH: nitrgeno absorbido aparente en g/da. DAN = (NTI - NH)/NTI: digestibilidad aparente del nitrgeno. NH/NTI: nitrgeno en las heces como proporcin del nitrgeno ingerido. 2/: Medias seguidas por letras iguales en la misma fila no son significativamente diferentes (p > 0,05) segn prueba de Duncan *(p < 0,05) ** (p < 0,01) *** (p < 0,001). NS: no significativa.

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Tabla 5. Produccin de orina y nitrgeno metabolizado en una pastura asociada gramnea-leguminosa y una mixta de gramneas
Variables1/ POR L/vaca/da NO % NO g/vaca/da NO/NTI % NMA g/vaca/da MN % Pastura asociada Promedio 30,47 0,62 b 191,16 b 28,86 b 254,61 38,19 De 1,54 0,03 0,01 1,01 0,05 6,7 34,05 0,75 a 254,54 a 37,90 a 234,97 34,66 Pastura mixta Promedio De 2,08 0,08 0,02 5,76 0,06 7,19 Significancia2/ NS * ** ** NS NS

1/: POR: produccin de orina en L/da. NO: nitrgeno en orina en g/da. NO/NTI: nitrgeno urinario como proporcin del nitrgeno ingerido. NMA = NAP NO: nitrgeno metabolizable aparente en g/da. MN = (NAP-NO)/NTI: metabolicidad del nitrgeno. 2/: Medias seguidas por letras iguales en la misma fila no son significativamente diferentes segn prueba de Duncan (p > 0,05). *(p < 0,05) **(p < 0,01) ***(p < 0,001). NS: no significativa.

de la pastura asociada con 0,62%, dando mayor nivel de excrecin de nitrgeno en orina (p < 0,05) en la pastura mixta (254,54 g) frente a la asociada (191,16 g). Tambin se presentaron diferencias (p < 0,05) en la relacin de nitrgeno en orina del total ingerido (NO/NTI), con 37,9% en la pastura mixta, frente a 28,86% en la pastura asociada. En cuanto al nitrgeno metabolizable aparente (NMA) y la metabolicidad del mismo (MN) no se presentaron diferencias (p > 0,05) entre los dos grupos de animales en cada pastura. Variables de eficiencia y balance de nitrgeno en el animal La produccin de leche (PL) (tabla 6) fue mayor en las vacas que consumieron la pastura asociada (p < 0,01) con 23,24 L/v/d frente a las que pastaban la mixta de gramneas con 19,85 L/v/d. Para el caso del nitrgeno en la leche (NL) se presentaron diferencias (p < 0,05), siendo mayor en la leche de las vacas en la pastura asociada (0,5%) frente a la mixta (0,43%), lo que mostr que existieron tambin diferencias en la produccin total de nitrgeno en la leche (NL) con 115,86 g en la leche de las vacas en la pastura asociada y 85,32 g en la mixta.

Respecto a la eficiencia de uso del nitrgeno (NL/NTI), que relaciona el nitrgeno de la leche sobre el total ingerido, se observaron diferencias (p < 0,05) siendo ms eficiente el uso del nitrgeno en los animales que pastorearon la pastura asociada (17,55%) frente a los de la pastura mixta (12,78%). Para las variables de retencin de nitrgeno (NR) y nitrgeno para produccin (NP) y la relacin de ste con el total ingerido (NP/NTI) no hubo diferencias entre los grupos de vacas en cada pastura (p > 0,05) Balance de nitrgeno en las pasturas segn los supuestos del modelo de Thomas y colaboradores (1992) Para este balance se tom como unidad integral la pastura que se encontraba en un determinado suelo. En el presente estudio se parte de los supuestos empleados en este modelo para trpico bajo y se determin el valor real de los supuestos para el caso de trpico alto; los supuestos que no se corroboraron se asumieron como los del modelo inicial. En la tabla 7 se observa el modelo de simulacin aplicado para cada una de las pasturas; se parte del nitr-

Tabla 6. Eficiencia y balance de nitrgeno en vacas Holstein en una pastura asociada gramnea-leguminosa y una mixta de gramneas
Variables1/ PL L/vaca/da NL % NL g/vaca/da NL/NTI % NR g/vaca/da NP g/vaca/da NP/NTI % Pastura asociada Promedio 23,24 a 0,50 a 115,86 a 17,55 a 138,75 254,61 38,20 a 3,58 0,007 0,01 3,00 0,05 0,07 1,03 De 0,43 b 85,32 b 12,78 b 149,64 234,97 34,66 b 19,58 b Pastura mixta Promedio 2,36 0,04 0,006 1,97 0,06 0,09 0,89 De ** * ** * NS NS * Significancia2/

1/: PL: produccin de leche L/da. NL: nitrgeno de la leche g/da. NTI: nitrgeno total ingerido. NR: balance de nitrgeno o nitrgeno retenido g/da (NTI NH NO - NL). NP: nitrgeno en produccin animal g/da (NTI NH NO). NP/NTI: nitrgeno en produccin animal como proporcin del nitrgeno ingerido. 2/: Medias seguidas por letras iguales en la misma fila no son significativamente diferentes segn prueba de Duncan (p > 0,05). *(p < 0,05) **(p < 0,01) ***(p < 0,001). NS: no significativa.

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Tabla 7. Balance de nitrgeno simulado en una pastura asociada gramnea-leguminosa y una mixta de gramneas empleando el modelo de Thomas y colaboradores
estimacin de N en diferentes etapas (kg N/ha/ao) Fijacin (kg N/ha/ao) N en biomasa (MS * N (%) Gramnea (MS * N (%) Leguminosa Ingestin N (A * 40, 50%) N produccin animal (C * 20%) Excretas animales (C * 80%) Retomado planta (E * 30%) Reciclado interno (B C) * 50% Hojarasca (G * 40%) Total reciclado (A+F+G+H) Balance Fertilizacin Extrado plantas Cantidad retomada Dficit (J - K)1 J K L 0 591,4 605,3 - 13,9 400 482,9 227 255,9 C D E F G H I tem A B Pastura asociada 300,0 591,5 343,2 248,3 236,6 47,3 189,3 56,8 177,5 71,0 605,3 Pastura mixta 0 482,9 482,9 0 241,5 48,3 193,2 57,9 120,7 48,3 227,0

1/: Cuanto mayor sea el dficit mayor cantidad de nitrgeno debe aplicarse de fuentes externas al sistema.

geno fijado por la leguminosa en la pastura asociada que corresponde al 90% de sus requerimientos (300 kg); se obtuvo el contenido de nitrgeno en la biomasa que corresponde a la produccin de cada pastura durante el ao (8 cortes), y se calcul el porcentual de N correspondiente. As, se tienen 591,5 kg para la pastura asociada y 482,9 kg para la mixta. En cuanto a la ingestin animal el modelo sugiere que una pastura asociada tendra un valor de 40% y una mixta, de 30%. En este estudio, con los valores de consumo estimados, los consumos fueron de 40% para la pastura asociada y 50% para la mixta, tomando como 100% el N de la biomasa. Las excretas animales corresponden a 80% del N ingerido y el valor del modelo es muy cercano al de este estudio, por lo tanto no se modific, pero se observ que el nivel de N en las excretas fue ms alto en la pastura mixta que en la asociada. Tampoco se modific el valor del N retomado por la planta, el de reciclado interno y el de hojarasca, que en este caso corresponde a 40% del N reciclado interno. Con todos los parmetros establecidos para el modelo, se realiz el balance en el sistema de pastura. La pastura mixta recibe 400 kg N/ha/ao, suministrados en 50 kg de N/ha/corte durante 8 cortes al ao. Para el caso de las dos pasturas, el valor de reciclaje corresponde a la suma del nitrgeno fijado, el retomado por la planta, el reciclado interno, el de la hojarasca, y el extrado por las plantas para determinar si el sistema de pastura presenta o no
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dficit del elemento. En este estudio se pudo observar que la pastura mixta present un valor en el balance de 255,9 kg y la pastura asociada, de -13 kg. Lo anterior indica que en la pastura mixta la cantidad de N para el balance en el sistema es de 255,9 kg, los cuales en ausencia de entradas deben venir directamente de otras fuentes como mineralizacin en el suelo, deposicin seca o con las lluvias; en cuanto a la pastura asociada el valor corresponde a un balance positivo (-13,9 kg), donde se ve el efecto del aporte de N que hace la leguminosa y adems el incremento sobre la produccin animal.
DISCUSIN

Consumo y entradas de nitrgeno El National Research Council (2001) afirma que para vacas lecheras multparas el consumo total de materia seca entre las semanas 5 y 30 de lactancia se encuentra entre 23 y 25 kg MS/da o sea 3,6% de su PV. En el presente estudio, el consumo de materia seca total fue superior al estipulado por el NRC y a lo reportado por Kalscheur y colaboradores (1999) en vacas en el segundo tercio de la lactancia alimentadas con una dieta de 13,2% de protena cruda con un valor de 20,8 kg MS/da equivalente a 3,45% del PV. Sin embargo, en el presente estudio a pesar de las diferencias en consumo, no se afect el nitrgeno total ingerido y se relacion directamente con un mayor contenido de nitrgeno en el forraje de la pastura asociada.

