Informe Técnico: Anisoles y Brettanomyces

ANISOLES Y BRETTANOMYCES
Causas, efectos y mecanismos de control
INFORME TCNICO
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Indice
NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA ...................................7 CONTROL DE CALIDAD DE LOS LOTES DE TAPONES NUEVOS PARA PREVENIR EL RIESGO DE CONTAMINACIN POR CLOROANISOLES......................................20
ORIGEN Y BIOSNTESIS DE TCA EN EL CORCHO: MECANISMOS MOLECULARES EN EL HONGO TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM..............33 MTODO ROSA PARA LA REDUCCIN DE TCA EN EL TAPN DE CORCHO ......................................... 81
LA CONTAMINACIN DE LOS VINOS POR BRETTANOMYCES DURANTE LA VINIFICACIN Y LA CRIANZA ..................................................87 COMPARATIVA ENTRE DOS TCNICAS DE TOSTADO DE BARRICAS DE ROBLE FRANCS PARA CHARDONNAY .........................................97
PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL...............................107
NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA
Cloroanisoles y Bromoanisoles resultan de la sustitucin del ncleo llamado anisol, presente en gran nmero de molculas voltiles y odorferas, por ambos halgenos. Esta modificacin de la estructura molecular da lugar a una molcula de caractersticas organolpticas de carcter mohoso y de gran potencial contaminante para la industria alimentaria y en concreto la vincola. En este documento encontraremos el origen y las consecuencias de dichas contaminaciones en el vino.
Pascal CHATONNET Laboratoire EXCELL MERIGNAC Francia
ndole, origen y consecuencia de la presencia de anisoles en el mundo vincola

Introduccin
a estructura qumica metoxibencil, correspondiente al ncleo llamado "anisol", est presente en un gran nmero de molculas voltiles y a menudo odorferas. Estas diversas molculas estn muy presentes en la naturaleza, y en especial en el entorno vincola. La sustitucin del ncleo anisol por tomos de cloro o de bromo para originar haloanisoles da lugar a la formacin de una molcula con propiedades organolpticas particulares. En un contexto vincola, estas molculas se caracterizan concretamente por olores relativamente desagradables, que evocan el carcter "mohoso". Adems, en su mayora presentan umbrales relativamente reducidos de deteccin olfativa. Estas caractersticas confieren a los haloanisoles en su conjunto un potencial contaminante considerado muy serio por el sector. En este trabajo, estudiamos las principales molculas de cloroanisoles y de bromoanisoles que se pueden encontrar en el mundo vincola, indicando, para cada una de ellas, tanto su origen como sus consecuencias en la calidad de los caldos.
1- Los cloroanisoles En los vinos, los olores con carcter "mohoso" son uno de los defectos organolpticos ms desagradables y ms severamente juzgados tanto por los catadores expertos como por los consumidores. Se han identificado diversas molculas que transmiten ese aroma desagradable a los caldos. Entre ellas, los cloroanisoles, y en especial el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) y el 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) constituyen los compuestos identificables con mayor frecuencia en los
vinos considerados "mohosos" o "con sabor a corcho" en la cata.

2,4,6-tricloroanisol (TCA) 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) pentacloroanisol
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mica de algunos plaguicidas a base de 2,3,4,6-tetraclorofenol (TeCP) o, ms frecuentemente, de pentaclorofenol (PCP) que contiene TeCP como impureza (entre un 10 y un 15 % El carcter "con sabor a corcho", que indica una contaminade TeCP en el PCP tcnico industrial). La metilacin de los cin procedente del tapn de corcho utilizado tradicionalclorofenoles debida a una actividad O-metilasa, frecuente en mente para el taponado de las botellas, se aplica equivocanumerossimos microorganismos y en especial en los damente con frecuencia, pese a ser cierto que, mohos existentes en las bodegas, produce el cloroanisol efectivamente, el corcorrespondiente (figura cho procedente de la 2). A partir de una molcorteza del alcornocula poco voltil y prctique (Quercus suber) camente inodora, se puede transmitir TCA obtiene un cloroanisol a los caldos si la que se transmite fcilcalidad de la materia mente a la atmsfera y prima o el proceso que resulta muy maloliende fabricacin de los te. Estos compuestos tapones no son tambin pueden contamiFigura 2 - Metilacin bioqumica del 2,3,4,6-tetraclorofenol en satisfactorios nar el caldo sin que ste 2,3,4,6-tetracloroanisol (Tanner et al., 1981, haya entrado en contacto Buser et al., 1982, con corcho (Dubois et Tanner et Zannier, 1983). El lavado con cloro, largo tiempo Rigaud, 1981, Chatonnet et al., 1994). Los mecanismos de utilizado por los corchotaponeros, era un factor agravante, degradacin de estos precursores y las condiciones de conpero en ningn caso una causa de contaminacin del cortaminacin a distancia, cho por el precursor por va de la atmsfera, directo del TCA: el han sido descritos deta2,4,6-triclorofenol lladamente (Chatonnet et (TCP). El abandono al., 1994). Resulta sumade ese mtodo en la mente fcil la contaminaactualidad no por cin del vino durante su ello ha suprimido la manipulacin al aire, su contaminacin de conservacin en recipienlos tapones, lo cual tes microporosos (barridemuestra claracas) o por contacto con mente que el origen materiales contaminados de la contaminacin indirectamente (tapones del corcho es mltide silicona, madera de ple, y no obedece las barricas, bentonita, nicamente a una colas, tapones de corcontaminacin inicial cho). Figura 3 - Formacin de 2,4,6-triclorofenol por cloracin qumica a partir de de la materia prima El uso inconsiderado de solucin clorada situada en un entorno cido y al entrar en contacto con por TCP. productos de desinfecncleos fenilos Ulteriormente a su cin a base de sales de abandono, se ha hipoclorito tambin puede causar la contaminacin de los podido identificar otras fuentes de contaminacin por cloroamateriales orgnicos (en especial la madera) que estn en nisoles. Y es que el corcho es un material da estructura contacto con el caldo o del ambiente de la bodega tras la microporosa rica en lpidos que puede fijar fcilmente los formacin qumica de TCP (Burtschell et al., 1959) y su contaminantes presentes en fase gaseosa en la atmsfera degradacin por ciertos hongos filamentosos (Maujean et de almacenamiento; tapones nuevos indemnes de contamial., 1985, lvarez-Rodrguez et al., 2002). La utilizacin del nacin pueden acabar contaminados a niveles molestos si cloro es indeseable para la limpieza y desinfeccin de cualhan permanecido almacenados en dependencias contaminaquier material poroso o microporoso, incluido el caucho das (Chatonnet et al., 1994, Chatonnet et Labadie, 1995). natural utilizado para la fabricacin de canalizaciones flexiEl pentacloroanisol (PCA), poco oloroso (umbral de percepbles o de ciertos tapones para el cierre de las piqueras de cin > 50 g/l), y sobre todo el 2,3,4,6-tetracloroanisol las barricas. (TeCA), son molculas procedentes de la degradacin bioqu(PCA)
Figura 1 - Principales cloroanisoles considerados contaminantes de los vinos y responsables de los defectos tipo "mohoso".
10 Anisoles y Brettanomyces
La reaccin del cloro con el ltex o los sedimentos de polifenoles produce qumicamente TCP que se acumula en el polmero y que posteriormente se puede degradar bioqumicamente generando TCA (figura 3). Por el contrario, las siliconas son insensibles a la accin del cloro. La formacin de tetra y de pentaclorofenol por esa misma reaccin slo se puede producir con pH inferiores a 6, pero siempre es limitada debido a la polaridad del medio de reaccin (Noilet, 1996). El TCA tiene un umbral de deteccin olfativa relativamente bajo (300 pg L-1 en el agua, segn Curtis, 1972; o 30 pg L1 segn Griffiths, 1974). Dependiendo del tipo de caldos, las alteraciones del olor y sobre todo del aroma retroolfativo son significativas entre 1,5 y 3 ng L-1 (Duerr, 1985). El anlisis de las primeras muestras de vinos contaminados por TeCA en la poca en que se empez a tomar seria-
mente en cuenta el problema en el mundo vincola se realiz sobre muestras que presentaban niveles de contaminacin sumamente altos (varios g/l) y se sobreestim en buena medida los umbrales de alteracin (CHATONNET et al., 1994). Se sospechaba entonces que el TeCA contaminaba los caldos a partir de 150 ng/l. En realidad, aunque en efecto el TeCA es menos oloroso (4 ng L-1 en el agua segn Curtis, 1972) que el TCA, actualmente se detectan alteraciones notables a partir de 10-15 ng L-1 en los vinos tranquilos y de menos de 5 ng L-1 en los vinos espumosos (Chatonnet et Labadie, 1995). En todos los casos de contaminacin atmosfrica de la bodega - atmsferas a menudo hmedas y cerradas - la eliminacin de la contaminacin exige ante todo la identificacin exhaustiva y previa de las fuentes contaminantes y su eliminacin. El aumento de la ventilacin de las estancias
Tabla 1. Contenidos de halofenoles y haloanisoles en diversos vinos alterados por un carcter "mohoso" en la cata. Evidencia de la presencia de TBA
MUESTRAS DE CALDOS ( NG L-1 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

nd: nd < DL trazas: > DL, < QL
TCA
TCP
TeCA
TeCP
PCA
PCP
TBA
TBP
TeBP
PBP
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd trazas 2,9 nd nd 2,6 trazas trazas nd nd nd nd nd nd nd nd nd
11,5 nd nd nd nd nd nd nd trazas nd nd trazas trazas nd nd nd nd nd 6,5 nd 7,6 nd 8,5 nd 7,1 nd 5,4 nd trazas nd trazas nd trazas nd 12,3 nd 17,1 nd 21,5 nd 72,0 nd 14,3 nd trazas nd nd nd trazas nd 11,7 nd 64,6 nd 3,2 nd trazas nd nd nd
nd nd 22,4 13,2 71,0 7,5 6,9 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 23,9 nd nd nd 27,0 nd nd nd nd 59,2 nd
trazas nd trazas nd trazas trazas trazas trazas trazas trazas nd trazas nd trazas nd trazas nd trazas trazas trazas nd nd nd nd nd nd 11,0 122,9 trazas nd
16,8 12,9 68,5 113,5 34,4 17,8 19,5 2,1 trazas 33,7 3,9 8,3 8,3 12,1 5,4 675,4 2,2 252,8 147,6 12,0 67,0 48,0 0,0 68,3 nd 2,5 11,1 nd trazas 7,2 40,2 12,3 37,1 28,5 26,7 31,3 nd 13,1 13,4 nd 9,1 14,6 trazas 26,1 32,4 trazas 17,9 36,1 nd 3,8 7,5 8,3 nd 3,6 29,8 3,5 37,4 45,2 6,3 18,8 10,7 nd trazas 12,9 13,7 43,5 nd 16,8 104,1 87,7 12,8 78,2 nd 37,9 108,1 23,7 28,3 100,8 nd 4,0 9,6 38,0 4,0 30,1 81,2 6,5 392,6 nd 6,3 44,9
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
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siempre es deseable, pero no necesariamente suficiente. Todo depende del caudal de contaminantes emitida por la o las fuentes. La climatizacin de los locales a menudo agrava la contaminacin del aire al reducir la renovacin de la atmsfera; la introduccin de aire fresco es pues una necesidad imperiosa en las estancias destinadas al almacenamiento de vinos a granel.
2- Los bromoanisoles
Se ha recurrido mucho a los cloroanisoles para explicar la presencia de defectos de carcter "mohoso" en los vinos. Ahora bien, existen algunos caldos que presentan exactamente el mismo tipo de defecto organolptico en la cata pero que no contienen cantidades suficientes de cloroanisoles para explicar la presencia de un carcter "mohoso". Soleas et al. (2002) sealan que en el control de un gran nmero de muestras de vinos, slo una fraccin menor (27 %) contena una cantidad significativa de TCA (> 2 ng L-1). No obstante, estos autores no han procedido a la dosificacin de los TeCA; por lo tanto no permiten una certeza concluyente sobre la intervencin de otros cloroanisoles. La investigacin y la dosificacin exhaustiva de los diversos cloroanisoles en un nmero suficientemente importante de vinos comparativamente sospechosos tras su cata en nuestro laboratorio nos ha permitido identificar claramente situaciones que conducen a una frecuencia de alteracin elevada sin que se pueda detectar o cuantificar TCA o TeCA a un nivel suficientemente alto para poder comunicar un defecto. Por primera vez, hemos evidenciado la presencia de 2,4,6-
caldos que presentan un carcter "mohoso" en la cata. La tabla I presenta el resultado de la dosificacin de diversos cloroanisoles y clorofenoles, considerados contaminantes clsicos de los vinos que presentan un defecto de carcter "mohoso", as como del TBP y del TBA. Con excepcin de algunas muestras que contienen un contenido reducido de TCA, los vinos seleccionados en este trabajo son en su mayora pobres (cantidades dosificadas inferiores al umbral de alteracin) o incluso carentes de cloroanisoles (< lmite de cuantificacin). Se observa que la intensidad relativa del defecto "mohoso", medida sobre una escala arbitraria de intensidad de 0 a 5, presenta una correlacin significativa (p< 0.05) con el contenido de TBA del vino y no con los dems cloroanisoles estudiados (figura 5). En los casos de fuerte contaminacin por TBA (> 20 ng L-1), adems de un intenso carcter "mohoso", los vinos presentan un carcter "fenlico" y "yodado" ms o menos intenso. Este defecto se percibe fundamentalmente en la cata del vino, en retro-olfato, y persiste largo tiempo en boca. El olor evoca el del TBP, pero la intensidad del defecto no est vinculada de forma evidente con las concentraciones dosificables en los caldos. Adems, el contenido de TBA de los vinos tampoco est correlacionado significativamente con el TBP dosificable
Figura 4 - estructura molecular del 2,4,6-tribromoanisol (TBA)
tribromoanisol (TBA) (figura 4) en caldos significativamente "mohosos" pero que no contenan cantidades suficientes de cloroanisoles para comunicar un defecto. Esta nueva forma de contaminacin se ha podido demostrar en vinos con o sin contacto directo con materiales susceptibles de haberlos contaminado por contacto directo (Chatonnet et al., 2004). Se ha especificado el umbral de percepcin y las condiciones de contaminacin de los vinos en el transcurso de su elaboracin, almacenamiento o crianza. 2.1- Identificacin y aislamiento del 2,4,6-tribromoanisol en
Figura 5 - Relacin entre la intensidad relativa del defecto "mohoso, con sabor a corcho" en vinos que no contienen o contienen pocos cloroanisoles pero s 2,',6-tribromoanisol
en esos mismos caldos, lo cual hace pensar que la transformacin del TBP no se lleva a cabo en el vino, sino que procede de una contaminacin externa. A diferencia del pentabromofenol, del tetrabromobisfenol A (TBBPA) y de los teres difenilpolibromados (polibrominated diphenyl ethers, PBDEs), molculas utilizadas masivamente como ignfugos (Brominated Flame Retardants, BFR) que podran ser perturbadores endocrinos (Ilonka et al., 2000), el TBA y el TBP no parecen tener una toxicologa severa en las concentraciones medidas. El TBA se ha identificado como un contaminante presente en trazas en la fauna marina y en cier tos sedimentos marinos (Miyazaki et al., 1981; Watanabe et al., 1983) y en la atmsfera (Wittlinger and Ballschmiter, 1990). El TBA deriva de su precursor directo, el TBP, tras su O-metilacin por microorganismos bacterianos (Allard et al., 1987). El TBP est presente en estado natural en numerosos organismos marinos (Whitfield et al, 1992a, Whitfield et al., 1992 b, Whitfield et al., 1988, Boyle et al., 1992, Whitfield et al., 1995) y concretamente en cier tas algas que pueden sintetizar de novo el TBP a par tir de los bro-
muros de contenidos en el agua de mar, mediante un equipo enzimtico especfico (Flodin and Whitfield, 1999). El TBA es conocido por causar potentes defectos de carcter "mohoso" y "terroso" en la fruta embalada en cajas contaminadas por TBP degradado en TBA por Paecelomyces variotii (Whitfield et al., 1997), un hongo filamentoso tambin conocido por su capacidad de transformar el TCP en TCA por O-metilacin (Tindale et al., 1989). Wylie (1997) tambin seala la presencia de TBP y de TBA en peras, aun cuando no se utilicen dichos productos en las huer tas. Hof fman et Sponholz (1997) tambin han sealado la contaminacin indirecta de productos farmacuticos a travs de obturadores de polietileno contaminados por contacto de la madera de los palets impregnados de TBP. Por ltimo, se sabe que el TBA en estado de trazas causa este mismo tipo de defecto organolptico en las redes de abastecimiento de agua (Lahoussine, 2000, Malleret and Bruchet, 2001, Malleret and Bruchet 2002). Los umbrales de percepcin del TBA contenidos en el
Figura 6 - Estimacin del umbral de percepcin y del umbral de recuperacin del TBA
agua son sumamente bajos. Saxby et al (1982) han medido un umbral de 8 pg L-1; Whitfield et al. (1997) 20 pg L-1; Malleret y Bruchet (2002) un umbral de 30 pg L-1. Estos umbrales convier ten al TBA en uno de los contaminantes ms potentes de todos los identificados; su potencial de perjuicio es parecido al del TCA, cuyo umbral de percepcin en el agua tambin es prximo a 30 pg L-1 (Grif fiths, 1974). En el caso del vino, solucin hidroalcohlica cida (pH 3,5 a 4,0) que contiene entre un 10 y un 15 % vol. de etanol, los umbrales que hemos estimado en un 50 % de los catadores (entrenados pero no exper tos) en un medio
modelo (Pt) o en un vino estndar (Rt) arrojan valores claramente ms altos. El umbral de percepcin Pt a: 50 % se estima en 3.4 ng L-1 y el umbral de recuperacin Rt a: 50 % en 7.9 ng L-1 (figura 6). Estos resultados son compatibles con las catas de los vinos sospechosos estudiados en este trabajo (tabla I), pero es posible que el TBA altere la calidad y la tipicidad de los caldos por debajo de su umbral de deteccin o de identificacin (umbral de recuperacin). El TBP se puede formar qumicamente en las aguas tratadas con cloro en presencia de iones bromuro y de trazas de fenoles orgnicos. El cloro puede oxidar los
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iones bromuros, liberando bromo que se puede combinar rpidamente con muchos contaminantes orgnicos y producir, adems de clorofenoles, bromofenoles y bromoclorofenoles (Patnaik et al., 2002). En presencia de hipoclorito de sodio y de radiaciones UV, los bromuros presentes en las salmueras pueden formar 2-bromo-2metilfenol capaz de comunicar un potente olor "fenli-
co" o "qumico" identificable en algunos quesos Gouda (Mills et al., 1997). En el presente estudio no se ha investigado ese compuesto, pero tal vez pueda explicar el carcter "yodado" y de "fenol" obser vado en algunos caldos adems del carcter "mohoso". 2.2- Origen de la contaminacin de los vinos por TBA El anlisis de las diversas muestras de vinos tintos
Tabla 2. Anlisis de diversas atmsferas de bodega por atrapado esttico en kits EXCELL
ATMSFERA ( NG G-1 ABSORBENTE) 1 2 3 4 5

nd: nd < DL trazas: > DL, < QL
TCA
TCP
TeCA
TeCP
PCA
PCP
TBA
TBP
TeBP
PBP
nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd
nd nd nd 54 64
2 nd nd 5 2
15 nd nd 210 393
179 28 26 30 10
26 72 52 0 0
nd 1 48 1 2
nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd
cuyas condiciones de vinificacin y de almacenamiento en diversas bodegas ha permitido evidenciar varios modos de contaminacin de los caldos. Al igual que los cloroanisoles derivados del PCP y del TeCP capaces de contaminar indirectamente los vinos a distancia a travs de la atmsfera (Chatonnet et al., 1994, Chatonnet et al., 1995), se ha detectado TBA procedente a todas luces de la degradacin microbiolgica de TBP en la atmsfera de diversas bodegas. Los ambientes contaminados por derivados del PCP y del TeCP no contienen
derivados del TBP y viceversa; nunca se ha identificado TeBP ni PBP en los casos estudiados (tabla III). Las caractersticas fsico-qumicas de estos contaminantes (tabla III) explican que, pese a sus puntos de ebullicin elevados, los halofenoles y haloanisoles considerados se puedan encontrar tan fcilmente en las atmsferas de estancias que contienen fuentes de emisin de dichas molculas. Todos los contaminantes en cuestin tienen una hidrofobia similar (log P). La escasa presin de vapor saturado de TeCA explica la facilidad de
Tabla 3. Caractersticas fsico-qumicas de los halofenoles y haloanisoles (Fuente: PhysProp Database Syrres Inc. (2003))
MOLCULA [ NCASR]
PUNTO DE PUNTO DE Presin EBULLICIN FUSIN de vapor C C 760 MM Hg 760 MM Hg 10-3.mm Hg 241 246 298 286 232 309 61 69 88 95 84 70 108 174 0,228 2,500 0,644 0,303 3,190 0,666 0,592 0,110
LOG P OCTANOL/ AGUA 4,11 3,69 4,74 4,18 4,65 4,09 5,29
SOLUBILIDAD CTE EN AGUA DE HENRY MG L-1 10,0 800,0 1,0 70,0 1,4 23,0 0,4 14,0 130,000 2,600 20,200 0,035 96,100 8,840 1930,000 0,025
TCA [87-40-1] TCP [88-06-2] TBA [607-99-8] TBP [118-79-6] TeCA [938-86-3] TeCP [58-90-2] PCA [1825-21-4] PCP [87-86-5]
En la bodega A (tabla IV), tanto los vinos conservados en depsito de acero inoxidable, libre de cualquier traza de contaminacin, como los conservados en barricas que han acumulado contaminantes pueden presentar altos niveles
de contaminacin. En este caso, el TBP poco voltil emitido por una fuente contaminante primaria se degrada microbiolgicamente en TBA, ms voltil y maloliente, que pasa fcilmente al aire. El vino manipulado en ese ambiente puede
disolver los contaminantes presentes en la fase gaseosa, o contaminarse indirectamente por contacto con los materiales porosos fcilmente contaminados con los que est en contacto directo (madera de las barricas). En la bodega B (tabla V), la fuente que originaba contaminacin fue suprimida varios aos antes, pues en esa bodega slo quedan barricas que no estaban contaminadas a su llegada. An as, todava se puede detectar la presencia de cantidades notables de TBA en la atmsfera. Los contaminantes residuales, adsorbidos por la estructura microporosa de la bodega recubierta de ladrillo de tierra, que representa una considerable superficie desarrollada de intercambio, se volatilizan poco a poco en el aire. En la bodega C (tabla VI), los vinos criados en barricas sufren una fuerte contaminacin por TBA y TBP. La concentracin de contaminantes en el vino aumenta regularmente con la edad de las barricas, es decir con el tiempo que pasan en esta bodega; el grado de contaminacin de la madera de las barricas aumenta en el mismo sentido. Pero la contaminacin de los vinos tambin debe proceder de los tapones de silicona utilizadas para obturar las piqueras, pues stos se encuentran en contacto directo con el vino. Igual que ocurre con los cloroanisoles, los materiales plsticos en general y las resinas elastmeras de silicona en particular pueden adsorber fcilmente el TBA, y en menor medida el TBP, igual de hidrfobo pero menos voltil (menor presin de vapor saturado y constante de Henry mucho ms alta). El material a base de polietileno o de polister, las juntas de caucho vulcanizado y los tapones de silicona de las
barricas pueden fijar fcilmente los contaminantes del aire y cederlos despus a los caldos. El anlisis de diversos materiales en contacto con la atmsfera de esta bodega permite demostrar que los elementos estructurales de madera se han impregnado masivamente de TBP que se degrada progresivamente en TBA debido a la accin de la microflora ambiente. Adems, algunas pinturas contienen TBP en su formulacin. Ms difcil de explicar resulta el anlisis de los vinos en botellas taponadas y contaminadas por TBA y, en ciertos casos, por TCA (tabla VII). Y es que en esta fase del proceso, ya no se sabe si la alteracin del caldo se ha producido de resultas de la contaminacin de los tapones almacenados en una atmsfera contaminada antes de su la utilizacin (en las depedencias del corchotaponero o del usuario), o si, como en el caso descrito para los TCA, la contaminacin se debe a un tapn contaminado por TBA formado en situ en el corcho. Es obvio que evidencia de la presencia de importantes cantidades de contaminantes en tapones de polietileno extrusionado (PET) almacenados en un ambiente viciado demuestra que es posible una contaminacin aerolgica de los obturadores a gran distancia, a travs de la atmsfera y de los embalajes, igual que en el caso de los tapones de silicona estudiados ms arriba. Este resultado se debe considerar asimismo a la luz de las observaciones de Whitfield et al. (1997) sobre el TBA y el TCA en lminas de envasado de PET, y de Hoffman and Sponholz (1997) en tapones PET roscados almacenados sobre palets de madera tratados con TBP. Ahora bien, no sabemos en qu propor-
Tabla 4. Concentracin de halofenoles y haloanisoles en las atmsferas y en diversos materiales de la bodega (A)
MATERIALES
Atmsfera de bodega (en ng g-1 adsorbente) Bodega de cubas Bodega de barricas Caldos guardados en la bodega (en ng L-1) Guardados en cubas de acero inoxidable Guardados en barricas de 12 meses de antigedad Fuentes de contaminacin potenciales (ha) (en ng g-1) Barricas de roble de 12 meses de antigedad Barricas de roble de 14 meses de antigedad Estructura de madera nueva de la bodega de cubas Estructura de madera antigua de la bodega de cubas
(ha) parte externa del material, con espesor de 0-3 mm
TCA
TCP TeCA TeCP PCA
PCP TBA TBP TeBP PBP
nd nd
nd nd
nd nd
nd nd
nd nd
nd nd
46 162
13 4
nd nd
nd nd
nd nd
nd 3
trazas nd
8 7
trazas 675 trazas 148
2 12
253 67
nd nd
nd nd
nd nd nd nd
nd trazas nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
trazas 143 902 224 1158 6 nd nd nd 33 nd 835
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd: < DL
trazas: > DL, < QL
Informe Tcnico 15
Tabla 5. Concentracin de halofenoles y haloanisoles en las atmsferas y en diversos materiales de la bodega (B)
MATERIALES
Atmsfera de bodega (en ng g-1 adsorbente) Bodega subterrnea 1 Bodega subterrnea 2
TCA
TCP TeCA TeCP PCA
nd nd
nd nd
nd nd
nd nd
nd nd
nd 15 trazas 122
trazas 15
nd nd
nd nd
Caldos guardados en la bodega (en ng L-1) Guardados en bodegas de barricas nuevas 1+2
nd
nd
nd
trazas 13 78
nd
nd
Fuentes de contaminacin residual (ha) (en ng g-1) Bodegas de suelo de tierra 1+2 Bodegas con paredes de hormign 1+2 Bodega con paredes de ladrillo 1
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd trazas trand zas nd 2
nd trazas
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd: < DL
trazas: > DL, < QL
Tabla 6. Concentracin en halofenoles y haloanisoles en las atmsferas y en diversos materiales de la bodega (C)
MATERIALES
Atmsfera de bodega (en ng g-1 adsorbente)
TCA
TCP TeCA TeCP PCA
PCP
TBA
TBP TeBP PBP
nd
trazas
nd
trazas
nd
nd
190
38
nd
nd
Caldos guardados en la bodega (en ng L-1) Guardados en barricas nuevas Guardados en barricas de 12 meses de antigedad Guardados en barricas de 24 meses de antigedad
nd nd nd
nd 4 12
nd nd nd
nd nd nd
nd nd nd
nd nd nd
13 38 28
78 108 101
nd nd nd
nd nd nd
Fuentes de contaminacin residual (ha) (en ng g-1) Barricas de roble nuevas (9 meses en la bodega) Barricas de roble de 12 meses de antigedad Barricas de roble de 24 meses de antigedad Barricas de roble de 36 meses de antigedad Soportes de barricas Tapones de silicona Estructura de madera de la bodega: Parte superficial (0-3 mm) Parte interior (3-15 mm) Barniz
nd nd nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd trazas trazas nd nd
nd nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd nd
nd
nd: < DL
nd nd nd nd
nd nd nd nd
nd nd nd nd
trazas trazas 6 trazas trazas nd
22 143 224 1973 2185 1337
240 902 1158 2943 13127 57
nd nd nd nd nd nd
nd nd nd nd nd nd
234 82363 201 963 tra39 zas 4933
nd nd nd nd
nd nd nd nd
trazas: > DL, < QL
MATERIALES
Atmsfera de bodega (en ng g-1 absorbente)
TCA
nd
TCP TeCA TeCP PCA

