Está en la página 1de 13

TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN CÁNCER CURSO 2007/2008

Javier Sáez Castresana Unidad de Biología de Tumores Cerebrales-CIFA Facultad de Ciencias jscastresana@unav.es

Ayudantes Mónica Enguita Jana Balbuena Paula Schiapparelli

1

7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1. Aula 4 Los Castaños Clase teórica Clase teórica RFLP (digestión producto PCR y preparar gel de agarosa) PCR diferencial SSCP (preparar gel de acrilamida) SSCP (cargar gel de acrilamida) PCR diferencial (correr gel de agarosa) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (tratamiento con bisulfito) MARTES MIÉRCOLES JUEVES Examen Salón de Actos de Ciencias Clase teórico-práctica Clase teórico-práctica Clase teórico-práctica VIERNES Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.2.7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.2.2.7 MSP (PCR y preparar gel de Clase teórico-práctica agarosa) Si no se especifica ningún lugar. 2 .7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.2.2. Aula 4 Los Castaños Examen.7 Examen. la clase se imparte en el laboratorio de prácticas de Genética en la 4ª planta del edificio de Ciencias.2.ESQUEMA DE TRABAJO LUNES 9-10 10-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 RFLP (correr gel de agarosa) Preparar gel para PCR diferencial SSCP (tinción de plata) SSCP (tinción de plata) MSP (tratamiento con bisulfito) MSP (correr gel de agarosa) MSP (correr gel de agarosa) Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.2.2. Aula 4 Los Castaños Examen.7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.7 Biblioteca de ciencias Salas de trabajo 1.

dTTP 0. 3.1 mM .Mezclar con vórtex e incubar 2 horas a 15ºC. 4.2 ml (volumen final de reacción 50μl): . Para ello añadir a un tubo de 0.2 mM .Poner los tubos a 4ºC para que las enzimas no actúen.Buffer 10X .Ponerlo en una columna y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 3 .DNA .Poner en hielo. PROTOCOLO Marcaje del DNA por nick translation (CGH Nick Translation Kit.Mezcla de enzimas .Cargar 5μl del producto de reacción en un gel de agarosa al 1% en TAE.CGH Se realizará la técnica de CGH para determinar el perfil de ganancias y pérdidas de material genético de las líneas celulares de neuroblastoma IMR-32 y SK-N-MC. Correr el gel a 100V durante 40 min. 5.Añadir 5 volúmenes (225μl) de buffer PB y mezclar. Vysis) 1.Poner agua estéril a calentar a 65ºC. Purificación del DNA (QIAquick PCR Purification Kit.Agua estéril 5 μl 10 μl 5 μl 2.dUTP 0.5 μl (Spectrum Green para el DNA tumoral y 10 μl x μl hasta completar 50 μl Spectrum Red para el DNA normal) 2. 2. Qiagen) 1.Pasar todo el volumen de reacción restante a un tubo de 1. 7.dNTPs 0.Los fragmentos de DNA observados en el gel deben tener entre 250 y 2000 pb (si fuera necesario incubar un poco más de tiempo a 15ºC) 6.1 mM . Ruptura de las enzimas a 70ºC durante 10 min.Marcar por separado 500 ng de DNA normal (S-101) y 1 μg de DNA tumoral (IMR-32 o SK-N-MC). 3.5 ml.