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En diferentes investigaciones se encontr que se podran relacionar las diferencias en consumo de materia seca con el contenido de taninos en L. uliginosus, lo que puede limitar el consumo de la leguminosa en la pastura asociada (Min et al., 2003; Decruyenaere et al., (2009). Al igual que en Pereira y colaboradores (2009), en la presente investigacin el muestreo y mtodo de determinacin del consumo no estableci cunto del consumo diario correspondi a gramnea y cunto a leguminosa, aunque se observ que debido al manejo diario de la cuerda del pastoreo no hubo seleccin por parte de los animales. Excrecin de nitrgeno en heces y orina En cuanto a la excrecin de nitrgeno en heces, varios autores han reportado que la cantidad de heces puede variar con la cantidad y la digestibilidad del alimento que consume el animal, encontrndose valores entre 2,5 a 6,5 kg de heces en MS da en ganado de leche, con un contenido de materia seca entre 8% y 16% (Churo, 1976; Haynes y Williams, 1993; Ledgard et al., 1999; Betancur y Trujillo, 2003; Spears et al., 2003). Otros estudios han mostrado el contenido de N en las heces de bovinos y ovinos pastoreando gramneas + trboles u otras mezclas de gramneas y leguminosas, el cual vara en un rango de 1,2% a 4,0% de la materia seca (Dickinson et al., 1981; Kirchmann, 1992; Jonker et al., 1998; Ledgard et al., 1999; Astarriaga et al., 2002). La produccin normal de nitrgeno en las heces de una vaca vara entre 100 y 200 g/da, con 7 a 15 defecaciones por da (Spedding, 1971; Betancur y Trujillo, 2003; Correa, 2003). En este estudio se pudo observar que los valores reportados para el contenido de nitrgeno en las heces y la excrecin diaria de nitrgeno (g/da) se encuentran dentro de rangos ya observados por otros estudios; siendo particular para este caso la mayor excrecin de nitrgeno en las heces de las vacas alimentadas con la pastura asociada, lo que puede ser causa de variaciones en las vas de excrecin de nitrgeno, asociado directamente con el tipo de pastura. Varios reportes coinciden en que despus ingerir cierta racin de taninos se produce un aumento en la excrecin de nitrgeno en las heces, debido a la disminucin en la digestibilidad de la protena, encontrndose no solo nitrgeno proveniente de la protena alimentaria no degradada sino tambin de la protena de origen endgeno (Hill et al., 1987; Nishimuta et al., 1973; Min et al., 2003; Posada et al., 2005). En cuanto a la produccin y excrecin del nitrgeno en la orina, tambin se encontr el efecto de la pastura. En este estudio se observ que la salida de N aument en la orina en animales que pastaban la pastura mixta de gramneas y disminuy en los que consuman la pastura

asociada. Esta disminucin de N en se debe quizs a su menor degradacin por parte de los microorganismos del rumen, debido a la presencia de taninos en la dieta (Ben Salem et al., 2000; Carulla et al., 2005). En un trabajo similar realizado por Grieve y colaboradores (1980) con animales alimentados con un 14% de PC report una excrecin de 126,1 g/da, valor inferior al obtenido en este estudio. La produccin de orina tambin est dentro del rango normal reportado por otros autores (10 a 40 L/da) entre 8 a 12 micciones diarias (Spedding, 1971; Betteridge et al., 1986; Colmes, 1989; Haynes y Williams, 1993), con un contenido dentro de un rango de 0,2% a 2,0% de la materia seca en nitrgeno, para un rango de produccin de 100 a 150 g/v/d (Betteridge et al., 1986; Ledgard et al., 1999; Kohn et al., 2002; Betancur y Trujillo, 2003; Correa, 2003; Kohn et al., 2005). En la presente investigacin se destaca que, para el caso de la pastura asociada hubo mejor relacin entre el nitrgeno que ingiere el animal y el que se excreta en la orina, lo que sugiere mayor empleo del nitrgeno ingerido de la pastura asociada frente a la pastura mixta, donde para la primera la proporcin de nitrgeno en la orina es menor con relacin al nitrgeno total ingerido. Lo anterior indica directamente una menor excrecin de nitrgeno al medio como material contaminante, efecto directamente asociado a la presencia de taninos en la leguminosa de la pastura asociada como ya se ha reportado en otros estudios (Flores et al., 1999; Ben Salem et al., 2005; Tiemann et al., 2008; Otukoya y Babayemi, 2008). Eficiencia y balance del nitrgeno en el animal La produccin de leche fue mayor en las vacas que pastaban la pastura asociada, debido quizs a un contenido mayor de nitrgeno de la misma y relacionado directamente con la presencia de taninos en la leguminosa de esta pastura. Se destaca que la eficiencia del N fue ms alta en la pastura asociada frente a la mixta, si bien se encuentra entre los rangos reportados por autores como Betancur y Trujillo (2003) en Antioquia (18%). Tambin Moorby y Theobald (1999) afirman que la conversin del nitrgeno dietario en nitrgeno lcteo es ineficiente llegando a ser slo de 20% a 30% del nitrgeno ingerido; similar comportamiento ha sido reportado en otros autores (Baker et al., 1995; Kalscheur et al., 1999; Correa, 2003). Otros estudios presentan eficiencias con rangos entre 25% y 30% en el balance de nitrgeno para ganado de leche (Ledgard et al., 1999; Astarriaga et al., 2002; Jonker et al., 2002). Sin embargo, se debe enfatizar que para el presente estudio los animales en pastoreo en la pradera asociada presentaron valores ms altos de eficiencia frente a aqullos en pastoreo en la pradera mixta, lo que indica que en
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la primera hubo un mejor flujo del nitrgeno en el animal hacia la produccin de leche y la generacin de tejido. Kalscheur y colaboradores (1999) reportaron valores de nitrgeno total en leche para vacas en el segundo tercio de la lactancia superiores a los obtenidos en este trabajo, los cuales oscilaron entre 123,87 y 133,0 g/da. En general, se puede decir que con la inclusin de la leguminosa con taninos, como en este estudio, se presentan cambios en las vas de excrecin del nitrgeno partiendo de un nivel similar de nitrgeno ingerido donde se observ que la utilizacin del ltimo puede ser ms eficiente si el nivel de ingestin de taninos es adecuado. Balance de nitrgeno segn el modelo de Thomas y colaboradores Este modelo de simulacin fue utilizado por Crdenas (2003) en diferentes pasturas de clima fro para la misma zona de este estudio, encontrando que las praderas de gramneas asociadas a la leguminosa Lotus uliginosus presentaron un balance favorable para el nitrgeno en el suelo (valor negativo), siendo el caso de F. arundinacea + Lotus (-22 kgN/ha/ao) frente a especies con balance desfavorable (valor positivo) como P. clandestinum (puro). En el mismo estudio tambin se observ que cultivares del gnero Lolium presentaron balances desfavorables y elevados. Sin embargo, dicho estudio fue una aproximacin en la que el punto de partida fue la produccin de biomasa y el contenido de nitrgeno de sta, mas no se realiz bajo efecto del pastoreo directo. Crdenas (2003) concluye que existen gramneas ineficientes en el uso del nitrgeno aplicado y que la leguminosa ejerce un factor mejorante en el balance del nitrgeno en el suelo al asociar las gramneas, reduciendo as la necesidad de fertilizante nitrogenado que deba aplicarse a la pradera. Estos reportes coinciden con los realizados por Whitehead (1995) para pasturas de raigrs asociadas con Trifolium sp. con un balance de 39 a 130 kg N/ha/ ao. Tambin para la cantidad de nitrgeno retomado por las plantas, los cuales concuerdan con los reportes de Simpson (1981) en pasturas de Dactylis glomerata

asociadas con Trifolium sp. de 154 kg N/ha/ao y con Medicago sativa de 48 kg N/ha/ao. Tambin Ledgard y colaboradores (1999) reportaron en pasturas de raigrs ms trboles -34 kgN/ha/ao en pasturas sin fertilizacin nitrogenada y -24 kgN/ha/ao en pasturas con 400 kgN/ ha/ao. En el estudio de Spears y colaboradores (2003) en diferentes granjas de lechera especializada en Estados Unidos, la mayora de los reportes muestran 80,84 kg N/ ha/ao como potencial de prdida.
CONCLUSIONES

La pastura asociada de Festuca + Lotus uliginosus reflej mejores parmetros de calidad de la leche, en especial el contenido de protena y casena. En la asociacin F. arundinacea + L. uliginosus se reduce la emisin de nitrgeno en orina. Los animales que pastorearon la asociacin F. arundinacea + L. uliginosus mostraron mejor eficiencia en el uso del nitrgeno que los animales que pastorearon praderas de gramneas mixtas fertilizadas con nitrgeno. L. uliginosus puede ser empleada en los sistemas de produccin de lechera como factor mejorante de la dieta, de la produccin y de la eficiencia de uso del nitrgeno. El uso de pasturas asociadas de gramnea y leguminosa en sistemas ganaderos de trpico alto puede contribuir a la reduccin de costos por fertilizacin nitrogenada.
AGRADECIMIENTOS

A la Vicerrectora de Investigaciones, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, por la financiacin de esta investigacin en la modalidad 7: apoyo a tesis de maestra y especialidades en el rea de la salud (Convocatoria Nacional de Investigacin 2006). Y al personal de apoyo del Laboratorio de Nutricin Animal y del Centro Agropecuario Marengo.

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Balance de nitrgeno en pastura de gramneas y pastura de gramnea ms Lotus uliginosus en la sabana de Bogot, Colombia 101
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A R t c u lo c I e N t F I co

Evaluation of three native Colombian yeasts as feed additives for broilers

Evaluacin de tres levaduras provenientes de ecosistemas colombianos en la alimentacin de pollos de engorde


Natalia Lpez Hernndez1, Germn Afanador Tllez2, Claudia Janeth Ariza Nieto3

A strategy to improve the health of the gastrointestinal tract in broilers is to include novel products such as functional feed additives. Among these, yeasts have been recently reported to play a beneficial role as a feed additive. The objective of this study was to evaluate the nutritional value of three strains of yeasts, isolated from native fruits in Colombia. A total of 240 male broilers were used, and the effects of yeasts on performance, carcass quality, blood and heart parameters were evaluated. Chicks were randomly distributed in six treatments: three different native yeasts (0.5% of inclusion in the diet), two positive controls added with commercial yeasts and a negative control group without yeasts. Chicks fed with yeasts commercial had lower total feed intake (-73.7 g) compared with the native yeast groups. Therefore, final body weight was higher for the native yeast groups compared with the commercial yeasts (98.9 g/bird, p < 0.01). Chicks fed native yeasts tended to have better feed conversion ratio (intake/gain) compared with the control group. Carcass and breast weights were higher for the yeasts groups (p < 0.05). It is concluded that native yeasts can have a beneficial effect on broiler performance, and some native yeasts could also improve meat quality traits such as shear force. Although more research is required, native yeasts should be regarded as relevant and promising functional additives for broilers. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, carcass quality, ascites, nutritive value, animal performance.