nd

5 14 2 nd nd
tra- trazas trazas zas
Tapn de corcho nacional nuevo (ng por tapn) Tapn sinttico de PET nuevo (ng por tapn)
16 nd
13 nd
nd
15 107
24 872
9 39
33 294
nd nd
nd nd
3 51
106
Vino embotellado contaminado: Vino (ng L-1) Tapn usado (ha) (ng por tapn)
nd 27
12 8
nd nd
2 5
17 48
13 68 275 117
nd nd
nd nd
(ha) una vez retirado 1/3 de la parte externa del tapn para evitar el riesgo de contaminacin a travs de la atmsfera nd: < DL trazas: > DL, < QL
ciones pueden migrar al vino los contaminantes adsorbidos por el PET. 2.3- Origen del TBP en los ambientes vincolas Los casos de contaminacin de caldos por TBA y TBP evidenciados en este trabajo proceden a todas luces de elementos de madera o a base de madera impregnados o tratados super ficialmente con TBP, de forma similar a lo descrito sobre el PCP en contacto directo (Wurdig, 1975) o indirecto (Dubois and Rigaud, 1981, Chatonnet et al., 1994). En los vinos y materiales estudiados no se ha detectado PBP y TeBP, precursores potenciales del TBP, o, en todo caso, slo en estado de trazas no cuantificables. El TBP y diversos derivados bromofenlicos se utilizan ampliamente como tratamiento fungicida de la madera en Latinoamrica, como alternativa al PCP (Towa Mokuzai, 1982; Pulido and Ayzaguer, 1991) y antiincendios (pirorretardante), pero tambin en numerosos materiales plsticos (Takashi and Sato, 1992; Nishibori and Kondo, 1993; Hoffman and Sponholz, 1997). A diferencia del PCP, cuyo uso est regulado en buena medida en todo el mundo o incluso prohibido, como es el caso concretamente en Europa (CEE, 1991), el TBP no est sujeto a restriccin alguna. Adems, el uso muy extendido de derivados del TBP como agentes ignfugos en numerosos materiales hace temer un riesgo muy generalizado de contaminacin ambiental. La creciente utilizacin de materiales reciclados, tanto a base de madera como de polmeros plsticos que pueden estar ms o menos impregnados de TBP o sus derivados, podra constituir una fuente de contaminacin latente susceptible de contaminar los productos alimentarios sensibles, pero tambin las aguas subterrneas en caso de almacenamientos inconsiderados. La extensin de la presencia del TBP y de sus derivados mere-
cera pues investigaciones ms amplias.
Conclusiones
Prcticamente ha desaparecido la utilizacin del cloro para el lavado de tapones, sin que haya disminuido por ello la frecuencia de contaminacin de los caldos debida al TCA apor tado por cier tos tapones de corcho. El corcho y el proceso de fabricacin tradicional de tapones resultan fcilmente infestados por microorganismos capaces, en ocasiones, de sintetizar grandes cantidades de TCA. Por lo tanto, el control de la calidad de los lotes de tapones sigue siendo necesario. Otros materiales, como la madera de roble de las barricas nuevas, presentan en ocasiones una contaminacin aleatoria por TCA. El origen de esta contaminacin, poco frecuente, an no se conoce bien; tambin por ello resulta imperativo el control de la ausencia de anisoles. La contaminacin por productos de degradacin de plaguicidas organoclorados a base de PCP utilizados en el interior de las bodegas, concretamente para el tratamiento de la madera o de los productos a base de madera, tiende a disminuir, pero se sigue produciendo. Nuestros trabajos han evidenciado claramente la posibilidad de contaminacin de los caldos a distancia, a travs de la atmsfera. La atmsfera contaminada tambin puede contaminar los productos que estn en contacto directo con el vino, y por ltimo los propios caldos. Aunque la utilizacin del PCP ya est prohibida en Europa, siguen subsistiendo numerosas fuentes de contaminacin antiguas, impregnadas o contaminadas indirectamente por TeCA y accesoriamente por TCA. Para reducir el riesgo de contaminacin accidental, conviene cerciorarse siempre de la ausencia de dichos productos en el entorno de las bodegas, y ms especialmente en los materiales que entran en contacto directo
Informe Tcnico 17
con el vino. La seleccin de los materiales y revestimientos utilizados para la construccin o la reforma de las naves vincolas sigue siendo muy til para garantizar una buena fabricacin y unas buenas condiciones de transpor te y almacenamiento. La reciente identificacin de TBA en bodegas indemnes de clorofenoles impone el mantenimiento de una presin de control suficiente. La utilizacin del TBP como sucedneo del PCP procede contaminaciones idnticas a las obser vadas con PCA y TeCA. La utilizacin de este tipo de derivados rganobromados en numerosos productos complica la identificacin y la rpida erradicacin de las fuentes de contaminacin. Los anisoles constituyen una fuente de contaminacin de los caldos relativamente extendida. La multiplicidad de molculas implicadas, las reducidas cantidades de contaminantes suficientes para crear un defecto organolptico y la gran variedad de circunstancias que permiten la contaminacin invitan a una vigilancia especialmente rigurosa de todos los materiales y condiciones susceptibles de representar un riesgo de contaminacin molesta de los vinos.
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Informe Tcnico 19
homogeneizacin del SO2 no es buena en los vinos conservados a baja temperatura (< 16C). Con frecuencia es necesario bazuquear para mejorar la difusin de la dosis, y tanto ms cuanto ms voluminoso es el recipiente (600 litros o ms). 3- Alternativas al dixido de azufre El cido srbico no es eficaz respecto Brettanomyces sp. en las dosis clsicas, y no se puede utilizar en los vinos tintos debido a su inestabilidad en presencia de bacterias lcticas. El pirocarbonato de etilo, propuesto por BAYER desde 1995 con el nombre de Baycovin acta sobre las levaduras y bacterias. Este compuesto no permanece estable en el vino, pues se hidroliza rpidamente en etanol y en gas carbnico, generando productos secundarios menores, entre ellos el carbonato de etilo, que puede transmitir al vino cierto olor "afrutado". La produccin de uretanos (carbamato de etilo) ha descartado su utilizacin en enologa. Actualmente, este producto muy antiguo reaparece en forma de dimetilo con el nombre de Vercorin o DMDC. La dosis de 60 mg/l es fungisttica para S. cerevisiae y la dosis de 150 mg/l es fungicida. B. bruxellensis se inhibe a partir de 120 mg/l, pero para su destruccin total son necesarios ms de 200 mg/l. La utilizacin del DMDC permite la destruccin eficaz de los grmenes presentes, pero no una proteccin duradera, pues la hidrlisis de este tipo de compuesto en el vino es muy
rpida (figura 10), y tanto ms cuanto ms alta es la temperatura. Por lo tanto, slo se puede aplicar con dosificadores especiales cuando no hay posibilidad de recontaminacin (por ejemplo, al embotellar). En el caso contrario, habra que reajustar continuamente la dosis de principio activo. De momento, este producto est prohibido en Europa.
Conclusin
El desarrollo de tcnicas modernas de deteccin adecuadas para el seguimiento de la crianza de caldos y la elaboracin de mtodos de desinfeccin y de control de los recipientes de madera eficaces y que respeten el material permitirn sin duda en un futuro prximo controlar perfectamente el desarrollo de estos grmenes de contaminacin para reducir sus efectos indeseables, preservando al mismo tiempo la pureza y la tipicidad del aroma de los vinos.
CHATONNET P., BOIDRON J.N. et PONS Monique, 1990, Elevage des vins rouges en fts de chne: Evolution de certains composs volatils et de leur impact aromatique. Sci. Alim., 10, 565-587; CHATONNET P., BOIDRON J.N., DUBOURDIEU D., 1993 Influence des conditions d'lelevage et de sulfitage des vins rouges en barriques sur leur teneur en acide actique et en thyl-phnols. J. Int. Sci. Vigne et vin, 27, 4, 277-298 ;
TIPO DE ENSAYO
N de tapones ensayados
Defecto grave NQA = 1,5
(a)
Defecto crtico NQA = 0,65
(b)
Clasificacin de la calidad del lote
simple
80
Aceptado: 3 Rechazado: 4
Buena (1) Media (2)
reforzado
200
Media (2) Mala (3)
(1) defectos graves: ligero sabor a corcho, ligero sabor a moho, gasolina, cola (2) defectos crticos: sabor a corcho medio, sabor a corcho fuerte, sabor a moho medio, sabor a moho fuerte, terroso ftido, estanca-
CHATONNET P., DUBOURDIEU D., BOIDRON J.N. et PONS M., 1992. The origin of ethylphenols in wines. J. Sci. Food Agric., 60, 165-178 .
Introduccin
Informe Tcnico 21
CONTROL DE CALIDAD DE LOS LOTES DE TAPONES NUEVOS PARA PREVENIR EL RIESGO DE CONTAMINACIN POR CLOROANISOLES
Figura 1 - TCA total en diver-
sos lotes de tapones de Champagne evaluados y clasificados previamente mediante anlisis sensorial individual
Figura 2 - Figura 2 -
TCA total en diversos lotes de tapones de corcho natural previamente evaluados y clasificados mediante anlisis sensorial individual.
Figura 3 - Relacin entre el TCA total de los tapo-
nes de corcho natural y el TCA dosificado en los vinos embotellados
a contaminacin de los vinos por los tapones de corcho es uno de los temas de mayor preocupacin para la industria vincola mundial. Los obturadores utilizados pueden causar diversos tipos de defectos que afectan ms o menos gravemente a la calidad de los productos embotellados. No obstante, debido a su impacto y a las repercusiones econmicas que conlleva, el problema del "sabor a tapn" es el que ms atencin moviliza hoy en da. Las tergiversaciones de ciertos fabricantes a la hora de reconocer la ndole y la amplitud del problema, la exageracin irracional de la frecuencia de alteracin por este tipo de defecto muy concreto, la tentacin de sustituir el taponado de corcho por diversos tipos de obturadores totalmente sintticos sin una previa reflexin profunda, y el eco excesivo en los medios de comunicacin han contribuido en buena medida a la prdida de racionalidad para atender y solucionar este delicado problema. Los tapones de corcho o a base de corcho pueden ceder diversos contaminantes a los caldos (BUSER et al., 1982., RIBOULET, 1982., LEFEBVRE et al., 1983, BOIDRON et al., 1984., MAZZOLENI et al., 1993), incluidos los sintticos (CHATONNET et al., 1999, CHATONNET et
Labadie, 2003). Aunque se puede sospechar de otros contaminantes organolpticamente muy activos (TANNER et BUSER, 1981, CHATONNET, 1994, SOLEAS, 2002), de hecho es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) identificado inicialmente por TANNER y BUSER en 1981, la molcula responsable de la gran mayora de defectos calificados de "sabor a tapn", pero que en realidad corresponden a un olor a "moho"" (AMON et al., 1989). Los mtodos de fabricacin tradicional de los tapones y las condiciones que propician el desarrollo de un gran nmero de microorganismos en el material suberoso originan la aparicin de este contaminante en los tapones y de la contaminacin de los caldos (LEE y SIMPSON, 1993). En este trabajo, realizado a partir de casos concretos observados en la industria, estudiamos la distribucin de la contaminacin de lotes de tapones compuestos utilizados para el taponado de los vinos espumosos (discos pegados a un cuerpo de corcho aglomerado) y de tapones de corcho natural empleados para el taponado de los vinos tranquilos. Se comparan distintos enfoques de medicin del contenido y de la migracin del TCA de los tapones, con objeto de evaluar objetivamente el riesgo de utilizar un lote de obturadores determinado. La primera
Figura 4 - Estimacin de la variabili-
dad de la migracin del TCA total de los tapones en el interior de los vinos embotellados juzgados significativamente alterados en la cata
(nmero de muestras: corcho natural = 85, disco y aglomerado de corcho compuesto = 33, corchos enteros naturales = 57)
parte se dedica a un enfoque que toma en cuenta el contenido total (extrable mediante un disolvente orgnico potente, CHATONNET et al., 2003) de TCA presente en los obturadores; la segunda parte trata sobre el inters del concepto de TCA fcilmente extrable desarrollado ms recientemente. 1-Utilizacin de la dosificacin de los contaminantes totales presentes en los tapones
El control de calidad de los lotes de tapones mediante anlisis sensorial es una tcnica laboriosa y ms complicada de lo que podra parecer, pero hoy por hoy sigue siendo la nica tcnica que permite un anlisis individual de una muestra sin resultar demasiado costosa. En el mundo se utilizan diversos enfoques. Cada uno de ellos presenta sus ventajas y sus inconvenientes, pero todos ellos exigen mucho tiempo, personal y competencia. Los lotes de tapones estudiados se han evaluado mediante la
Informe Tcnico 23
Figura 5 - Distribucin del TCA total en
los discos de corcho natural y en el cuerpo aglomerado de diversos tapones de Champagne
cata individual de maceraciones acuosas de tapones; la frecuencia de contaminacin de los lotes de tapones por olores de carcter "mohoso" permite clasificar los lotes en diversos niveles de calidad. Los tapones tomados como muestras de lotes de 140.000 unidades se aplican a medias botellas que contienen 125 ml de agua mineral controlada previamente mediante cata. Las botellas se almacenan boca abajo durante 6 das. Pasado ese tiempo, se abren y catan individualmente les maceraciones anotando la intensidad (sobre una escala que vara de 0 a 3) y el tipo de defecto detectado, en su caso (Tabla I).
Los tapones de corcho natural nuevos no han sido sometidos a lavado, y proceden de una seleccin visual realizada entre la 2 y la 3 calidad segn la escala de referencia de la Fdration Nationale des Syndicats du Lige (FNSL, 1999) y una 1 calidad para los tapones de Champagne segn la escala de referencia CIVC (1999). Los lotes llamados "buenos" son los lotes aceptados en su mayor medida en un control de calidad rutinario, y en el control de recepcin presentan como mximo un tapn defectuoso. Los lotes "medios" se rechazan en el ensayo simple, pero se aceptan en el control reforzado. Los lotes "malos"
Figura 6 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapones de Champagne evaluados previamente por anlisis sensorial
Figura 7 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapones de corcho natural evaluados previamente por anlisis sensorial
son lotes rechazados en el control reforzado. La dosificacin del TCA total del corcho se lleva a cabo sobre una muestra de entre 25 y 50 tapones nuevos triturados (CHATONNET et al., 2003). Se extrae una alcuota mediante un disolvente orgnico por agitacin durante 60 minutos. El extracto as obtenido se separa del corcho, se concentra y se analiza por cromatografa en fase gaseosa combinada con la espectrometra de masa. La deteccin especfica del TCA y de su precursor directo, el TCP, por fragmentometra de masa permite detectar de niveles de contaminacin muy bajos. 1.1-Heterogeneidad de la contaminacin de los tapones en los lotes comerciales El estudio de la distribucin de la contaminacin dentro de cada lote de tapones de corcho natural o compuesto indica claramente que el TCA no est repartido uniformemente dentro de cada lote. Incluso en los lotes de riesgo escasamente utilizados a la vista del resultado de los ensayos sensoriales, sigue existiendo una proporcin de tapones que pueden contener grandes cantidades de TCA. El nivel medio de contaminacin de TCA total no permite diferenciar los lotes de alto riesgo de los de bajo riesgo. Los lotes de riesgo potencialmente alto slo se distinguen de los lotes de bajo riesgo por una mayor proporcin de tapones contaminados por encima de 50 ng/ tapn. En la prctica, se puede considerar que no existen lotes totalmente indemnes de contaminantes y por tanto de riesgo sea cual sea el tipo de obturadores (figuras 1 y 2). 1.2-Utilizacin del contenido de TCA total para predecir la calidad de los lotes Se observa poca o ninguna correlacin significativa entre el contenido total de TCA de los obturadores y la cantidad de TCA que afecta a los caldos (figura 3). En efecto, la migracin del contaminante de los tapones al conteni-
do de la botella depende de diversos factores, y no slo de la cantidad de contaminante. En el marco de un tapn de corcho natural, o a fortiori compuesto, la contaminacin no es homognea. El estudio de un nmero considerable de casos de contaminacin de vinos embotellados por sus tapones de corcho indica por una parte que en el vino slo se difunde una fraccin de los contaminantes totales, y por otra parte que la magnitud de la migracin es bastante variable (figura 4). En los tapones de corcho natural, los casos marginales de fuerte migracin (> 25% del TCA total) representan en torno a un 2,4%. Este porcentaje es prximo a la tasa mxima de alteracin de un lote de botellas por encima de la cual son frecuentes las reclamaciones (en torno a un 3% segn nuestra experiencia). En estas condiciones, tericamente los obturadores no deberan contener ms de 15 ng/ tapn de TCA total, considerndose un lmite mximo admisible de 3 ng/l de TCA en el caldo. Pero en este caso, slo estar en contacto con el vino una fraccin imprevisible del tapn. Salvo que se sea excesivamente severo, esto impide sacar cualquier conclusin objetiva e irrefutable. En los tapones de Champagne, el uso del tapn tiene una orientacin clara. A pesar de ello, la situacin es ms compleja, debido a la estructura compuesta y a la gran variabilidad inter-individual del nivel de contaminacin de los discos y del aglomerado (figura 5). Por su fabricacin, la migracin del TCA de los discos es fcil. Slo se oponen dbilmente a una contaminacin que puede proceder del cuerpo aglomerado. Si tambin aqu se considerara la fraccin marginal del ndice de migracin (> 25%) con discos en contacto directo, situacin que representa a una gran mayora de los casos observados (> 40%), habra que admitir como mximo 6 ng de TCA total en la fraccin correspondiente a los discos (considerndose una canti-
Figura 9 - Correlacin entre el TCA liberable medido en las maceraciones individuales de tapones de corcho natural y el nivel de calidad estimado a partir de la evaluacin sensorial de los lotes. Calidad del lote segn el ensayo sensorial: 1 = bueno, 2 = medio, 3 = malo(LD: lmite de deteccin = 0,6 ng/l; LQ: lmite de cuantificacin = 1,4 ng/l) Informe Tcnico 25
a) corcho natural b) tapn de champagne
Figura 9 - Relacin entre la dosificacin del TCA liberable en maceracin individual o conjunta (25 tapones/500 ml)
dad mxima admisible de TCA de 1.5 ng/l vino espumoso); es decir alrededor de 3 ng/g de TCA total en los discos de corcho natural. Dado el estado actual de las tcnicas de fabricacin, resulta bastante difcil garantizar sistemticamente un nivel de contaminacin tan bajo.
2- Utilizacin de la dosificacin de contaminantes considerados fcilmente extrables o "TCA liberable"

Habida cuenta de los resultados expuestos ms arriba, de la localizacin superficial del TCA en las partes externas de los tapones (HOWLAND et al., 1997) y de la ausencia de migracin a travs de importantes espesores de tejidos suberosos (CAPONE et al., 2002), se estudia la nocin de "TCA fcilmente extrable", es decir que migra fcilmente en contacto con una solucin hidroalcohlica modelo que simula el comportamiento de un obturador en una botella. Se trabaja con muestras de entre 25 y 50 tapones o con muestras mltiples de 10 tapones por lote. Los tapones enteros se sumergen en una solucin hidroalcohlica a 12% vol de etanol durante 24 h. Al cabo de ese tiempo, se mide el TCA que ha migrado a la solucin (TCA liberable) para representar la fraccin del TCA del corcho susceptible de migrar al vino. Se utiliza la tcnica de "head-space solid phase micro-extraction" (HSSPME) combinada con la cromatografa en fase gaseosa y con la deteccin de masa por fragmentometra ("selected ion monitoring" o SIM) para poder detectar y dosificar el TCA a niveles muy bajos (en torno a 1,5 ng/l). Apar te de los trabajos del Cork Quality Council en Estados Unidos (HERVE et al, 1999), no se ha realizado ningn otro trabajo de validacin seria de este concepto. En efecto, la mayor par te de los trabajos se ha concentrado en la tcnica de dosificacin del TCA aplicando el principio propuesto inicialmente por EVANS et al. 1997 (BUTZKE et al., 1998, RIBOULET et al., 2003), pero nunca en la interpretacin de los resultados obtenidos, es decir en la relacin potencial entre el contenido medio de TCA extrable medido en una muestra de
trabajo y la frecuencia de alteracin previsible en caso de utilizacin del lote de tapones en cuestin. En efecto, desde un punto de vista prctico, no importa tanto conocer el contenido potencial de TCA cedido por el tapn si no se puede estimar el nmero de botellas potencialmente afectadas por la utilizacin de tal o cual lote de tapones.
2.1 -Estudio de la distribucin del TCA liberable en los lotes de tapones de corcho natural o compuestos En los tapones compuestos destinados al taponado de vinos espumosos, clasificados previamente en diversos niveles de calidad mediante cata individual, se obser va que no se puede diferenciar los lotes de tapones de uso ms o menos arriesgado en funcin de su contenido medio de TCA liberable. En un lote de bajo riesgo (bueno) se pueden encontrar algunos tapones capaces de liberar cantidades impor tantes (> 7 ng/l) de TCA (figura 6). Tampoco existe una diferencia obvia entre los lotes considerados de riesgo "medio" y "alto". La nica diferencia existente entre los lotes de tapones clasificados como de bajo o alto riesgo reside en la proporcin de tapones que liberan ms o menos de 3 ng/l de TCA liberable. Aunque se lleve a cabo una maceracin orientada, limitando el contacto con la par te aglomerada de los tapones de Champagne, el cuerpo, con frecuencia ms contaminado (figura 7), per turba la medida del TCA liberable. Dado el estado actual de las tcnicas de fabricacin y a la luz de los trabajos realizados en este estudio, parece pues ms difcil prever la calidad de este tipo de obturador mediante la dosificacin del TCA liberable (figura 8a). Por lo que se refiere a los tapones de corcho natural, se obser va que en cier tos casos, los lotes considerados satisfactorios por el ensayo sensorial individual pueden contener asimismo un porcentaje considerable de tapo-
nes contaminados por encima de 8 ng/l/ tapn (figura 2). El contenido medio de TCA liberable de los tapones de
Figura 10 - Correlaciones existentes entre el contenido de TCA liberable medido en maceracin individual o conjunta y la
frecuencia de contaminacin medida en el lote para diversos tipos de tapones

Tabla 2 - Relacin entre el riesgo de utilizacin terico y la dosificacin de TCA liberable obtenida a partir de maceraciones conjuntas de tapones de corcho natural
Ensayo N total de tapones Nmero de Tapones sin contaminacin* Nmero de tapones con un potencial significativo de contaminacin (> 6 ng/l) y nivel individual de contaminacin (ng/l)
1 25 25
2 25 24
3 25 24
4 25 23
5 25 22
6 25 21
1 [13 ng/l]
1 [121 ng/l]
2 [13, 28 ng/l]
3 [14, 17, 21ng/l]
4 [ 12, 8, 7, 6 ng/l]
Riesgo real de utilizacin % TCA liberable en la maceracin conjunta Terico (ng/l)

0
4 4 nd 4,8 trazas ** 13 5 1,7 8
12 6,5
16 1,6
Medido nd* (ng/l)
Riesgo evaluado (1) %
0 24,2 7,9
16,1
1,8
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corcho natural permite diferenciar ms fcilmente los lotes de riesgo del resto. Se obser va una buena correlacin entre el nivel medio de TCA liberable dosificado por maceracin individual y la calidad del lote estimada por el procedimiento de evaluacin sensorial (figura 8b).
tenido de TCA liberable medido en una maceracin conjunta (25 tapones/500 ml) y la media de las dosificaciones individuales de los mismos tapones de corcho natural y de Champagne. Adems, en los tapones de corcho natural, existe una
2.2- Utilizacin de la medida del TCA liberable para la previsin del riesgo de la utilizacin Si se admite que el muestreo de trabajo utilizado es representativo de la realidad de un lote, la dosificacin del TCA liberable por maceracin individual de los tapones de corcho natural y de los tapones de Champagne debe permitir determinar la proporcin de tapones cuya utilizacin presenta un riesgo. Como slo disponemos de los datos obtenidos por HERVE et al (1999), consideraremos, como primera hiptesis, que la migracin efectiva del TCA liberable del tapn al vino es idntica a
Figura 12 - Variabilidad y niveles de contaminacin de diver-
sos tipos de tapones por el TCA liberable (maceraciones individuales) buena correlacin entre el contenido de TCA medido en una maceracin conjunta o en maceraciones individuales, y la frecuencia de contaminacin por encima de 3 o de 6 ng/l (figura 10). En el caso de un bajo potencial contaminante (prximo al lmite de deteccin en los vinos, es decir en torno a 3 ng/l), la calidad de la correlacin es ms satisfactoria con los resultados procedentes de las maceraciones individuales que con los obtenidos a par tir de las maceraciones conjuntas. En el caso de los tapones de Champagne, la correlacin es ms baja, y no disponemos de ningn dato sobre la cuota de migracin del TCA liberable a la botella. Para comprobar estos resultados, despus hemos trabajado sobre muestras formadas por tapones de corcho natural. Se han utilizado series de 25 tapones (2-3 calidad de seleccin visual sin tratamiento super ficial) no contaminados (TCA liberable < 0,6 ng/l) en las que hemos incluido una proporcin variable de tapones idnticos contaminados naturalmente a muy diversos niveles (de 1 a 4 tapones por cada 25) y seleccionados tras la maceracin individual. Los resultados de la tabla II presentan la relacin existente entre el riesgo de utilizacin real y el riesgo estimado por el modelo de regresin obtenido a par tir de las maceraciones conjuntas de tapones de corcho natural. As pues, los tapones contaminados a un nivel no detectable (< 0,6 ng/l) desembocan en una ausencia de riesgo de la utilizacin (ensayo 1). En el caso de lotes con una proporcin de tapones contaminados a un nivel moderado (13 ng/l individual de TCA liberable, potencial
Figura 11 - Correlaciones existentes entre el contenido de
TCA liberable medido en maceracin individual o conjunta y la frecuencia de contaminacin medida en el lote para diversos tipos de tapones la obser vada en los tapones de corcho natural, es decir de alrededor de un 50%. En estas condiciones, admitiendo que una concentracin de TCA superior a 1,5 ng/l en los vinos espumosos y a 3 ng/l en los vinos tranquilos puede causar un trastorno organolptico, los tapones que liberan individualmente ms de 3 ng/l en el primer caso y ms de 6 ng/l en el segundo podran causar contaminaciones excesivas y representan lo que hemos llamado tapones de riesgo. En un primer tiempo, hemos comparado el resultado de la dosificacin del TCA liberable obtenida a par tir de maceraciones conjuntas o individuales de lotes de tapones comerciales de corcho natural y de Champagne. Los resultados de la dosificacin del TCA liberable se presentan en las figuras 9 a) y b). Se obser va que existe una buena correlacin entre el con-
de migracin = 6.5 ng/l si la migracin admitida es del 50%), pero cuyo riesgo de utilizacin ya es alto (1 tapn/25: 4%), la dosificacin del TCA liberable a par tir de una maceracin conjunta no permite estimar la frecuencia de contaminacin (ensayo 2). En el ensayo 3, con la misma proporcin de tapones contaminados (4%), pero esta vez con un nivel muy alto (potencial contaminante = 60 ng/l), el riesgo de utilizacin estimado por la dosificacin est muy sobrevalorado (24% frente al 4% en la realidad). Cuando los tapones tienen un potencial contaminante bastante moderado (migracin terica de 6-10 ng/l) y estn presentes con una frecuencia superior al 4%, el riesgo de utilizacin se aprecia bien mediante la dosificacin del TCA liberable en una maceracin conjunta (ensayos 4 y 5). Pero en el caso de una contaminacin frecuente (ensayo 6) por tapones cuyo potencial contaminante (3 a 6 ng/) supera ms escasamente el lmite de percepcin organolptica del TCA (# 3 ng/l), el riesgo de utilizacin est muy infravalorado (2% frente al 16% en realidad). En cuanto a los tapones de corcho natural, segn el modelo obtenido a par tir de nuestras obser vaciones (figura 10b) y si se fija un riesgo mximo de utilizacin en un 3% de tapones contaminantes (que liberan al menos 6 ng/l de TCA liberable), no se debera aceptar lotes de tapones que liberen ms de 2,6 ng/l en maceracin conjunta (25 tapones/500 ml) para los vinos tranquilos (alteracin por encima de 3 ng/l de TCA). Si el riesgo de utilizacin se reduce al 1%, el TCA liberable mximo alcanza 1,6 ng/l, es decir aproximadamente el lmite de cuantificacin de la dosificacin. a) tapones contaminados a partir de 3 ng/l de TCA liberable (potencial contaminante terico > 1,5 ng/l de vino) 2.3- Caso especial de los tapones sintticos a base de corcho ALTEC de SABATE La aparicin de una nueva generacin de tapones industriales fabricados a base de granulados de corcho y de diversos coadytuvantes texturizantes ha permitido obtener obturadores tcnicos muy eficaces y de calidad muy superior a la de los tapones aglomerados tradicionales. Se han sucedido varias fabricaciones tras el lanzamiento del tapn Altec de SABATE en Francia. Diversas peripecias en la seleccin de la materia prima utilizada y las tcnicas de fabricacin han podido afectar a la calidad de ciertas remesas, y han alterado la confianza en este tipo de obturador. Taras varias modificaciones del proceso de seleccin de granulados y de mtodos de fabricacin, el grupo SABATE ha recurrido a nosotros para validar los procedimientos de control de calidad de los tapones Altec de nueva generacin, para permitir certificar la presencia de TCA y posible el riesgo de contaminacin de los lotes de tapones fabricados.
Habida cuenta de los mtodos de fabricacin de los granulados empleados, de las diversas etapas de mezcla de granulados con los distintos agentes aglomerantes y texturizantes utilizados y del moldeo individual de cada tapn, hemos demostrado que la utilizacin de la dosificacin del TCA liberable en maceracin individual o conjunta a partir de una muestra de tapones Altec nuevos daba resultados sumamente homogneos entre tapones (figura 11). Comparados con los dems tipos de obturadores y concretamente con otros tipos de obturadores sintticos a base de corcho inspirados en el modelo Altec, todos los dems tapones presentan un ndice de variacin del contenido de TCA contaminante muy superior (figura 12). Con Altec, para una misma categora, y dentro de un mismo lote, la variacin media es de 0,13 n/l de TCA liberable, con una desviacin mnima que vara entre 0,2 y 0,6 ng/l (0,33 ng/l en promedio). Para un mismo tipo de fabricacin, la variacin entre lotes es de 0,37 ng/l para un potencial contaminante de 1,48 ng/l (la desviacin mnima vara de 0,87 a 2,15 ng/l). En los tapones de corcho naturales o los tapones compuestos, que siempre presentan un grado de variabilidad considerable, la problemtica del muestreo representativo siempre resulta difcil de resolver. Con los tapones Altec, la gran homogeneidad medida permite predecir fcil y seriamente la calidad de un lote de fabricacin a partir del anlisis de un solo tapn. Asimismo, en caso de mezcla de lotes considerados similares a raz de un control previo, el control de calidad de lotes de Altec resulta infinitamente ms sencillo, y permite certificar el riesgo de utilizacin con mucha ms garanta.
3- Conclusiones
Los lotes de tapones de buena calidad no estn necesariamente libres de tapones contaminados; en realidad slo se diferencian del resto por una menor proporcin de tapones significativamente contaminantes. Aunque slo la frecuencia de contaminacin dentro de un lote es realmente representativa de su riesgo de utilizacin, hemos demostrado que se puede establecer una relacin entre la calidad de los lotes de tapones de corcho natural y su contenido medio de TCA liberable, pero no con su contenido de TCA total. Esta relacin es mucho menos evidente en los tapones compuestos de Champagne estudiados en este trabajo, pues, aunque se realice una maceracin orientada conforme a sus condiciones de uso, su composicin heterognea afecta mucho a los resultados de dosificacin. La dosificacin del TCA liberable en maceraciones conjuntas est relativamente bien correlacionada con las dosificaciones en maceraciones individuales para todos los tipos de tapones. En los tapones industriales a base de corcho Altec, la gran homogeneidad de fabricacin permite utilizar
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muy fcilmente la dosificacin del TCA liberable para controlar la calidad de los lotes. En el corcho natural, la frecuencia de tapones contaminados individualmente por encima de 3 o de 6 ng/l de TCA se puede relacionar satisfactoriamente con la dosificacin del TCA en una maceracin conjunta. Por lo tanto, y a condicin de admitir que el muestreo de trabajo utilizado es realmente representativo, se puede estimar la frecuencia de contaminacin de un lote de tapones en funcin del nmero de tapones de riesgo, es decir por los tapones capaces de liberar una cantidad suficiente de TCA para alterar la calidad de un vino tranquilo, a partir de la dosificacin de una maceracin conjunta. No obstante, los experimentos realizados sobre muestras compuestas demuestran bien que esta metodologa puede conducir a una infravaloracin del riesgo cuando el potencial contaminante de los tapones es moderado (3-6 ng/l) pero no por ello molesto. Por el contrario, una fuerte contaminacin de los tapones puede provocar una importante sobrevaloracin del riesgo y motivar el rechazo de lotes que son no obstante utilizables, pues poseen una frecuencia de tapones contaminados perfectamente aceptable. Por lo tanto, se podra considerar un control fcil y econmico de los lotes de tapones antes de su uso, siempre que se ponderen las conclusiones a la luz de los resultados expuestos. Y es que segn estos, los niveles de 4 a 6 ng/l utilizados a menudo en la actualidad como lmite de rechazo parecen considerablemente excesivos. Queda por estudiar ms finamente la relacin entre el TCA liberable medido en las condiciones de dosificacin en laboratorio y la migracin real durante la crianza en botella. Hoy por hoy, no disponemos de medidas suficientes para permitir la admisin y la generalizacin del valor aproximado de 50% medido por HERVE et al. (1999) en condiciones precisas. Es posible que en esta migracin influyan la calidad fsico-mecnica del corcho y algunos de los tratamientos aplicados a los tapones. Es pues necesario llevar a cabo estudios complementarios para valorar mejor su variabilidad en condiciones de uso reales. A partir de ese dato, sin duda se podr mejorar la estimacin del riesgo de utilizacin en funcin del contenido medio de TCA de una maceracin conjunta. No parece que se pueda apreciar tan sencillamente la calidad de los tapones compuestos que combinan corchos de diversas procedencias. La estructura heterognea de estos obturadores y el riesgo de migracin de TCA a partir de la parte aglomerada a pesar de la aplicacin de uno o de varios discos de corcho natural complica mucho el problema. No se sabe si este razonamiento se puede generalizar a todos los tapones compuestos. Por lo tanto, es necesario acometer trabajos especficos sobre este tipo de obturadores. Hemos demostrado que la distribucin de la contaminacin de los tapones, tanto en trminos de TCA total que de TCA
liberable, dentro de un mismo lote no sigue claramente la ley normal de distribucin. Ahora bien, la mayor parte de las tcnicas de muestreo y de interpretacin de resultados, como ANSI/ASQC Z 1.4-1993 Plan/US Military Standards (FUSELSANG et al.., 1995, AFNOR, 2000) se basan en la hiptesis de una distribucin homognea que cumple la ley normal o del binomio. El Sequential Probability Ratio Test (SPRT) (SIMPSON y VEITCH, 1993) exige tomar muestras hasta alcanzar el umbral de rechazo; esta solucin resulta pues muy pesada y poco compatible con las condiciones de trabajo en enologa. En realidad, es ms conveniente utilizar, como modelo de distribucin de la contaminacin por el TCA, la ley de Poisson, que permite considerar los incidentes de escasa probabilidad dentro de una serie larga, en vez de la ley de Laplace-Gauss. En la prctica, slo se puede utilizar el Fraction Defective Sampling Plan (FDSP) (BUTZKE y SURPRENANT, 1997). Adems, incluye la nocin de riesgo de proveedor a (probabilidad de rechazar un lote de calidad aceptable) y de riesgo de usuario b (probabilidad de aceptar un lote de mala calidad) para un nivel de calidad determinado (Average Quality Level AQL y la proporcin de tapones defectuosos que debe ser rechazada Pt), cosa que no hacen el ANSI/ASQC o el SPRT. Salvo para los tapones de tipo Altec que presentan muy poca variacin, la cuestin de la representatividad de la muestra sigue completamente abierta. Hoy por hoy, habida cuenta de la distribucin y de la frecuencia de la contaminacin del corcho observada en los lotes de tapones, es cierto que el examen de muestras de trabajo limitadas a 10, 25 o 50 unidades para controlar la calidad de un lote que contiene varias decenas de miles de tapones slo permite descartar los lotes de peor calidad. La multiplicacin de los controles a escala de los subembalajes, que slo contienen algunos miles de unidades, es desde luego deseable, pero todava queda por especificar un mtodo serio y prctico de muestreo que responda satisfactoriamente a las exigencias de los fabricantes y de los usuarios de tapones.
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Origen y biosntesis de TCA en el corcho