80% y 100%) durante 3 min a temperatura ambiente en cada uno de ellos.Deshidratar las metafases introduciendo los portas en copling con etanol de gradación creciente (70%. 4.Mezclar los DNAs normal y tumoral marcados y purificados anteriormente.Precipitar 1 hora a -80ºC o toda la noche a -20ºC. Desnaturalización de las sondas (DNAs marcados) 1.5 volúmenes de etanol absoluto. incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugar a 13000 rpm 1 min.Descartar el sobrenadante.Desnaturalizar las metafases introduciendo los portas en un copling (35 ml de formamida desionizada. incubar 5 min a temperatura ambiente y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 9.2 y 2.Centrifugar a 13000 rpm 30 min a 4ºC.Añadir 7μl de buffer de hibridación (LSI/WCP hybridization buffer. 5 ml de 20X SSC y 10 ml de agua MiliQ todo a pH 7) a 80ºC durante exactamente 1 min 30 s. 8.Retirar bien el sobrenadante y dejar secar el DNA en oscuridad de 5 a 10 min. 6. 4 .Añadir 750μl de buffer PE y centrifugar a 13000 rpm 1 min. 10.Volver a añadir 50μl de agua estéril a 65ºC.Añadir 1/10 volúmenes de acetato sódico 3M pH 5. 3. 2.Poner en hielo. 7.Añadir 30μg de DNA humano CotI.5 ml.Descartar el sobrenadante y volver a centrifugar para eliminar bien los restos. Precipitación del DNA 1. 5. Resuspender bien. 7.Pasar la columna a un tubo limpio de 1. Vysis) y 3μl de agua estéril. 2. 5. Desnaturalización de las metafases (durante la incubación de la sonda a 37ºC) 1.Posteriormente incubar a 37ºC 30 min.Añadir 50μl de agua estéril a 65ºC. 6. 2.Incubar la mezcla de hibridación a 80ºC 10 min.4.

2 min a temperatura ambiente.Mezclar DAPI II con Antifade en proporción 1:1 y añadir 20μl de la mezcla por porta.Dejar secar en oscuridad a temperatura ambiente 10-15 min. 3. 0.Dejar secar el porta hasta que la sonda esté preparada.3% NP40 a 75ºC 2 min. 100%) preenfriado a -20ºC durante 3 min a -20ºC en cada uno de ellos introduciendo los coppling en el congelador.Cubrir con un cubre pequeño teniendo cuidado de no formar burbujas.Envolver en parafilm. 4. 2. Montaje de las preparaciones 1. 4. 5 . 3.Lavar en copling con PBD 1X.Visualizar los resultados. 2.1% NP40 5 min a temperatura ambiente en agitación. 4.Meter unos minutos en la nevera.Poner cubre grande y sellar con rubbert cement. 2.3.Inmediatamente deshidratar en etanol de gradación creciente (70%.Añadir la sonda sobre las metafases.Lavar en copling con 2X SSC. 0. Hibridación 1. Lavados 1. 3.4X SSC.Incubar bocabajo en una cámara húmeda en oscuridad en una estufa a 37ºC durante 72 horas. 80%.Lavar en copling con 0. 4.

Preparación de los reactivos. . . Medir el pH con tira o con pHmetro. Para cada muestra a modificar añadir 750 µl de esta solución a 1. .35 g de reactivo II.6 µl de NaOH 3M. MC-IXC e IMR-32 mediante MSP. PROTOCOLO TRATAMIENTO CON BISULFITO SÓDICO (CpGenomeTM DNA Modification Kit. .4 µl de agua estéril y 6. MC-IXC. SK-N-MC.ESTUDIO DE HIPERMETILACIÓN A NIVEL DE PROMOTOR Determinación del grado de hipermetilación a nivel del promotor del gen RASSF1A en las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-MC. Modificación con bisulfito Modificar las muestras: S-101 (sangre normal).Preparar una solución de NaOH 3M (preparar en el momento antes de usar) Disolver 1 g de NaOH en 8.0 con aproximadamente 20 µl de NaOH 3M por muestra.227 g de reactivo I y añadirles 0.Preparar una solución de 20 mM NaOH/90% EtOH (preparar en el momento antes de usar) Para preparar 1 ml de solución mezclar 900 µl de EtOH absoluto. PASO 2. Ajustar el pH a 5.3 ml de agua destilada autoclavada.Disolver el reactivo II Añadir 1 µl de ß-mercaptoethanol a 20 ml de agua desionizada. Chemicon) PASO 1. SIMA.Disolver el reactivo I (preparar en el momento antes de usar) Para cada muestra a modificar pesar 0. IMR-32 e IMD (DNA metilado “in vitro”) 6 . Este reactivo una vez preparado puede conservarse a temperatura ambiente protegido de la luz hasta un máximo de 6 semanas. SIMA. 93.571 ml de agua destilada estéril.

Centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm). 19. Incubar 10 min a 37ºC. 8. Eliminar TODO el sobrenadante con una micropipeta y dejar secar a temperatura ambiente entre 10-20 min. Descartar el sobrenadante. Añadir 1 ml de EtOH al 90% y dar un vortex para lavar el precipitado. 6. Centrifugar de nuevo y decantar el sobrenadante. 11. Incubar a temperatura ambiente durante 5-10 min. (Al añadir este volumen de agua si partimos de 1 µg de DNA la concentración final será de 40 ng/µl) 18. 3. Añadir 25 µl de agua estéril y dar un vortex para resuspender bien el precipitado. 5. Añadir 50 µl de 20 mM NaOH/90% EtOH. 17. Añadir 7 µl de NaOH 3M y mezclar. Añadir 550 µl de reactivo I y mezclar con vortex. Resuspender el reactivo III con vortex hasta que no quede ningún grumo. centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm) y descartar el sobrenadante. centrifugar la muestra a 13000 rpm 3 min. Añadir 5 µl de reactivo III. Repetir este paso un total de 3 veces. en tubos de 1. Añadir 750 µl de reactivo II y mezclar brevemente. Resuspender el precipitado dándole un vortex breve e incuba a temperature ambiente 5 min. Incubar las muestras 15min a 50-60ºC para eluir el DNA. 2.1. 9. 13. Una vez descartado el sobrenadante del tercer lavado centrifugar 2 min a 13000 rpm y eliminar los restos de sobrenadante con una micropipeta. Repetir este paso una vez más. Mezclar 1 µg de DNA con 2 µl de reactivo IV en un volumen final de 100 µl de agua estéril. 12. 4. mezclar con vortex. 7. Realizar la MSP o la secuenciación. 14. 15. 10. o guardar las muestras a -20ºC durante máximo 2 meses o a -80ºC durante máximo 6 meses. Añadir 1 ml de EtOH al 70%. Después de eliminar el sobrenadante del segundo lavado.5-2 ml con tapón de rosca. Centrifugar 15 s a 5000g (7500 rpm) para precipitar del reactivo III con el DNA (debe observarse un pequeño precipitado blanco). Incubar 16 h a 50ºC. Centrifugar 2-3 min a 13000 rpm y transferir la muestra (el sobrenadante) a un tubo limpio. 20. 16. 7 .

5% en TAE a 100V durante 35 min. Realizar dos PCRs por separado utilizando oligonucleótidos para DNA no metilado (U) y para DNA metilado (M) respectivamente. Sentido (U/M) o Olig. Antisentido (U/M) o DMSO 5% 1U 60 25μl 0. 8 . Condiciones de PCR.5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles o AmpliTaq Gold (5U/μl) o DNA (ng) Volumen final - Condiciones del termociclador RASSF1A-U Desnaturalización Desnaturalización Emparejamiento Extensión N° de ciclos Extensión 94ºC – 10 min 94°C – 1 min 62°C – 45 s 72°C – 45 s 38 72°C – 10 min 4°C RASSF1A-M 94°C – 10 min 94°C – 1 min 58°C – 45 s 72°C – 45 s 35 72°C . Correr 10 µl de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 2. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig.2 mM 2.10 min 4°C - Visualización de los resultados.MSP Realización de una PCR para determinar el grado de hipermetilación a nivel del promotor del gen RASSF1A.

Antisentido .c12 o BioTaq DNA Pol (5U/μl) o DNA (ng) Volumen final 25μl 20 pmoles 10 pmoles 1U 50 20 pmoles 10 pmoles 0. S-104. MC-IXC e IMR-32.c12 o Olig. SIMA. SIMA. SK-N-MC. PROTOCOLO Condiciones de PCR.PCR diferencial Determinación de deleciones homocigóticas a nivel de la región STS intrónica g14 del gen DMBT1 en las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-MC. MC-IXC e IMR32 Muestras: S-101. S-102. S-103.g14 . o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig.2 mM 2. Sentido .5 mM 1X Condiciones del termociclador Desnaturalización Desnaturalización Emparejamiento Extensión N° de ciclos 95ºC – 5 min 94°C – 30s 59°C – 30 s 72°C – 30 s 28 9 .g14 .

