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TCNICAS IMUNOLGICAS E ENSAIOS HORMONAIS

Professora: Valria Cristina Ribeiro Dantas

Definio e Caractersticas dos Testes Imunolgicos


So testes que dependem da ligao de antgenos, com anticorpos especficos. A Interao Ag-Ac um tipo especial de reao qumica e, como tal, sujeita a vrios tipos de foras.

Reconhecimento do Antgeno
Superfcie da Clula Em Soluo

CARACTERSTICAS
Especificidade: As clulas do sistema imune competente sintetizam o Ac sob influncia das caractersticas estruturais do Ag; Afinidade: a capacidade de ligao do Ac com o Ag que estimula a sua sntese; Diversidade: Acs especficos sintetizados em resposta a um nico determinante antignico so diferentes entre si e tm propriedades diferentes, especialmente em relao a afinidade.

Avidez e Afinidade

Tcnicas Utilizadas - Mtodos


1. Reagentes no Marcados Reao de Precipitao Reao de Aglutinao 2. Reagentes Marcados RIA ELISA (Quimioluminescncia, Fluorimetria) Imunofluorescncia Western Blotting

Tcnicas Utilizadas - Mtodos


1.Aplicaes Clnicas:
Finalidades de Pesquisa; Diagnstico; Inquritos Epidemiolgicos

TCNICAS IMUNOLGICAS
(REAES DE PRECIPITAO)

REAES DE PRECIPITAO
Interao entre Ac e Ag solvel Anticorpo precisa ser bivalente Antgeno precisa ser bi ou polivalente A reao pode ser afetada pelo n de stios de ligao que cada Ac possui para seu Ag VALNCIA

PRECIPITADO

REAO DE PRECIPITAO
Permite quantificao de precipitados formados pela reao antgeno-anticorpo; Vrios fatores fsico-qumicos e imunolgicos interferem na quantidade de precipitado formado, mas as principais so as concentraes relativas de antgeno e anticorpo; uma reao reversvel que pode se dissolver quando h excesso de um dos componentes; A precipitao mxima ocorre quando as quantidades de antgeno e anticorpo so equivalentes e diminuem quando h excesso de um ou de outro

REAO DE PRECIPITAO
TNICAS BASEADAS NAS REAES DE PRECIPITAO

IMUNODIFUSO (Imunodifuso simples linear, simples radial, dupla linear e dupla radial); IMUNOELETROFORESE IMUNOFIXAO ELETROIMUNODIFUSO NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA (Automao)*

REAO DE PRECIPITAO
NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA - Determinaes de protenas de significado clnico
em qualquer fludo corporal; - Protenas mensurveis: 1 glicoprotena cida, -1-antiquimiotripsina, -2antiplasmina, fator reumatide, antitrombina III, apolipoprotenas A e B, IgA, IgG, IgM, c3, c4, albumina, pr-albumina, protena C reativa, transferrina, fibronectina, etc.

Vantagens
Precisa Rpida Fcil de Realizar Totalmente Automatizada

Desvantagens
o
o

Alto custo do antisoro Reaes inespecficas que podem surgir de soros lipmicos e hemolisados Necessidade de vrias diluies para antgenos muito concentrados.

TCNICAS IMUNOLGICAS
(REAES DE AGLUTINAO)

REAES DE AGLUTINAO
Ac + Ag multivalente particulado Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao (semiquantitativo) Pr-zona: excesso de Anticorpo Potencial Zeta : alguns Ag podem apresentar carga eltrica (repulso) Agregao visvel de partculas = Eritrcitos, bactrias, fungos e ltex

REAO DE AGLUTINAO
Ocorre quando se formam agregados grandes de partculas com mltiplos determinantes antignicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligam-se em dos stios antignicos iguais em partculas diferentes; Presena de IgG e IgM; A visualizao depende dos agregados formados. Pode ser realizada em placas, tubos ou em lminas.

REAO DE AGLUTINAO
FATORES QUE INTERFEREM NA FORMAO DE AGREGADOS Classe do Anticorpo envolvido; Eletrlitos; Macromolculas Hidroflicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; Temperatura

REAO DE AGLUTINAO
REAES FALSO-NEGATIVAS Quantidade muito pequenas de anticorpos; a partcula ficar com o anticorpo preso a sua superfcie (sensibilizada), no formando pontes e no aglutinando; Quantidade muito grandes de anticorpos (fenmeno pr-zona).

REAO DE AGLUTINAO
TIPOS DE PARTCULAS UTILIZADAS 1. Determinantes antignicos Naturais: Hemcias, bactrias e protozorios 2. Partculas inertes revestidas: Ltex, bentonita, gelatina, polipeptdeo 3. Clulas antignicamente no relacionadas As quais se adsorvem ou se fixam antgenos solveis, como hemcias e bactrias

REAO DE AGLUTINAO
TCNICAS MAIS UTILIZADAS

Aglutinao direta; Hemaglutinao direta; Hemaglutinao indireta; Aglutinao passiva; Inibio da Hemaglutinao; Hemaglutinao passiva; Inibio de aglutinao passiva.

negativo

positivo

TCNICAS IMUNOLGICAS
(REAES DE IMUFLUORESCNCIA)

REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA
Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antgeno. Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos Isotiocianato de Fluorescena* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)

REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA
MICROSCPIO DE IMUNOFLUORESCNCIA

Transiluminao Epiiluminao

PADRES DE IMUNOFLUORESCNCIA FAN-FATOR ANTINUCLEAR

TCNICAS IMUNOLGICAS
(REAES DE ENZIMAIMUNOENSAIO*, QUIMIOLUMINESCNCIA E FLUORIMETRIA)

TCNICAS IMUNOLGICAS
(Ensaios Hormonais)

Metodologia Utilizada
Fatores Interferentes
Reao cruzada: Ocorrem devido a especificidade e o uso de anticorpos policlonais. Anticorpos heterfilos: Resultados falso

positivos, em pacientes transplantados ou com cncer tratados com anticorpos monoclonais.