1.- Introduccin
1.1.- Breve historia del corcho y sus aplicaciones. El corcho es un biopolmero de origen vegetal obtenido a partir de la corteza externa del alcornoque (Quercus suber L). Este rbol es tpico de la regin mediterrnea y ocupa extensas zonas de Espaa, Portugal, Francia, Italia, Grecia, Argelia, Marruecos y Tnez. En estos pases existen aproximadamente unas 2.178.000 hectreas de alcornocales. La mayor extensin corresponde a Portugal con 725.000 hectreas (33%), situndose Espaa a continuacin con 510.000 hectreas, que se localizan principalmente en Extremadura y Andaluca. El corcho es un producto que tiene como principales propiedades una baja densidad, gran elasticidad, adherencia, impermeabilidad y compresibilidad. Adems, posee otra serie de cualidades fundamentales: es compacto, resistente y se puede considerar inalterable. Estas caractersticas son bien conocidas desde la antigedad. De hecho, ya se utilizaba 3000 aos antes de Cristo en China como elemento de flotacin en artes de pesca. Ms tardamente se utiliz en la Grecia antigua para cerrar vasijas de vino y aceite. Los romanos tambin conocan las extraordinarias propiedades del corcho como elemento capaz de proporcionar un cierre eficaz, como lo atestigua el hallazgo de nforas cerradas con corcho en excavaciones en Pompeya, Campania o en numerosos barcos romanos hundidos a lo largo del Mediterrneo, y que en algunos casos han permitido mantener inalterable el contenido de dichos recipientes. Son las propiedades anteriormente reseadas las que determinaron que desde el siglo XVIII se empezara a usar regularmente en la industria, sobre todo despus de que el abad D. Perignon reinventara el tapn de corcho ya utilizado por griegos y romanos, aunque otros autores creen que tom la idea de peregrinos espaoles que visitaban la abada. Ya en 1750 se estableci en la frontera francoespaola la primera factora de tapones de corcho. En la
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ORIGEN Y BIOSNTESIS DE TCA EN EL CORCHO
actualidad la principal aplicacin del corcho es la fabricacin de tapones para embotellar vinos y espumosos, alcanzando la produccin mundial los 25.000 millones de unidades anuales ( http://www.amorimcork.com). En menor medida, el corcho tambin se utiliza en la fabricacin desde utensilios domsticos hasta pernos, plumillas, papel de corcho, chalecos salvavidas, etc. Adems es importante como elemento aislante y decorativo en construccin. Desde un punto de vista econmico la produccin mundial de corcho alcanz en 1999 las 335.000 toneladas, siendo Portugal el primer pas productor (55% de la produccin mundial), seguido de Espaa, cuya produccin se elev hasta 88.000 toneladas (26% del total). Sin embargo, y en lo que se refiere a produccin de tapones, Portugal ocupa el primer puesto (78% de la produccin mundial), mientras que la produccin en Espaa se reduce al 20%. Estos dos pases prcticamente copan la produccin mundial de tapones. De estos datos podemos deducir que al valor econmico intrnseco del proceso de manufactura del corcho hay que sumarle el extraordinario valor ecolgico de los alcornocales, sin duda uno de los ms tpicos ejemplos de bosque mediterrneo. Sin embargo, la enorme importancia econmica del tapn de corcho se ve en la actualidad amenazada por el problema conocido como cork taint o contaminacin del corcho, fenmeno por el cual el tapn sera el responsable de contaminar el vino con metabolitos de origen microbiano que le proporcionan olores y/o sabores desagradables que impiden su consumo. 1.2.- Composicin qumica y estructura del corcho. La pared celular es uno de los rasgos ms caractersticos de las clulas vegetales. Hay casos, como el del alcornoque, cuyas clulas tienen la capacidad de producir una pared celular secundaria muy engrosada (adems de la primaria) que es lo que conocemos como corcho. 1.2.1. Composicin qumica del corcho. El corcho es un heteropolmero muy complejo en el que qumicamente se distinguen varias fracciones: - La suberina es el componente mayoritario del corcho (45%) y el principal agente responsable de su elasticidad. Desde un punto de vista qumico, la suberina de corcho es una mezcla compleja de cidos fenlicos (especialmente cido ferlico) esterificados a cidos grasos de cadena larga (C14-C30). Tambin encontramos cidos ,-dicarboxlicos y -hidroxicidos (Garca-Vallejo et al., 1997). Anlisis realizados con suberina de peridermo de patata indican que los principales componentes de la fraccin fenlica son polmeros derivados del cido hidroxicinmico (Bernards et al., 1995). Una representacin de su estructura se puede apreciar en la Figura 1.1.
- La composicin en polifenoles del corcho es muy variable (aproximadamente el 33% en peso), pero el principal componente de esta naturaleza es la lignina. La lignina (aproximadamente el 27% en peso) es un polmero formado por restos fenilpropanoides derivados casi exclusivamente de los cidos p-cumrico, coniferlico y sinaplico, unidos entre s por enlaces ter o carbono-carbono (Azcn-Bieto y Taln, 1993). Es una estructura muy estable y extremadamente resistente a la degradacin, hecho que contribuye a aumentar tanto la resistencia qumica como fsica del corcho. Su objetivo fundamental es actuar como elemento de soporte que contribuye a la unin del resto de los componentes. Otros polifenoles presentes en corcho son los taninos (aproximadamente el 6% del peso) responsables, en ltimo trmino, de la peculiar coloracin del corcho. Muchos de estos polifenoles se descomponen, posiblemente por accin microbiana, en sus componentes bsicos, de manera que en el corcho podemos encontrar una gran cantidad de fenoles de bajo peso molecular como cidos (cinmicos, glico, vainllico, cafeico, ferlico, protocatecuato y elgico), aldehdos (benzaldehdo, vainillina,
Figura 1.1. Representacin simplificada de la estructura de la suberina (Kolatukkudy, 1981). Se indican en recuadros algunos de los derivados fenlicos ms significativos. etilvainillina y aldehido coniferlico) y cumarinas (Conde et al., 1997; Pea-Neira, et al., 1999). - Los polisacridos (en torno al 12% del peso) se localizan sobre todo en la pared celular y contribuyen a definir la textura del corcho. Los ms importantes son la celulosa y la hemicelulosa. La celulosa es un polmero lineal no ramificado de alto peso molecular, formado por unidades de -D-glucopiranosa unidas por enlaces glicosdicos (14). Las hemicelulosas son polmeros de pentosas y hexosas asocia-
das a celulosa y lignina en la pared celular (Cabral, 1988). - Las ceras (aproximadamente el 5% del peso) son componentes muy hidrfobos que reducen drsticamente la permeabilidad del corcho al agua y solutos. (Azcn-Bieto y Taln, 1993). Estn formadas por mezclas complejas de compuestos alifticos, siendo los mayoritarios los alcanos de nmero impar de carbonos (C29-C31). Tambin podemos encontrar compuestos terpenoides, concretamente triterpenos como cerina y friedelina (Caldas et al., 1985). - El 5% restante est constituido por agua, minerales, sales y otros componentes minoritarios como el glicerol. 1.2.2. Estructura del corcho. El corcho estructuralmente se podra definir como un parnquima suberoso, producido por el meristemo felodrmico de Quercus suber, que recubre el tronco y ramas del rbol, y que tiene una gran capacidad de regeneracin cada vez que es retirado del rbol, por trmino medio cada 8-11 aos. Al microscopio est compuesto por clulas poligonales, ligeramente aplanadas, ocupadas principalmente por aire (Prez y Prez, 1996) y que presentan una disposicin bastante regular en capas superpuestas. Esta estructura particular es consecuencia del proceso de suberificacin durante el ciclo vegetativo de la planta. Con este proceso el lumen celular se restringe y el protoplasto desaparece al ser totalmente reabsorbido. De la clula original slo queda la pared, formada por tres capas: 1.- Una capa celulsica, en contacto con las cavidades celulares. 2.- Otra capa suberificada de mayor espesor, compuesta por estratos superpuestos de suberina y cera y que es la que confiere al corcho su elasticidad. 3.- Otra ms externa o capa lignificada. El tejido suberoso no es homogneo, y de hecho est atravesado en su interior por poros o canales, con paredes ms o menos lignificadas, que constituyen las lenticelas, rellenas de polvo rico en taninos (Surez, 1992). La forma, tamao y porcentaje de lenticelas son responsables de la porosidad del corcho y dependen fundamentalmente de factores genticos.
1.3.- Microbiota del corcho.

El corcho es desde el punto de vista microbiano un ecosistema muy complejo en el que encontramos gran cantidad y variedad de microorganismos, y ello a pesar de que el corcho es un material que por sus caractersticas tiende a limitar el crecimiento de los microorganismos. Entre ellas citaremos, la relativamente baja concentracin de nutrientes y su baja actividad de agua. El valor de actividad del agua calculado para tapones de corcho almacenados en bolsas hermticamente cerradas es de 0.55-0.56, valor por debajo del lmite del crecimiento microbiano (Beuchat, 1983; Sarrete et al., 1992), aunque
suficiente para permitir la supervivencia de los microorganismos. La disponibilidad de agua no siempre es un factor limitante, ya que a lo largo del proceso de fabricacin del tapn existen fases que suponen un gran incremento del nivel de humedad del corcho. De hecho, tras una incubacin de tapones durante una semana en cmaras con humedad atmosfrica se aprecia un aumento gradual en sus niveles de humedad, obtenindose valores de actividad de agua de 0.86-0.89 (Danesh et al., 1997), adecuados para el crecimiento microbiano. En cuanto a la baja disponibilidad de nutrientes, debemos tener en cuenta que la compleja estructura del corcho determina que slo aquellos microorganismos con capacidad suberoltica, ligninoltica, o con capacidad para degradar celulosas y hemicelulosas, puedan mediante su capacidad degradativa acceder a compuestos ms sencillos y fcilmente metabolizables. Ambos factores determinan que los microorganismos se desarrollen preferentemente en la superficie del corcho. No obstante, algunos pueden penetrarlo profundamente y desarrollarse en las lenticelas, casi siempre como consecuencia de heridas producidas mecnicamente o por insectos. Estudios realizados con tcnicas de microscopa electrnica confirman que en la mayor parte de los casos los hongos filamentosos (los de mayor capacidad invasiva) no penetran en profundidad ms all de ocho a 15 niveles celulares (Silva Pereira et al., 2000a). Estos microorganismos se pueden dividir en dos grandes grupos: I).- Aquellos con capacidad para crecer a expensas del corcho (microorganismos saprfitos del corcho). II).- Microorganismos naturales de otros nichos ecolgicos (suelo, material vegetal, etc.) y que aparecen como contaminantes ocasionales del corcho. Sin embargo, diferenciar entre ambos grupos es prcticamente imposible. Si acaso los primeros presentaran una distribucin prcticamente universal, mientras que la aparicin de los segundos en el corcho sera ocasional. De hecho, la mayora de los microorganismos aislados se encuentran en el corcho ya en el momento de la extraccin del rbol, mientras que otros colonizan el corcho durante la etapa de reposo en patio, en el proceso de manufactura, en la fase de bodega o durante el almacenamiento en fbrica (Silva Pereira et al., 2000a). La microbiota del corcho es muy variada y podemos destacar la presencia de un elevado nmero de bacterias, hongos filamentosos y levaduras. En la tabla 1.1 se indican los microorganismos ms frecuentemente aislados a partir de corcho (Bureau et al., 1974; Davis et al., 1981; Lefebvre et al., 1983; Simpson y Lee, 1990; Lee y Simpson, 1993; Danesh et al., 1997). Otros autores han descrito la presencia ocasional de otros microorganismos no incluidos en la tabla para no alargarla excesivamente.
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Algunos de estos estudios se han realizado en Espaa. As, a partir de corteza de alcornoques y diferentes muestras de corcho (correspondientes a distintas etapas del proceso de fabricacin de tapn) obtenidas de robledales de Catalua se han aislado numerosos microorganismos: casi 50 especies de hongos filamentosos o mohos, tres levaduras (Cryptococcus sp., Rhodotorula glutinis y Saccharomyces cerevisiae) y varias cepas bacterianas pertenecientes a nueve gneros diferentes (Codina et al., 1993, Calvo et al., 1993; Calvo y Agut, 1996; Calvo et al., 1995). Por otro lado Muoz et al. (1996) han detectado en la corteza de alcornoques del Parque Nacional de los Alcornocales (Cdiz) un total de 112 hongos de los cuales dos son zigomicetos, 24 ascomicetos, 42 basidiomicetos y 43 deuteromicetos.
La mayor parte de estos estudios se han centrado en la caracterizacin de la microbiota de hongos filamentosos. As Lee y Simpson (1993) indican que los hongos predominantes en corcho recin recogido son los Penicillium, y en menor medida Trichoderma y Acremonium. Por el contrario, en una partida de tapones de Australia los gneros dominantes fueron Penicillium, Trichoderma, Cladosporium y Rhizoctonia (Simpson y Lee, 1990). Otros autores indican que el hongo dominante en muestras de corcho portugus es Chrysonilia sitophila (Danesh et al., 1997). En todo caso, la microbiota del corcho puede variar considerablemente dependiendo de su origen, tipo de muestra (corteza, tapn, etc.) y condiciones ambientales. A pesar de las limitaciones del corcho para el crecimiento de los microorganismos, se trata de un material capaz de soportar poblacio-
Tabla 1.1.- Microorganismos detectados con mayor frecuencia en muestras de corcho.
BACTERIAS
Bacillus Corynebacterium Flavobacterium Kurtia Listeria Micrococcus M. luteus Nocardia Pseudomonas Streptomyces
HONGOS FILAMENTOSOS
Acremonium Alternaria Aphanocladium Aspergillus A. niger A. flavus Armillaria Aureobasidium Cladosporium Chrysonilia (Monilia) C. sitophila Eurotium Fusarium Mucor M. hiemalis Neurospora Paecilomyces Penicillium P. glabrum P. chrysogenum P. citrinum P. decumbens P. frequentans P. granulatum P. glabrum P. meleagrinum P. purpurogenum P. spinolosum P. variabile Phoma Rhizopus Stachybotrys Trichoderma T. longibrachiatum T. viride Troncatella Verticillium
LEVADURAS
Candida C. famata Cryptococcus Rhodotorula R. glutinis Saccharomyces Sporodiobolus S. johnsonii
nes microbianas enormes. As, en corteza de corcho se han detectado hasta 3 x 106 hongos filamentosos y 7 x 105 bacterias por gramo. Estos niveles aumentan hasta alcanzarse en la fase de maduracin en bodega unos valores mximos de 1 x 108 hongos filamentosos y 5 x 103 bacterias por gramo (Calvo y Agut, 1996). No obstante y a pesar de su alto contenido microbiano sabemos muy poco acerca de la posible influencia de la microbiota asociada a corcho en la calidad final del tapn. Sin embargo, los productores mantienen que los hongos que crecen sobre corcho tendran un efecto beneficioso, ya que produciran un emblandecimiento que favorecera su manejo, adems de producir el colapso de las lenticelas, lo cual resulta en un tapn ms compacto y con menores prdidas. Sin embargo, estas afirmaciones deben ser tomadas con cautela, ya que no existen datos experimentales que las confirmen (Silva Pereira et al., 2000a).
1.4.- Los microorganismos del corcho y el problema del cork taint o contaminacin del corcho (sabor a corcho o sabor a moho de los vinos).
El trmino cork taint, o contaminacin del corcho, hace alusin al aroma terroso y/o mohoso que presentan en ocasiones los vinos, y que impide su comercializacin. Este fenmeno es reconocido como un problema muy serio en la industria del vino, ya que a bajos niveles causa la prdida de sus caractersticas frutales y enmascara su aroma (Amn et al., 1989). Segn algunos autores, la incidencia del problema oscila entre el 2-7% del total de botellas (Butzke et al., 1999). Para otros el porcentaje es ligeramente ms bajo, variando entre el 0.5-6% (Lee y Simpson, 1993). No obstante, independientemente de la incidencia real del problema, se estima que el vino estropeado por este fenmeno supone a las bodegas de todo el mundo unas prdidas anuales de 10.000 millones de dlares, incluyendo las causadas por fugas y oxidaciones por defectos fsicos del corcho (Butzke et al., 1999). Son muchas (unos 100 compuestos voltiles) las sustancias identificadas como posibles agentes causantes del cork taint
(Amn et al., 1989). Ver Tabla 1.2. Entre ellos destacan los cloroanisoles como el pentacloroanisol (PCA), el 2,3,4,6-tetracloroanisol (2,3,4,6-TeCA) y especialmente el 2,4,6-tricloroanisol (2,4,6-TCA) como los agentes que contribuyen en mayor medida a este problema. Especialmente importante es el papel del 2,4,6-TCA, considerado como el compuesto responsable del 80% de los casos detectados, y que en un estudio sobre vinos australianos afectados por este problema, lleg a detectarse en el 100% de las botellas (Pollnitz et al., 1996). Adems, algunos estudios establecen una clara correlacin entre la presencia 2,4,6-TCA en vino y tapn o entre la presencia de 2,4,6-TCA e intensidad de la contaminacin del corcho (Pea-Neira et al., 2000). Otro compuesto importante es el guayacol (un derivado del cido vainllico) que proporciona al vino un sabor medicinal, fenlico o a quemado y que podra originarse por la accin de microorganismos que degradaran la lignina (Maga, 1978). De menor importancia citaremos la geosmina (proporciona aromas y sabores terrosos) y el 2-metilisoborneol, que aporta desagradables sensaciones a lodo. Ocasionalmente tambin se han detectado compuestos alifticos como octanol, octanona-3-octanal, 1-octeno-3-ona y 1octen-3-ol. Finalmente, citemos pirazinas y metoxipirazinas y diferentes sesquiterpenos identificados en muestras de corcho contaminadas por Penicillium roquefortii (Amn et al., 1989). Se cree que estas sustancias son producidas por microorganismos que crecen sobre el corcho utilizado en el taponado de las botellas de vino, aunque las evidencias al respecto son escasas. Sin embargo, es necesario mencionar que el fenmeno de la contaminacin del corcho es muy complejo, ya que a menudo no es posible establecer una relacin directa entre el cork taint y una nica sustancia en una matriz qumicamente tan compleja como el vino. As, Silva Pereira et al. (2000a) sostienen que es probable que en muchos casos, varios compuestos contribuyan de forma simultnea y sinrgica a este fenmeno, siendo la contribucin parcial de cada compuesto difcil de determinar.
Tabla 1.2. Principales compuestos qumicos y sus caractersticas organolpticas responsables de la contaminacin del corcho.
COMPUESTO QUMICO
Cloroanisoles (2,4,6-TCA; 2,3,4,6-TeCA y PCA) Guayacol Geosmina 2-metilisoborneol Compuestos alifticos: octanol, octanona-3-octanal, etc Pirazinas y metoxipirazinas Terpenos (sesquiterpenos)
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS
Sabor y olor a corcho y/o moho Sabor y olor fenlico, medicinal o a quemado Sabores y olores terrosos Sabores y olores a lodo Sabores y olores a moho Sabores y olores terrosos y/o a moho Sabor y olor a moho
POSIBLES MICROORGANISMOS PRODUCTORES

Hongos filamentosos? Actinomicetos? Actinomicetos? Penicillium? / Aspergillus? Penicillium? / Aspergillus? Penicillium? / Aspergillus? Penicillium roquefortii
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1.4.1.- Posibles mecanismos de formacin del 2,4,6-tricloroanisol. A pesar de la gran importancia del 2,4,6-TCA en el fenmeno del cork taint, el conocimiento que existe acerca de los mecanismos que conduciran a su formacin es ms bien escaso. Aunque son varias las hiptesis enunciadas, los datos experimentales para intentar confirmarlas o refutarlas son casi inexistentes. Los hipotticos mecanismos para su formacin se resumen en la Figura 1.2. 1.4.1.a.- Sntesis por catabolismo (deshalogenacin y biometilacin) de fenoles altamente clorados. El 2,4,6-TCA se originara por catabolismo de fenoles altamente clorados (mecanismo 1 en Figura 1.2) como el PCP o el 2,3,4,6-TeCP (Maarse et al ,1989; Tanner et al., 1981). Tambin el hexaclorobenceno o el lindano (hexaclorociclohexano) podran originar 2,4,6-TCA por deshidrohalogenacin (Neidlemann y Geigert, 1986). Estos compuestos son muy txicos y su metilacin para dar lugar a anisoles podra ser un mecanismo de detoxificacin, puesto que los fenoles menos clorados tienen una menor toxicidad y adems son ms fcilmente biodegradables por microorganismos anaerobios (Nicholson et al., 1992; Mohn et al., 1992). 1.4.1.b.- Deshalogenacin de anisoles altamente clorados. El 2,4,6-TCA podra originarse por la eliminacin de tomos de cloro (deshalogenacin) de anisoles clorados como el PCA o el 2,3,4,6-TeCA (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981). Ver mecanismo 2 en Figura 1.2. 1.4.1.c.- Sntesis por halogenacin (cloracin) de anisol por lavado de corcho con hipoclorito. Otros autores apuntan que la biometilacin del fenol podra ser anterior a la cloracin (Neidleman y Geigert, 1986). As, los cloroanisoles se formaran a partir de anisol (metoxibenceno) durante la etapa de lavado con hipoclorito que en ocasiones se realiza en el proceso de fabricacin del tapn (mecanismo 3 en Figura 1.2). Algunos estudios indican que el 18% del corcho lavado con hipoclorito contena de 6 a 13 ng de 2,4,6-TCA por gramo y todos contenan 2,4,6-TCP en el rango 19-301 ng por gramo de corcho (Sponholz y Muno, 1994). Por ello, el bao clorado ha sido reemplazado por un lavado con perxido de hidrgeno al 10% (conteniendo un 5% de amonio). Este proceso de cloracin podra ser un proceso de destoxificacin que algunos microorganismos poseeran para eliminar tomos de cloro presentes en el ambiente en el que crecen. Tambin se ha postulado que la limpieza en la bodega con hipoclorito de los pals y estanteras donde se almacenan las botellas de vino sera otra posible causa de contaminacin (Maujean et al., 1985). 1.4.1.d.- Sntesis endgena del ncleo fenlico y posterior
cloracin y metilacin. Maujean et al., (1985) sugieren que el ncleo fenlico del 2,4,6-TCA podra formarse a partir de glucosa; sta a travs de la ruta de las pentosas fosfato originara cido siqumico que sera el precursor del fenol, el cual sera clorado para dar lugar a 2,4,6-TCP. Finalmente, este compuesto sera metilado para su destoxificacin mediante una actividad metiltransferasa, en presencia de cido flico como cofactor y S- adenosilmetionina (SAM) como donador de grupos metilo (mecanismo 4 de la Figura 1.2). 1.4.1.e.- Biometilacin a partir de clorofenoles como el 2,4,6-TCP. En este caso el 2,4,6-TCA se formara por biometilacin directamente a partir del 2,4,6-TCP (modelo 5 en Figura 1.2) (Silva Pereira et al., 2000b). Una posible fuente de clorofenoles sera su absorcin por la corteza del rbol. Los clorofenoles podran tener su origen en la contaminacin ambiental, debido a su uso como fungicidas y pesticidas en los alcornocales, o durante el almacenaje de las planchas para prevenir el crecimiento de microorganismos (Kun y Suflita, 1989). Independientemente de cual sea el proceso que da lugar a la formacin de anisoles, parece claro que existe una relacin directa entre la contaminacin del corcho con clorofenoles y la aparicin de cloroanisoles. No podemos dejar de mencionar que los clorofenoles han sido ampliamente utilizados durante dcadas como pesticidas y preservantes de la madera, tanto en agricultura como en industria. En consecuencia han llegado a convertirse en contaminantes que pueden encontrarse en prcticamente cualquier ecosistema (Chaudhry y Chapalamadugu, 1991). De hecho, algunos estudios han demostrado que el 2,4,6TCP y el 2,4,6-TCA son contaminantes de los ecosistemas acuticos de agua dulce en Suecia (Nystrom et al., 1992). Este hecho se agrava por la elevada recalcitrancia de estos compuestos a la degradacin, lo que determina su persistencia en los ecosistemas durante periodos de tiempo muy largos. 1.4.2.- Los microorganismos del corcho y la produccin de 2,4,6-TCA. A pesar de que el 2,4,6-TCA es el principal agente responsable del cork taint (Amon et al., 1989; Buser et al., 1982), no existen apenas estudios que de manera inequvoca identifiquen microorganismos productores de este compuesto. La mayora de los autores sugieren que los hongos filamentosos son los responsables de la sntesis de este compuesto: as Daly et al., (1984) y Sponholz y Muno (1994) hablan de un hongo que produce esporas negras que cuando crece sobre corcho puede producir 2,4,6-TCA. Silva Pereira y colaboradores (2000b) afirman que algunos hongos aislados del corcho tienen bajo potencial de produccin de 2,4,6-TCA a partir de 2,4,6TCP (0.03% a 9,5%). Destacan el caso de Chrysonilia sitophila, hongo que tras la fase de cocido y durante el alma-
cenamiento en bodega experimenta un desarrollo incontrolado (Calvo et al.,1995), debido a que la elevada humedad relativa favorece su desarrollo.
A pesar de ello este hongo apenas puede sintetizar 2,4,6TCA (slo un 0.03% de 2,4,6-TCP es biometilado), lo cual es un hecho muy beneficioso para el corcho dado que su
Figura 1.2. Posibles mecanismos para la formacin de 2,4,6-TCA: 1.- Sntesis por catabolismo de compuestos clorados (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson et al., 1992; Mohn et al, 1992). 2.- Sntesis por deshalogenacin de anisoles altamente clorados (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981). 3.- Halogenacin de anisol mediante lavado de corcho con hipoclorito (Neidleman y Geigert, 1986; Sponholz y Muno, 1994; Maujean et al., 1985). 4.- Sntesis endgena del ncleo fenlico y posterior halogenacin y biometilacin (Maujean et al., 1985). 5.- Biometilacin directa de 2,4,6-TCP (Kun y Suflita, 1989; Silva Pereira et al., 2000b).
crecimiento imposibilitara el crecimiento de otros microorganismos posiblemente nocivos, la mayora de los cuales habran sido eliminados por el proceso de cocido. 1.4.3.- Posibles mejoras del proceso de fabricacin para evitar el cork taint o contaminacin del corcho. El grave problema que para las industrias que manufacturan tapn de corcho ha llegado a ser el cork taint ha hecho que algunos investigadores hayan propuesto que el tapn debiera ser considerado como una parte del vino y en consecuencia, tratado como un producto alimenticio a
lo largo de todo el proceso de fabricacin. As, Butzke et al. (1999) han propuesto las siguientes medidas posibles a fin de disminuir la incidencia de este problema, y que tienen como principal objetivo minimizar el contacto de la materia prima, tanto con organoclorados, como con posibles microorganismos productores de 2,4,6TCA: 1).- El uso de pesticidas y fungicidas conteniendo trazas de clorofenoles debera ser prohibido en los alcornocales y reas prximas, y los rboles sistemticamente analizados para verificar que estn libres de este tipo de com-
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puestos. 2).- Puesto que ciertos niveles de clorofenoles y 2,4,6TCA se han encontrado en muestras de corteza de alcornoques, los alcornocales deberan, en lo posible, ser protegidos de la polucin industrial y area. 3).- La corteza del alcornoque una vez retirada del rbol no debera entrar en contacto con el suelo, para evitar la contaminacin microbiana. 4).- Las planchas de corcho no deberan almacenarse en el bosque, en condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de microorganismos, sino en instalaciones industriales aireadas y saneadas (suelo de cemento). 5).- Las planchas no deberan ser almacenadas o transportadas en pals u otra estructura de madera que pueda contener clorofenoles como conservantes de la madera. 6).- El crecimiento microbiano sobre el corcho debera ser evitado a lo largo de todo el proceso de fabricacin. 7).- El agua en que se cuece el corcho debera ser libre de cloro y cambiada frecuentemente. 8).- El tratamiento blanqueador con hipoclorito debera ser eliminado y en general se debera evitar el uso de cualquier agente halogenante. 9).- Los lotes de tapones deberan ser almacenados en condiciones de baja humedad para evitar el desarrollo de microorganismos, y siempre lejos de las planchas iniciales de alto contenido microbiano. 10).- Los tapones deberan ser almacenados en recipientes cerrados, sin contacto directo con el aire, para evitar la contaminacin microbiana y la absorcin de clorofenoles y cloroanisoles presentes en la atmsfera.
Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas aisladas del Mar Bltico y de sedimentos de lagos de Suecia (Neilson et al., 1988). Estos autores demuestran que dos especies del gnero Arthrobacter (aisladas de muestras de suelo) son capaces de llevar a cabo la O metilacin de mono, di, tri y tetracloroguayacoles y PCP para dar lugar a los correspondientes anisoles derivados (Neilson et al., 1983). Esta reaccin de O metilacin no est limitada a microorganismos procariotas. As Cserjesi y Johnson (1972) aislaron a partir de material vegetal de un bosque canadiense una cepa del hongo Trichoderma virgatum capaz de biometilar PCP para producir PCA. Otros autores han demostrado la O metilacin de varios compuestos fenlicos por el alga Euglena gracilis (Drotar y Fall, 1985a y 1985b), el protozoo Tetrahymena thermophila (Drotar y Fall, 1986) y la levadura Saccharomycopsis lipolytica (Drotar et al., 1987). Esta reaccin de O metilacin sera un mecanismo que algunos microorganismos han desarrollado para destoxificar o neutralizar los clorofenoles altamente txicos, mediante la metilacin de su grupo hidroxilo muy reactivo. Ello supone su transformacin en cloroanisoles con una toxicidad despreciable si se compara con la del clorofenol del que proceden. De hecho, la importancia de la reaccin de O metilacin de clorofenoles como mecanismo de destoxificacin ha sido sealada por varios autores (Cserjesi, 1967; Cserjesi y Johnson, 1972; Allard et al., 1987 y Neilson et al., 1988). Sin embargo, la informacin disponible sobre las reacciones de O metilacin que conducen a la formacin de anisoles es limitada. No obstante, en algunas bacterias como Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas se ha detectado una metiltransferasa constitutiva dependiente de S-adenosilmetiononina (SAM) implicada en la formacin de anisoles y tioanisoles. Esta actividad puede metilar una amplia variedad de sustratos (cloro y bromofenoles, clorotiofenoles, cloro y bromoguayacoles y cloro o bromocatecoles) en mayor o menor grado, aunque muestra una mayor actividad hacia tiofenoles (Neilson et al., 1988). Por otro lado en el basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium (hongo ligninoltico que causa la podredumbre blanca de raices), se han detectado varias O-metiltransferasas. Estas enzimas podran estar implicadas en la degradacin de lignina y secundariamente intervendran en la metilacin de fenoles clorados y dioxinas, cuya degradacin parece tener lugar a travs de intermediarios metoxilados. De hecho, se cree que en estos procesos degradativos el papel de la O metilacin sera generar un sustrato intermediario capaz de ser atacado ms fcilmente por las lacasas y lignina peroxidasas de este
1.5.- Los anisoles en la naturaleza.