Sentido o Olig. PROTOCOLO Condiciones de PCR. Antisentido o BioTaq DNA Pol (5U/μl) o DNA (ng) Volumen final 25μl 0. Muestras: DNA de sangre y tumor de un paciente afectado de sarcoma.5% en TAE a 100V durante 40 min.2 mM 1. Correr 10 µl de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 2.Extensión 72°C – 10 min 4°C - Visualización de los resultados. DETECCIÓN DE MUTACIONES POR SSCP Detección de mutaciones a nivel del gen p53 en sarcomas.5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles 1U 50 Condiciones del termociclador Desnaturalización Desnaturalización Emparejamiento Extensión N° de ciclos Extensión 95ºC – 10 min 94°C – 45 s 65°C – 45 s 72°C – 45 s 30 72°C – 10 min 10 . o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig.

* Loading Buffer:  Formamida: 950 µl  EDTA: 40 µl Azul de Bromofenol y Azul de Xileno cianol: una punta de micropipeta de cada uno. con una pipeta pasteur. * Electroforesis: Buffer de electroforesis: TAE 0. verter entre los cristales. y. añadir a la mezcla APS 10%: 70 µl Temed: 3. Una vez el borde quede rebasado.5:1 al 12%) * Gel de acrilamida Acrilamida:bisacrilamida (37.4°C - Visualización de los resultados en gel de acrilamida (37. y poner a vacío 10-15 minutos. * Tinción de plata.5 µl Agitar suavemente para que se mezcle.25 ml 350 µl 4. mezclar con suavidad.5:1) 40% TAE 10X: H2O MiliQ: 2. * Preparación de las muestras: Mezclar 2 µl del producto de PCR con 6 µl de Loading Buffer. y pasar a hielo de inmediato. Una vez preparado el montaje del gel. Calentar a 95 ºC durante 15 minutos.5 ml Verter en un vaso de precipitados. Correr los geles a 300V durante 4h30min-5h a 4ºC.5X. 11 . poner el peine.

DETECCIÓN DE PÉRDIDA DE HETEROCIGOSIDAD MEDIANTE RFLP Detección de pérdida de heterocigosidad a nivel del exón 4 de p53. Sentido o Olig. y lavar con agua destilada. observando cómo van apareciendo las bandas.  Añadir una pequeña cantidad de solución de revelado. un minuto. Muestras: S-102. dos veces.  Detener la reacción. para fijarlos.  A continuación.5 mM 1X 10 pmoles 10 pmoles 1U 50 Condiciones del termociclador Desnaturalización 95ºC – 10 min 12 .2 mM 1. durante 3 minutos. A partir de aquí. o dNTPs o MgCl2 o Buffer 10X o Olig.  Sumergir los geles en la solución de nitrato de plata 1%. A continuación. añadir mayor cantidad de solución de revelado. S-103. y a temperatura ambiente. PROTOCOLO Condiciones de PCR. y decantar por la fregadera. 28.  Volver a lavar en agua destilada dos veces.  Decantar. un minuto. y dejar durante veinte minutos. agitar manualmente hasta que la solución enturbie. T98G. (Na2CO3). Es importante no exceder este tiempo.  Lavar en agua destilada. añadiendo ácido acético al 10%. protegido de la luz. HNO3 1%. Separar los cristales. todos los pasos se dan en agitación. y agitar suavemente. e introducir los geles 10 minutos en 10% etanol en agitación. Antisentido o BioTaq DNA Pol (5U/μl) o DNA (ng) Volumen final 25 μl 0. y agitando.

- Visualización de los resultados Correr todo el volumen de la reacción de restricción en un gel de agarosa al 2.Desnaturalización Emparejamiento Extensión N° de ciclos Extensión 94°C – 45 s 57°C – 45 s 72°C – 45 s 30 72°C – 10 min 4°C - Ensayo de restricción Mezclar en un tubo de 0.2 μl de Buffer NE2 .5 ml: .3 μl de producto de PCR . 13 .5% en TAE a 100V durante 40 min.1 μl de enzima BSTUI (2 unidades) .14 μl de agua estéril Incubar durante 2h30 min a 60ºC.