ABSTRACT

RESUMEN

Una estrategia para mejorar la salud del tracto gastrointestinal en pollos de engorde es incluir productos novedosos como los aditivos funcionales entre los que se encuentran las levaduras, caracterizadas por su papel beneficioso en la salud animal. En este estudio se evalu el valor nutricional de tres cepas nativas de levaduras, aisladas de frutales de Colombia. Se utilizaron 240 pollos machos para evaluar los efectos de levaduras en el desempeo, calidad de la canal, parmetros hematolgicos y del corazn. Los pollos se distribuyeron al azar en seis tratamientos: tres diferentes levaduras nativas (0,5% inclusin en la dieta), dos controles positivos (inclusin de dos levaduras comerciales) y un grupo control negativo sin levaduras. Las aves que fueron alimentadas con las levaduras comerciales presentaron menor consumo de alimento total (-73,7 g) comparado con los grupos a los que se les suministr levaduras nativas. Por consiguiente, el peso corporal final fue ms alto para los grupos de levaduras nativas comparado con las levaduras comerciales (98,9 g/ave, p < 0,01). Los pollos alimentados con levaduras presentaron mejor conversin comparados con el grupo control. El peso de la canal y la pechuga fueron ms altos para los grupos alimentados con levaduras (p < 0,05). Se concluye que las levaduras nativas pueden tener un efecto beneficioso en el desempeo de pollos de engorde, y algunas levaduras nativas podran mejorar las caractersticas de calidad de carne como la terneza. Aunque se requiere mayor investigacin, pueden considerarse las levaduras nativas como aditivos funcionales prometedores para los pollos de engorde. Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, calidad de la canal, ascitis, valor nutritivo, desempeo animal.
INTRODUCCIN

Radicado: 19 de diciembre de 2008 Aceptado: 30 de abril de 2009

Z. MSc. Universidad Nacional de Colombia, Bogot. nlopezh@unal.edu.co MV.Z. Ph.D. Coordinador Nacional Pecuario, Corpoica, Mosquera, Cundinamarca. gafanador@corpoica.org.co 3 Z. Ph.D. Coordinadora Laboratorio Nutricin, CBB, Corpoica, Mosquera, Cundinamarca. cariza@corpoica.org.co
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l uso de antibiticos promotores de crecimiento (APC) en dietas para pollos de engorde actualmente est bajo examen por parte de diferentes actores sociales, debido a que han sido implicados en mecanismos de resistencia microbial. Frente a esta problemtica se han desarrollado alternativas tecnolgicas que cubren diferentes aspectos entre los que se encuentran las normas de
2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

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bioseguridad y manejo, vacunacin, seleccin gentica, exclusin competitiva, y el desarrollo de productos multifuncionales como probiticos, prebiticos, oligosacridos (mananoligosacaridos y fructoligosacridos), cidos orgnicos (fumrico) y extractos vegetales (aceites esenciales de organo), entre otros. Los oligosacridos son considerados las alternativas ms promisorias al uso de los APC, pues facilitan y apoyan la relacin simbitica entre el hospedero y su microflora. Los mananoligosacridos son derivados de la superficie celular de las levaduras, especficamente de su pared celular, y tienen alta afinidad ligante, lo que permite proteger al hospedero contra un determinado tipo de bacterias patgenas (Santin et al., 2001). En el campo de la nutricin aviar, antes del descubrimiento de las vitaminas del complejo B, las levaduras, especficamente la de cerveza, se utilizaban como complemento alimenticio. Posteriormente se desarrollaron diversas investigaciones sobre el uso de levaduras y su incidencia en la salud y productividad animal (Bradley et al., 1994; Santin et al., 2001; Morales, 2007). Dentro de las levaduras ms usadas se encuentran Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Cryptococcus curvatus, Candida utilis y Torula utilis. La levadura Saccharomyces cerevisiae Sc7 es una de las especies que ha sido aprobada como un microorganismo seguro en alimentacin animal por la Unin Europea y por otros pases como Japn (Nitta y Kobayashi, 1999) y Estados Unidos de Amrica, donde la FDA (Food y Drug Administration) le ha otorgado el grado GRAS (generally recognised as safe). Saccharomyces cerevisiae es la levadura con mayor nmero de estudios cientficos como aditivo natural (NRC, 1994; Miazzo y Kraft, 1998; Miazzo et al., 2001; Cruickshank, 2002). En estudios realizados por Miazzo y colaboradores (1995, 1997, 1998 y 2005) los niveles de inclusin en dietas para pollos de engorde variaron entre 0,5% y 1,5%; en los de Churchil y colaboradores (2000) y Upendra y Yathiaray (2003) variaron entre 0,2% y 1%; en general, estos porcentajes de inclusin no afectaron el comportamiento productivo de los pollos de engorde. Otros estudios tambin sealan los beneficios de la inclusin de levaduras en aves (Murakami et al., 1993; Ergl, 1994; Kumprechtov et al., 2000; Spring et al., 2000; Santin et al., 2001; Grangeiro et al., 2001). Adicionalmente, se ha mejorado el rendimiento y la calidad de la canal, y la produccin de carne con altos niveles proteicos y bajos niveles de grasa, agregando levaduras a las dietas de los pollos de engorde (Onifade et al., 1999; Gagic et al., 2003; Modirsane, et al., 2003; Miazzo et al., 2005).
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En general, en la bsqueda de una mxima velocidad de crecimiento, mayores ganancias de peso corporal, alta eficiencia alimenticia y viabilidad, mayor rendimiento en canal y menores deposiciones de grasa, los programas de mejoramiento gentico de los pollos de engorde han desencadenado predisposicin a sndromes fisiolgicos como el estrs calrico, la muerte sbita y la ascitis (Fernndez et al., 2004). En particular, el sndrome asctico aviar se basa en la premisa de que un dficit de oxgeno aumenta la concentracin de hemoglobina, el hematocrito y el nmero del eritrocitos, con el aumento consecuente de la viscosidad sangunea. En el contexto de los planteamientos presentados, el objetivo general de este estudio fue evaluar el potencial nutricional de tres diferentes cepas de levaduras aisladas de frutales colombianos y de dos levaduras comerciales. Adems, debido a la importancia de la ascitis aviar en el rea de influencia del estudio, en esta investigacin se evalu el efecto de la inclusin de levaduras (0,5% de la dieta) sobre la presencia del sndrome asctico en pollos de engorde machos.
M AT E R I A L E S Y M T O D O S

Localizacin El presente estudio se llev a cabo en el Centro de Investigaciones Tibaitat de Corpoica, Mosquera, Cundinamarca, Colombia, ubicado a 2.547 msnm, con temperatura media de 13C, precipitacin anual de 621 mm y humedad relativa de 73% (Moreno et al., 2006). Instalaciones y equipos Las aves se alojaron aleatoriamente en tres bateras verticales de cra provistas de los elementos necesarios para efectuar todas las mediciones requeridas tales como: comederos de canal para el suministro de las dietas experimentales, bebederos automticos con copa, fuente elctrica de calor, rejilla y bandeja de recoleccin de heces. La densidad mxima manejada fue de 10 aves/corral. La temperatura se mantuvo a partir de la segunda semana de edad, en 24C. Aves Se utilizaron 240 pollos machos de la estirpe Hybro de un da de edad, provenientes de una incubadora comercial. Los pollos se preseleccionaron buscando una homogeneidad en el peso corporal promedio de 130 g (se eliminaron pesos atpicos de ms de una desviacin estndar de la mediana) y de acuerdo con el tamao, caractersticas fenotpicas y estado sanitario.

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Dietas experimentales Se evaluaron seis dietas en harina formuladas en un mbito comercial con y sin la adicin de levaduras (nivel de inclusin 0,5% a expensas del contenido de maz) y de acuerdo con un sistema de alimentacin por fases: preiniciacin (1-7 das de edad), iniciacin (8-24 das de edad) y crecimiento (25-35 das de edad). La composicin de cada dieta fue de 22%, 21% y 20% de protena cruda y 3000, 3050 y 3100 Kcal/kg de energa metabolizable aparente para cada fase de alimentacin, respectivamente. La formulacin de las dietas experimentales se realiz utilizando el programa UFFDA (User-Friendly Feed Formulation, Done Again) y se utilizaron los valores composicionales de ingredientes reportados en el National Research Council (NRC, 1994), y ajustadas a la composicin de estos recursos alimenticios en Colombia (tabla 1). Los grupos experimentales fueron los siguientes: tratamiento 1: dieta control sin inclusin de levadura; tratamiento 2: dieta con inclusin de levadura comercial Levapan presentacin seca; tratamiento 3: dieta con inclusin de levadura comercial ab vista; tratamiento 4: dieta con inclusin de levadura nativa 1; tratamiento 5: dieta con inclusin de levadura nativa 2; tratamiento 6: dieta con inclusin de levadura nativa 3. Las levaduras nativas colombianas 1, 2 y 3 corresponden respectivamente a los gneros: Cryptococcus humicola, aislada de manzanas (Pyrus mulas) cultivadas en Nuevo Coln, Boyac; Cryptococcus laurentii, aislada
Tabla 1. Composicin de las dietas experimentales
Materia prima Maz Harina arroz Torta soya 49 Soya extruida Harina pescado 64 Aceite de palma Carbonato Ca Fosfato diclcico Sal Bicarbonato de Na DL- metionina L- lisina HCl L -treonina Cloruro de colina 60% Premezcla minerales y vitaminas
Las levaduras fueron incluidas a un nivel de 0,5% en la dieta a expensas del maz.

de granadillas (Pasiflora lingularis) cultivadas en Ro Negro, Antioquia, y Cryptococcus humicola, aislada de lulo (Solalum quitoensi) cultivados en Ro Negro, Antioquia. Dichas levaduras forman parte del Banco de Germoplasma del Centro de Biotecnologa y Bioindustria (CBB) de Corpoica. La identificacin de estas levaduras la realiz el Laboratorio de Control Biolgico y el Centro de Biotecnologa y Bioindustrias de Corpoica (Cotes, 2006).
METODOLOGA