Los anisoles no son compuestos que hayan merecido una gran atencin por parte de los investigadores. Vamos a continuacin a repasar las escasas referencias relacionadas con este tipo de compuestos. 1.5.1.- Significado de la O metilacin de clorofenoles: los cloroanisoles como productos resultantes de la destoxificacin de clorofenoles. Los clorofenoles son algunos de los xenobiticos ms recalcitrantes que podemos encontrar en la naturaleza, con el agravante de su amplia utilizacin como pesticidas y fungicidas en la agricultura o para la conservacin de la madera. Adems, constituyen la base en muchas industrias qumicas para la sntesis de otros plaguicidas ms complejos y efectivos. No es pues de extraar que muchos investigadores se estn centrando en la bsqueda de posibles estrategias degradativas de estos compuestos altamente contaminantes. Algunos estudios han demostrado que diversos anisoles y tioanisoles se pueden formar por O metilacin a partir de clorofenoles y clorotiofenoles por bacterias de los gneros
hongo (Jeffers et al., 1997). Hasta la fecha se han descrito en P. chrysosporium tres metiltransferasas diferentes implicadas en reacciones de O metilacin: - Una 3-O-metiltransferasa especfica de posicin meta, con alta actividad hacia el grupo 3-hidroxilo de varios cidos benzoicos sustituidos (Jeffers et al., 1997). - Una 4-O-metiltransferasa que podra participar en la metilacin de productos de degradacin de la lignina como cidos vainllicos y sirngicos especficamente en la posicin para (Eriksson et al., 1984). - Una O-metiltransferasa especfica de fenoles 2,4-disustitudos (Coulter et al., 1993). Esta enzima es interesante porque, aunque metila preferentemente 3-metoxi y 3,5dimetoxi-4-hidroxibenzaldehdos y cidos benzoicos y acetofenonas 3,5-disustitudas, tambin puede metilar eficientemente 2,4-diclorofenol y 2,4-dibromofenol, para generar los correspondientes anisoles. Aunque el rango de sustratos de esta enzima sugiere un papel en el catabolismo de lignina, no podemos excluir la posibilidad de que sea responsable de la formacin de 2,4,6-TCA y PCA observados cuando P. chrysosporium crece bajo condiciones no limitantes de fuente de nitrgeno (Bhasker Reddy et al., 1998 y 2000). Debemos mencionar tambin que se han descrito reacciones de O metilacin en las que intervienen metiltransferasas que usan clorometano como donador de grupos metilo en vez de SAM. Estas enzimas son responsables de la produccin de alcohol veratrilo (3,4-dimetoxibencil alcohol) por P. chrysosporium (Harper et al., 1990) y en el hongo Phellinus pomaceus de la produccin de anisoles a partir de distintos compuestos como 2-, 3- y 4-clorofenol y 2,6-diclorofenol (Harper et al., 1989; McNally et al., 1991). 1.5.2.- Los cloroanisoles como intermediarios en la degradacin de clorofenoles por basidiomicetos ligninolticos. La lignina es el biopolmero ms abundante en la naturaleza y es muy resistente a la degradacin dada su gran estabilidad qumica, debida a su estructura polifenlica, muy parecida a la de la suberina (ver Figura 1.1). Existen sin embargo algunos hongos basidiomicetos que causan la podredumbre blanca de la raz, como Phanerochaete chr ysosporium, que tienen una gran capacidad de degradacin de este biopolmero. Curiosamente la batera de enzimas ligninolticas son
de un gran inters como agentes que pueden degradar clorofenoles. Bhasker Reddi et al., (1998) han demostrado que este hongo es capaz de mineralizar 2,4,6-TCP cuando crece en un medio en el que existe una limitacin de la fuente de nitrgeno. Curiosamente cuando este microorganismo crece en un medio sin limitacin de nitrgeno no degrada el 2,4,6-TCP sino que lo metila, aunque muy lentamente para producir 2,4,6-TCA. 1.5.3.- Los anisoles y su importancia en la industria alimentaria. Adems del papel ya mencionado de los anisoles como responsables del cork taint, podemos encontrar en la bibliografa algn ejemplo ms en los que se cita a los anisoles como agentes responsables de olores y sabores desagradables en distintos alimentos. La primera mencin que se conoce en la literatura sobre el papel de los cloroanisoles como contaminantes de alimentos data del ao 1966, cuando Engel y colaboradores informaron de la presencia de 2,3,4,6-TeCA en partidas de huevos y pollo con un desagradable sabor a moho (Engel et al., 1966). Ms tarde se demostr que el 2,3,4,6-TeCA era el agente responsable del mal olor de un lote de pollos (Curtis et al., 1972 y 1974). Estos autores demostraron que la formacin de este compuesto poda tener lugar a partir de 2,3,4,6-TeCP por hongos filamentosos que crecan sobre el pollo como Penicillium crustosum, Aspergillus sydowi y Scopulariopsis brevicaulis. Estos microorganismos tambin podan metilar PCP. En un trabajo paralelo Gee y Peel (1974) aislaron a partir de restos de comida de la basura en un restaurante un total de 116 aislados fngicos pertenecientes a un total de 26 especies. De ellos 99 (el 85.3%) podan metabolizar 2,3,4,6-TeCP, mientras que 68 de 116 (58.6%) metilaban este compuesto a 2,3,4,6-TeCA, siendo las especies ms eficientes en ese proceso Penicillium cor ylophilum, Paecilomyces variotii y Aspergillus sydowi. Tambin se ha demostrado la implicacin del 2,4,6-TCA y el 2,3,4,6-TeCA en el desagradable olor y sabor de un lote de frutas secas. En este caso se concluy que estos compuestos se originaron a par tir de los clorofenoles presentes en grandes cantidades en los embalajes de cartn reciclado utilizados, de donde pasaron a los alimentos (Whitfield et al., 1985; Tindale et al., 1989). El microorganismo identificado como responsable fue el hongo Paecilomyces variotii (Whitfield et al.,
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1991). Tambin se ha demostrado la presencia de cloroanisoles en una par tida brasilea de caf contaminada con un desagradable olor fngico (Spadone et al., 1990). Estos compuestos tambin han sido sealados como productores de olores y sabores desagradables en agua para el consumo humano en Suecia (Nystrom et al., 1992). As, el anlisis de muestras de agua, tanto cloradas como no cloradas, permiti detectar niveles significativos de 2,4,6-TCA. Este estudio muestra que este compuesto est presente en los ecosistemas acuticos de agua dulce (ros y lagos) de Suecia. Los autores indican que el 2,4,6-TCA probablemente se originara por metilacin de 2,4,6-TCP, el cual podra aparecer en las muestras de agua como consecuencia del proceso de cloracin. En este estudio se aislaron varios microorganismos responsables de la metilacin del 2,4,6-TCP: hongos filamentosos de los gneros Acremonium, Phialophora y Penicillium y sorprendentemente, tambin varios actinomicetos con esta capacidad.
ganismos diferentes, inicialmente seleccionados en base a propiedades morfolgicas y/o fisiolgicas fcilmente observables y tpicas de cada grupo. De esta manera inicialmente seleccionamos un total de 69 aislados que parecan diferentes y que fueron artificialmente agrupados como sigue: - Hongos filamentosos. Se seleccionaron en base a caractersticas morfolgicas macroscpicas un total de 25 aislados (denominados F1 a F25) que pertenecieron a 14 especies diferentes (ver apartado 2A.2.1). - Levaduras. Un total de 11 aislados, llamados Y1 a Y11, que correspondieron a ocho cepas diferentes (ver tabla 2.2) 2A.2.2. Su identificacin se llev a cabo mediante la secuenciacin del ADNr 26S. - Bacterias no filamentosas. Aislamos 20 cepas (B1 a B20). Se seleccionaron en base a forma y coloracin de la colonia en medio PCA, crecimiento a 30 37C, tincin de Gram, produccin de endosporas y morfologa celular. - Finalmente, aislamos un total de 13 actinomicetos, (A1 a A13), seleccionados en base a su tpica morfologa filamentosa y el desarrollo de micelio en medio slido. Los caracteres empleados en su diferenciacin fueron: color de micelio sustrato y micelio areo, capacidad de esporulacin y produccin de exudado en medio MEY slido, as como la produccin de pigmentos en medio YPD lquido. 2A.2.- Caracterizacin de los microorganismos aislados. 2A.2.1.- Identificacin de los hongos filamentosos aislados de corcho. La identificacin, en colaboracin con la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT), se llev a cabo en base a aspectos morfolgicos de la colonia, caractersticas morfolgicas macro y microscpicas del micelio y propiedades fisiolgicas (capacidad de crecimiento en distintos medios a diferentes temperaturas).
2.- RESULTADOS Y ANLISIS

APARTADO 2A: CARACTERIZACIN DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A MUESTRAS DE CORCHO EXTREMEO. Objetivo: Dado el escaso conocimiento de la microbiota asociada a corcho en la Comunidad de Extremadura, pretendamos profundizar en el anlisis de la evolucin de la poblacin microbiana a lo largo del proceso de fabricacin del tapn, as como caracterizar aquellos grupos de microorganismos aislados que pudieran ser de inters. 2A.1.- Aislamiento de microorganismos a partir de muestras de corcho. Nuestro estudio comenz con el aislamiento de microorganismos a partir de muestras de corcho correspondientes a distintas etapas del proceso de fabricacin de tapn de corcho aglomerado. Se aislaron un total de 55 microor-
Tabla 2.1. Listado de las diferentes especies de hongos filamentosos aisladas a partir de corcho.
AISLADO
F1, F2, F4, F5, F10 F3 F6 F7, F20, F25 F8 F11 F12 F13, F17 F14, F24 F15, F22, F23 F16 F18 F19 F21
ESPECIE
Penicillium decumbens Acremonium strictum Fusarium oxysporum Trichoderma longibrachiatum Cladosporium oxysporum Mucor plumbeus Trichoderma viride Chrysonilia sitophila Penicillium purpurogenum Penicillium citreonigrum Paecilomyces viridis Verticillium sp. Penicillium chrysogenum Mortierella alpina
DEPSITO EN LA CECT
Aislado F2: CECT 20418 CECT 20419 CECT 20420 Aislado F25: CECT 20431 CECT 20421 CECT 20422 CECT 20423 Aislado F13: CECT 20424 Aislado F14: CECT 20425 Aislado F15: CECT 20426 CECT 20427 CECT 20428 CECT 20429 CECT 20430
Para la identificacin a nivel de especie del aislado F18 recurrimos a la secuenciacin de su ADNr 28S, mientras que las especies de Trichoderma se identificaron mediante un anlisis RFLP de la regin del ADNr 5.8S que contiene las regiones espaciadoras ITS1 e ITS2. Los hongos aislados pertenecan a 14 especies diferentes (ver tabla 2.1). El gnero dominante fue Penicillium con un total de cuatro especies aisladas. A continuacin destacaba el gnero Trichoderma (dos especies), mientras que slo se aisl una especie de los gneros Acremonium, Fusarium, Cladosporium, Mucor, Chrysonilia, Paecilomyces, Verticillium y Mortierella.
En general se trata de hongos cosmopolitas que se pueden encontrar en suelo, aire y restos vegetales, especialmente cuando las condiciones ambientales son de humedad elevada. Muchos de ellos ya haban sido aislados de corcho por otros autores (ver tabla 1.1 en introduccin), aunque hay que destacar que algunas especies como P. citreonigrum, M. alpina o Verticillium sp. han sido detectadas en corcho por primera vez. 2A.2.2.- Identificacin de las levaduras aisladas de corcho. La identificacin se llev a cabo mediante la secuenciacin parcial de una regin del ADN ribosomal 28S que incluye las regiones D1 y D2. Las especies identificadas se recogen en la
Tabla 2.2. Listado de las diferentes especies de levaduras aisladas a partir de corcho.
AISLADO
ESPECIE
TIPO
N DE ACCESIN EN GENBANK
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6, Y9 Y7, Y8 Y11
Cryptococcus sp. Y1 Rhodosporidium kratochvilovae Debaryomyces hansenii var. fabryi Sporobolomyces nylandii Rhodotorula slooffiae Sporobolomyces salmonicolor Sporidiobolus johnsonii Aureobasidium sp. Y11
Basidiomiceto Basidiomiceto Ascomiceto Basidiomiceto Basidiomiceto Basidiomiceto Basidiomiceto Levadura negra (Hongo imperfecto?)
AY167602 AY167603 AY167604 AY167605 AY167606 AY167607 AY167608 AY167611
tabla 2.2. Apreciamos como la mayor parte de las levaduras aisladas son basidiomicetos, con la excepcin del aislado Y3 perteneciente a los hongos ascomicetos, y del aislado Y11 perteneciente al enigmtico grupo de las levaduras negras de clasificacin incierta, aunque algunos investigadores incluyen el gnero Aureobasidium dentro de los hongos imperfectos (Muoz et al., 1996). Un total de seis levaduras se identificaron a nivel de especie, mientras que dos de ellas fueron slo identificadas a nivel de gnero y posiblemente se trate de nuevas especies. 2A.2.3.- Caracterizacin de las bacterias filamentosas aisladas de corcho. Se aislaron un total de 13 bacterias filamentosas con una clara capacidad de formar micelio, y que por tanto se seleccionaron como actinomicetos. De ellas nicamente se identificaron tres que para nosotros tenan algn inters como microorganismos con capacidad para degradar cido vainllico y producir guayacol (datos no mostrados). En concreto, se trataba de los actinomicetos A3, A5 y A13. Para su identificacin se secuenci su ADNr 16S. Las secuencias obtenidas han sido depositadas en el
GenBank con las calves de acceso AY154478 (ADNr 16S del actinomiceto A3) y AY154479 (la entrada uno corresponde al ADNr 16S del actinomiceto A5 y la entrada dos al ADNr 16S del actinomiceto A13). Las tres secuencias mostraron una homologa mayor del 97% con secuencias de ADNr 16S de varias especies del gnero Streptomyces. Por tanto, podemos afirmar que los tres actinomicetos analizados pertenecen al gnero Streptomyces y por ello han sido denominados Streptomyces sp. A3, Streptomyces sp. A5 y Streptomyces sp. A13. 2A.2.4.- Caracterizacin de las bacterias no filamentosas aisladas de corcho. Tradicionalmente las bacterias no filamentosas son el grupo de microorganismos al que menos inters se ha prestado en cuanto a su posible papel en el cork taint. En nuestro caso obtuvimos 20 aislados diferentes, pero dado su escaso inters como posibles productores de cloroanisoles nuestro estudio se centr en identificar aquellas cepas que pudieran llevar a cabo la degradacin del cido vainllico, como posibles responsables de la contaminacin del corcho por guayacol.
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Tabla 2.3. Nmero de microorganismos totales aislados a partir de las diferentes muestras correspondientes al proceso de fabricacin de tapn de corcho aglomerado.
MUESTRA
N DE MICROORGANISMOS TOTALES/ GRAMO DE CORCHO

3.57 ( 1.21) x 105 1.17 ( 0.45) x 105 6.91 ( 2.22) x 106 6.67 ( 2.34) x 106 1.35 ( 0.41) x 104 1.55 ( 0.68) x 101 0.40 ( 0.29) x 101
(A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza (B) plancha cocida (hervida) (C) plancha almacenada en bodega durante 3 semanas (D) plancha almacenada a la intemperie un periodo de tiempo indeterminado (E) granulado de corcho de 2-4 milmetros de dimetro (F) tapn aglomerado y suavizado (G) tapn aglomerado suavizado y tratado con SO2 (producto final) - El nmero de microorganismos decae notablemente a partir de la obtencin del granulado (muestra E), posiblemente debido a los procesos qumicos (mezcla con ltex, poliuretano, colas, etc) y fsicos (desintegracin mecnica) a que se somete el granulado para la obtencin del tapn, y que son nocivos para los microorganismos. - En el producto final (tapn aglomerado tratado con SO2 o muestra G) el nivel de microorganismos es prcticamente nulo. Slo ocasionalmente se aislaron hongos filamentosos o bacterias no filamentosas en un nmero mximo de 4-6 por gramo. En esta etapa nunca se detectaron levaduras ni actinomicetos. - El mayor nmero de microorganismos correspondi a la muestra almacenada en bodega (muestra C) donde se detectaron los siguientes valores de microorganismos: * 2.23 ( 0.61) x 104 bacterias no filamentosas. * 6.19 ( 2.36) x 106 hongos filamentosos. * 6.90 ( 3.25) x 105 actinomicetos. * 5.35 ( 1.35) x 103 levaduras. En esta etapa y a diferencia con el resto de las muestras los hongos filamentosos constituyen el grupo predominante. Esto es debido a que las condiciones de baja temperatura (20-24C) y alta humedad en bodega favorecen su crecimiento masivo. - Hay que destacar tambin que las poblaciones de bacterias no filamentosas predominan siempre sobre los actinomicetos. Esta tendencia se invierte en la muestra C, donde el nmero de actinomicetos se dispara y llega a triplicar el nmero de otras bacterias. Aunque no hay una explicacin clara para este fenmeno podemos suponer que el gran aumento de hongos filamentosos en esta fase podra resultar en la produccin de antibiticos que llegaran a limitar el crecimiento bacteriano, excepto en el caso de los actinomicetos, grupo que por su alta capacidad de produccin de antibiticos han desarrollado unos elevados niveles de
resistencia. - Finalmente mencionemos que excepto en la muestra C el grupo dominante es el de las bacterias no filamentosas, a diferencia de lo descrito por otros autores, que apuntan a los hongos filamentosos como poblacin dominante a lo largo del proceso de fabricacin. 2A.3.1.- Evolucin de la poblacin de hongos filamentosos a lo largo del proceso. Tradicionalmente se ha considerado que los hongos filamentosos jugaran un papel fundamental en el proceso de maduracin del corcho y en la calidad final del tapn (Lee y Simpson, 1993; Silva Pereira et al., 2000a). Por ello, una vez realizada la cuantificacin de la poblacin de hongos filamentosos decidimos tratar de determinar que cepas aparecan en cada etapa del proceso de fabricacin, a fin de determinar la posible predominancia de alguna especie en cada paso. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 2.4. Las conclusiones que pudimos obtener de este estudio son: - Todas las especies pudieron ser aisladas a partir de corteza (muestra A). - Adems, dos de los aislados, Mortierella alpina y Mucor plumbeus, slo pudieron ser detectados en esta etapa. - El cocido o calentamiento del corcho (muestra B) provoca la desaparicin de buena parte de los hongos filamentosos, puesto que un total de cinco especies nunca pudieron ser aisladas en esta etapa. - La posterior incubacin en bodega o a la intemperie provoca que dos de estas especies vuelvan a aparecer en corcho (Acremonium strictum y Verticillium psalliotae). - El tratamiento qumico y/o mecanico que sufren las muestras en la elaboracin del tapn provoca en las muestras E y F la desaparicin de un buen nmero de especies, mantenindose slo aquellas ms resistentes a
este tipo de tratamientos. - En el producto final (muestra F) slo se han podido detectar de manera ocasional Cladosporium oxysporum, Penicillium citreonigrum y Trichoderma longibrachiatum.
- El tratamiento del tapn con SO 2 es efectivo, puesto que el nmero de microorganismos en el producto final se reduce considerablemente. Este tratamiento tambin produce una disminucin de la variedad de especies detectadas, ya que pasamos de siete espe-
Tabla 2.4. Abundancia relativa (%) de las distintas especies de hongos filamentosos detectados en cada etapa del proceso de fabricacin del tapn de corcho aglomerado.
HONGO FILAMENTOSO
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA MUESTRA D MUESTRA E MUESTRA F MUESTRA G C

3.0 (0.2) 6.6 (0.4) 10.4 (1.2) 2.1 (0.1) 1.8 (0.2) 2.4 (0.2) 5.2 (0.1) 12.9 (0.5) 10.2 (0.2) 14.8 (0.7) 4.0 (0.4) 13.2 (1.0) 10.3 (0.9) 3.1 (0.4) ND 2.8 (0.3) 6.3 (0.4) ND ND ND 8.4 (0.7) 9.2 (0.7) 15.2 (0.9) 2.8 (0.1) 12.1 (0.5) 20.3 (1.6) 18.5 (1.4) 4.4 (0.1) 0.8 (0.2) 6.1 (0.3) 15.0 (1.0) 1.6 (0.2) ND ND 6.0 (0.7) 10.5 (0.8) 20.8 (1.2) 9.9 (1.0) 17.9 (2.0) 5.1 (0.4) 3.1 (0.4) 3.2 (0.4) ND 2.2 (0.2) 20.4 (1.7) ND ND ND ND ND 38.0 (4.1) ND 22.4 (3.3) 10.2 (1.2) 6.8 (0.7) ND ND 1.3 (0.3) 38.5 (2.8) ND ND ND ND 8.4 (0.5) 38.6 (3.2) 3.0 (0.2) ND 7.2 (0.8) 3.0 (0.5) ND ND ND 34.2 (4.6) ND ND ND ND ND 57.4 (7.8) ND ND 8.4 (1.3) ND ND
Acremonium strictum Chrysonilia sitophila Cladosporium oxysporum Fusarium oxysporum Mortierella alpina Mucor plumbeus Paecilomyces viridis Penicillium chrysogenum Penicillium citreonigrum Penicillium decumbens Penicillium purpurogenum Trichoderma longibrachiatum Trichoderma viride
0.8 (0.1) 57.4 (3.9) 6.4 (0.3) ND ND ND 2.5 (0.2) 3.4 (0.1) 3.0 (0.1) 4.6 (0.2) 1.0 (0.1) 11.3 (0.6) 9.6 (0.6)
Muestras de corcho: (A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza; (B) plancha cocida (hervida). (C) plancha almacenada en bodega durante tres semanas; (D) plancha almacenada a la intemperie un tiempo indeterminado; (E) muestra de corcho granulado; (F) tapn aglomerado y suavizado; (G) tapn aglomerado suavizado tratado con SO2 (producto final). Los valores mostrados son la media de estimaciones hechas por duplicado en 3 experimentos independientes. La desviacin estndar se muestra entre parntesis. ND: no detectado.
nas; (D) plancha almacenada a la intemperie un tiempo indeterminado; (E) muestra de corcho granuFigura 2.1. Evolucin lado; (F) tapn aglomerade la poblacin de do y suavizado; (G) tapn microorganismos a lo aglomerado suavizado tralargo del proceso de tado con SO2 (producto fabricacin del tapn final). Los valores mostraaglomerado de cordos son la media de esticho. (A) plancha no maciones hechas por procesada de corcho duplicado en 3 experimencrudo con corteza; tos independientes. La (B) plancha cocida desviacin estndar se (hervida). (C) plancha muestra entre parntesis. almacenada en bodega durante tres semaInforme Tcnico 47
APARTADO 2B: ANLISIS DE LA FORMACIN DE 2,4,6TRICLOROANISOL POR HONGOS FILAMENTOSOS AISLADOS DE CORCHO. Objetivo: El objetivo de este apartado era profundizar en el conocimiento del origen y los posibles mecanismos implicados en la produccin de 2,4,6-TCA por hongos filamentosos aislados de corcho. 2B.1.- Anlisis de la formacin de 2,4,6-TCA por hongos filamentosos creciendo directamente sobre corcho. Aunque son varias las hiptesis que intentan explicar el origen del 2,4,6-TCA en corcho, los datos disponibles en la bibliografa, sin ser concluyentes, indicaban que el mecanismo ms probable para la formacin del 2,4,6TCA sera la O metilacin de 2,4,6-TCP. Con estos antecedentes decidimos ensayar la posible capacidad de todos los hongos filamentosos aislados para realizar esta bioconversin, cuando creciesen directamente sobre corcho. Para ello se desarroll un ensayo que nos permiti imitar las condiciones de crecimiento de los hongos filamentosos en bodega durante el proceso de fabricacin del tapn. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 2.5. En ella vemos como 11 de las 14 especies analizadas incrementaban significativamente los niveles de 2,4,6TCA en corcho cuando el granulado de par tida fue suplementado con 2,4,6-TCP. Por el contrario, las muestras de corcho no inoculadas con hongo filamentoso, o aquellas a las que no se adicion 2,4,6-TCP, no mostraron un incremento apreciable de los niveles endgenos de
2,4,6-TCA. Por tanto, podemos concluir que la conversin de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA es un proceso biolgico mediado por la accin, en nuestro caso, de un hongo filamentoso. En funcin de los resultados obtenidos los hongos filamentosos se clasificaron en 4 grupos: - Grandes productores de 2,4,6-TCA. Aquellas especies como T. longibrachiatum, T. viride y F. oxysporum que podan bioconver tir ms del 25% del precursor. - Moderados productores. La eficiencia de bioconversin oscilaba entre el 10 y el 25%. En este grupo se incluan A. strictum, C. sitophila y C. oxysporum. - Bajos productores, cuando el grado de bioconversin era del 5-10%. En este grupo se encontraban P. viridis, P. chr ysogenum y V. psalliotae. - Finalmente los no productores. Aquellos como M. alpina, M. plumbeus y P. decumbens para los que el porcentaje de bioconversin fue siempre menor del 5%, ya que slo pudieron ser detectadas trazas de 2,4,6-TCA (la diferencia del contenido en 2,4,6-TCA respecto del control no era superior al 0.15%). Estas pequeas variaciones podran ser achacadas a variaciones normales del mtodo de medida. Es necesario indicar que de estas tres cepas slo P. decumbens mostr capacidad para crecer sobre granulado de corcho, por lo que la ausencia de 2,4,6-TCA en el caso de los cultivos de M. alpina y M. plumbeus podra ser debida a una falta de crecimiento ms que a una incapacidad para sintetizar 2,4,6TCA. Sin embargo, puesto que en cultivos en medio lquido de estas tres especies, tampoco se detectaron niveles apreciables de 2,4,6-TCA podemos concluir que su ausencia en los cultivos sobre corcho debera atri-
Tabla 2.5. Anlisis por cromatografa de gases-masas de los niveles de 2,4,6-TCA formado a partir de 2,4,6-TCP por hongos filamentosos creciendo directamente sobre granulado de corcho.
HONGO FILAMENTOSO
2,4,6-TCAa 2,4,6-TCAa BIOCONVERSION (%) DE CRECIMIENTO SOBRE (- 2,4,6-TCP) (+ 2,4,6-TCP) 2,4,6-TCP EN 2,4,6-TCA CORCHO
9.9 11.0 18.0 12.4 6.0 5.5 6.3 9.9 9.7 11.0 9.5 6.4 20.5 17.2 6.5 10.1 153.4 128.2 155.5 292.5 6.6 6.6 88.7 86.5 143.8 10.6 116.6 396.1 278.9 75.5 0 14.24 11.02 14.31 28.65 0.11 0.03 7.88 7.68 13.28 0.11 11.02 37.56 26.17 6.90 ND b +c + + + -d + + + + + + +
Muestra de corcho no inoculada Acremonium strictum Chrysonilia sitophila Cladosporium oxysporum Fusarium oxysporum Mortierella alpina Mucor plumbeus Paecilomyces viridis Penicillium chrysogenum Penicillium citreonigrum Penicillium decumbens Penicillium purpurogenum Trichoderma longibrachiatum Trichoderma viride
a Los valores indicados en ng/g de corcho son la media de medidas hechas por duplicado en dos experimentos independientes segn la metodologa descrita por lvarez-Rodrguez et al., (2002a) b ND, no detectado. c El nmero de UFCs por gramo de corcho tras la incubacin fue mayor de 5.5 x 105. d El nmero de UFCs por gramo de corcho tras la incubacin fue menor de 4.5 x 105. buirse a la incapacidad de estas cepas para su formacin. 2B.2.- Formacin de 2,4,6-TCA a partir de distintos precursores. Diversos autores han postulado que el 2,4,6-TCA podra formarse por varios mecanismos diferentes a partir de distintos precursores. Por ello, una vez que habamos identificado a T. longibrachiatum como el hongo filamentoso que poda producir con mayor eficiencia 2,4,6-TCA por O metilacin de 2,4,6-TCP, y que adems presentaba una alta capacidad de crecimiento sobre corcho, decidimos ensayar la posible existencia en este hongo de otros posibles de mecanismos de formacin de 2,4,6-TCA. Para ello, muestras de corcho conteniendo diferentes precursores, se inocularon con este hongo (tanto en ausencia como en presencia de hipoclorito sdico como agente halogenante) determinndose tras un periodo de incubacin adecuado el contenido de 2,4,6-TCA del corcho. Los resultados de este experimento (tabla 2.6) fueron los siguientes: - Los diclorofenoles, slos o en presencia de hipoclorito, no son sustratos efectivos para la formacin de 2,4,6-TCA mediante un mecanismo de O metilacin y halogenacin. - Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA en muestras que contenan como posibles precursores compuestos clorados como el hexaclorociclohexano, hexaclorobenceno, pentacloroanisol, 2,3,4,6-tetracloroanisol, PCP o 2,3,4,6-TeCP. En estos casos el 2,4,6-TCA podra haberse formado mediante un proceso degradativo que implicara necesariamente la O metilacin y deshalogenacin del precursor. - Entre los triclorofenoles ensayados el nico sustrato efectivo para la formacin de 2,4,6-TCA fue el 2,4,6-TCP: el nivel de conversin detectado era del 34.72%.
Tabla 2.6. Anlisis por cromatografa de gases-masas de la formacin de 2,4,6-TCA por el hongo filamentoso T. longibrachiatum a partir de diferentes posibles precursores.
PRECURSOR
2,3-DCP 2,3-DCP 2,3-DCP 2,4-DCP 2,4-DCP 2,4-DCP 2,5-DCP 2,5-DCP 2,5-DCP 2,6-DCP 2,6-DCP 2,6-DCP 3,4-DCP 3,4-DCP 3,4-DCP Hexaclorociclohexano Hexaclorobenceno PCP PCA 2,3,4,6-TeCP 2,3,4,6-TeCA 2,3,6-TCP 2,4,5-TCP 2,4,6-TCP Anisol Anisol Anisol Fenol Fenol Fenol
HIPOCLORITO T. LONGIBRACHIATUM SDICO