LIMA, J.G. (2001)

Metodologia Utilizada
Fatores Interferentes:
Elevado background: Leituras mais elevadas do que as reais por ligao inespecfica de constituintes do soro ao suporte slido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito hook: Resultados menores do que o esperado na quantificao de substncias que na realidade encontramse elevadas, bloqueando a ligao.

LIMA, J.G. (2001)

Ensaios Hormonais
Ensaios Hormonais: Baseiam-se em Imunoensaios: Competitivos e no competitivos 1. Competitivos: H competio entre o hormnio presente na amostra (ou o padro) e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos especficos variante: Radioimunoensaio.

Dosagens Hormonais
Ensaios Hormonais:
2. No Competitivos: So utilizados dois anticorpos, um ligado fase slida e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, que se ligam ao hormnio em estudo Mais preciso, reprodutvel, e possui nveis de sensibilidade analtica superiores. Desvantagem, precisam ter dois eptodos. Variante: Imunomtrico

LIMA, J.G. (2001)

Mtodos Hormonais
1. Radioimunoensaio (RIE) 2. Imunorradiomtrico (IRMA) 3. Enzimaimunoensaio (EIA) 4. Imunofluorimtrico (IFMA) 5. Quimioluminescencia (ICMA)

Marcador
Istopo radioativo

Mtodo
Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiomtrico (IRMA)

Enzimas Enzima (Fluorescentes) Enzima (Quimioluminescentes)

Enzimaimunoensaio (EIA) Imunofluorimtrico (IFMA) Quimioluminescncia (ICMA)

Mtodos Hormonais
Ensaios com Substncias Ligantes (3 estgios) 1. Construo de curva de calibrao: - (padres ou calibradores) 2. Interpolao dos Resultados: 3. Controle de Qualidade: - (erros sistemticos e ocasionais)

Tipos de Ensaio - Radioistopo


Utilizam um dos reagentes marcados, Ag ou Ac para quantificar o Ag ou Ac presente na amostra O termo Radioimunoensaio utilizado quando o componente marcado o antgeno/anticorpo E o termo Imunorradiomtrico quando o componente marcado o anticorpo O radioistopo mais utilizado o I125 (57,5 dias); Ensaio mais utilizado o Imunorradiomtrico

Tipos de ensaios- ELISA EnzymeLinked Immunosorbent Assay


Objetivos:
Detectar a presena de antgenos e anticorpos. Princpio Bsico: Pontos importantes que devem ser considerados: Propriedades da fase slida; Pureza do antgeno ou anticorpo; Diluio da amostra Mtodos utilizados para expressar os resultados do ELISA: Quantificao da concentrao da amostra em anlise ou relato dos valores das absorbncias(expresso do resultado em Unidades).

ENZIMAIMUNOENSAIO - EIA
So tcnicas que permitem medidas quantitativas diretas da interao antgeno-anticorpo por medida da atividade enzimtica sobre um substrato. Reagentes Utilizados: Suporte slido (poliacrilamida, poliestireno) Diluente de amostra (Tween 20, protenas) Conjugados Substratos cromognicos (OPD e TMB)

Tipos de ensaios- ELISA EnzymeLinked Immunosorbent Assay


Vantagens e Desvantagens:
Sensibilidade, especificidade e simplicidade da tcnica; Cuidados com interferentes, reaes cruzadas Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variveis analticas Adaptao a diferentes graus de automao Instabilidade dos reagentes Influncia em manipulaes e do equipamento

Tipos de ensaios Imunofluorimtricos


Fluorimetria Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes Utilizam aparelhos denominados de Fluormetros; As tcnicas diferem quanto ao suporte slido E tambm forma de ampliar o sinal; Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; Possui sensibilidade e especificidades elevadas; Bom mtodo para dosagens hormonais

Fluorescncia

Tipos de ensaios Quimioluminescentes


QUIMIOLUMINESCNCIA Reao entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instvel o qual aps estabilizao gera emisso de ftons de luz medida por FM, que tem a funo de transformar a luz emitida pelos ftons em impulsos eltricos(CPS). So reaes de oxidao luz no espectro visvel;

QUIMIOLUMINESCNCIA
Vantagens: - Maior sensibilidade, eficincia e simplicidade que os RIAs. Desvantagens: - Maior probabilidade de sofrer interferncia por mltiplos fatores que causam aumento inespecficos do background.

QUIMIOLUMINESCNCIA
TCNICAS UTILIZADAS PARA O ENSAIO:

- Pesquisa de marcadores tumorais; - Hormnios**; - HIV; - Hepatites; - Vitaminas; - IgE total e especfica, etc.

Tipos de ensaios - Quimioluminescentes


A sensibilidade de um mtodo enzimtico aumenta cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromognico por um luminescente; a emisso de luz produzida em algumas reaes qumicas envolvendo molculas que emitem luz, quando passam do estado de excitao para o basal eletrnico; So altamente sensveis; Mtodo de escolha para quantificao de substncias, como hormnios e marcadores tumorais.

QUIMIOLUMINESCNCIA