El estudio se realiz durante un perodo de 36 das. El alimento junto con el agua de bebida se proporcion a voluntad. Las aves se identificaron individualmente y se pesaron los das 1, 3, 8, 11, 15, 18, 22, 26, 29 y 36 del estudio. Se registr peridicamente la cantidad de alimento consumido descontndolo de la cantidad suministrada al inicio de cada fase de alimentacin. Con estos datos se calcul el consumo de alimento y la conversin alimenticia por fase de produccin. Diariamente se registr el nmero y peso corporal de las aves muertas por corral para calcular la conversin de alimento ajustada. Al finalizar el experimento, el da 36, se pes el total de los pollos por corral, despus de un perodo de 24 horas de ayuno. Cuatro pollos de cada grupo experimental se sacrificaron manualmente por sangrado de la vena yugular y la arteria cartida, dejando un tiempo aproximado de sangra de 2 minutos y medio antes de entrar a la escaldadora, donde fueron sumergidos en

Preiniciacin (1-7) 48,67 8,00 25,43 10,00 1,50 1,63 1,25 1,49 0,35 0,30 0,22 0,27 0,12 0,07 0,70

Iniciacin (8-24) Inclusin (%) 52,20 8,00 22,08 10,00 1,50 1,81 1,19 1,36 0,35 0,30 0,16 0,20 0,08 0,07 0,70

crecimiento (25-35) 55,82 8,00 18,65 10,00 1,50 1,89 1,10 1,19 0,35 0,30 0,15 0,21 0,08 0,07 0,70

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agua caliente de 58C a 60C durante 100 segundos, desplumados, separadas las patas, cabeza, cuello y eviscerados. Las canales fueron sumergidas en agua con hielo a 4C, durante 40 minutos. Se tomaron los pesos de las fracciones y la canal para determinar el rendimiento. Estos procedimientos fueron realizados siguiendo los protocolos establecidos en la planta de sacrificio del Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos (ICTA) de la Universidad Nacional de Colombia. Prdida de agua por goteo Se tom una muestra post mrtem del msculo trceps femoral fresco de cuatro pollos por rplica por grupo experimental. La base de la determinacin de la prdida por goteo fue el mtodo de Honikel y Hamm (1994). A este mtodo se le realiz la siguiente modificacin propuesta por Moron y colaboradores (2003): se cortaron longitudinalmente a la fibra muscular trozos de 0,5 cm de ancho x 0,5 cm de alto x 3,0 cm de largo. Las muestras de carne se pesaron (5,7 g promedio) en una balanza analtica Ohaus sensibilidad 0,1 mg y posteriormente fueron colocadas en vasos de plstico suspendidas con hilo, evitando que el trozo de msculo tocara las paredes o tapa del vaso. El procesamiento de las muestras se realiz a 4C realizando pesajes cada 24 horas (24, 48 y 72 horas). El porcentaje de prdida por goteo se calcul en funcin de la diferencia de peso inicial menos el peso final por 100. Prdida de agua por coccin Se colocaron las pechugas de cuatro pollos por tratamiento, en un recipiente cubierto con papel de aluminio y se cocinaron en un horno convencional a 177C hasta que la carne alcanz una temperatura interna de 77C. El lquido liberado se elimin y se pesaron las muestras para determinar la prdida de agua por coccin (Ramos, 2005). Terneza La terneza se evalu aplicando el mtodo de WarnerBratzler a una seccin de la carne cocida como se indic en la seccin anterior. Los segmentos (en promedio 8 cortes) de carne se obtuvieron cortando una franja de la pechuga y del pernil cocinados de un centmetro de alto, un centmetro de ancho y tres centmetros de largo. El eje ms largo del segmento se ubic paralelamente a la fibra muscular. Los segmentos de carne se colocaron perpendicularmente a la cuchilla triangular del equipo Warner-Bratzler Shimadzu - Modelo EZ Test; la cuchilla metlica era de 1 mm de espesor y el orificio triangular, de un ngulo de 60; el equipo fue configurado con una velocidad de corte de 200 mm por minuto
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para determinar la fuerza requerida para hacer el corte (Ramos, 2005). Estos anlisis se realizaron en el Centro de Investigaciones de Corpoica, Tibaitat. Parmetros hematolgicos Al final del perodo experimental se tomaron muestras de sangre de cuatro aves seleccionadas al azar de cada rplica; se coleccionaron 5 ml de sangre de cada pollo en tubos Vacutainer para anlisis hematolgicos en el laboratorio clnico de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia y en el Centro de Investigacin en Salud Animal (Ceisa) de Corpoica. Se colectaron y pesaron los corazones de cuatro pollos de cada repeticin, determinado el peso del ventrculo derecho (VD) y del ventrculo izquierdo (VI). Cuando est relacin present valor entre 0,250 y 0,299 se consider como una hipertrofia moderada; severa, cuando super 0,299 y normal, por debajo de 0,25 (Julian, 1987). El diagnstico cualitativo de ascitis se bas en la cantidad aumentada de lquido abdominal y presencia de cogulos de fibrina en el abdomen, as como por la dilatacin y congestin del ventrculo derecho y un hgado aumentado, congestionado o irregular. Anlisis econmico de presupuestos parciales El anlisis econmico comparativo se realiz a travs de la tcnica de presupuestos parciales, basado en los costos e ingresos por tratamiento o grupo experimental. Para estimar el costo por kilogramo de pollo en pie por tratamiento se utiliz el modelo descrito por Reyes (2001). Anlisis estadstico Los pollos fueron distribuidos al azar en seis tratamientos, cuatro rplicas y 10 aves por rplica. Cada piso de cada batera se dividi en dos corrales (de 10 aves), el corral fue considerado como la unidad experimental. Las variables respuesta se analizaron bajo un diseo completamente al azar con muestreo en las unidades experimentales. Se realiz un anlisis de varianza (Anova) y una prueba de comparacin no planeada para ver las diferencias de los tratamientos en los promedios de los parmetros productivos, rendimiento y calidad de la canal, parmetros hematolgicos, costos e ingresos parciales. Adicionalmente, se realiz una comparacin de la estimacin de medias de los siguientes contrastes: control versus levaduras y levaduras comerciales versus levaduras nativas mediante el programa SAS versin 9 (SAS, Inst. Inc. Cary, NC). Las diferencias fueron consideradas significativas p < 0,05, y valores de probabilidad p < 0,10 fueron analizadas como una tendencia.

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R E S U LTA D O S

Desempeo productivo del pollo de engorde Consumo de alimento por fase y total (g/ave) En la tabla 2 se muestra el efecto promedio de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos durante las fases de alimentacin: preiniciacin (1-7 das de edad), iniciacin (8-24 das de edad) y crecimiento (25-35 das de edad) sobre el consumo de alimento total. Se observaron diferencias significativas (p < 0,05) durante el perodo de iniciacin para los pollos que recibieron el tratamiento levadura nativa 2, los cuales consumieron ms alimento (1457 g) comparado con los pollos que recibieron el tratamiento levadura nativa 1 (1309 g). En contraste, los pollos que recibieron levaduras comerciales (Levapan presentacin seca y AB vista) comparados con los pollos que recibieron levaduras nativas (1, 2 y 3), (p < 0,02) en promedio consumieron menos alimento (-73,68 g). Ganancia de peso corporal (g/ave) En la tabla 3 se muestra el efecto promedio de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos durante las fases de alimentacin: preiniciacin (1-7 das de edad), iniciacin (8-24 das de edad) y crecimiento (25-35 das de edad) sobre la ganancia de peso corporal por fase y acumulada. Durante la fase de crecimiento se observaron diferencias significativas (p < 0,05). Los valores promedio ms altos para la ganancia de peso corporal se presentaron en los grupos con levadura nativa 2 y levadura nativa 3 (656 y 638 g/ave res-

pectivamente) y el valor promedio ms bajo se observ en el grupo control (472 g/ave). Los pollos que recibieron la dieta control durante la fase de crecimiento, comparados con los que recibieron levaduras, presentaron menor ganancia de peso corporal, con una diferencia estimada de 106,72 g/ave/fase (p < 0,015). Esta diferencia se mantuvo en las aves que recibieron las dietas con inclusin de levaduras comerciales (Levapan y AB vista), comparadas con la inclusin de levaduras nativas (1, 2 y 3), con una diferencia estimada de 102,95 g/ave, a favor de las levaduras nativas (p < 0,006) (tabla 3). La ganancia de peso corporal acumulada (g/ave) durante el estudio fue afectada por la inclusin del tipo de levaduras (p < 0,01). Los promedios ms altos se presentaron en los grupos que recibieron la levadura nativa 2 y levadura nativa 3 (1654 y 1654 g respectivamente) y el valor promedio ms bajo fue para el grupo control (1460 g). Los promedios en los tratamientos Levapan, AB vista y levadura nativa 1 fueron similares entres s y con respecto a los presentados para el tratamiento control, levadura nativa 2 y levadura nativa 3. En resumen, a los 35 das de edad se mantuvo la tendencia observada durante la fase de crecimiento, en el sentido que el grupo control present un menor peso corporal en comparacin con los pollos suplementados con levaduras nativas 1 y 2 (p < 0,05). Los pollos que recibieron las levaduras comerciales (Levapan y AB vista), comparados con los que reci-

Tabla 2. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre el consumo de alimento total de pollos de engorde machos en un sistema de alimentacin por fases (preiniciacin, iniciacin y crecimiento)
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas -3,76 -1,97 -25,25 -73,68 0,381 0,579 0,500 0,027 Diferencia estimada -33,00 -93,73 -62,00 -169,37 consumo de alimento /fase (g/ave) Preiniciacin (0-7) 101 105 104 103 110 106 ns 7,64 Iniciacin (8-24) 1348 ab 1325 ab 1333 ab 1309 b 1454 a 1445 ab ** 67,10 Probabilidad 0,675 0,163 0,490 0,033 crecimiento (25-35) 1103 1124 1034 1193 1135 1191 ns 141,20 consumo total 2552 2554 2470 2604 2699 2742 ns 160,52

a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente (p < 0,05). * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01).