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
2,4,6-TCAa
8.6c 9.6 13.2 8.0 9.6 8.0 4.5 8.9 4.7 7.2 9.7 15.5 6.2 3.1 3.2 8.3 9.1 6.8 7.0 7.0 9.7 7.3 9.9 4.6 1.5 7.5 355.8 8.8 18.8 15.5 17.4 25.2 13.6
BIOCONVERSIN (%) DEL PRECURSOR EN 2,4,6-TCAb

0 0.10 0 0 0.03 0 0 0.11 0.83 0 0 0 0 0.05 0 0 0 0.11 0 0.13 0 0 0 34.72 0 1.02 0.69 0.88 1.66 0.50
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a Los valores mostrados en ng/g de corcho son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado segn la metodologa descrita por lvarez-Rodrguez et al., (2002a). b Los valores indicados son el resultado de restar en cada caso el contenido endgeno de 2,4,6-TCA del corcho. c Valor considerado como contenido endgeno de 2,4,6-TCA del granulado de corcho utilizado en este experimento. - Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA en cultivos suplementados con anisol (ni siquiera en presencia de hipoclorito), compuesto a partir del cual el 2,4,6-TCA podra haberse producido directamente por halogenacin. Una situacin similar se dio en los cultivos desarrollados en presencia de fenol. En este caso la produccin de 2,4,6-TCA implicara una reaccin de O metilacin y una halogenacin para introducir tomos de cloro en la molcula. Por tanto, podemos decir que en el hongo T. longibrachiatum el nico mecanismo efectivo detectado para la formacin de 2,4,6-TCA es la O metilacin de 2,4,6-TCP. Dicha reaccin, que resulta en la introduccin de un grupo metilo sobre el grupo hidroxilo del clorofenol, podra ser llevada a cabo por un enzima metiltransferasa que podra usar S-adenosilmetionina (SAM) como dona-
Figura 2.2. Probable mecanismo de formacin por T. longibrachiatum de 2,4,6-TCA por O metilacin de 2,4,6-TCP en una reaccin catalizada por una actividad enzimtica O-metiltransferasa (2,4,6-TCP metiltransferasa) que quizs pudiera usar SAM como donador de grupos metilo.
dor de grupos metilo, como podemos apreciar en la figura 2.2. Una actividad enzimtica similar, implicada en la formacin de anisoles y tioanisoles, ha sido detectada en bacterias aisladas a partir de lodos del Mar Bltico (Neilson et al., 1988). 2B.3.- Bioconversin de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA en medio lquido y su regulacin. Los resultados resumidos en el apartado 2B.1 fueron importantes porque demostraban la capacidad de varios hongos filamentosos, y ms especficamente de T. longibrachiatum, de producir 2,4,6-TCA en unas condiciones naturales similares a las de maduracin del corcho en bodega. Sin embargo, los ensayos a partir de cultivos sobre corcho nos planteaban varios problemas metodolgicos graves: incubaciones muy largas en el tiempo (25-30 das) y un complejo y costoso procedimiento de extraccin del 2,4,6-TCA de las muestras. Para evitar estos inconvenientes decidimos ensayar la posible produccin de 2,4,6-TCA en medio lquido y su
valoracin a partir de sobrenadantes de cultivos por HPLC, equipamiento disponible en nuestro laboratorio.
2B.3.1.- Desarrollo de un mtodo para identificar 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA por HPLC en sobrenadantes de medios de cultivo. Nuestro primer paso consisti en la puesta a punto de un mtodo de HPLC que nos permitiera separar eficazmente en sobrenadantes de cultivos el 2,4,6-TCP y el 2,4,6-TCA, (adems de otros compuestos como el 2,3,4,6-TeCP y el 2,3,4,6-TeCA utilizados como estndares internos). La columna elegida fue una columna de fase reversa Zrbax SB-C8 y se ensayaron diferentes fases mviles (metanol:agua, acetonitrilo:agua y acetonitrilo:cido frmico 5mM) en distintas proporciones, y tanto en rgimen isocrtico (lineal) como en gradiente. Tras varios intentos
se consigui una eficaz separacin de estos compuestos, que eluan en condiciones de rgimen isocrtico con una fase mvil de metanol:agua (75:25) con los siguientes tiempos de retencin: 2,3,4,6-TeCP (2.7 minutos); 2,4,6-TCP (3.2 minutos), 2,4,6-TCA (5.8 minutos) y 2,3,4,6-TeCA (6.8 minutos), como podemos apreciar en la figura 2.3. Figura 2.3. Perfil cromatogrfico de elucin por HPLC de varios clorofenoles y cloroanisoles a una concentracin de 50 mg/ml en una columna Zrbax SB-C8. La separacin se realiz en una fase mvil de metanol:agua (75:25) a un flujo de 1 ml/minuto en rgimen isocrtico. Los compuestos se detectaron a una longitud de onda de 230 nm. 2B.3.2.- Anlisis de la bioconversin de 2,4,6-TCP en cultivos en medio lquido. Una vez que disponamos de un mtodo de anlisis por HPLC y a fin de profundizar ms en el mecanismo de la reaccin de O metilacin decidimos comprobar si T. longibrachiatum poda producir 2,4,6-TCA en medio lquido. Para ello realizamos en paralelo dos cultivos en caldo extracto de malta: en uno adicionamos el precursor 2,4,6-TCP y en otro no. A continuacin tomamos muestras a distintos tiempos de cultivo en las que determinamos los siguientes parmetros: crecimiento (determinado como peso seco de micelio), niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA en sobrenadantes y niveles de la hipottica actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa asociada a micelio que sera responsable de la formacin de 2,4,6TCA. Los resultados se recogen en las figuras 2.4 y 2.5. La figura 2.4 nos muestra el resultado de analizar por HPLC los sobrenadantes del cultivo desarrollado en presencia de 2,4,6-TCP en los que detectamos un compuesto cuyo tiempo de retencin coincida con el del 2,4,6TCA. As, apreciamos como en un cultivo de cero horas
(panel A) se aprecia un pico muy evidente de 2,4,6-TCP. Este pico decrece rpidamente a las 24 horas (panel B), a la vez que comienza a detectarse un pico incipiente de 2,4,6-TCA. Los mayores niveles de este compuesto se detectan entre las 48 y 72 horas de cultivo, momento en que los niveles de 2,4,6-TCP son indetectables (panel C). La identificacin de este compuesto como autntico 2,4,6-TCA se bas en los siguientes datos: - Su presencia en el medio de cultivo es dependiente de la adicin del precursor 2,4,6-TCP, no detectndose nunca en caso contrario (datos no mostrados). - La adicin a un sobrenadante de cultivo de 72 horas de una pequea cantidad de 2,4,6-TCA exgeno produjo un incremento del pico identificado como 2,4,6-TCA (panel D de la figura 2.4). - Este compuesto migra como autntico 2,4,6-TCA en cromatografa en capa fina (datos no mostrados). De las grficas mostradas en la figura 2.5 podemos extraer varias conclusiones: - El hongo T. longibrachiatum tiene capacidad para transformar el 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo, como se puede concluir al ver su desaparicin progresiva en el panel A. De hecho este compuesto no es detectado despus de las 60 horas de cultivo. - Aproximadamente el 32% del 2,4,6-TCP es transformado a 2,4,6-TCA. Podemos apreciar como en el panel A ya detectamos la presencia de este compuesto a las 48 horas de cultivo, acumulndose de manera progresiva para alcanzar un mximo en torno a las 60-72 horas. Posteriormente los niveles detectados decaen ligeramente hasta el final de la fermentacin (120 horas). No sabemos a que se debe esta ligera disminucin de los niveles de 2,4,6-TCA en el cultivo. Podra deberse a un proceso de fijacin al micelio, o a la posible evaporacin al abrir los matraces para tomar las muestras (el 2,4,6TCA es un compuesto relativamente voltil). Tampoco se puede descartar una posible degradacin, aunque creemos que es bastante improbable dada la gran estabilidad qumica de este compuesto. - Es muy importante resear que no existe una correlacin directa entre la cantidad de 2,4,6-TCP que desaparece del cultivo y la cantidad de 2,4,6-TCA que se produce. El 68% restante de 2,4,6-TCP podra ser degradado, o alternativamente convertirse en otro producto no detectado que fuese secretado al medio o metabolizado. Sin embargo, debemos mencionar que ensayos de mineralizacin de 2,4,6-TCP [C14] por T. longibrachiatum realizados en el laboratorio de la Dra. M Jess Martnez (CIB, CSIC, Madrid) resultaron negativos. Por tanto, podemos concluir que el 2,4,6-TCP que no es convertido a 2,4,6-TCA no se degrada hasta CO2. Este dato puede sugerir que parte del 2,4,6-TCP podra ser degradado hasta algn producto intermediario que pudiera ser incor-
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Figura 2.4. Cromatogramas de HPLC correspondientes a sobrenadantes de un cultivo de T. longibrachiatum. (A). Cultivo de 0 horas. (B). Cultivo de 24 horas. (C) Cultivo de 72 horas y (D) cultivo de 72 horas al que se ha aadido 2,4,6-TCA exgeno para confirmar la identidad de este compuesto. Los picos correspondientes a 2,4,6-TCP y 2,4,6TCA se indican con flechas.
Figura 2.5. Comportamiento de un cultivo de T. longibrachiatum crecido en presencia (A) y ausencia (B) de 2,4,6-TCP. Las grficas mostradas son el resultado de analizar por duplicado muestras correspondientes a tres experimentos independientes. Los niveles de 2,4,6TCP y 2,4,6-TCA se determinaron por HPLC a partir de sobrenadantes de cultivos.
porado como material celular, aunque la confirmacin de esta hiptesis requerira complejos estudios. - La produccin de 2,4,6-TCA es absolutamente dependiente de la presencia de 2,4,6-TCP en el medio de cultivo (ntese la ausencia de 2,4,6-TCA en el panel B). Este dato sugiere que al menos en las condiciones de nuestro ensayo no hay sntesis endgena de 2,4,6-TCA a partir de precursores celulares. - Como era previsible detectamos asociada a micelio una actividad O-metiltransferasa, que denominamos 2,4,6-TCP metiltransferasa (ver panel A). Esta enzima sera la responsable de la O metilacin del precursor 2,4,6-TCP. Esta actividad comienza a detectarse a las 36 horas de cultivo, alcanzando su actividad mxima alrededor de las 48 horas, precediendo por tanto en unas 12 a 24 horas la mxima acumulacin de 2,4,6-TCA en sobrenadantes. A partir de las 48 horas, coincidiendo con la desaparicin del precursor 2,4,6-TCP, esta actividad decae rpidamente. Este comportamiento, y el hecho de que esta actividad es slo residual en cultivos desarrollados en ausencia de 2,4,6-TCP, (ver panel B), sugiere que se trata de un enzima inducible por sustrato. - Finalmente, se aprecia como en el caso del cultivo desarrollado en presencia de 2,4,6-TCP existe inicialmente un retardo notable del crecimiento del hongo de unas 20-24 horas (comprense los paneles A y B). Coincidiendo con la desaparicin del 2,4,6-TCP, a partir de las 60 horas, ambos cultivos tienen un comportamiento similar. De hecho, los mximos niveles de crecimiento se producen con un pequeo desfase de slo 6 horas, entre las 60 y 72 horas de cultivo y son parecidos en ambas condiciones. Estos datos sugieren un claro efecto txico del 2,4,6-TCP sobre el hongo, efecto transitorio que sin embargo desaparece en cuanto los niveles de 2,4,6-TCP en el medio de cultivo son bajos o indetectables.
2B.3.3.- Regulacin de la formacin de 2,4,6-TCA por glucosa y amonio en cultivos en medio lquido. En un intento de profundizar en la regulacin de la formacin de 2,4,6-TCA en T. longibrachiatum y dado el gran desconocimiento sobre los procesos implicados en la formacin de este compuesto, decidimos abordar el estudio de su posible regulacin por mecanismos generales, como la represin catablica por fuente de carbono (glucosa) o la represin por fuente de nitrgeno (amonio). Para ello desarrollamos cultivos en caldo extracto de malta, en presencia de 2,4,6-TCP (10 mg/ml), que fueron suplementados con glucosa (2%), amonio (50 mM) y glucosa ms amonio. De estos cultivos procedimos a tomar muestras de sobrenadantes a distintos tiempos, en las que determinamos crecimiento (peso seco de micelio) y niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA. Los resultados obtenidos se reflejan en la figura 2.6, de cuyo anlisis podemos extraer las siguientes conclusiones: - La formacin de 2,4,6-TCA no est sujeta a regulacin por glucosa (2%), amonio (50 mM) o una combinacin de ambos, puesto que la eficiencia de bioconversin obtenida en todos los casos fue muy parecida, variando ligeramente entre el 29.2 y el 39.5%. De hecho, el nivel de 2,4,6-TCA detectado en sobrenadantes de medios de cultivo es muy similar en todos los paneles (A, B, C y D), aunque con ligeras variaciones. - La desaparicin del 2,4,6-TCP de sobrenadantes de medios de cultivo no est sometida a regulacin nutricional. No obstante, se aprecia un aumento en el nivel de crecimiento del cultivo que va asociado a un incremento de la velocidad con que el 2,4,6-TCP desaparece del medio (comprense los paneles A y D). Este dato es perfectamente lgico: una mayor tasa de crecimiento va a permitir una eliminacin ms veloz
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APARTADO 2C: PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DEL ENZIMA 2,4,6-TCP METILTRANSFERASA DE Trichoderma longibrachiatum IMPLICADA EN LA FORMACIN DE 2,4,6-TRICLOROANISOL.
tores. Resultados similares se obtuvieron con anisoles como el PCA o el 2,4,6-TCA, aunque en este caso si apreciamos una mayor actividad relativa (5.21% 0.28) respecto del control negativo.
Objetivo: El objetivo fundamental de esta parte de nuestro estudio era la purificacin y caracterizacin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de Trichoderma longibrachiatum implicada en la formacin de 2,4,6-TCA.
2C.1.- Anlisis de la induccin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa implicada en la formacin de 2,4,6TCA Como se indica en el apar tado 2B.3.2, los resultados mostrados en la figura 2.5 sugeran que la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se compor taba como un enzima inducible. Para tratar de confirmar esta posibilidad realizamos un experimento con un sistema de clulas en reposo. Los resultados obtenidos (figura 2.7), indicaban claramente la induccin de la actividad metiltransferasa por su sustrato 2,4,6-TCP. En dicha figura se aprecia como en ausencia de 2,4,6-TCP la actividad asociada a micelio es slo residual, mientras que por el contrario los niveles de actividad enzimtica detectados aumentaban considerablemente en micelio inducido. El efecto inductor se apreciaba rpidamente una hora despus de la adicin de 2,4,6-TCP y los niveles de actividad aumentaban notablemente hasta ocho horas despus de la induccin, para descender a continuacin. Una vez demostrado el carcter inducible de esta enzima nos planteamos analizar el posible efecto inductor de varios clorofenoles, anisoles y otros compuestos clorados, as como tambin de compuestos aromticos no halogenados. Como se aprecia en la figura 2.8 el mayor efecto inductor correspondi al 2,4,6-TCP, al que arbitrariamente atribuimos un valor inductor de 100. Otros clorofenoles clorados como el 2,4,5-TCP, el 2,3,4,6-TeCP y el PCP tambin mostraron un claro efecto inductor. Por el contrario, tanto el 2-CP como el resto de diclorofenoles ensayados no fueron buenos inductores, puesto que los valores de actividad relativa obtenidos oscilaban entre el 5.89% ( 0.94) para el 2-CP y el 13.75% ( 0.81) del 3,4-DCP. Tengamos en cuenta que un cultivo no inducido (control negativo) mostr una actividad relativa del 4.02% ( 0.28). Otros compuestos clorados, derivados o no del benceno, como el hexaclorobenceno, el hexaclorociclohexano o el 1,3,5-triclorobenceno no actuaron como induc-
Figura 2.7. Induccin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum por el sustrato 2,4,6TCP en un sistema de clulas en reposo.
Por otro lado, los compuestos aromticos no clorados (fenol, cido vainllico, guayacol y catecol) no actuaron como inductores. Estos resultados sugieren que la induccin de esta actividad enzimtica es ejercida de manera especfica por clorofenoles, especialmente si tienen tres o ms tomos de cloro en su molcula. Un estudio complementario consisti en determinar la cantidad mnima de 2,4,6-TCP que poda inducir la sntesis del enzima. Para ello a un sistema de clulas en reposo se aadieron cantidades de 0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 20, 30 y 40 mg/ml de 2,4,6-TCP. La cantidad ms baja de este compuesto que fue capaz de inducir un aumento de la actividad fue 7.5 mg/ml. Los niveles de mxima actividad se obtuvieron para valores de inductor comprendidos entre 10 y 20 mg/ml, mientras que cantidades superiores tenan un efecto negativo y producan un descenso de la actividad cataltica detectada, posiblemente debido a que a estas concentraciones se pone de manifiesto el carcter txico del compuesto.
Figura 2.8. Anlisis de varios compuestos aromticos como posibles inductores de la actividad enzimtica 2,4,6-TCP metiltransferasa. El mayor efecto inductor observado correspondi al 2,4,6-TCP al que se asign un valor arbitrario de 100. Los restantes datos mostrados son valores relativos respecto de ese valor. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003).
2C.2.- Optimizacin del ensayo enzimtico para la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Los primeros ensayos para detectar la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa se realizaron segn el mtodo de Neilson et al. (1988). Los niveles as detectados eran bajos (lvarez-Rodrguez, 2001) por lo que se intent mejorar el rendimiento del ensayo enzimtico. Para ello analizamos el efecto de varios parmetros en la reaccin: pH, temperatura, tiempo de reaccin, adicin de distintos compuestos, concentracin de sustrato (2,4,6TCP) y donador de grupos metilo S-adenosilmetionina (SAM). 2C.2.1.- Efecto de distintos compuestos sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. La tabla 2.7 muestra el efecto de varios compuestos sobre dicha actividad. Podemos apreciar como la reaccin es absolutamente dependiente de la presencia del donador de grupos metilo SAM en la mezcla de reaccin. La presencia de EDTA, compuesto cuya inclusin en la mezcla de reaccin es esencial para la actividad metiltransferasa de Rhodococcus sp. 1395 (Neilson et al., 1988) no tuvo el mismo efecto en nuestro caso. De hecho, su adicin provoc un ligero descenso de la actividad enzimtica. La adicin de metiltetrahidrofolato (MTHF), compuesto utilizado por algunas metiltransferasas como cofactor, produjo un ligero aumento de la actividad enzimtica. Adems su adicin permita contrarrestar el ligero efecto
negativo que el EDTA tena sobre la actividad. Por el contrario, varios agentes reductores con grupos tol como el ditiotreitol (DTT), el -mercaptoetanol y la cistena no incrementaron la actividad. El fluoruro de p-metilenfenilsulfonilo (PMSF), uno de los inhibidores de serina-cistena proteasas ms ampliamente utilizados (Turini et al., 1969) para evitar problemas de digestiones proteolticas en mezclas proteicas, tampoco tena un claro efecto inhibidor de la actividad, a diferencia de lo que ocurre con otras metiltransferasas (James et al., 1995). Sorprendentemente la utilizacin conjunta de DTT y PMSF provoc un aumento del 47% en la actividad obtenida, revertiendo el pequeo efecto inhibidor del PMSF. Finalmente, la inclusin de glicerol al 10% (p/v) supuso un incremento de casi el 36% en los niveles de actividad, supuestamente debido a un efecto estabilizador sobre el enzima. A la vista de estos resultados decidimos incluir en la mezcla de reaccin glicerol (10%,), DTT y PMSF (1 mM). Por el contrario, decidimos no incluir el EDTA en la mezcla de reaccin, ni tampoco el MTHF, ya que aunque ste tena cierto estimulante dej de ser suministrado por los fabricantes. 2C.2.2.- Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Para determinar el efecto del pH sobre la actividad enzimtica obtuvimos extractos proteicos en diferentes tampones que cubran el rango de pH 5-10. Los resultados
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obtenidos al valorar la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de las distintas preparaciones se muestra en el panel A de la figura 2.9. El enzima mostr su mximo de actividad en un estrecho rango de pH de 8.2-8.5. A pH 8.0 y 9.0 el enzima retena un 83.3% de actividad y un 87.5% respectivamente. El descenso de actividad era acusado para pHs superiores a 9.0 o inferiores a 7.0. De hecho a pH 5.0, 6.0 10.0 la actividad enzimtica detectada era casi nula. Por lo que respecta a la temperatura (figura 2.9, panel B), vemos como la mxima actividad se detect en el rango 25-28C, disminuyendo rpidamente a temperaturas superiores. La cada en los niveles de actividad es apreciable a 30C y acusada a 37C, mientras que a 42C la actividad era slo residual. A la vista de estos resultados seleccionamos como temperatura ptima de ensayo 28C y como pH ptimo de reaccin el valor de
8.2. 2C.2.3.- Efecto del tiempo de incubacin sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Se trataba de determinar durante cuanto tiempo la reaccin enzimtica tena lugar de manera lineal. Para ello realizamos varias reacciones enzimticas con el mismo extracto proteico, que fueron paradas a distintos tiempos, determinndose en cada caso la cantidad de 2,4,6TCA acumulada. Los resultados obtenidos se representan en la figura 2.10. De la observacin de esta grfica se deduce que en las condiciones del ensayo el enzima mantiene su actividad durante las cuatro primeras horas de incubacin de una manera casi lineal. Se trata de un aspecto llamativo puesto que no es normal que en una mezcla de reaccin un enzima sea activa por un periodo de tiempo tan prolon-
Tabla 2.7. Efecto de diferentes compuestos sobre la actividad enzimtica 2,4,6-TCP metiltransferasa.
REACCIN
CONCENTRACIN (MM)
-0 0 1 1 1+1 1 1 1 1 1+1 1085.7 (10% p/v)
ACTIVIDAD ESPECFICA a
ACTIVIDAD RELATIVA (%)b
Normal - SAM - 2,4,6-TCP + MTHF + EDTA + MTHF + EDTA + -Mercaptoetanol + L-Cistena + DTT + PMSF + DTT + PMSF + Glicerol
11.71 0 0 13.97 10.01 11.95 9.81 10.25 10.62 9.31 17.22 15.91
100 0 0 119.3 85.5 102.0 83.8 87.5 90.7 85.2 147.0 135.9
a La actividad especfica se expresa como picomoles de producto formados por minuto por mg de protena. Los valores mostrados son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. Las variaciones detectadas en todos los casos fueron menores del 10%. b Arbitrariamente se atribuy el valor de 100 a la actividad de una reaccin enzimtica normal sin ningn aditivo. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003). 2C.2.4.- Influencia de la concentracin de los sustratos de reaccin (2,4,6-TCP y SAM) sobre la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa. Otros parmetros que tratamos de optimizar para mejorar el ensayo enzimtico fueron la influencia de la concentracin de los sustratos de reaccin, 2,4,6-TCP y SAM sobre la actividad enzimtica. Para ello realizamos dos series diferentes de reacciones: a).- reacciones en las que la concentracin de 2,4,6-TCP en la mezcla de reaccin variaba en el rango 0.04-4 MM, mantenindose constante la concentracin de SAM en un valor saturante de 2 MM. El resultado obtenido se resume en el panel A de la figura 2.11. Podemos apreciar como la mxima actividad se obtuvo para una concentracin de sustrato 0.25 MM, mientras que para valores superiores la actividad enzimtica disminua a valores de actividad relativa comprendidos entre el 41.6% y el 62.7%. Esta disminucin del rendimiento de la reaccin podra deberse a un fenmeno de inhibicin por altas concentraciones de sustrato, como se indica tambin en el apartado 2C.6.4. b).- reacciones en las que la concentracin de 2,4,6-TCP se mantuvo constante en 0.25 MM y variamos la concentracin del donador de grupos metilo SAM para valores comprendidos entre 0.25-2.5 mM. Los resultados obtenidos (panel B de la figura 2.11) sugieren que la actividad enzimtica aumenta cuando se incrementa la concentracin de SAM, hasta alcanzar el mximo de actividad para una concentracin 2 MM. En el ensayo decidimos, por una pura cuestin
Figura 2.9. Efecto del pH (A) y la temperatura (B) sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Los resultados mostrados corresponden a la media de los valores obtenidos en tres experimentos independientes realizados por duplicado. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003).
Figura 2.10. Formacin de 2,4,6-TCA por extractos acelulares de T. longibrachiatum a lo largo del tiempo. Los resultados mostrados son la media de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
Figura 2.11. Efecto de la concentracin de 2,4,6-TCP y SAM sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.
econmica, utilizar una concentracin 1 mM de SAM, a pesar de que la actividad enzimtica detectada era aproximadamente un 36.75% menor. Una vez analizados estos parmetros realizamos en paralelo dos tipos diferentes de reacciones enzimticas: a).- reacciones segn el ensayo inicialmente descrito por Neilson y colaboradores (1988) para una metiltransferasa bacteriana. b).- reacciones en las cuales se modificaron varios parmetros, de acuerdo a los resultados descritos anteriormente de pH y temperatura ptimas, influencia de distintos componentes en la mezcla de reaccin, tiempo de reaccin y concentracin de sustratos, a fin de optimizar la reaccin enzimtica. Un resumen de las condiciones iniciales de reaccin y todas las mejoras y modificaciones realizadas en el ensayo enzimtico se recogen en la tabla 2.8. Las mejoras obtenidas en el ensayo enzimtico nos permitieron aumentar de manera muy notable el nivel de actividad enzimtica detectada, como se pone de manifiesto en la figura 2.12.
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Tabla 2.8. Cambios realizados a fin de optimizar el ensayo enzimtico de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa (la actividad se valor segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003).
REACCIN INICIAL BASADA EN EL ENSAYO DESCRITOPOR NEILSON ET AL., (1988)

* * * * * * * * Tampn fosfato 100 mM pH 7.0 MgCl2 1 mM EDTA 1 mM MTHF 0.04 mM 2,4,6-TCP 0.06 mM SAM 0.1 mM Temperatura de reaccin: 30C Tiempo de reaccin: 1 hora+ Glicerol * * * * * * * * * * *
REACCIN MEJORADACOQUE ET AL., (2003)

Tris 50 mM pH 8.2 MgCl2 1 mM No EDTA No MTHF 2,4,6-TCP 0.25 mM SAM 1 mM Temperatura de reaccin: 28C Tiempo de reaccin: 3 horas DTT 1 mM PMSF 1 mM Glicerol 10% (p/v)
Obsrvese la ausencia de actividad cuando el ensayo de reaccin no inclua SAM (panel A), la dbil actividad detectada con el ensayo descrito por Neilson et al., (1988) (panel B) y la mejora considerable de actividad detectada con el ensayo optimizado en este trabajo (panel C), que
nos permiti pasar de una actividad especfica de 108.7 pmoles minuto-1 mg de protena-1 en el panel B, a una actividad especfica en el panel C de 523.2 pmoles minuto-1 mg de protena-1, lo que supuso una mejora de un 381.3%.
Figura 2.12. Optimizacin del ensayo de reaccin para la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. (A) Reaccin negativa sin SAM; (B) Reaccin realizada de acuerdo con el ensayo desarrollado por Neilson et al., (1988). (C) Reaccin optimizada realizada segn las condiciones indicadas en la tabla 2.8.
2C.3.- Estudios previos a la purificacin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. 2C.3.1.- Precipitacin con sulfato amnico. La precipitacin con sulfato amnico es una tcnica usada rutinariamente en la purificacin de protenas, generalmente como paso inicial del proceso. A veces tambin se utiliza para precipitar y concentrar las protenas presentes en una mezcla. En nuestro caso varios experimentos de precipitacin de las protenas presentes en un extracto crudo libre de clulas de T. longibrachiatum, con distintos porcentajes de sulfato amnico, nos permitieron obtener las siguientes conclusiones: - La actividad enzimtica se repar ta como sigue: un 0% en la fraccin correspondiente a un porcentaje de sal del 0-40%; un 32.1% en la fraccin 40-60%; un 66.8% en la fraccin 60-80% y slo el 1.1% en la fraccin 80-100%. - El 93.4% de la actividad precipitaba con un porcentaje de sal del 50-75%, mientras que en la fraccin correspondiente a un porcentaje de saturacin 75100% se detect nicamente el 6.6% de la actividad restante. - Estos estudios mostraron que concentraciones elevadas de sulfato amnico tenan un fuer te efecto inhibidor sobre la actividad metiltransferasa: la actividad detectada tras el fraccionamiento por precipitacin nunca era superior al 10% de la actividad inicialmente presente en el extracto. La actividad, adems, no se recuperaba aunque el sulfato amnico se eliminase por dilisis prolongada o por desalado en una columna de Sephadex G-25. 2C.3.2.- Interaccin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con columnas de interaccin hidrofbica. Para comprobar la interaccin de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa por interaccin hidrofbica con varias resinas utilizamos el HiTrap HIC Selection Kit (Amersham Pharmacia Biotech). A fin de favorecer la interaccin del enzima con cada resina se ensayaron tres condiciones salinas diferentes: NaCl 3.5 M, tampn fosfato 1.5 M y Na2SO4 0.5 M. El uso de tampn fosfato se desech porque a la temperatura de trabajo de 4C se produca precipitacin proteica e indicios de precipitacin salina. De manera similar el uso de Na2SO4 se descar t porque a 4C precipitaba en grandes cantidades y tena un efecto inhibitorio de la actividad. Por tanto, la sal elegida fue el NaCl que no planteaba ningn problema de precipitacin o inhibicin de la actividad. El compor tamiento de las diferentes columnas del kit
se indica en la tabla 2.9. Como podemos ver la columna HiTrap Phenyl HP fue la que mostr un mejor compor tamiento y por tanto la elegida para su uso en el proceso de purificacin. 2C.3.3.- Interaccin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con columnas de intercambio inico. Para comprobar la interaccin de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa con varias resinas por intercambio inico utilizamos el HiTrap IEX Selection Kit (Amersham Pharmacia Biotech). El tampn utilizado para ensayar la interaccin con resinas de intercambio aninico fue Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), mientras que en el caso de intercambio catinico utilizamos un tampn fosfato 50 mM (pH 6.8). El compor tamiento de las diferentes columnas del kit se indica en la tabla 2.9. Podemos apreciar como la metiltransferasa no se una a los intercambiadores catinicos. Entre los intercambiadores aninicos, los que mostraron un mejor compor tamiento fueron el HiTrap DEAE FF (intercambiador dbil) y el HiTrap Q FF (intercambiador fuer te) por lo que se seleccionaron para su uso en el proceso de purificacin. 2C.3.4.- Estudio de la interaccin de la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa con matrices cromatogrficas por afinidad o pseudoafinidad. Las tcnicas cromatogrficas de afinidad y pseudoafinidad son muy tiles para purificar protenas ya que tienen la ventaja de permitir un alto grado de purificacin en un nico paso. As, metiltransferasas de hojas de Wollastonia biflora (James et al., 1995) y de Brassica oleracea (Attieh et al., 1995) han sido purificadas gracias al uso de resinas de AMP-agarosa. Se trata de una tcnica de pseudoafinidad basada en el parecido estructural que existe entre el AMP y la molcula de SAM. En nuestro caso intentamos dos estrategias diferentes para intentar purificar la metiltransferasa: a).- una cromatografa de pseudoafinidad a una matriz de AMP-agarosa. Desafor tunadamente todos los intentos realizados fueron negativos y aunque se repitieron varias veces en distintas condiciones (variando la fuerza inica y el pH, inclusin o no de glicerol en el tampn, etc.) el resultado siempre fue el mismo: la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa no era retenida por ninguna de las dos matrices empleadas. Este resultado se puede considerar como normal, ya que de hecho, slo un pequeo porcentaje de metiltransferasas interaccionan con matrices de AMP-agarosa (James et al., 1995). b).- una cromatografa de afinidad sobre una resina
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Tabla 2.9. Interaccin de la actividad enzimtica 2,4,6-TCP metiltransferasa con varias columnas cromatogrficas de interaccin hidrofbica e intercambio inico.
COLUMNA
Columnas de interaccin hidrofbica
NIVEL RELATIVO DE ACTIVIDAD 2,4,6-TCP METILTRANSFERASA DETECTADO EN CADA FRACCIN:

Aa +++b +++ +++ +++ +++ B +/C D + ++ +++ + ++
1.2.3.4.5.-
HiTrap Phenyl FF (high sub) HiTrap Phenyl FF (low sub) HiTrap Phenyl HP HiTrap Butyl FF Hitrap Octyl FF
Columnas de intercambio ini-
1.2.3.4.-
HiTrap HiTrap HiTrap HiTrap
DEAE FF Q FF ANX FF Q XL
+++ +++ +++ +++
aninico
+++ +++ + ++
a Fracciones ensayadas: extracto crudo (A); fraccin no unida a la columna (B); lavado de la columna (C); eludo (D). b Nivel relativo de actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa: actividad detectada superior al 90% (+++); actividad detectada entre el 60-90% (++); actividad detectada entre el 30-60% (+); actividad detectada inferior al 30% (+/-); actividad no detectada (-). En cuanto a la columna de 2,4,6-TCPsefarosa creemos que la inmovilizacin del sustrato 2,4,6-TCP a travs de su grupo hidroxilo reactivo puede suponer un impedimento a la interaccin del sustrato con el enzima, ya que es obvio que para que tenga lugar el proceso cataltico, y posiblemente tambin el reconocimiento del sustrato, el grupo hidroxilo debe estar libre. 2C.3.5.- Estabilidad a 4C y -20C. El conocimiento del grado de estabilidad del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa a 4C era de inters, ya que todo el proceso de purificacin se realizara a dicha temperatura. El estudio se llev a cabo con una preparacin proteica semipurificada, correspondiente al paso 4 del proceso de purificacin (columna DEAE FF. Ver apar tado 2C.4.4). La muestra en tampn A [Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), MgCl2 2 mM] se suplement con varias sustancias: glicerol al 10% (p/v), DTT 1 mM y
catinico
5.- HiTrap CM FF 6.- HiTrap SP FF 7.- HiTrap SP XL
+++ +++ +++
+++ +++ +++
Figura 2.13. Estabilidad a 4C del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa en tampn A (pH 8.0) suplementado con distintos compuestos. Los resultados mostrados son la media de medidas realizadas por duplicado en dos experimentos independientes. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003).
SAM 0.1 mM, solas o en combinacin y a continuacin se mantuvo a 4C hasta un mximo de 15 das. Los resultados obtenidos se pueden apreciar en la figura 2.13. El enzima mostr en tampn A una estabilidad pobre (vida media de 50 horas): tras cuatro das de incubacin a 4C slo retena el 26.9% de la actividad inicial y nicamente el 6.6% cuando la incubacin se prolong a 15 das. Este comportamiento no mejor significativamente por la inclusin de un 10% de glicerol (p/v) en el tampn. La estabilidad aument por la adicin de SAM (0.1 mM): el enzima retena el 24.7% de actividad el da 15 y su vida media aument hasta las 170 horas. Fue, sin embargo, el DTT (1 mM) el compuesto que produjo un efecto ms notable: el enzima retena el cuarto da el 100% de actividad y en torno al 60.1% el da 15, siendo su vida media de 290 horas. Por ello, en todos los pasos de purificacin se procedi a incluir DTT 1 mM a las preparaciones proteicas. El estudio de estabilidad del enzima a -20C se realiz en el mismo tampn A conteniendo glicerol al 10% (p/v): el enzima retena ms del 85% de actividad tras 6 meses de congelacin. Por otro lado, cuando el enzima fue sometida a cuatro ciclos de congelaciones y descongelaciones sucesivas experiment una prdida de actividad de aproximadamente el 35%. Finalmente, indicar que el enzima mostr una alta inestabilidad tras el ltimo paso de purificacin (filtracin en gel en Superdex 200. Ver apartado 2C.4.6): su vida media a 4C en tampn A conteniendo DTT decay a 20 horas y la actividad se perda casi completamente tras congelacin de las preparaciones a -20C. 2C.3.6. Estabilidad a 42C. Tambin se ensay la estabilidad del enzima a 42C: la preparacin proteica en tampn A suplementado con DTT 1 mM, se incub a esa temperatura, retirando muestras a distintos intervalos en las que valoramos la actividad metiltransferasa a 28C. Los resultados obtenidos se recogen en la figura 2.14. El enzima mostr una baja tolerancia a la incubacin a 42C. De hecho tras 15 minutos de exposicin el enzima retena slo el 45.7% (5.8) de actividad; para incubaciones de 60 minutos la actividad disminuy hasta el 8.4% (2.3) y hasta el 4.6% (1.8) para prolongaciones de 240 minutos. 2C.4.- Purificacin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Los resultados de aplicar tcnicas convencionales para la purificacin a homogeneidad de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se resumen en la tabla 2.10. El enzima se purific 222.67 veces hasta una aparente homogeneidad, obtenindose una preparacin de una actividad especfica de 550.00 pmoles minuto-1 mg de protena-1. El rendimiento del proceso fue del 0.92%.
2C.4.1.- Paso 1. Obtencin de extractos enzimticos acelulares. El primer paso del proceso de purificacin se realiz a partir de 6.0 gramos de micelio inducido con 2,4,6-TCP. A partir de dicho micelio se obtuvo por sonicacin un extracto crudo que fue filtrado en columnas PD-10 (G-25) a fin de eliminar pequeas molculas, especialmente trazas de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA que pudieran interferir en los ensayos de valoracin enzimtica. Tras dicha filtracin obtuvimos un total de 20 ml de extracto crudo que contena 480.89 mg de protena (aproximadamente 24.04 mg de protena por ml de cultivo) y una actividad total de 1189.65 pmoles min-1. 2C.4.2.- Paso 2. Cromatografa de interaccin hidrofbica en una columna Resource PHE. El segundo paso del proceso de purificacin fue una cromatografa de interaccin hidrofbica en columna Resource PHE que nos permiti captar la mayor parte de la actividad presente en el extracto. De hecho el rendimiento de este paso fue del 80.95%. La actividad, unida a la columna en condiciones de alta fuerza inica (3.5 M de NaCl), se liber a continuacin usando un gradiente decreciente de NaCl, eluyendo la metiltransferasa en el intervalo 1.26-0 M de NaCl (ver figura 2.15). Este paso fue realmente el ms efectivo de todo el proceso de purificacin: slo una pequea fraccin de las prote-
Figura 2.14. Estabilidad a 4C del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa en tampn A (pH 8.0) suplementado con distintos compuestos. Los resultados mostrados son la media de medidas realizadas por duplicado en dos experimentos independientes. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003).
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Tabla 2.10. Etapas en la purificacin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum.
ETAPA DE PURIFICACIN
ACTIVIDAD TOTAL PROTENA TOTAL (pmoles min-1) (mg)
ACTIVIDAD RENDIMIENTO PURIFICACIN (%) (veces) ESPECFICA (pmoles min-1 mg de protena-1)
1.2.3.4.5.6.-
Extracto crudo Resource PHE Ultrafiltracin HiTrap DEAE Resource Q Superdex 200
1189.65 963.12 667.37 289.40 75.31 11.00
480.89 33.67 18.89 5.18 0.81 0.02
2.47 28.60 35.32 55.87 92.97 550.00
100.00 80.95 56.10 24.33 6.33 0.92
1 11.58 14.30 22.62 37.64 222.67
2C.4.3.- Paso 3. Ultrafiltracin. Posteriormente las fracciones activas de la columna Resource PHE (20 ml) se concentraron por ultrafiltracin en un Vivaspin 6 (con una membrana de polietersulfona de baja adsorcin de protenas) con lmite de exclusin molecular de 50.000 Da. Este paso nos permiti eliminar una buena cantidad de protena (especialmente de tamaos nativos menores de 50.000 Da), obtenindose una muestra purificada 14.3 veces con una actividad total de 667.37 pmoles min-1. 2C.4.4.- Paso 4. Cromatografa de intercambio aninico en columna HiTrap DEAE FF. La muestra se someti luego a un intercambio aninico dbil (DEAE FF) a pH 8. La actividad se eluy de la columna utilizando un gradiente discontinuo de NaCl, detectndose actividad en las fracciones que eluan en el intervalo 40 a 125 mM de NaCl (mxima actividad a 75 mM), como podemos apreciar en la figura 2.16. Este paso, aunque con una prdida alta de actividad, nos permiti obtener una preparacin purificada 22.62 veces con una actividad total de 289.40 pmoles min-1. 2C.4.5.- Paso 5. Cromatografa de intercambio aninico en columna Resource Q. El comportamiento de la actividad enzimtica en una columna del intercambiador aninico fuerte Resource Q a pH 8.2 se representa en la figura 2.17: la actividad elua en un rango muy estrecho de concentracin de NaCl 25-65 mM (mximo alrededor de 45 mM). Este paso nos permiti obtener una muestra purificada 37.63 veces, aunque el rendimiento del proceso decay considerablemente al 6.33% (equivalente a una actividad total de 75.31 pmoles min-1). 2C.4.6.- Paso 6. Cromatografa de gel filtracin en columna Superdex 200. El ltimo paso del proceso de purificacin fue una cromatografa de filtracin en gel en una columna Superdex 200 que fracciona protenas cuyo peso molecular se sita entre
Fig. 2.15. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa en una columna de interaccin hidrofbica Resource PHE. nas del extracto crudo fueron retenidas en la columna,
Fig. 2.16. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa en una columna de interaccin aninico HiTrap DEAE FF.
10.000 y 600.000 Da. Aunque el rendimiento obtenido en este paso baj hasta el 0.92% y la actividad total recuperada fue de 11.00 pmoles min-1, se trat de una tcnica efectiva, ya que nos permiti obtener una preparacin en la que la metiltransferasa elua en un pico bien definido (ver figura 2.18) que corresponda al enzima purificada aparentemente a homogeneidad (el enzima haba sido purificada 222.67 veces). El anlisis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE) de las fracciones correspondientes al pico en el que detectamos actividad nos permiti detectar una nica
Fig. 2.17. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa en una columna de intercambio aninico Resource Q.
banda del tamao esperado (52.500 Da) Fig. 2.19. SDS-PAGE del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa obtenida tras el ltimo paso de purificacin (Superdex 200). Carrill 1: marcadores de peso molecular; carril 2: enzima purificada. se marcaba con una intensidad ligeramente superior al resto (datos no mostrados). Figura 2.20. Deteccin de la 2,4,6-TCP metiltransferasa (indicada por una flecha) por fotomarcaje con SAM[metil-3H]. Carriles 1 y 2: tincin con Azul Brillante de Coomasie de marcadores de peso molecular (carril 1) y mezcla de las fracciones activas del paso 4 del proceso de purificacin -columna DEAE FF(carril 2). Carriles 3 y 4: reacciones de fotomarcaje de la muestra proteica en ausencia (carril 3) y presencia (carril 4) de SAHC. Tambin se detect fotomarcaje del enzima purificada y en una mezcla proteica de las fracciones activas de la columna ResourceQ (datos no mostrados).
Fig. 2.18. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa en una columna de filtracin en gel Superdex 200. banda proteica, que corresponda a un tamao molecular de 52.500 Da (ver figura 2.19.) 2C.5.- Identificacin del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa por fotomarcaje con sustratos radiactivos. Algunas metiltransferasas han podido identificarse mediante fotomarcaje (cross-linking inducido por luz ultravioleta) utilizando un sustrato radiactivo (Som et al., 1990; Ruz et al., 1998). En nuestro caso utilizamos dos sustratos diferentes: - SAM[metil-3H]. En las fracciones correspondientes a los pasos finales 4, 5 y 6 del proceso de purificacin detectamos una protena de un peso molecular aproximado de 52.000 Da, que coincida en tamao con el enzima purificada, y que era marcada dbilmente con SAM tritiada (figura 2.20). La reaccin de fotomarcaje era inhibida cuando la muestra se preincubaba durante 10 minutos con SAHC 1 mM (comprense los carriles 3 y 4 de la figura), lo que indica la especificidad del fotomarcaje. - La utilizacin de 2,4,5-TCP [UL-14C] en los experimentos de fotomarcaje result insatisfactoria, debido al alto nmero de bandas que se marcaban, incluso en muestras correspondientes a los pasos 4 y 5 del proceso de purificacin (datos no mostrados). Ello podra deberse a la gran reactividad del grupo hidroxilo de los clorofenoles (responsable de su alta toxicidad), el cual reaccionara de manera inespecfica con una gran cantidad de protenas. No obstante una
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2C.6.- Caracterizacin de la actividad enzimtica 2,4,6-TCP metiltransferasa. La purificacin de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa nos permiti abordar una serie de estudios que requieren un alto
grado de pureza de la preparacin proteica. La mayor parte de los estudios que se indican a continuacin (a excepcin de la determinacin del peso molecular nativo) se llevaron a cabo con una preparacin proteica semipurificada
Tabla 2.11.Efecto de tioles y otros compuestos, as como diferentes cationes sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum
COMPUESTO AADIDOa Ninguno MTHF Glicerol b-mercaptoetanol DTT L-Cys Tioglicolato PMSF PMSF + DTT
CONCENTRACIN FINAL (MM) -1 1085.7 (10% p/v) 1 1 1 1 1 1+1
ACTIVIDAD RELATIVA (%)b 100 122.5 121.7 104.8 96.7 91.5 102.5 80.6 142.5
CATIN AADIDOa Ca2+ Cu2+ Fe2+ Hg2+ Mg2+ Zn2+ Ag+ Cs+ Li+ NH4+
CONCENTRACIN ACTIVIDAD FINAL (MM) RELATIVA (%)b