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Tabla 3. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre la ganancia de peso corporal por fase y acumulado de pollos de engorde machos en un sistema de alimentacin por fases (preiniciacin, iniciacin y crecimiento)
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas -7,83 -1,57 -22,10 5,59 0,078 0,658 0,393 0,794 Diferencia estimada -106,72 -102,95 -136,65 -98,93 Ganancia peso /fase (g/ave) Preiniciacin (0-7) 102 112 106 109 110 113 ns 7,64 Iniciacin (8-24) 886 909 914 926 888 904 ns 46,07 Probabilidad 0,015 0,006 0,013 0,028 crecimiento (25-35) 472 b 526 ab 507 ab 566 ab 656 a 638 a ** 72,80 total 1460 b 1547 ab 1527 ab 1600 ab 1654 a 1654 a ** 90,91

a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente (p < 0,05). * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01). ns = p > 0,05.

bieron levaduras nativas (1, 2 y 3), ganaron menos peso corporal durante el perodo experimental (98,93 g/ave) (p < 0,013); esta diferencia se mantuvo en las aves que recibieron la dieta control comparadas con la inclusin de levaduras, con una diferencia estimada de (136,65 g) a favor de las levaduras nativas (tabla 3).

Conversin alimenticia por fase y acumulada En la tabla 4 se muestra la inclusin de levaduras en dietas para pollos de engorde machos durante las fases de alimentacin, preiniciacin (1-7 das de edad), iniciacin (8-24 das de edad) y crecimiento (25-35 das de edad), con respecto a la conversin alimenticia. Se encontraron

Tabla 4. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre la conversin alimenticia por fase y acumulada de pollos de engorde machos en un sistema de alimentacin por fases (preiniciacin, iniciacin y crecimiento)
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. Levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. Levaduras Comerciales vs. nativas 0,04 0,00 0,01 -0,09 0,254 0,892 0,812 0,008 Diferencia estimada 0,40 0,17 0,11 -0,01 conversin alimenticia / fase Preiniciacin (0-7) 0,10 0,93 0,98 0,95 0,10 0,94 ns 0,06 Iniciacin (8-24) 1,52 ab 1,46 a 1,46 a 1,41 a 1,64 b 1,60 b *** 0,07 Probabilidad 0,006 0,127 0,018 0,883 crecimiento (25-35) 2,38 b 2,13 ab 2,04 ab 2,11 ab 1,74 a 1,89 ab ** 0,23 conversin alimenticia total 1.75 1.65 1.62 1.63 1.63 1.66 ns 0,08

a, b, c, d, Dentro de una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05. * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01). ns= p > 0,05.

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diferencias significativas durante la fase de iniciacin y la de crecimiento (p < 0,05). Durante la fase de iniciacin, los pollos que recibieron los tratamientos Levapan, AB vista y levadura nativa 1 presentaron menor conversin alimenticia (1,46, 1,46 y 1,41 respectivamente) en comparacin con los pollos que recibieron los tratamientos levadura nativa 2 y levadura nativa 3 (1,64 y 1,60 respectivamente) (p < 0,05). Los pollos que recibieron levaduras comerciales (Levapan y AB vista), comparados con los pollos que recibieron levaduras nativas (1, 2 y 3), presentaron menor conversin alimenticia, con una diferencia estimada de 0,09 a favor de las levaduras comerciales (p < 0,008) (tabla 4). Durante la fase de crecimiento, los pollos del grupo control comparados con los del grupo de levaduras presentaron mayor conversin alimenticia con una diferencia estimada de (0,40) a favor de la inclusin de levaduras (p < 0,018). La conversin alimenticia durante el ciclo completo no fue afectada por la inclusin de levaduras (p > 0,05). Sin embargo, los pollos que recibieron la dieta control, comparados con los que recibieron las dietas con inclusin de levaduras, presentaron mayor conversin alimenticia, con una diferencia estimada de 0,11 a favor de la inclusin de levaduras (tabla 4). Rendimiento de las fracciones de la canal En la tabla 5 se observa el efecto de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos a los 36 das de edad, sobre el peso en pie, peso en canal, rendimiento en canal, cantidad relativa de pechuga, pierna pernil,

alas-costillar y rabadilla. Diferencias significativas en el peso en pie, peso en canal, cantidad relativa de pechuga, alas-costillar y rabadilla fueron observadas en los pollos que recibieron la dieta control comparados con los que recibieron levaduras (p < 0,05); estos mostraron menor peso en pie y peso en canal, con una diferencia estimada de 247 y 159 g/ave, respectivamente. Este comportamiento se mantuvo para la cantidad relativa de rabadilla con una diferencia estimada de 1,5% a favor de las aves que recibieron las dietas con levaduras (p < 0,004) (tabla 5). En relacin a la cantidad relativa de pechuga, los promedios ms altos se presentaron en los grupos que recibieron Levapan (34%) y el valor promedio ms bajo fue para el grupo que recibi levadura nativa 1 (31%). Sin embargo, este grupo de pollos fue el que mostr los valores ms altos para la cantidad relativa de la fraccin alas-costilla (28%) (tabla 5). Terneza y prdida de agua por goteo y por coccin En la tabla 6 se muestra el efecto de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos a los 36 das de edad, sobre la fuerza de corte de la pechuga y la pierna, la prdida de agua por goteo y por coccin de pechuga y pierna. Se observaron diferencias significativas (p < 0,05) en la fuerza de corte de la pechuga o terneza de la carne, entre los pollos que recibieron levadura nativa 3, los cuales presentaron una carne ms dura (3,72 kg F) y los pollos con levadura nativa 2 (2,29 kg F). No se presentaron diferencias significativas (p > 0,05) en las dems variables evaluadas. Sin embargo, los pollos que recibieron levaduras

Tabla 5. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre el peso en pie, peso en canal, rendimiento en canal, cantidad relativa de pechuga, pierna pernil, alas-costillar y rabadilla de pollos de engorde machos
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas -246,88 -78,79 -158,55 -60,96 0,03 -0,67 <.0001 0,069 0,001 0,097 0,981 0,606 Peso en pie kg 1392 b 1591 ab 1591 a 1640 a 1666 a 1704 a *** 85,06 Peso canal kg 894 b 1046 ab 987 ab 1088 a 1064 a 1081 a ** 72,57 Rendimiento canal % 64 66 62 66 64 63 ns 2,65 Pechuga % 32 ab 34 a 33 ab 31 b 33 ab 33 ab ** 1,19 Probabilidad 0,569 0,019 Diferencia estimada -0,38 1,48 -1,00 -0,70 -0,12 -1,20 1,50 0,41 0,117 0,203 0,838 0,029 0,004 0,315 Pierna-pernil % 30 31 30 31 32 31 ns 1,10 Alas-costilla % 24 b 23 b 24 b 28 a 23 b 23 b *** 1,05 Rabadilla % 14 a 12 ab 13 a 11 b 12 ab 13 a *** 0,82

a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05. * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01). ns = p > 0,05.

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Tabla 6. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre la fuerza de corte de pechuga y pierna, prdida de agua por goteo, prdida de agua por coccin de pechuga y pierna de pollos de engorde machos
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas 0,629 0,110 0,998 0,814 Mxima fuerza de corte pechuga (kg F) 3,07 ab 3,17 ab 3,09 ab 2,55 bc 2,29 c 3,72 a *** 1,15 Mxima fuerza de corte pernil (kg F) 1,77 1,63 1,86 1,7 1,97 1,7 ns 0,57 Prdida de agua por goteo (%) 10,85 12,97 14,64 11,14 16,01 10,61 ns 2,79 Probabilidad 0,233 0,425 0,419 0,663 0,986 0,043 Prdida de agua por coccin pechuga (%) 23,22 21,59 18,59 20,61 24,67 18,77 ns 4,68 Prdida de agua por coccin pierna (%) 32,54 34,08 41,72 33,08 30,77 23,48 ns 7,38

a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05. * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01). ns = p > 0,05.

comerciales (Levapan y AB vista), comparados con los que recibieron levaduras nativas (1, 2 y 3), en la fraccin de la pierna mayor presentaron prdida de agua por coccin (diferencia estimada de 8,79%) (p < 0,043) (tabla 6). Parmetros hematolgicos y cardiacos No se presentaron diferencias significativas en las variables evaluadas: hematocrito, protena plasmtica total, recuento de glbulos rojos y glbulos blancos (p > 0,05). En la tabla 7 se muestra el efecto de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos a los 36 das de edad, sobre el recuento de heterfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos, basfilos y la relacin heterfilos/ linfocitos. Se presentaron diferencias significativas en el

recuento de heterfilos, cantidad relativa de linfocitos y en la relacin heterfilos/linfocitos (p < 0,05). Las levaduras nativas 2 y 3 fueron diferentes del control en el nmero de clulas por l (p < 0,05), mientras que las levaduras comerciales y la levadura nativa 1 no fueron diferentes del control (p > 0,05). Los pollos que recibieron levaduras comerciales (Levapan y AB vista), comparados con los que recibieron levaduras nativas (1, 2 y 3), presentaron mayor nmero de heterfilos/l, con una diferencia estimada de 9,6 (cel/l) (p < 0,0316) (tabla 7). En relacin con la cantidad relativa de linfocitos, los valores promedio ms altos se presentaron en los grupos que recibieron levadura nativa 2 y levadura nativa 3 (67%

Tabla 7. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre parmetros hematolgicos y la relacin heterfilos/linfocitos en pollos de engorde machos a los 36 das de edad
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas 0,4282 0,0316 0,9139 0,3365 0,8841 0,2972 Heterfilos (cel/ul) 40,43 40,75 43,25 42,74 28,18 26,30 ** 11,76 linfocitos % 57,60 ab 57,46 ab 54,10 ab 41,93 b 67,24 a 69,95 a *** 11,09 Relacin H/l 0,73 ab 0,72 ab 0,84 ab 1,07 a 0,47 b 0,41 b *** 0,32 Probabilidad 0,4275 0,8685 0,2343 0,0583 0,2205 0,4089 Monocitos % 0 1 1 0 1 1 ns 1,49 eosinfilos % 1 0 0 1 0 1 ns 1,03 Basfilos % 0 1 3 2 7 1 ns 3,01

a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05. * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01). ns = p > 0,05.

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y 70%, respectivamente) y el promedio ms bajo fue para el grupo que recibi levadura nativa 1 (42%). Sin embargo, este efecto es contrario para la relacin heterfilos/linfocitos, cuyos valores promedio ms bajos se presentaron en los grupos que recibieron levadura nativa 2 y levadura nativa 3 (0,47 y 0,41 respectivamente), mientras que el valor promedio ms alto fue para el grupo de levadura nativa 1 (1,07) (p < 0,05) (tabla 7). Hipertrofia ventricular El efecto de la inclusin de levaduras en dietas de pollos de engorde machos a los 36 das de edad, sobre la relacin ventrculo derecho/ventrculo total VD/VT, se muestra en la tabla 8. Se presentaron diferencias significativas entre los pollos que recibieron la dieta control y los que recibieron Levaduras, con una diferencia estimada de 0,06, a favor del tratamiento control (p < 0,05). Los valores promedio ms altos fueron observados en los grupos que recibieron levadura nativa 1 y Levadura nativa 3 (0,37 y 0,38 respectivamente) (p < 0,05) (tabla 8). La relacin VD/VT fue mayor para las levaduras comparadas con el control (p < 0,0377); las levaduras nativas presentaron mayor relacin en comparacin con las levaduras comerciales (p < 0,0517). Anlisis econmico de presupuestos parciales El anlisis econmico comparativo para valorar la inclusin de levaduras en un sistema de alimentacin de pollos de engorde de 36 das tuvo en consideracin la infraestructura de costos e ingresos estipulados comercialmente, en el rea de influencia del proyecto. La inferencia eco-

nmica en este escenario comercial muestra que el costo de pollo en pie, el ingreso neto parcial por pollo en pie (INPP), el ingreso parcial por pollo en canal (IPPC) y el ingreso parcial por pollo fraccionado (IPPF) presentaron diferencias significativas, por efecto de la inclusin de levaduras (p < 0,01) (Tabla 9). El costo del kilogramo de pollo en pie del grupo control fue $1.550 ms que el costo

Tabla 8. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre la relacin en pollos de engorde machos a los 36 das de edad
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Relacin ventrculo derecho/ ventrculo total 0,28 b 0,27 b 0,36 ab 0,37 a 0,31 ab 0,38 a *** 0,08 Probabilidad 0,0377 0,0517 Diferencia estimada -0,06 -0,04

a, b, c, d: promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05 * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01).

Tabla 9. Efecto de la inclusin de levaduras comerciales y nativas sobre los costos e ingresos parciales en pollos de engorde machos a los 36 das de edad
tratamiento Control Levapan AB vista Levadura nativa 1 Levadura nativa 2 Levadura nativa 3 Significancia Error estndar de la media contrastes Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas Parmetro Control vs. levaduras Comerciales vs. nativas 1550,05 208,68 -561,72 -91,17 0,0001 0,352 0,0001 0,355 Diferencia estimada -726,82 -253,30 -601,66 -182,62 costo kg pollo en pie $ 10186 a 8804 b 8718 b 8599 b 8610 b 8446 b *** 478,73 INPP1/ $ 2096 b 2558 ab 2647 a 2680 a 2659 a 2742 a *** 210,79 Probabilidad 0,0005 0,091 0,0004 0,133 IPPc2/ $ 3967 b 4673 a 4411 ab 4839 a 4733 a 4814 a *** 310,73 IPPF3/ $ 3046 b 3695 a 3381 ab 3729 a 3712 a 3721 a *** 254,75

1/: Ingreso neto parcial por pollo en pie (INPP). 2/: Ingreso parcial por pollo en canal (IPPC). 3/: Ingreso parcial por pollo fraccionado (IPPF). a, b, c, d: en una misma columna, promedios con distinta letra son diferentes estadsticamente p < 0,05. * = efecto poco significativo (p < 0,1), ** = efecto significativo (p < 0,05), *** efecto muy significativo (p < 0,01).

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del kilogramo de pollo con levaduras (p < 0,01). Al calcular los INPP, IPPC e IPPF se encontr que fueron menores en los pollos control en relacin con los de los pollos con inclusin de levaduras (p < 0,01), con diferencias estimadas de $562 para el INPP, $727 para el IPPC y $602 para el IPPF a favor de la inclusin de levaduras. Los mejores balances promedios econmicos fueron estimados para la levadura nativa 1.
DISCUSIN

mentales. La levadura nativa 1 mostr los valores ms altos en la relacin de heterfilos/linfocitos (H/L), lo cual est asociado a cuadros agudos de estrs. Para Davis y colaboradores (2000) los incrementos en la relacin H/L se asocian a cuadros agudos de estrs, con estresores que operan de manera intensa y durante breves lapsos de tiempo. En este estudio, los valores promedios de la relacin H/L variaron entre 0,41 y 1,07, lo que sugiere que los pollos se encontraban sometidos a importantes desafos ambientales en las condiciones experimentales. La terneza es la suma de la fuerza mecnica del tejido muscular esqueltico despus del rgor mortis ms el debilitamiento de la estructura durante el almacenamiento post mrtem (Takabashi, 1996). Para el consumidor es la caracterstica ms importante de la carne y es de gran influencia en sus preferencias. La terneza de la carne se estima midiendo la fuerza de corte; cuanto menor sea este valor mayor es la terneza de la carne. En este estudio, se encontraron diferencias significativas en los valores de la terneza de pechuga cocinada, de los pollos que recibieron la levadura nativa 2 comparados con los que recibieron la nativa 3, con valores promedio de 2,29 y 3,72 kg fuerza, respectivamente. Zhang y colaboradores (2005) compararon un grupo de pollos que recibi levadura completa frente al control, y encontraron que la fuerza de corte de pernil crudo disminuy en el primero; tanto la inclusin de extracto de levadura como la de pared celular (MOS) tuvieron efecto intermedio. La fuerza de corte en pechugas y perniles cocinados disminuy en los tratamientos de levadura completa y de pared celular en comparacin con el grupo control. Los parmetros de crecimiento y comportamiento productivo de los pollos de engorde en ese estudio y en otros reportados muestran que el enriquecimiento de las dietas con levaduras mejoran la calidad de la carne de pollo, mediante un incremento en la terneza (Bonomi et al., 1978 y capacidad de retencin de agua (Lee et al., 2002). Los efectos de la inclusin de levaduras respecto al rendimiento de la canal y de sus fracciones en pollos de engorde han sido poco documentados. Karaoglu y Durdag (2005) en su estudio no encontraron efectos de la suplementacin de levadura (Saccharomyces cerevisiae) sobre la calidad de la canal; en el presente estudio se encontr un incremento en el rendimiento de la canal por la inclusin de levaduras comparadas con el control (con diferencia estimada de 158 g). Estas respuestas corresponden a pollos machos a los 36 das de edad. En cuanto al porcentaje de pernil, algunos investigadores observaron que aument con la suplementacin de levaduras (0,3%) (Miazzo et al., 2005; Songsak et al., 2008); mientras que Loddi y colaboradores (2000) no observaron diferencias.

La levadura Saccharomyces cerevisiae se usa en dietas para pollos de engorde como un aditivo natural para proveer una protena de alto valor biolgico, sin un componente txico, alergnico o carcinognico (Stone, 1998). Estas caractersticas tambin mejoran la digestibilidad y absorcin de nutrientes y ayudan al control de patgenos entricos. En conjunto, estas caractersticas naturales producen mejor comportamiento productivo de los pollos de engorde (Cruickshank, 2002). Gran parte de la investigacin realizada durante los ltimos 15 aos ha sido diseada para evaluar diferentes niveles de inclusin de levadura de cerveza en diferentes edades de las aves. Miazzo y colaboradores (1994, 1995) encontraron que aadir niveles de 0,3% - 0,5% de levadura a dietas de iniciacin y finalizacin redunda en mejor conversin alimenticia y peso corporal final de los pollos de engorde; posteriormente confirmaron (1997, 1998) mejor expresin productiva del pollo de engorde cuando la levadura se incluye en niveles de 0,6% - 0,9%. En la presente investigacin, los pollos que recibieron levaduras durante un ciclo completo de produccin (0-35 das) presentaron, en comparacin con el grupo control, mayor ganancia de peso corporal, mejor eficiencia y mejor conversin alimenticia (con diferencias estimadas de 137 g aproximadamente, 4% y 0,11, respectivamente). El peso de la canal y de la rabadilla fue superior (con diferencias estimadas de 158 g y 1,5%, respectivamente) cuando se aaden levaduras. Estos valores fueron soportados por una relacin ventrculo derecho/ventrculo total (VD/ VT) mayor, (con una diferencia estimada de 0,06), posiblemente por una alta exigencia de oxgeno para que los pollos alcanzaran su mximo potencial de crecimiento en condiciones de altitud. Los pollos que recibieron levaduras nativas, comparados con los que recibieron levaduras comerciales, presentaron mayor ganancia de peso corporal y peso de la canal y mayor valor para la relacin VD/VT. Este aspecto indica una reaccin de adaptacin a las condiciones ambientales, asociadas a hipoxia, similar a lo encontrado por Moreno y Hernndez (1985) en las mismas condiciones experiRevista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 102-114

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En general, varias investigaciones revelan los efectos benficos de la inclusin de levaduras en alimentos para pollos de engorde sobre el desempeo productivo, donde se mejora la ganancia de peso corporal y la conversin alimenticia (Onifade et al., 1998; Miazzo et al., 2005; Zhang et al., 2005; Owens et al., 2007 y Gao et al., 2008). Estos hallazgos se corroboran en el presente estudio. Se argumenta adems que la inclusin de levaduras influye en el crecimiento de pollos de engorde debido a la modulacin de la salud intestinal; sin embargo, estos efectos beneficiosos de las levaduras no son consistentes con otras investigaciones. Al respecto, Gao y colaboradores (2008) sugieren que las diferencias en estas respuestas pueden estar relacionadas con las caractersticas particulares de los productos de levadura utilizados, ya que la presentacin de stas tiene varias posibilidades como levaduras secas, levaduras vivas, fermentados de levaduras, lo cual dificulta en este escenario las comparaciones entre los diferentes estudios. Desde el punto de vista econmico, los ingresos parciales fueron mayores en los pollos de engorde que recibieron levaduras. Los anteriores resultados reflejan la

importancia de la investigacin en esta rea y sugiere la posibilidad de futuros estudios a una escala mayor de las levaduras evaluadas, para ser utilizadas en la produccin de carne libre de residuos de antibiticos.
CONCLUSIONES

La ganancia de peso corporal de los pollos de engorde se mejor con la inclusin de 0,5% de levaduras en un sistema de alimentacin por fases. En general, la inclusin de levaduras nativas en las dietas de pollos de engorde tiene efectos beneficiosos en los parmetros zootcnicos, a pesar de las condiciones ambientales que incidieron negativamente en la respuesta al sndrome asctico en los pollos suplementados. Los efectos cualitativos y cuantitativos de la suplementacin de levaduras nativas y comerciales y su papel como aditivo funcional encontrados en este estudio deben ser ampliados en un ciclo completo de produccin, con sus valores agregados en el mercado de carne de pollo.