1 1 1 0.1 1 0.1 1 1 1 1 84.5 3.8 82.0 3.75 96.8 18.2 5.9 84.6 100.9 84.1
correspondiente al paso 5 del proceso de purificacin (columna Resource Q). 2C.6.1.- Efecto de tioles y otros compuestos. El efecto de varios tioles (-mercaptoetanol, DTT, L-Cys y cido tiogliclico) y otros compuestos como el glicerol, el cofactor de metiltransferasas metiltetrahidrofolato (MTHF) o el reactivo para residuos de Cys y Ser PMSF se recoge en la tabla 2.11. La adicin de glicerol o MTHF a la mezcla de reaccin produjo un ligero incremento en la actividad (como ya vimos en el apartado 2C.2.1). a La preparacin enzimtica en Tris-HCl 50 mM (pH 8.0) se preincub con cada compuesto o catin durante 10 minutos a 4C antes de aadir el resto de los componentes de la reaccin. b Los valores de actividad relativa mostrados resultan de asignar a la reaccin sin aditivos el valor de actividad 100. Los datos mostrados son la media de muestras ensayadas por duplicado en dos experimentos independientes. Por el contrario, los distintos toles ensayados no mostraron un claro efecto inhibidor ni estimulante del proceso cataltico. Sin embargo, la adicin conjunta de PMSF y DTT produca de manera repetida un claro incremento del 42.5% de la actividad metiltransferasa. Resultados similares se obtuvieron con extractos crudos (apartado 2C.2.1). 2C.6.2.- Efecto de iones metlicos. Con frecuencia las metiltransferasas, sobre todo de plantas y animales, exhiben su mxima actividad en presencia de un cation bivalente como el Mg2+, mientras que otros como el Hg2+ pueden tener un claro efecto inhibitorio (Poulton, 1981). El efecto de varios cationes mono y divalentes comnmente utilizados en este tipo de estudios, sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se recoge en la tabla 2.11. La preparacin enzimtica en Tris-HCl 50 mM (pH 8.2) se preincub con cada in durante 10 minutos a 4C, antes de la adicin del resto de los componentes de reaccin Ninguno de los cationes, ni siquiera el Mg2+, mostr un claro efecto estimulatorio, lo que permite concluir que la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa no presenta requerimientos por cationes. Por el contrario, los cationes Hg2+ y Zn2+ (0.1 mM) y Cu2+ y Ag 1+ (1 mM), ejercieron un fuerte efecto inhibitorio. 2C.6.3.- Efecto de varios inhibidores de metiltransferasas. Clculo de Ki para SAHC. La bsqueda de inhibidores se limit a una serie de compuestos que con frecuencia actan como tales para las metiltransferasas dependientes de SAM. Entre ellos podemos citar tres tipos fundamentales: en priFigura 2.21. Representacin de LineweaverBurk para determinar el efecto inhibitorio de la SAHC sobre la actividad 2,4,6TCP metiltransferasa.
Tabla 2.12. Inhibicin de la 2,4,6-TCP metiltransferasa por varios compuestos.
INHIBIDOR (1 MM) Ninguno Iodoacetamida N-etilmaleimida p-cloro-mercuriobenzoato EDTA S-adenosilhomocistena
INHIBICIN (%)a 0 18.3 2.9 16.5 1.9 45.2 6.6 5.8 0.3 87.1 5.6
la influencia en la velocidad de reaccin de diferentes concentraciones de SAM (100, 150, 250, 350, 450 y 600 MM) para cuatro cantidades constantes de 2,4,6-TCP (100, 150, 200 y 300 MM). La representacin grfica gener varias lneas rectas que se cortaban en el segundo cuadrante, en un punto que corres-
a Los datos mostrados son la media de tres experimentos independientes por duplicado. mer lugar reactivos de grupos tiol como la iodoacetamida, la N-etilmaleimida o el cido p-cloro-mercuriobenzoico; en segundo lugar quelantes catinicos, como el EDTA y finalmente inhibidores competitivos como la S-adenosilhomocistena (SAHC). De hecho una de las caractersticas ms notables de las metiltransferasas que utilizan SAM como donador de grupos metilo es el fuerte efecto inhibitorio que el producto desmetilado, SAHC, ejerce sobre ellas (Poulton, 1981). El efecto de todos estos compuestos sobre la actividad se refleja en la tabla 2.12. En primer lugar podemos apreciar como entre los reactivos de grupos tiol nicamente el p-cloro-mercuriobenzoato mostr un claro efecto inhibitorio. Por el contrario, el EDTA no se comport como inhibidor, de acuerdo con las observaciones realizadas en el apartado anterior que indicaban la ausencia de un requerimiento de cationes para la actividad enzimtica. Finalmente y como era de esperar la SAHC mostr un claro efecto inhibidor. A fin de determinar el tipo de inhibicin as como la constante de inhibicin (Ki) se recurri a una representacin grfica de Lineweaver-Burk. El efecto de la SAHC (a una concentracin 400 mM) sobre la actividad enzimtica se analiz para una concentracin constante de 2,4,6-TCP (200 MM) y concentraciones variables de SAM (100, 150, 250, 350 y 400 MM). La grfica obtenida (figura 2.21) confirmaba que la SAHC se comporta como un inhibidor competitivo de la metiltransferasa, ya que se obtenan dos lneas rectas que se cortaban en el eje de ordenadas en un punto de valor 1/Vmax. El valor deducido de Ki fue de 378.84 MM.
Figura 2.22. Representacin de Lineweaver-Burk para determinar el tipo de reaccin bisustrato y los valores de Km para los sustratos SAM (A) y 2,4,6-TCP (B) del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa. ponda a una Km para el sustrato donador SAM de 284.1 MM (figura 2.22, panel A). Anlogamente una Km de 136.0 MM se dedujo para el sustrato aceptor, o 2,4,6-TCP, de la representacin (figura 2.22, panel B) de los valores de velocidad de reaccin que se obtuvieron para concentraciones variables de 2,4,6-TCP de 50, 100, 150, 200, 250 y 300 MM respecto de cuatro concentraciones constantes de SAM (100, 200, 300 y 400 MM). En ambos casos comprobamos como el uso de concentraciones de 2,4,6-TCP superiores a 300 mM provocaban una prdida de la linealidad de los resultados, lo cual sugiere un fenmeno de inhibicin por altas concentraciones de sustrato. Una conclusin similar se deduce de los resultados del apartado 2C.2.4. Como en el caso anterior, se obtuvieron una serie de rectas que se cortaban en un punto del segundo cuadrante. La grfica obtenida es tpica de enzimas bisustrato que presentan
2C.6.4. Anlisis cintico: clculo de los valores de Km. La 2,4,6-TCP metiltransferasa es una tpica enzima bisustrato en la que intervienen el 2,4,6-TCP como sustrato aceptor y la SAM como sustrato donador del grupo metilo. Los valores de Km se determinaron, recurriendo a la representacin de Lineweaver-Burk (figura 2.22). En primer lugar medimos
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un mecanismo de reaccin secuencial al azar. Esto es, el enzima tiene en su centro cataltico dos centros de unin, uno para cada sustrato. Ambos centros, adems no son independientes, puesto que la unin de un sustrato va a favorecer la unin del otro, de tal manera que en el transcurso de la reaccin los sustratos pueden unirse al enzima de manera alternativa en cualquier orden. 2C.6.5. Determinacin del tamao molecular de la protena nativa. Como se ha indicado anteriormente en el apartado 2C.4, el anlisis en geles de poliacrilamida de la protena purificada nos permiti estimar un tamao molecular de unos 52.500 Da para su forma desnaturalizada. Para calcular el tamao de la forma nativa recurrimos a la cromatografa de filtracin en gel, utilizando una preparacin proteica correspondiente a la quinta etapa del proceso de purificacin (columna
Resource Q). Un estudio previo nos haba permitido determinar que la actividad enzimtica elua en el volumen muerto en una columna Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech), que tiene un rango efectivo de fraccionamiento de 3.000 a 70.000 Da y un lmite de exclusin de 100.000 Da para protenas globulares, lo que obviamente sugera que el enzima presentaba un tamao mayor al del lmite de exclusin de dicha columna. Por tanto utilizamos una columna Superdex 200 HR 10/30, que tiene un lmite de exclusin para protenas globulares de 1.300.000 Da y un rango efectivo de fraccionamiento de 10.000 a 600.000 Da. La columna, en las mismas condiciones en que se realiz el ensayo, haba sido previamente calibrada con varias protenas globulares de peso molecular conocido: tiroglobulina (669.000 Da), ferritina (440.000 Da), aldolasa (158.000 Da), albmina srica bovina (67.000 Da) y anhidrasa carbnica (29.000 Da). Con los valores de Kav
Figura 2.23. Determinacin del tamao molecular del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa por filtracin en gel en una columna Superdex 200 HR 10/30. El perfil de elucin proteico de una mezcla de las fracciones activas del paso 5 del proceso del purificacin (columna Resource Q) se muestra en negro, mientras que en azul se indica la deteccin de la actividad enzimtica en las fracciones recogidas. La calibracin de la columna (ver recuadro de la parte superior derecha de la figura) se realiz con varias protenas de tamaos conocidos.
obtenidos de los volmenes de elucin se construy una representacin grfica frente a los logaritmos de los pesos moleculares correspondientes (ver recuadro pequeo de la figura 2.23). Como podemos ver en dicha figura la actividad 2,4,6-TCP
metiltransferasa eluy entre los picos correspondientes a la aldolasa y la albmica srica bovina, con un valor de Kav de 0.254, que corresponda a un peso molecular aproximado de 112.202 2000 Da. El valor obtenido sugiere que en su forma nativa el enzima es un dmero, hecho por otro lado
relativamente comn para muchas metiltransferasas (Jeffers et al., 1997), aunque tambin es normal que puedan ser monomeros, dmeros o incluso tetrmeros (James et al., 1995; Dhar et al., 2000). 2C.6.6. Anlisis de especifidad de sustratos de la actividad 2,4,6-TCP MT. Una vez purificada el enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa realizamos un anlisis sobre los posibles sustratos susceptibles de ser metilados por el enzima. Para ello elegimos una amplia variedad de alcoholes aromticos y derivados, tanto halogenados como no halogenados, que se indican a continuacin: -- Fenoles no halogenados como fenol, 1,2-dihidroxibenceno (catecol) y 2-metoxifenol (guayacol). -- Aldehdos aromticos como el 3,4-dihidroxibenzaldehido y el 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehdo (vainillina). -- cidos benzoicos hidroxilados como el 4-hidroxi-3metoxibenzoico (cido vainllico), el 3-hidroxi-4-metoxibenzoico (cido isovainllico) y el cido 3,4-dihidroxibenzoico -- Una amplia variedad de fenoles halogenados, sobre
todo clorofenoles (mono, di, tri, tetra y pentaclorofenoles) y algunos otros fenoles halogenados con bromo, yodo y fluor. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 2.13, pudindose realizar el siguiente anlisis: - La reaccin es altamente especfica para fenoles halogenados. De hecho el enzima no usa como sustratos alcoholes aromticos no halogenados como el fenol, 2metoxifenol o el 1,2-dihidroxibenceno, benzaldehdos y derivados hidroxilados del cido benzoico. - El sustrato metilado con mayor eficiencia fue el 2,4DCP, mientras que el nivel de metilacin de otros DCPs disminuy progresivamente para 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6DCP y 3,4-DCP y no se detect metilacin del 3,5-DCP. - Entre los TCPs el mayor nivel de O metilacin correspondi al 2,3,4-TCP, disminuyendo sucesivamente para 2,4,5-TCP, 2,4,6-TCP y 2,3,6-TCP. - El nico TeCP biometilado fue el 2,3,4,5-TeCP, mientras que no se detect el anisol correspondiente en el caso de los sustratos 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP. - Adems el enzima puede metilar otros fenoles halogenados diferentes de los clorofenoles. De hecho se
Tabla 2.13. Especificidad de sustratos del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa
SUSTRATO
GRADO DE METILACINa 0 0 0 0 0 0 0 0 9.61 0 0 22.51 100.00 19.58 10.36
SUSTRATO
GRADO DE METILACINa
9.26 0 93.33 55.58 64.19 59.91 10.73 0 0 10.07 36.80 12.98 0 + (NC)b
cido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico cido 3-hidroxi-4-metoxibenzoico cido 3,4-dihidroxibenzoico 2-Metoxifenol 1,2-Dihidroxibenceno 3,4-Dihidroxibenzaldehdo 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehdo Fenol 2-Clorofenol 3-Clorofenol 4-Clorofenol 2,3-Diclorofenol 2,4-Diclorofenol 2,5-Diclorofenol 2,6-Diclorofenol
3,4-Diclorofenol 3,5-Diclorofenol 2,3,4-Triclorofenol 2,3,6-Triclorofenol 2,4,5-Triclorofenol 2,4,6-Triclorofenol 2,3,4,5-Tetraclorofenol 2,3,4,6-Tetraclorofenol 2,3,5,6-Tetraclorofenol Pentaclorofenol 2,4-Dibromofenol 2,4,6-Tribromofenol 2,4,6-Trifluorofenol 2,4,6-Triyodofenol
a Los datos mostrados son relativos respecto al sustrato metilado con ms eficiencia (2,4-DCP), al que se le atribuy un valor arbitrario de 100. Los valores son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. La actividad metiltransferasa se determin segn la metodologa descrita por Coque et al., (2003) pero variando en cada caso el sustrato de reaccin. b El sustrato 2,4,6-TIP fue metilado pero la cuantificacin del producto 2,4,6-TIA no fue posible por no estar comercialmente disponible.
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detect O metilacin de bromofenoles como el 2,4-DBrP y el 2,3,4-TBrP, adems de fenoles yodados (2,4,6-TIP). Curiosamente el derivado fluorado 2,4,6-TFP no fue metilado. En todos los casos el nivel de metilacin detectado fue inferior al del clorofenol correspondiente, lo cual sugiere que el enzima tiene una mayor preferencia por el uso de clorofenoles. De estos datos parece deducirse que la halogenacin de la posicin dos (orto) parece ser importante para la actividad enzimtica. Por otro lado, en clorofenoles con la posicin dos (orto) ocupada y que tienen dos o ms atomos de cloro, la introduccin adicional de un tomo de cloro en la posicin seis (orto) parece suponer un impedimento para la actividad enzimtica.
3.- DISCUSIN GENERAL
3.1.- Caracterizacin de la microbiota asociada a muestras de corcho extremeo. La caracterizacin de las especies microbianas, especialmente fngicas, que pueden ser aisladas a partir de muestras de corcho ha sido abordada por diversos autores (Davis et al. 1981; Lee y Simpson, 1993; Danesh et al.,1997). Algunos de estos trabajos se han realizado en Espaa: as se ha caracterizado la microbiota de alcornoques y corcho de bosques catalanes (Codina et al., 1993; Calvo et al., 1993 y 1995; Calvo y Agut, 1996), o del Parque Nacional de los Alcornocales de Cdiz (Muoz et al., 1996). Los gneros y especies identificados ms representativos se han recopilado en la tabla 1.1. Estos trabajos nos muestran que la microbiota fngica que podemos aislar de corcho es variable y est condicionada por la procedencia de las muestras, las condiciones ambientales y otros factores locales propios de la regin origen de la muestra (Silva Pereira et al., 2000). Existen, sin embargo, una serie de especies que son aisladas de manera recurrente y que por tanto deberan ser consideradas como microorganismos saprfitos del corcho, ya que su presencia es casi universal, independientemente del origen de las muestras. Entre ellas podemos citar a Chrysonilia sitophila que es el hongo dominante durante la fase de crecimiento en bodega (Danesh et al., 1997; Silva Pereira et al., 2000a y 2000b), especies de Trichoderma como T. viride y T. longibrachiatum y varias especies del gnero Penicillium. En nuestro caso hemos aislado un total de 14 hongos filamentosos de los cuales 11 haban sido previamente descritos en corcho. Sin embargo, en nuestro trabajo hemos detectado por primera vez en corcho las especies Mortierella alpina, Penicillium citreonigrum y Verticillium psalliotae (lvarez-Rodrguez et al., 2002a y 2003b). Del total de especies aisladas un total de 11 pudieron crecer de manera eficiente sobre corcho (ver tabla 2.5).
Sin embargo, M. alpina, Mucor plumbeus y Penicillium decumbens no fueron capaces de crecer sobre granulado de corcho, lo que quizs sugiere que ms que microorganismos saprfitos del corcho podran ser considerados como contaminantes ocasionales de las muestras (lvarez-Rodrguez et al., 2002a, 2003b y 2003c). En cuanto a la aparicin de los aislados a lo largo de las distintas etapas de fabricacin del tapn podemos destacar (ver tabla 2.4) como slo las especies C. oxisporum, P. citreonigrum y T. longibrachiatum pudieron ser aisladas a lo largo de todo el proceso. Adems, el tratamiento del tapn con S02, como mtodo antimicrobiano, para prevenir el crecimiento de microorganismos durante el transporte y almacenamiento de los tapones es slo parcialmente efectivo en el caso de los hongos filamentosos, puesto que pasamos de un total de siete especies detectadas en la muestra F (no tratada), a slo tres en la muestra G, tras el tratamiento con este producto. A diferencia del elevado nmero de estudios analizando las poblaciones de hongos filamentosos asociadas a corcho, apenas si se han realizado intentos de aislar y caracterizar las levaduras presentes. Como consecuencia, de las ocho levaduras aisladas en este trabajo, todas excepto Sporidiobolus johnsonii, Aureobasidium sp. Y11 y Cryptococcus sp. Y1 han sido detectadas por primera vez a partir de corcho (lvarez-Rodrguez et al., 2003a). En cuanto a las bacterias presentes en corcho, tradicionalmente se ha venido aceptando que su papel como microorganismos implicados en el cork taint es menos importante. Por ello en nuestro caso nos hemos centrado nicamente en la caracterizacin de aquellas con capacidad de degradacin de cido vainllico. 3.2.- Mecanismo de formacin de 2,4,6-TCA por hongos filamentosos creciendo directamente sobre corcho. De entre la amplia variedad de microorganismos que pudimos aislar de corcho los hongos filamentosos eran los candidatos ms probables como agentes responsables del cork taint. Por ello este trabajo se ha centrado fundamentalmente en su anlisis. 3.2.1.- Formacin de 2,4,6-TCA por O metilacin de 2,4,6-TCP. De todos los mecanismos posibles para la formacin de 2,4,6-TCA propuestos por diferentes autores la O metilacin de 2,4,6-TCP nos pareci el ms probable. Para partir de esta hiptesis tuvimos en cuenta los trabajos previos de Cserjesi y Johnson (1972) que haban detectado biometilacin de PCP por T. virgatum y los trabajos de Curtis et al., (1972, 1974) y Gee y Peel (1974) que haban detectado en pollos la presencia de 2,3,4,6-TeCA sintetizado a partir de 2,3,4,6-TeCP por varios hongos filamentosos. Otros autores han postulado que diferentes hongos filamentosos son los principales responsables de la produccin de este com-
puesto (Daly et al.,1984; Sponholz y Muno, 1994; Silva Pereira et al., 2000a), y apuntan a los gneros Penicillium y Trichoderma como los principales candidatos. Los resultados mostrados en la tabla 2.5 son de gran inters, ya que es la primera vez que se demuestra de manera concluyente que hongos filamentosos, creciendo directamente sobre corcho, pueden ser los responsables de la formacin de 2,4,6-TCA y su acumulacin en el tapn de corcho. Sorprendentemente un total de 11 de los 14 aislados (78.6%) mostraron capacidad, en mayor o menor medida, para sintetizar este compuesto. Ello sugiere que la O metilacin de clorofenoles, en este caso 2,4,6-TCP, podra ser una reaccin muy comn en los hongos filamentosos. De hecho Gee y Peel (1974) apuntan que de 116 aislados de muestras de pollo un total de 68 podan producir 2,3,4,6-TeCA, porcentaje del 58.6% que es sensiblemente inferior al obtenido en nuestro caso. De manera llamativa, en nuestro estudio C. sitophila qued incluido dentro del grupo de los moderados productores (eficiencia de bioconversin del 11.02%). Este resultado es de signo opuesto al apuntado por Silva Pereira et al., (2000b), que indican que este microorganismo exhibe una eficiencia de biometilacion del 2,4,6-TCP del 0.03%. Esta diferencia en los resultados obtenidos podra deberse a la diferente metodologa empleada, o quizs a una distinta capacidad metablica de las cepas empleadas en ambos estudios. 3.2.2.- Anlisis de otros posibles mecanismos de formacin de 2,4,6-TCA por T. longibrachiatum. Una vez establecido que un porcentaje elevado de los hongos filamentosos aislados podan producir 2,4,6-TCA decidimos elegir a T. longibrachiatum como microorganismo modelo de estudio. Para ello nos basamos en los siguientes hechos: a).- fue el hongo filamentoso que present un mayor nivel de bioconversin. b).- mostraba una buena capacidad de crecimiento sobre corcho. c).- se trata de un microorganismo para el que existen distintas tcnicas de manipulacin gentica puestas a punto que podran sernos de utilidad en un futuro. El anlisis de otros posibles mecanismos para la formacin de 2,4,6-TCA a partir de otros sustratos y por diferentes mecanismos fue negativo (ver tabla 2.6). Esto no es sorprendente si tenemos en cuenta los siguientes razonamientos: 1).- Parece improbable que el 2,4,6-TCA pueda originarse a partir del catabolismo de otros fenoles o anisoles altamente clorados como el PCP, PCA, hexaclorociclohexano, hexaclorobenceno, 2,3,4,6-TeCP o 2,3,4,6-TeCA como plantean diferentes autores (Maarse et al., 1989; Tanner
et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson et al, 1992; Mohn et al, 1992). Tengamos en cuenta que la degradacin de clorofenoles es un proceso complejo en el que se originan intermediarios de tipo quinonas, como resultado de reacciones del tipo deshalogenacin oxidativa (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Wieser et al., 1997; Xun, 1996 y Xun y Orser, 1991) que en ningn caso permiten explicar la aparicin de 2,4,6-TCA como producto intermedio. 2).- Tampoco detectamos formacin de 2,4,6-TCA por un mecanismo de sntesis endgena de fenol y posterior halogenacin para dar lugar a 2,4,6-TCP que debera ser biometilado. Parece muy extrao que un microorganismo sintetice un compuesto tan txico como el fenol o el 2,4,6-TCP, con el elevado gasto energtico que conlleva, para luego tener que detoxificarlo por un mecanismo de O metilacin. 3).- El tratamiento de corcho con hipoclorito sdico en presencia de distintos compuestos susceptibles de ser clorados, como fenol, anisol o varios diclorofenoles (mecanismo propuesto por autores como Neidleman and Geigert, 1986; Sponholz y Muno, 1994 y Maujean et al., 1985) tampoco nos permiti detectar niveles apreciables de 2,4,6-TCA. 4).- La biometilacin directa de 2,4,6-TCP fue el nico mecanismo que permite explicar la formacin de 2,4,6TCA. El uso como posible precursor de otros triclorofenoles tambin dio resultados negativos, lo cual es lgico porque la O metilacin de 2,3,6-TCP debera producir 2,3,6-TCA y no se conoce ningn mecanismo que pueda explicar la transformacin de ste a 2,4,6-TCA. Los resultados obtenidos, sin embargo, no nos permiten excluir la posibilidad de que el 2,4,6-TCA pueda ser sintetizado por alguno de estos mecanismos u otros, como resultado de la accin conjunta de dos o ms microorganismos presentes en el corcho, en un tpico ejemplo de cometabolismo. 3.3.- Anlisis de la bioconversin en medio lquido de 2,4,6TCP por T. longibrachiatum. En un trabajo previo (lvarez- Rodrguez, 2001) ya habamos demostrado que T. longibrachiatum era capaz de biometilar aproximadamente un 35% de 2,4,6-TCP para dar lugar a 2,4,6-TCA, mientras que el resto de precursor desapareca del cultivo lquido. 3.3.1.- O metilacin del 2,4,6-TCP. El estudio realizado en medio lquido que se representa en la figura 2.5 confirm que una parte del 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo era O metilado a 2,4,6-TCA. Este estudio nos permiti adems extraer otra serie de conclusiones importantes: 1).- En ausencia de precursor no pudimos nunca detectar
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2,4,6-TCA, lo cual sugiere que no se sintetiza de manera endgena, como podemos tambin deducir de los resultados recogidos en la tabla 2.5. 2).- Se ha detectado una actividad enzimtica 2,4,6-TCP metiltransferasa asociada a micelio que mostraba una cintica de expresin tpica de enzimas inducibles. El anlisis de la regulacin de esta actividad enzimtica por glucosa y amonio fue negativo (ver figura 2.6). De hecho los niveles de 2,4,6-TCA detectados en sobrenadantes de cultivo en todas las condiciones ensayadas fueron muy parecidos, oscilando el nivel de bioconversin en el rango 2939%. Este hecho es significativo si tenemos en cuenta que en el caso del basidiomiceto P. chrysosporium se ha observado formacin de 2,4,6.-TCA y PCA, a partir de 2,4,6-TCP y PCP respectivamente, cuando el microorganismo crece en un medio que contiente amonio 12 mM (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000). Sin embargo, en ausencia de amonio el 2,4,6-TCP es mineralizado a CO2 y no se detectan niveles de 2,4,6-TCA, lo que sugiere la existencia de mecanismos regulatorios por fuente de carbono y nitrgeno que controlan la degradacin de clorofenoles y lignina y la reaccin de O metilacin de estos compuestos en este hongo basidiomiceto. 3.3.2.- Qu ocurre con el resto del 2,4,6-TCP que no es O metilado a 2,4,6-TCA?. La degradacin de clorofenoles en condiciones aerbicas es un fenmeno ampliamente estudiado tanto en hongos basidiomicetos (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Ullah et al., 2000; Leontievsky et al., 1997 y 2000) como en bacterias (Xun y Orser, 1991; Xun, 1996; Wieser et al., 1997). Sin embargo, no existen en la literatura trabajos sobre la degradacin de estos compuestos por hongos filamentosos, a pesar de que como indican Gee y Peel (1974) un total de 99 de 116 aislados fngicos de pollo podan metabolizar 2,3,4,6-TeCP. Tambin Cserjesi y Johnson (1972) detectaron que T. virgatum poda metabolizar PCP. En este trabajo hemos detectado que T. longibrachiatum es capaz de biometilar del 29.2 al 39.5% del 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo, mientras que el resto del precursor desaparece totalmente (lvarez-Rodrguez et al., 2002a y 2003c). Existen varias posibilidades para explicar este hecho: 1).- Puede que el 2,4,6-TCP sea fijado por el micelio del hongo. La extraccin de ste con metanol y el posterior anlisis por HPLC no permitieron detectar trazas de este compuesto, lo cual sugiere que no es esta la causa de su desaparicin. 2).- Otra posibilidad es que el compuesto sea degradado totalmente hasta CO2 (mineralizacin). Sin embargo, estudios de mineralizacin de 2,4,6-TCP[14C] realizados en el laboratorio de la Dra. M Jess Martnez (CIB, CSIC,
Madrid) resultaron negativos, lo cual sugiere que T. longibrachiatum no puede mineralizar este compuesto. 3).- Una tercera posibilidad es que el 2,4,6-TCP sea parcialmente degradado hasta un intermediario incorporado a biomasa celular o eliminado al medio de cultivo. Dada la dificultad tcnica de este tipo de anlisis abordamos el estudio de esta hiptesis intentando detectar en el hongo alguna actividad enzimtica que pudiera explicar su degradacin. En condiciones aerobias la degradacin de 2,4,6-TCP y PCP consiste en unos pasos iniciales de deshalogenacin oxidativa (en bacterias y hongos) o deshalogenacin reductora (detectada en P. chrysosporium) que producen intermediarios tipo quinonas, que normalmente son hidroxilados (ver figura 3.1). Sin embargo, las enzimas que llevan a cabo este paso inicial de deshalogenacin son diferentes en bacterias y hongos: - en bacterias la desahalogenacin inicial es catalizada por monooxigenasas intracelulares como la clorofenol 4monooxigenasa de Burkholderia cepacia (Xun, 1996) o la 2,4,6-TCP-4-monooxigenasa de Azotobacter sp. cepa G1 (Wieser et al., 1997), que convier ten 2,4,6-TCP en 2,4-diclorobenzoquinona; o la pentaclorofenol hidroxilasa de Flavobacterium sp. ATCC 39723 (Xun y Roser, 1991), que transforma PCP en tetraclorodihidroxibenceno. - por el contrario, en hongos la deshalogenacin inicial es llevada a cabo por enzimas extracelulares del sistema ligninoltico. As lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa purificadas de Phanerochaete chr ysosporium pueden catalizar la conversin de PCP a tetraclorodihidroxibenceno (Bhasker Reddy et al., 2000) o de 2,4,6TCP a 2,6-dicloro-1,4-dihidroxibenceno (Bhasker Reddy et al., 1998). En otros basidiomicetos como Panus tigrinus o Coriolus versicolor, el 2,4,6-TCP se transforma en 2,6dicloro-1,4-dihidroxibenceno por la accin de manganeso peroxidasas y lacasas (Leontievsky et al., 2000). En nuestro laboratorio y en las condiciones en las que detectamos formacin de 2,4,6-TCA y desaparicin de 2,4,6-TCP hemos sido incapaces de detectar actividad monooxigenasa sobre diferentes sustratos como 2,4,5TCP, 2,4,6-TCP o PCP. Este hecho lo podramos considerar como normal ya que se trata de actividades bacterianas. Por el contrario, el anlisis realizado con sobrenadantes concentrados de cultivos nos ha permitido detectar la presencia en T. logibrachiatum de dbiles actividades arilalcohol oxidasa, lacasa y peroxidasa independiente de manganeso. Estos datos sugieren que la desaparicin de 2,4,6-TCP detectada podra deberse a la accin de estas actividades. En estas preparaciones no pudimos detectar actividad manganeso peroxidasa o lignina peroxidasa. En apoyo de esta posibilidad debemos mencionar que la
presencia de lacasas est bien documentada en hongos filamentosos, aunque su funcin no es bien conocida: as en Aspergillus nidulans (Scherer et al., 2001) la lacasa TILA aparece en el extremo de hifas en crecimiento, aunque su papel se desconoce; en Botr ytis cinerea las lacasas estn implicadas en la degradacin de la fitoalexina resveratrol que acta como un protector frente a infecciones fngicas (Schouten et al., 2002); por ltimo en Penicillium chr ysogenum se han detectado varias lacasas implicadas en la degradacin de lignina (Rodrguez et al., 1996). 4).- Otra posibilidad es que el 2,4,6-TCP no sea degradado, sino polimerizado por alguna lacasa para generar polimeros de alto peso molecular. As lacasa purificada de Coriolus versicolor puede destoxificar PCP generando polmeros de alto peso molecular y sin que exista liberacin de cloro (deshalogenacin) al medio (Ullah et al., 2000). En resumen, estudios preliminares sugieren que la desaparicin de 2,4,6-TCP observada en las condiciones de cultivo utilizadas no es debida a la mineralizacin del compuesto o su unin a micelio, y sin descar tar una posible polimerizacin, podra deberse a una accin degradativa mediada por una actividad lacasa o peroxidasa independiente de manganeso. 3.4.- Caracterizacin de la actividad enzimtica 2,4,6TCP metiltransferasa del hongo filamentoso T. longibrachiatum. Una vez detectada esta actividad enzimtica en T. longibrachiatum abordamos su caracterizacin. 3.4.1.- La actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa es inducible. Como hemos demostrado la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum es inducible. Este hecho es una diferencia notable con la metiltransferasa bacteriana implicada en la formacin de anisoles y tioanisoles detectada en Rhodococcus y Acinetobacter (Neilson et al., 1988), que es constitutiva, por lo que para realizar la O metilacin de un sustrato no se requiere una exposicin previa a clorofenoles. Es posible que el carcter inducible del enzima de T. longibrachiatum proporcione al hongo alguna ventaja, ya que probablemente resulte en una respuesta ms fuerte frente a clorofenoles en un tiempo ms corto, con la posibilidad adicional de una modulacin de la intensidad de la respuesta y el consiguiente ahorro energtico para la clula. El anlisis de diferentes compuestos aromticos y organoclorados como posibles inductores indic que esta actividad es inducida de manera eficaz y especfica no slo por 2,4,6-TCP, sino por clorofenoles con al menos tres tomos de cloro en su molcula. Otros compuestos clorados y derivados o no del fenol
como triclorobenceno, hexaclorobenceno y hexaclorociclohexano no se comportaron como inductores, como tampoco el fenol y otros compuestos aromticos no clorados. El efecto inductor parece ser independiente de las condiciones nutricionales del cultivo, como se deduce de las grficas de la figura 2.6. En efecto, los niveles de bioconversin detectados variaban ligeramente en el rango 29.239.5%, aunque en el medio hubiese una alta concentracin de glucosa (2%), amonio (50 mM) o ambos. Por el contrario, la formacin de 2,4,6-TCA y PCA por P. chrysosporium (Bhasker Reddy et al., 1998, 2000) est regulada nutricionalmente, ya que slo se detecta en condiciones HCHN (del ingls High Carbon-High Nitrogen); esto es, cuando el cultivo se desarrolla en condiciones no limitantes de fuente de nitrgeno (amonio 12 mM). Cuando el cultivo se realiza en condiciones limitantes de nitrgeno (condiciones HCLN) no se detecta produccin de anisoles. La ausencia de regulacin nutricional de la 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum sugiere un posible papel de la O metilacin de clorofenoles en la destoxificacin de estos compuestos altamente contaminantes. Parece claro que en la naturaleza podra ser peligroso para un microorganismos estar expuesto a clorofenoles en unas condiciones de represin de la reaccin de O metilacin, lo que evitara su detoxificacin y podra resultar en la muerte del microorganismo. 3.4.2.- Caractersticas de la 2,4,6-TCP metiltransferasa. La produccin de anisoles est ampliamente documentada en la naturaleza. De hecho se han encontrado como contaminantes en alimentos como huevos y pollos (Engel et al., 1966; Curtis et al., 1974), patatas (Cserjesi y Johnson, 1972), frutas secas (Tindale et al., 1989), caf (Spadone et al., 1990) y agua para bebida (Nystrom et al., 1992). Adems se ha detectado la produccin de anisoles por cepas de Rhodococcus y Acinetobacter (Allard et al., 1987, Neilson et al., 1988), el alga unicelular Euglena gracilis (Drotar y Fall, 1985a y 1985b), el protozoo Tetrahymena termophila (Drotar y Fall, 1986), la levadura Sacharomycopsis lipolytica (Drotar et al., 1987) y hongos basidiomicetos como Phanerochaete chrysosporium (Bhasker Reddy et al., 1998 y 2000) y Phellinus pomaceus (Harper et al., 1989; McNally y Harper, 1991). A pesar de ello, el significado biolgico de las reacciones de O metilacin es poco conocido: nicamente se ha caracterizado de manera muy preliminar una metiltransferasa de Rhodococcus sp. 1395 implicada en la formacin de anisoles y tioanisoles (Neilson et al., 1988) y se ha purificado una metiltransferasa especfica para fenoles 2,4-disustitudos de P. chrysosporium (Coulter et al., 1993), que puede O metilar 2,4-DCP y 2,4-DBrP. La 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum muestra una serie de caractersticas que podemos destacar:
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- El pH ptimo del enzima se sita entre 8.2-8.5 (figura 2.9) frente a un pH de 7.0 del enzima de Rhodococcus sp. 1395 y un rango amplio de pH (7-9) en el caso de la metiltransferasa de P. chrysosporium. - La reaccin transcurre de manera lineal durante las cuatro primeras horas de reaccin (figura 2.10), mientras que en el caso del enzima bacteriana la linealidad slo se mantiene durante la primera hora de reaccin. - El enzima fngica no requiere EDTA para su actividad, a diferencia del enzima bacteriano. - La influencia de varios grupos toles sobre la actividad enzimtica fue escasa: nicamente la adicin conjunta de DTT y PMSF supuso un incremento notable del rendimiento de la reaccin (42.5%). Por otro lado, el efecto inhibitorio de varios reactivos de grupos tiol (iodoacetamida, Netilmaleimida o p-cloro-mercuriobenzoato) que generalmente se comportan como inhibidores de metiltransferasas fue pobre. nicamente el p-cloro-mercuriobenzoato (1 mM) supuso una inhibicin de la reaccin del 45.2% ( 6.6). Estos datos parecen sugerir la existencia en el centro activo de al menos un grupo sulfidrilo (-SH), aunque su papel en el proceso cataltico pudiera no ser esencial, dado el escaso efecto inhibitorio de este tipo de compuestos. - Una de las caractersticas ms notables de las metiltransferasas que utilizan SAM como donador de grupos metilo es que la reaccin es fuertemente inhibida por el producto de la reaccin SAHC (Poulton, 1981). Esta norma tambin es aplicable a la 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum: la inclusin de SAHC 1 mM en le mezcla de reaccin produca una inhibicin del 87.1% ( 5.6). 3.4.3.- Rango de sustratos utilizados por la 2,4,6-TCP metiltransferasa. Las dos metiltransferasas conocidas hasta la fecha implicadas en la formacin de anisoles tienen una amplio rango de sustratos. As el enzima de Rhodococcus sp. 1395 es capaz de llevar a cabo la O metilacin de una amplia variedad de cloro y bromofenoles, cloro y bromoguayacoles y cloro y bromocatecoles. Por otro, la O-metiltransferasa especfica para 2,4-fenoles disustitudos de Phanerochaete chrysosporium tiene, como indica su nombre, una alta afinidad por fenoles disustitudos en posiciones orto y para (Coulter et al., 1993). De hecho metila una gran variedad de 3-metoxi y 3,5-dimetoxi 4-hidroxibenzaldehdos, 4-hidroxicidos benzoicos y 4-hidroxiacetofenonas. Ello sugiere un posible papel de esta enzima en la O metilacin de compuestos generados en la degradacin de la lignina, posiblemente para hacerlos ms fcilmente atacables por enzimas del aparato ligninoltico. Adems, de manera secundaria esta enzima metila con alta eficiencia 2,4-DCP y 2,4-DBrP. Esta
enzima pudiera ser responsable de la formacin del 2,4,6-TCA y PCA detectados en cultivos de este basidiomiceto en condiciones no limitantes de fuente de nitrgeno. El enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa detectada en T. longibrachiatum tiene un rango de sustratos claramente diferente a ambas enzimas (ver tabla 2.13). Son varias sus caractersticas destacables al respecto: - Es altamente especfica de fenoles halogenados. De hecho no es capaz de O metilar una amplia variedad de compuestos aromticos no halogenados como fenol, guayacol (2-metoxifenol), catecol (1,2-dihidroxibenceno); aldehdos como el 3,4-hidroxibenzaldehdo o la vainillina (4hidroxi-3-metoxi benzaldehdo); o cidos benzoicos como el vainllico (4-hidroxi-3-metoxi benzoico) o el isovainllico (3-hidroxi-4-metoxi benzoico). Este hecho la diferencia claramente de las dos enzimas antes mencionadas. A la vista de estos datos, y aunque a lo largo del texto el nombre que se ha utilizado para el enzima es el de 2,4,6-TCP metiltransferasa, creemos que una denominacin ms acertada seria la de clorofenol O-metiltransferasa o de manera abreviada CPOMT. - Entre los fenoles halogenados el enzima metila con mayor eficiencia clorofenoles que bromo o yodofenoles. As la actividad relativa desarrollada frente a 2,4,6-TCP fue de 59.91%; muy superior que frente a 2,4,6-TBrP (12.98%) o 2,4,6-TIP. Curiosamente no pudimos detectar O metilacin de 2,4,6-TFP. Estos datos son muy interesantes ya que parecen sugerir que la capacidad de metilacin de esta metiltransferasa depende de caractersticas estructurales o estricas de los sustratos, ms que de propiedades electrnicas, pues en este caso cabra haberse detectado metilacin del 2,4,6-TFP. Un comportamiento similar ha sido detectado para la O-metiltransferasa especfica de fenoles 2,4-disustitudos de P. chysosporium (Coulter et al., 1993). El enzima parece poseer una mayor actividad hacia clorofenoles, posiblemente por ser ms abundantes en la naturaleza que bromo y yodofenoles. De hecho a medida que el volumen del halgeno sustituyente aumenta el actividad del enzima parece disminuir. - En funcin de los niveles de metilacin de los diferentes sustratos ensayados parece ser que la halogenacin de la posicin dos (orto) parece ser importante para la actividad, aunque no necesaria. De hecho el nico CP metilado fue el 2-CP, mientras que 3-CP y 4-CP no fueron sustratos efectivos en la reaccin. Adems, entre los DCPs el sustrato biometilado con mayor eficiencia fue el 2,4-DCP, mientras que la eficiencia de la reaccin disminuy de manera progresiva para el 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6-DCP y 3,4-DCP (no detectndose actividad sobre el 3,5-DCP). - Cuando se analiza el nivel de actividad frente a DCPs, TCP, y TeCPs se deduce que, una vez halogenada la posicin dos, la introduccin adicional de un tomo de cloro
en la posicin seis supone un impedimento estrico para la actividad enzimtica. Para realizar esta aseveracin nos basamos en los siguientes datos: * La actividad frente a 2,4-DCP (100%) es mucho mayor que frente a 2,6-DCP (10.36%) o 2,4,6-TCP (59.91%). * Si analizamos el nivel de metilacin de TCPs y TeCPs vemos que la actividad frente a 2,3,4-TCP (93.33%) es mayor que frente a 2,3,6-TCP (55.58%), mientras que la halogenacin de la posicin seis del 2,3,4-TCP produce 2,3,4,6-TeCP, compuesto que no es metilado. Por otro lado el nivel de metilacin del 2,4,5-TCP (64.19%) es superior que el del sustrato 2,4,6-TCP. * Entre los TeCPs el nico metilado fue el 2,3,4,5-TeCP, mientras que la actividad fue nula frente a 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP, ambos con un tomo de cloro en posicin seis. * Sin embargo, es necesario hacer notar que el nivel de O metilacin del PCP (10.07%) fue slo ligeramente menor que el del 2,3,4,5-TeCP (10.73%), cuando quizs habra cabido esperar una ausencia total de actividad frente a este compuesto, si tenemos en cuenta que el PCP tiene ocupada la posicin seis y un tomo ms de cloro que 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP. 3.5.- Perspectivas futuras. El trabajo que hemos descrito se enmarca dentro de una lnea de investigacin (iniciada en enero de 2000) que tiene como objeto la bsqueda de posibles soluciones biotecnolgicas al problema de la contaminacin del corcho, producido por 2,4,6-TCA. Este planteamiento tiene, sin embargo, que enfrentarse a un serio problema: el escaso conocimiento general sobre el cork taint. En efecto, aunque los compuestos qumicos responsables de este fenmeno se identificaron en la dcada de los aos 80 (Maujean et al., 1985; Amn et al., 1989), el conocimiento acerca de los microorganismos productores y, sobre todo, de los mecanismos moleculares implicados en su formacin es muy escaso. Nuestro trabajo ha pretendido tratar de identificar los microorganismos productores de 2,4,6-TCA, as como los procesos implicados en su produccin. A la vista de los resultados expuestos en este trabajo podemos establecer las siguientes premisas: - El verdadero problema del cork taint no es la presencia de microorganismos en el corcho, sino la absorcin de pesticidas clorofenlicos por la corteza. Dichos clorofenoles seran destoxificados, principalmente por hongos filamentosos, para producir cloroanisoles no txicos. - Controlar el contacto de clorofenoles con el rbol es casi imposible si tenemos en cuenta que el amplio uso de estas sustancias durante dcadas, unido a su recalcitrancia a la degradacin, ha provocado que contaminen todos los ecosistemas areos, acuticos y terrestres. - Algunos autores han postulado la posibilidad de manu-
facturar los tapones de corcho en un ambiente libre de microorganismos (Butzke et al., 1999). Creemos que este planteamiento es equivocado por dos razones: en primer lugar, prcticamente todas las planchas de corcho tienen unos niveles basales de 2,4,6-TCA; por otro lado, la manufactura de tapones en un ambiente estril encarecera tanto el tapn que posiblemente el coste econmico para las bodegas sera inasumible. Por ello, planteamos como posible solucin biotecnolgica el desarrollo de dos tipos de estrategias para controlar la presencia de cloroanisoles en corcho: 1).- En primer lugar el desarrollo de inculos microbianos para crecer sobre corcho basados en la cepa Trichoderma longibrachiatum CECT 20431 (caracterizada en este trabajo), aprovechando las propiedades que hacen del gnero Trichoderma un microorganismo ideal para su uso como agente de control biolgico (Hjeljord y Tronsmo, 1998). Las caractersticas de estos inculos seran las siguientes: a).- Buena capacidad de crecimiento sobre corcho. Esta cepa muestra un crecimiento invasivo sobre corcho, de manera que podra evitar el crecimiento de otros hongos indeseables. b).- Capacidad de degradar el precursor 2,4,6-TCP. En ensayos en medio lquido slo una parte del 2,4,6-TCP se convierte a 2,4,6-TCA siendo el resto del precursor degradado (lvarez-Rodrguez et al., 2002a y lvarez-Rodrguez, 2003c) c).- Incapacidad de producir 2,4,6-TCA por interrupcin del gen codificante de la metiltransferasa. La purificacin de la clorofenol O-metiltransferasa (CPOMT) nos permitir la determinacin de la secuencia de algn pptido de la protena. A partir de sus secuencias podremos clonar el gen. Una vez clonado el gen se proceder a su interrupcin gnica para obtener cepas deficientes en CPOMT. d).- Produccin de lacasas por expresin de genes codificantes de lacasas que permitan la oxidacin (polimerizacin) del precursor 2,4,6-TCP, evitando su disponibilidad para la sntesis de 2,4,6-TCA. Las lacasas son enzimas que muestran una alta capacidad de oxidacin de derivados fenlicos (Reinhammar y Malmstrom, 1981; Bollag et al., 1988; Ullah et al., 2000). e).- Muy baja probabilidad de produccin de micotoxinas. El gnero Trichoderma es reconocido como GRAS (Generally Recognized As Safe) (Nevalainen et al., 1994) y la produccin de micotoxinas es anecdtica. Este hecho
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hace del gnero Trichoderma un candidato ideales para su posible uso en aplicaciones agroalimentarias. 2).- Produccin de preparados enzimticos a base de lacasas para lavar el tapn antes del envasado y eliminar cualquier resto de clorofenoles y cloroanisoles. Se trata de obtener a partir de cultivos de hongos preparados que contengan lacasas que se utilizaran para el lavado superficial de tapones, a fin de eliminar cualquier resto de clorofenoles o cloroanisoles presentes en el tapn. La obtencin de este tipo de extractos semipurificados podra una solucin adicional y barata para el problema del cork taint. Para ello optimizaramos la expresin de genes codificantes de lacasas de basidiomicetos en T. longibrachiatum. Una preparacin de lacasa con el nombre comercial de SUBERASE es comercializada por Novo Nordisk. Sin embargo, su utilizacin por las industrias que manufacturan corcho ha sido ampliamente rechazada ante el prohibitivo precio de las preparaciones. En nuestro caso se tratara de transferir a las empresas una tecnologa barata de produccin propia o en su defecto poder proporcionar una alternativa mucho ms econmica. Ambos tratamientos deberan permitirnos obtener tapones libres de cloroanisoles, cuya utilizacin en el envasado de vinos espaoles podra, sin duda, aumentar su calidad frente a vinos competidores producidos en otros pases.
5.- La produccin de 2,4,6-TCA en cultivos de T. longibrachiatum en medio lquido no est sometida a regulacin catablica por glucosa ni a represin por amonio. 6.- En T. longibrachiatum la O metilacin de 2,4,6-TCP es llevada a cabo por una O-metiltransferasa inducible dependiente de S-adenosilmetionina como donador de grupos metilo que denominaremos clorofenol O-metiltransferasa. 7.- T. longibrachiatum posee unos niveles basales bajos de esta metiltransferasa, pero su sntesis es inducida de manera especfica por exposicin a clorofenoles, especialmente si tienen tres o ms tomos de cloro en su molcula. 8.- El enzima clorofenol O-metiltransferasa de T. longibrachiatum ha sido purificada a homogeneidad, un total de 222.67 veces a par tir de extractos acelulares. 9.- Esta enzima tiene un peso molecular nativo de 112.000 daltons, mientras que el tamao molecular en condiciones desnaturalizantes es de 52.500 daltons, lo que indica que en su forma nativa es un dmero.
4.- CONCLUSIONES
1.- El corcho es un ecosistema microbiano complejo a par tir del cual podemos aislar una gran variedad y cantidad de microorganismos. En nuestro caso se aislaron 55 microorganismos diferentes: 14 hongos filamentosos, 8 levaduras, 13 actinomicetos y 20 bacterias no filamentosas. 2.- La capacidad de producir 2,4,6-TCA a par tir de 2,4,6-TCP est muy extendida entre los hongos filamentosos. De un total de 14 aislados, 11 fueron capaces de producir este compuesto cuando crecan directamente sobre corcho. 3.- En Trichoderma longibrachiatum el nico mecanismo detectado capaz de generar 2,4,6-TCA fue la O metilacin de 2,4,6-TCP. 4.- En cultivos en medio lquido la eficiencia de O metilacin del 2,4,6-TCP por T. longibrachiatum oscila entre el 29.2 y el 39.5%, mientras que el resto del pesticida desaparece del medio de cultivo.
10.- La clorofenol O-metiltransferasa de T. longibrachiatum puede ser identificada mediante fotomarcaje con Sadenosilmetionina tritiada. 11.- La reaccin catalizada por esta enzima es altamente especfica de fenoles halogenados, siendo el 2,4DCP el compuesto metilado con mayor eficiencia. 12.- La clorofenol O-metiltransferasa metila de mayor a menor eficiencia los sustratos 2,4,6-TCP, 2,4,6-TBrP y 2,4,6-TIF, mientras que no metila 2,4,6-TFP. Por lo tanto desarrolla una mayor actividad frente a clorofenoles que frente a fenoles halogenados con bromo, yodo o fluor. 13.- El corcho es por tanto un ecosistema microbiano en el que podemos encontrar microorganismos potencialmente responsables del problema del sabor a corcho y/o moho de los vinos (cork taint).
ABREVIATURAS
A: absorbancia ADN: cido desoxirribonucleico ADNr: ADN ribosomal 5'-AMP: adenosina-5'-monofosfato ARN: cido ribonucleico AU: unidades de absorbancia BSA: albmina srica bovina C: grado centgrado CECT: Coleccin Espaola de Cultivos Tipo Ci: curio CPOMT: clorofenol O-metiltransferasa Cys: cistena Da: dalton DEAE: dietilaminoetil DMSO: dimetilsulfxido DNAsa: desoxirribonucleasa DO: densidad ptica DTT: ditiotreitol EDTA: cido etiln diaminotetraactico FPLC: cromatografa lquida de desarrollo rpido g: gramo h: hora HPLC: cromatografa lquida de alta presin Kav: constante de proporcionalidad de filtracin en gel kb: kilobase. Ki: constante de inhibicin Km: constante de Michaelis-Menten M: molar mAU: miliunidades de absorbancia Mr: masa molecular MTHF: 5-metiltetrahidrofolato p/v: relacin peso-volumen PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida PMSF: fluoruro de p-metilenfenilsulfonilo RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin r.p.m.: revoluciones por minuto SAHC: S-adenosil-homocistena SAM: S-adenosil-L-metionina SDS: dodecil sulfato sdico SDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico Ser: serina Tris: tris (hidroximetil) aminometano U: unidad (de actividad enzimtica) UFC: unidad formadora de colonia UV: ultravioleta v: velocidad de reaccin Vmax: velocidad mxima de reaccin v/v: relacin volumen-volumen Abreviaturas de compuestos aromticos y fenoles halogenados
CA: cloroanisol CP: clorofenol DBrP: dibromofenol DCA: dicloroanisol DCP: diclorofenol 2,6-DMP: 2,6-dimetoxifenol HCB: hexaclorobenceno HCCH: hexaclorociclohexano TBrA: tribromoanisol TBrP: tribromofenol TCA: tricloroanisol
TCB: triclorobenceno TCP: triclorofenol TeCA: tetracloroanisol TeCP: tetraclorofenol TFA: trifluoroanisol TFP: trifluorofenol TIA: triyodoanisol TIP: triyodofenol PCA: pentacloroanisol PCP: pentaclorofenol
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5.- Referencias bibliogrficas
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6.- Agradecimientos
El trabajo aqu expuesto ha sido posible gracias a la financiacin del Ministerio de Educacin y Cultura y la Comunidad Europea (Proyecto FEDER 1FD97-1172) y de la Junta de Extremadura -Consejera de Educacin, Ciencia y Tecnologa- (Proyectos IPR00C004 y 2PR01A009). Deseamos agradecer tambin el apoyo prestado por el Instituto para la promocin del corcho (IPROCOR, Mrida), que amablemente nos ha cedido sus instalaciones para la realizacin de todos aquellos estudios que pudieran ser necesarios y especialmente a D. Miguel Elena Rosell y D. Luis Javier vila por su apoyo y su colaboracin tcnica en la realizacin de los anlisis por cromatografa de gases-masas. A SANVICORK S.A. (San Vicente de Alcntara, Badajoz) y especialmente a su director D. Andrs Gilo, por el firme apoyo al trabajo realizado y la donacin de muestras para su anlisis.
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MTODO ROSA PARA LA REDUCCIN DE TCA EN EL TAPN DE CORCHO