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Revista Corpoica
Objetivos y alcance Poltica editorial

OBJETIVOS Y ALCANCE

Ciencia y Tecnologa Agropecuaria

Instrucciones a los autores

La Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria es una publicacin peridica de carcter cientfico al servicio del sector agropecuario colombiano y del Sistema Nacional de Ciencia y Tecnologa. Es publicada semestralmente por la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria Corpoica y tiene circulacin nacional e internacional. Est dirigida a investigadores, profesionales, profesores y estudiantes de las ciencias agrcolas y pecuarias, extensionistas y a quienes trabajan para beneficio de la productividad del campo. La revista tiene por objeto divulgar artculos inditos derivados de la investigacin y experimentacin en las diferentes reas de las ciencias agrcolas, pecuarias y afines. Publica artculos cientficos (investigaciones originales), artculos de revisin que aporten soluciones y nuevas perspectivas al agro colombiano, y ensayos (artculos de reflexin) que estimulen el debate acerca de aspectos cientficos relevantes, desarrollados con una ptica crtica, proactiva y prospectiva. Lo anterior enmarcado en altos estndares de rigor cientfico y calidad editorial. Las opiniones y afirmaciones publicadas en la Revista Corpoica reflejan exclusivamente los puntos de vista de sus autores y no comprometen necesariamente las polticas de la Corporacin.
POLTICA EDITORIAL

Todos los artculos enviados son revisados y analizados por tres evaluadores (peer review): uno interno y dos externos a la Corporacin, de alto nivel acadmico seleccionados por el Comit Editorial, la editora y el director de la revista. Si los artculos son aceptados para publicacin, los autores debern corregirlos segn las observaciones de los pares de evaluacin, en el perodo de tiempo otorgado para ello; el material no se publica si dos evaluadores consideran que no tiene el nivel y la calidad requeridos. La presentacin de los artculos deber ajustarse a las normas establecidas por el Comit Editorial en la seccin Instrucciones a los autores (ver al final de la revista o bajarlas de: http://www.corpoica. org.co/SitioWeb/Revistas/Revistas.asp). Los materiales de texto e ilustracin se deben enviar impresos y en medio magntico al director de la revista. Aquellos artculos que no se ajusten a estas pautas sern devueltos antes de ser considerados para evaluacin. Los artculos puestos a consideracin del Comit Editorial de la Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria deben ser inditos; en consecuencia, los autores se abstendrn de presentar aquellos escritos que hayan sido publicados en otras revistas o publicaciones tcnico-cientficas en cualquier idioma (excepto si forma parte de una tesis de grado o un abstract de un congreso). El Comit
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Instrucciones a los autores

Editorial se reserva el derecho de rechazar o aceptar los materiales enviados para su publicacin. La presentacin de artculos a la revista implica: 1) que su publicacin ha sido aprobada por todos los coautores (si los hay) y por las autoridades responsables de la institucin donde se llev a cabo la investigacin; 2) que los autores transfieren los derechos de publicacin a Corpoica y su revista cientfica en sus versiones impresa y en lnea. La Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria acepta artculos originales de los siguientes tipos: Artculo cientfico: en un artculo cientfico original se busca comunicar los resultados de investigaciones, ideas y debates de manera clara, concisa y fidedigna. Consta de cuatro partes esenciales: introduccin, metodologa (materiales y mtodos), resultados y discusin, y conclusiones. Ensayo cientfico: emana de las reflexiones y meditaciones originales del autor, y por tanto presenta su visin y juicio sobre un tema cientfico, en su inters de explorar ms a fondo la realidad. Artculo de revisin: presenta un panorama amplio de un campo especfico de la ciencia desde una perspectiva analtica, interpretativa y crtica del autor y recurriendo a fuentes originales. Se caracteriza por presentar un cuidadoso soporte bibliogrfico no menor de 50 referencias.
INSTRUCCIONES A LOS AUTORES

y mapas, ya sean originales o escaneadas, deben imprimirse en hojas independientes, adems del formato digital de compresin JPG (o JPEG), preferiblemente con una resolucin de 600 x 600 dpi (mnimo 300 dpi); se prefiere que las fotografas sean enviadas como diapositivas. Remisin de artculos La remisin de los artculos debe incluir: el documento impreso y en medio magntico (CD-R), la carta de presentacin del artculo, los formatos de informacin de los autores y la declaracin de indito (bajarla de http://www. corpoica.org.co/SitioWeb/Revistas/Revistas.asp). Dirigir a: Dr. Jairo Osorio Subdirector de Investigacin CORPOICA Centro de Investigacin Tibaitat Km 14 va Mosquera O al: Apartado areo 240142, Las Palmas Bogot, Colombia Telfono: ++[571] 422 73 00 ext: 1230, 1252, 1096 Fax: ++[571] 422 73 00 ext: 1069, 1248 Ttulo y autores El ttulo del artculo debe ser en redondas, negrilla, de 16 palabras mximo sin subttulo, y sin abreviaturas; si incluye nombres cientficos deben seguir la norma para stos. Debe traducirse al ingls. Debajo de ste se escribe nombre(s) y apellido(s) de los autores, sin ttulos acadmicos ni cargos laborales, en una lnea horizontal, en orden de contribucin en la investigacin y/o preparacin del artculo, as: en los primeros lugares quienes hayan redactado el artculo, seguidos opcionalmente de quienes hayan contribuido de manera importante a mejorar su calidad mediante una lectura crtica y aportes de texto, bibliografa o ilustracin; finalmente quienes se desempeen como lderes del proyecto y estn a cargo del equipo de investigacin. En la parte inferior de la primera pgina se escriben el grado acadmico, cargo laboral y direccin de correo electrnico de los autores, el nombre de la entidad a la cual prestan sus servicios o del patrocinador para la realizacin del trabajo y la ciudad. Resumen y palabras clave El resumen debe describir brevemente el problema, su justificacin, los mtodos utilizados y los resultados ms relevantes; no debe exceder de 250 palabras escritas en un nico prrafo. Las palabras clave son trminos para indexacin; deben identificar el contenido del artculo y preferiblemente ser
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El documento y sus ilustraciones Los idiomas oficiales de la revista son espaol, ingls y portugus. En general, la redaccin de los textos debe cumplir las normas gramaticales del idioma en que se escribe. Para esta revista se presentan, ms adelante, algunas normas generales de la gramtica del espaol bajo el ttulo Normas de estilo. El artculo debe presentarse en el procesador de palabra Word; no exceder de 25 pginas tamao carta, numeradas consecutivamente, con mrgenes de 2,5 cm por cada lado, escritas en espacio interlineal de 1,5 cm, en letra o fuente Arial con tamao de 12 puntos en redondas. Las lneas de texto irn numeradas. Las tablas y las figuras (grficos, dibujos, esquemas, diagramas de flujo, diagramas de frecuencia -barras y tortas-) llevan numeracin consecutiva (Tabla 1, etc., Figura 1, etc.) y deben ser en blanco y negro -excepcionalmente se incluir color en caso de que sea estrictamente necesario. Las tablas, adems, deben suministrarse en su original de Excel. Figuras como fotografas

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diferentes de las que constan en el ttulo; deben ser cinco aproximadamente. Para seleccionar sus palabras clave, se sugiere consultar y usar los descriptores del tesauro agrcola multilinge AGROVOC, creado por la FAO; el cual abarca terminologa de la agricultura, silvicultura, pesca, medio ambiente y temas afines (http://www.fao.org/aims/ ag_intro.htm). El resumen y las palabras clave se escriben en el idioma del artculo y en ingls (abstract y keywords); si el idioma original es el portugus se traducirn adems al espaol y deben cumplir los mismos parmetros -250 y 5 palabras, respectivamente- (use en el men Herramientas la opcin contar palabras). Introduccin Debe contener el problema, su definicin y la revisin de los trabajos previos relacionados con l; adems, los objetivos y la justificacin de la investigacin. Materiales y mtodos En este apartado se deben describir de forma clara, concisa y secuencial, los materiales (vegetales, animales, implementos agrcolas o de laboratorio) utilizados en desarrollo del trabajo, adems de los procedimientos o protocolos seguidos y el diseo escogido para el tratamiento estadstico de los datos. Resultados y discusin Se deben discutir los resultados sobresalientes, contrastndolos con la literatura ms actual sobre el tema. Los resultados deben presentarse de manera lgica, objetiva y secuencial mediante textos, tablas y figuras; estos dos ltimos apoyos deben citarse siempre en el texto, y su lectura e interpretacin deben ser fciles y autnomas. Las tablas se deben elaborar con pocas columnas y renglones. Las grficas sern bidimensionales y a una sola tinta con porcentajes de negro para las variaciones de las columnas; las lneas de las curvas deben ser de color negro, punteadas o continuas usando las siguientes convenciones:

Agradecimientos Si se considera necesario, se agradecen contribuciones importantes en cuanto a la concepcin, financiacin o realizacin de la investigacin: financiadores, especialistas, firmas comerciales, entidades oficiales o privadas, asociaciones de profesionales y operarios de campo y laboratorio. Referencias bibliogrficas Para la presentacin de las referencias bibliogrficas que sustentan las afirmaciones dentro del texto se utiliza el sistema autor(es), ao. Las referencias bibliogrficas completas van al final del artculo y se rigen por las normas bibliogrficas del Council of Science Editors (CSE), las ms usadas internacionalmente en biologa, qumica y campos afines. Se lista en orden alfabtico de autores, en letras redondas. La norma general es: apellido, iniciales del nombre (sin puntos y cada autor se separa con comas). Ao. Ttulo. Edicin, Ciudad, Editorial (slo el nombre propio de sta), pginas consultadas o totales segn el caso. Cuando se citan varias publicaciones del mismo(s) autor(es) se listan en orden cronolgico de la ms antigua a la ms reciente. Si la publicacin citada tiene ms de tres autores, se menciona el apellido del primer autor acompaado de la expresin latina et al. (y otros), en cursivas (Garca et al., 2003). Libros: autor(es). Ao. Ttulo del libro. Edicin, Ciudad, Editorial, pginas. Ejemplo: Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P. 1990. The pharmacological basis of therapeutics. 8th ed. New York, Pergamon, 1811 p. Captulos de libros: autor(es), ao. Ttulo del captulo. En: apellidos y nombres de los compiladores o editores (eds.), Ttulo del libro, edicin, Ciudad, Editorial, pginas del captulo (pp.). Ejemplo: Carpio L. 1996. Materiales didcticos. En: Garca A. Educacin sistemtica. Madrid, Narcea, p. 229-250. Revistas: autor(es), ao. Ttulo del artculo, Nombre de la revista, volumen (nmero): pginas consultadas (unidas por guin). Ejemplo: Omer A, Pascual U, Russell N. 2007. Biodiversity Conservation and Productivity in Intensive Agricultural Systems. Journal of Agricultural Economics 58(2):308-329. Citas de internet: autor(es), ao. Ttulo del artculo. En: nombre de la publicacin electrnica (si aplica), sitio de internet, portal o pgina y su URL, fecha de consulta. Ejemplo: Mahmoud, Y. 1996. Siembra de olivos en el desierto palestino. En: Agricultura Tropical, http://agrotropical.edunet.es; consulta: noviembre 2005.

Conclusiones En este apartado se relacionan los hallazgos ms concluyentes de la investigacin, es decir, aquellos que constituyan un aporte significativo para el avance del campo temtico explorado, adems de un direccionamiento sobre futuras investigaciones.
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Instrucciones a los autores


NORMAS DE ESTILO

Se debe redactar en voz activa (Se evaluaron dos metodologas, y no: dos metodologas fueron evaluadas); en impersonal, es decir, tercera persona del singular (Se encontr, y no: encontr o encontramos). En cuanto a los tiempos verbales, el uso comn es el pasado para la introduccin, procedimientos y resultados; el presente para la discusin. Se debe evitar el gerundio, si no se domina al mximo su uso. Recurra a esta forma verbal slo para indicar dos acciones simultneas; en los dems casos, redacte diferente la frase. (Remplazar: un protocolo fue estandarizado, minimizando el efecto negativo..., con: se estandariz un protocolo, lo cual minimiz el efecto negativo...) Los nombres cientficos de vegetales o animales se escriben igual en todos los idiomas: la familia se escribe en redondas con mayscula inicial; el gnero en cursiva y mayscula inicial, y la especie en cursiva y minsculas, as: Familia (Solanaceae), Gnero especie (Solanum tuberosum, la primera vez, las siguientes veces puede ser S. tuberosum). El texto se escribe en redondas (en Word se llama: regular). Las cursiva o itlicas se usan para los nombres cientficos y palabras en idioma extranjero. El significado de las siglas y abreviaturas debe citarse por extenso cuando se mencionan por primera vez en el texto. Las siglas no tienen forma plural; ste se indica en las palabras que la acompaan: las ONG, dos elisa.

Los ttulos y los nombres de figuras y tablas no llevan punto final. Los smbolos no llevan punto, plural ni mayscula: 1 kg, 25 kg, 1 m, 30 m, etc. Entre el valor numrico y el smbolo se deja un espacio: 35 g (no 35g), p > 12 (no p>12); excepto para los signos: %, +, - (estos dos ltimos cuando indican positivo y negativo). Ejemplos: 99%, +45, -37. En una serie de medidas, el smbolo va al final: hileras a 3, 6 y 9 m (excepto para el signo de porcentaje, que se escribe siempre 14%, 16% y 18%). La barra oblicua (/) es un signo lingstico que en alguno de sus usos significa por: tres flores/planta, 4 tabletas/da, 2 L/matera, 10 frutos/rama. Uno de sus usos no lingsticos es expresar los cocientes de magnitudes y unidades de medida: 80 km/h, 10 m3/s, 10C/h. Uno de los usos no lingsticos del punto () es indicar la multiplicacin de dos cantidades, caso en que se coloca separado de stas y a media altura: 6 3 = 18; 2 (x + y) = 30. La coma (,) se usa para separar decimales. Las unidades que se basan en nombres se usan en minsculas: un siemens (con algunas excepciones como cuando el smbolo se deriva de un nombre propio: C, grados Celsius). Las instrucciones a los autores pueden consultarse en: http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/Revistas/ Revistas.asp.

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 115-118

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2008) 9(2), 119-122

Unidades de medida
En la Revista Corpoica se usa el sistema de unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI), tambin llamado Sistema Internacional de Medidas, usado internacionalmente y basado en el sistema mtrico decimal. Sin embargo, debido a las particularidades de las ciencias agrcolas y pecuarias, debern usarse algunas unidades especficas que no pertenecen al SI (por ejemplo, la unidad de superficie hectrea) (ver listado de abreviaturas y smbolos). A continuacin se presentan algunas abreviaturas, siglas y unidades de medida.
S I G L A S , A B R E V I AT U R A S Y S M B O L O S

Trmino o locucin Asterisco Atmsfera controlada Atmsfera modificada Ji cuadrado Coeficiente de correlacin lineal Coeficiente de determinacin Coeficiente de variacin Conductancia elctrica Conductividad elctrica (su unidad es el siemens) Cromatografa en capa fina Cromatografa gaslquido Cromatografa lquida de alta eficiencia Cruzado con Cultivar(es) Dao por el fro (chilling injury) Desviacin estndar de una muestra Diferencia honestamente significativa Diferencia mnima significativa ADN polimrfico amplificado al azar (Randomly amplified polymorphic DNA) Error estndar (standard error) Especie (singular y plural) Especies cruzadas (hbrido interespecfico) Flujo fotosinttico de fotones Fotosntesis neta Generaciones filiales Generaciones parentales Grados de libertad Gravedad (en centrifugacin) Humedad relativa ndice de rea foliar Infrarrojo Ingrediente activo Logaritmo comn (base 10) Logaritmo natural

Abreviatura o smbolo * AC AM 2 r R 2 , r2 Cv G CE ( sigma) CCF CGL CLAE o HPLC x (minsculas) cv., cvs. CI DE DHS DMS RAPD se sp., spp. (redondas) FFF Fn P1, P2 gl G (cursiva) HR IAF IR i.a. log ln F1, F2

2009 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria

120

Unidades de medida

Trmino o locucin Magnificacin, poder de Metros sobre el nivel del mar Microscopia electrnica de barrido Microscopia electrnica de transmisin Molaridad (o concentracin molar) No significativo(a) Nmero Nmero de observaciones en una muestra Nmero de observaciones en una poblacin Pares de bases Polimorfismos de longitud de fragmentos por restriccin (Restriction Fragment Length Polymorphism) Por (dimensin, interaccin) Potencial osmtico Probabilidad Promedio de una muestra Prueba enzimtica inmunoabsorbente Prueba t student Radiacin fotosintticamente activa Repeticiones de secuencia simple Subespecie Ultravioleta Unidades formadoras de colonias Varianza Volumen/volumen total (razn de una mezcla)

Abreviatura o smbolo msnm MEB MET M ns no. n N pb PLFR (RFLP) p S

X, Y elisa (minsculas) t RFA RSS ssp. (redondas) UV ufc V v/v

U N I D A D E S D E L S I S T E M A I N T E R N A C I O N A L D E M E D I D A S ( B S I C A S y D E R I VA D A S )

Unidad Becquerelio Brix Centmetro Centmetro cuadrado Centmetro cbico Curie Dalton Da Decisiemens Decmetro Desintegracin por minuto Eigen voltio Einstein Grado (angular)

Abreviatura/smbolo Bq Brix cm cm2 cm3 Ci Da d dS dm dpm eV E

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 119-122

Unidades de medida 121

Unidad Grado celsius Gramos por centmetro cbico Hectrea Hertz Joule Kelvin Kilodalton Kilogramo Kilolux Kilmetro Kilovoltio Lux Megagramo Metro Metro cuadrado Metro cbico Tonelada mtrica Microequivalente Microgramo Microlitro Micrometro (antes, micrn) Micromol Miliequivalente Miligramo Mililitro Milmetro Milimol Milivoltio Mol Nanolitro Manmetro Irradiancia espectral Nanosegundo Newton o neutonio Solucin normal Pascal Rotaciones por minuto Segundo (tiempo) Tonelada (mtrica) Voltio Vatio

Abreviatura/smbolo C g/cm3 ha Hz J K kDa kg klx km Kv lx Mg m m2 m3 t eq g L m mol (m) meq mg mL mm mmol (mM) mV mol (M) nL nm nm-1 ns N n Pa rpm s t V W

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 119-122

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Unidades de medida
U N I DA D E S N O P E RT E N E C I E N T E S A L

SI

D E U S O A C E P TA D O C O N S T E

Magnitud Tiempo

Nombre de la unidad minuto hora da grado

Smbolo de la unidad min h d ' 1' '' 1'' ha L, l t bar (1 bar = 0,1 MPa = 100 kPa = 105 Pa) mmHg

ngulo plano rea Volumen Masa Presin Presin Longitud

minuto segundo hectrea litro tonelada bar milmetro de mercurio ngstrm

ALGUNOS PREFIJOS COMUNES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE MEDIDAS

102 10 10 10 10 10 10 10
3 6

hecto kilo mega deci centi mili micro nano pico

h k M d c m n p

101
2 3 6 9 12

Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2009) 10(1), 119-122


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