ROSA es la nueva arma de Amorim para combatir el TCA (2,4,6 tricloroanisol) en los tapones de corcho de las botellas de vino. Los ensayos cientficos demuestran que ROSA reduce espectacularmente los TCA y la incidencia de la contaminacin por mohos en el vino embotellado.
Miguel Cabral AMORIM Sta. Mara de Lamas Portugal
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os TCA siguen siendo el mayor obstculo para mejorar la regularidad de la fabricacin de corchos para vinos. Se estima que los TCA, contaminantes en trazas corrientes en las industrias de alimentos y bebidas envasados, son responsables de entre un 70 y un 80% de las incidencias de contaminacin relacionada con el corcho en los vinos. Confieren un sabor a humedad o a moho a la comida o las bebidas, y, en el vino, pueden empaar las cualidades afrutadas o volverlo simplemente imbebible. Los TCA son detectables en nariz y en el paladar a concentraciones extraordinariamente bajas, una caracterstica que representa una tremenda dificultad para el control de calidad del proceso de produccin de tapones de corcho y de la manipulacin y el almacenamiento en post-produccin. Los TCA, compuestos organoclorados
presentes en la cor teza del alcornoque y en el entorno de fbrica o de almacn, pueden ser absorbidos rpidamente por el corcho prcticamente en cualquier etapa de su proceso de fabricacin. Derrotar un contaminante en trazas infinitesimales en estas circunstancias ha exigido tanto un enorme esfuerzo en I+D como una gran inversin en una nueva planta y en maquinaria, que, en su momento, se extender a todas las fbricas que Amorim tiene repar tidas por el mundo.
La estrategia anti-TCA de Amorim

A finales de los aos 1990, Amorim acometi un esfuerzo coordinado para atacar las fuentes de TCA en la corteza de alcornoque y la formacin de TCA durante el proceso de transformacin del corcho. El objetivo consista en
Prevencin
Materias primas
Almacenamiento selectivo Nuevo sistema de coccin Inos II Ozono Anlisis qumico
Limpieza Reducir los TCA Higiene Control de calidad
Eliminacin
ROSA
reducir drsticamente la incidencia de TCA en el vino, y, en ltima instancia, en conseguir que el corcho dejara de ser causa de contaminaciones por mohos. La estrategia adoptada por Amorim consisti en examinar y validar su proceso de produccin y desarrollar una serie de tcnicas para prevenir o evitar los TCA y suprimir o eliminar el contaminante en los productos de corcho de Amorim. Entre las tcnicas preventivas aplicadas desde que se adopt esta estrategia figuran las siguientes: Mejora de los mtodos de cosecha del corcho y sus controles Controles rigurosos sobre el almacenamiento y el secado de la corteza bruta Nuevos procedimientos de compra y seleccin de corcho Sistema de coccin totalmente nuevo para la limpieza de las planchas de corcho
Proceso de lavado agresivo (INOS I) para los discos de corcho Aplicacin de ozono para desodorizar los corchos y prevenir la contaminacin microbiana Anlisis qumico exhaustivo para detectar el corcho sospechoso Estas iniciativas han permitido conseguir un avance significativo en la lucha contra los TCA. Por ejemplo, el ensayo qumico exhaustivo de las planchas de corcho para detectar la presencia de TCA ha eliminado prcticamente el rechazo sensorial de los tapones de corcho
suministrados a los clientes estadounidenses de Amorim, gracias a lo cual han cesado las reclamaciones por presencia de TCA. Gracias a la utilizacin de las mquinas de cromatografa de gases quntuples de que actualmente dispone el depar tamento de I + D de Amorim, esta sociedad puede analizar cerca de 2.500 muestras de corcho por semana, y detectar los TCA a muy bajas concentraciones. Una capacidad analtica de esta magnitud ha permitido al personal identificar y aislar rutinariamente los lotes de corcho sospechosos en todas las etapas de produccin, mejorando significativamente con ello los procedimientos de control de calidad de Amorim. La introduccin del sistema ROSA constituye el primer proceso a escala industrial que extrae fiable y significativamente los TCA y otros compuestos voltiles de los componentes del corcho y de los tapones enteros.
Cmo funciona ROSA

ROSA es la novedad ms reciente, y tal vez ms importante hasta la fecha de Amorim en su estrategia contra el TCA. Es un sistema de purificacin patentado, desarrollado por Amorim a raz de una intensa labor de investigacin realizada durante ms de tres aos, que ha conllevado miles de experimentos y de anlisis qumicos y un programa de profunda revisin del diseo de procesos. Los ensayos de validacin tanto internos como externos han confirmado que ROSA reduce los niveles de TCA voltil hasta en un 80%. Como consecuencia de estos ensayos, actualmente se est introduciendo progresivamente el sistema en las fbricas de productos de corcho para el vino de Amorim. ROSA se basa en una destilacin al vapor controlada, mediante la cual el vapor y el agua a presin expulsan los compuestos presentes en cantidades infinitesimales en las clulas del corcho. Para reproducir los ensayos de laboratorio de ROSA a escala semi-industrial primero e industrial despus para integrar el sistema en el proceso de fabricacin industrial de tapones de corcho, los investigadores e ingenieros de Amorim han tenido que superar numerosos obstculos, entre los que cabe destacar los siguientes. Irregularidad de los niveles de reduccin de TCA Efecto adverso del proceso sobre las propiedades fsicas y la apariencia visual del corcho Recontaminacin del corcho debida a la condensacin del vapor. El tratamiento al vapor puede alterar por ejemplo las propiedades mecnicas del corcho, reduciendo su elasticidad o compresibilidad y por ende su eficacia de cierre. Tambin puede modificar su apariencia visual, que afecta a su clasificacin y por lo tanto al
valor comercial del corcho. En el caso de un disco de corcho o de un tapn de corcho acabado, el tratamiento al vapor puede deformar las dimensiones fsicas del producto, y exigir una rectificacin laboriosa y costosa. En su investigacin de estos fenmenos, Amorim ha obser vado que el vapor a altas temperaturas - an siendo ms eficaz para eliminar los TCA - afecta proporcionalmente ms al corcho que el vapor a menor temperatura. Esta obser vacin ha exigido la realizacin de pruebas para determinar el equilibrio ptimo entre la supresin de TCA y el nivel de deformacin o alteracin mecnica, una labor de investigacin que contina todava. En 2003, ya se ha per feccionado el proceso ROSA para el serrn de corcho utilizado en la fabricacin de
Informe Tcnico 85
tapones aglomerados. El resultado son los tapones aglomerados tratados con ROSA que, desde el punto de vista mecnico y funcional, son casi idnticos a los tapones sin tratar - con la salvedad de que presentan un riesgo mucho ms reducido de contaminacin por TCA. Al da de hoy, la sociedad sigue realizando un gran esfuerzo de I + D con objeto de optimizar el pro-
Pruebas de embotellado
El objeto de esta investigacin consiste en evaluar la incidencia de contaminacin por TCA registrada en el vino embotellado con tapones tratados con ROSA y conservados en condiciones tpicas de bodega.
ceso para los tapones de corcho enteros.
Conversaciones en el Reino Unido

A los ocho meses de su creacin, el Centro de Contacto Minorista de Amorim en el Reino Unido ya ha entablado un dilogo productivo con todos grandes minoristas de vino en Gran Bretaa. El centro dirigido por Ann Harkins, anteriormente directora de control de calidad de una destacada cadena de supermercados en el Reino Unido, es una iniciativa de Amorim. Se ha creado para fomentar an ms el contacto directo entre los minoristas del vino y los proveedores de tapones, con objeto de propiciar una mayor comprensin entre ellos. Uno de sus principales objetivos ha sido alejar a los minoristas y a los proveedores de tapones de los estriles debates pblicos sobre asuntos referentes a los tapones de vino, para que inicien un proceso proactivo de dilogo privado y constructivo. Tras la ltima ronda de conversaciones celebrada en el mes de septiembre, la retroaccin ha sido especialmente positiva.. "Los minoristas se han quedado impresionados ante el compromiso de Amorim con el mercado britnico y el hecho de que haya dedicado recursos para atenderlo", dice la Sra. Harkins. "Tambin se han enterado de lo que lleva conseguido Amorim hasta la fecha en su lucha contra los TCA, y la envergadura del esfuerzo continuo realizado por la empresa en este sentido." Se espera que el centro sea beneficioso para las dos partes. Para los minoristas, este dilogo es una oportunidad de conocer mejor el corcho y sus capacidades tcnicas como tapn, y de transmitir directamente sus necesidades al proveedor de corcho. Segn Ann Harkins, los minoristas valoran la formacin tcnica que Amorim est impartiendo a su personal. Tambin han acogido favorablemente la disposicin de Amorim para ayudarles a desarrollar normas para los tapones de sus vinos de marca propia. Adems, por primera vez, Amorim recibe informacin directa sobre las necesidades del negocio britnico del vino y sus
Incorporacin de ROSA a la cadena de produccin

Durante los aos 2003 y 2004 se ir integrando progresivamente el proceso ROSA en las plantas de pro-
LA CONTAMINACIN DE LOS VINOS POR BRETTANOMYCES DURANTE VINIFICACIN Y LA CRIANZA: Incidencia, Deteccin y Medios de lucha
La aparicin de olores fenlicos, animales, con recuerdos a cueros y orina de caballo en los vinos tintos se deben a la contaminacin por levaduras del gnero Brettanomyces/Dekkera. Dichas levaduras se sientes especialmente confortables en ambientes con poca higiene y son capaces de contaminar el vino el los diferentes procesos de elaboracin y crianza. Slo una adecuada tcnica de deteccin de la contaminacin y unos procesos de desinfeccin de los recipientes eficaces y respetuosos con el material, reducir los efectos indeseables producidos por estos grmenes.
Pascal CHATONNET Laboratoire EXCELL MERIGNAC Francia
Figura 2-Limitacin de la limpieza de barricas con los caos de Informe Tcnico 89
LA CONTAMINACIN DE LOS VINOS POR BRETTANOMYCES DURANTE LA VINIFICACIN Y LA CRIANZA: Incidencia, Deteccin y Medios de lucha
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Introduccin
as levaduras de contaminacin pertenecientes al gnero Brettanomyces (o a su forma esporulante Dekkera) son conocidas en enologa por los numerosos disgustos que causan (figura 1). En efecto, el desarrollo de estos grmenes provoca concretamente la aparicin de olores "fenlicos" y "animales" que evocan el "cuero" o la "orina de caballo" en los vinos tintos. En el marco del programa de investigacin de la tonelera SEGUIN MOREAU, hemos demostrado que este tipo de defecto, calificado de carcter "fenolado" de los vinos tintos, est directamente vinculado con la presencia de una cantidad excesiva (superior al valor de su umbral de recuperacin en el vino, > 450 g/l) de etilfenoles malolientes (etil-4-fenol y etil-4guaiacol # 8:1) (CHATONNET et al., 1990, 1992). El olor tpico del etil-4-fenol pasa a ser claramente perceptible a partir de unos 600 g/l, y especialmente dominante en concentraciones superiores a dicho valor. Debido a su equipo enzimtico especialmente adaptado, slo las levaduras del gnero Brettanomyces/Dekkera son capaces de formar cantidades importantes de etilfenoles en los vinos tintos; las bacterias lcticas son incapaces de generar los niveles necesarios para que aparezca un olor perceptible (CHATONNET et al., 1997).
A-Contaminacin de los vinos durante su elaboracin

Brettanomyces/Dekkera es una levadura sumamente extendida. Siente predileccin ante todo por los grifos poco limpios, los canalones, las piqueras de las barricas y las las. Por lo tanto, no se puede hablar con propiedad de bodega contaminada o indemne: todas las dependencias de vinificacin y de crianza alojan este tipo de grmenes. Lo nico que importa realmente es el nivel de contaminacin y las condiciones de control de las poblaciones en la bodega. La contaminacin ms frecuente se produce en el caldo terminado, durante el proceso de crianza, cuando han concluido las fermentaciones alcohlica y malolctica. A partir de ese momento cesan los fenmenos de antagonismo y de competencia entre microorganismos, y Brettanomyces bruxellensis, la especie ms corriente en el vino, puede explotar las trazas de azcares residuales presentes en todos los caldos (glucosa, fructosa, mano-
sa, galactosa, trehalosa y sacarosa). El desarrollo de estos grmenes se puede producir en estricta anaerobiosis; la fermentacin de una cantidad prxima a 300 mg/l de azcares residuales es suficiente para formar una cantidad de etilfenoles equivalente al valor de su umbral de percepcin (425 g/l) (CHATONNET et al., 1995). Al final de la fermentacin malolctica, los vinos secos contienen en promedio ms de 400 mg/l de azcares fermentables por Brettanomyces que, tericamente, permiten la formacin de cerca de 600 g/l de etilfenoles, el valor del umbral de percepcin del etil-4-fenol. As pues, en principio todos los vinos podran presentar un carcter "fenolado" en caso de contaminacin y de desarrollo de Brettanomyces. Sin embargo, existe un "factor de terreno" importante. Los vinos ms ricos, es decir de fuerte graduacin alcohlica por proceder de las uvas ms maduras, y por tanto de baja acidez y maceracin prolongada, a menudo son ms ricos en sustratos asimilables, y por lo tanto potencialmente ms favorables al desarrollo de Brettanomyces sp. El control exacto del contenido de azcares residuales al final de la fermentacin alcohlica y malolctica, en especial de la suma glucosa + fructosa fcilmente accesible, indica mucho mejor la "sensibilidad" de un vino respecto al desarrollo de Brettanomyces que la clsica medicin de azcares reductores qumicos, totalmente superada hoy en da. Esta dosificacin basada en ciertas propiedades reductoras de los azcares se ve cada vez ms expuesta a numerosas interferencias. Dependiendo de las cantidades de azcares residuales dosificados, se podr prestar ms atencin a ciertos lotes que a otros; de ese modo se podr razonar de forma distinta ciertas mezclas con objeto de reducir el riesgo de desarrollo de los grmenes. La crianza en barricas no induce sistemticamente una contaminacin de los caldos ni la aparicin de un carcter "fenolado". Ahora bien, la conservacin en madera, la utilizacin de barricas usadas sin someterlas a un buen tratamiento, de bodegas de crianza inadecuadas (variaciones de temperaturas), de rellenos (oxidacin excesiva) y de trasiegos insuficientes (frecuencia de desinfeccin de barricas), constituyen una suma de circunstancias que propician la contaminacin y el ulterior desarrollo de grmenes de contaminacin en general y de Brettanomyces sp. en particular. La utilizacin de barricas nuevas tambin es favorable al desarrollo de estos grmenes. Se barajan muchas hiptesis extravagantes para explicar la mayor frecuencia de contaminacin de las barricas nuevas en ciertas salas de crianza. La madera de barricas no aporta azcares en cantidad suficiente para crear un medio favorable al desarrollo de estas levaduras contaminantes; la madera nueva tampoco es fuente de innoculum pues el tueste esteriliza perfectamente las barricas. La realidad es que, debido a su potencial oxidante mucho mayor y a
la merma a menudo ms alta, en especial durante el periodo estival cuando sube la temperatura de la bodega, el contenido de dixido de azufre libre tiende a disminuir mucho ms rpidamente en las barricas nuevas que en las usadas. Se sabe que por debajo de cierto umbral de dixido de azufre libre (ver ms abajo), cesa la inhibicin de Brettanomyces, y aparece una alteracin proporcional a la poblacin microbiana. La contaminacin de los vinos tambin se observa con frecuencia en caso de dificultad en la terminacin de la fermentacin alcohlica y / o malolctica. En estas condiciones, los caldos permanecen expuestos al calor durante vinos varias semanas o incluso meses, sin ninguna proteccin a base de dixido de azufre y en presencia de altos contenidos de azcares. Si por desgracia, los caldos entran en contacto con Brettanomyces/Dekkera, el resultado puede ser un incremento fuerte y rpido del contenido de etilfenoles. En caso de deteccin precoz de la contaminacin, es preferible sulfitar y filtrar antes de volver a sembrar, con objeto de prevenir la alteracin de todo el volumen, y sobre todo la contaminacin masiva de la bodega. La flash-pasteurizacin es un procedimiento eficaz pero especialmente enrgico, y hay que reservarlo alas situaciones ms crticas. La contaminacin durante la fermentacin alcohlica, aunque se puede producir, es mucho menos frecuente. En cambio, cuando se desencadena en el mosto durante la maceracin (vinificacin del tinto), a menudo tiene consecuencias dramticas. Adems de la aparicin de olores desagradables, Brettanomyces puede formar cantidades importantes de acidez voltil (cidos grasos voltiles, y en especial cido actico). Hay que adelantar el trasiego, pero la contaminacin rara vez se limita a una sola cuba, debido a las contaminaciones cruzadas provocadas por el material de bodega. Para prevenir este tipo de accidente son imprescindibles una higiene intachable y una sulfitacin adecuada de la vendimia. En algunas situaciones, hemos observado que ciertas parcelas presentaban incidentes de contaminacin precoz del mosto con mayor frecuencia que otras. Se ha demostrado (CHATONNET et al., 1999) que las vias situadas a sotavento de destileras, de desages de bodega o de montones de orujos en ciertos casos pueden presentar contaminacin en la uva. En efecto, en ocasiones los montones de orujos almacenados al aire libre contienen grandes cantidades de grmenes que el viento y los insectos que habitan ese medio (en especial las drosfilas) pueden transportar fcilmente hasta las parcelas de via. Normalmente, una sulfitacin adecuada de la vendimia (al menos 5 g/hl) permite prevenir cualquier accidente durante la fermentacin. En caso de cosecha mecnica, se recomienda desinfectar las parcelas de riesgo despus de la vendimia.
B- Deteccin precoz de la contaminacin de los caldos

Las tcnicas de microbiologa clsica utilizan el cultivo sobre medios que permiten el recuento especfico de los grmenes del gnero Brettanomyces/Dekkera gracias a la presencia de inhibidores especficos. El principal inconveniente del recuento por cultivo es el tiempo que lleva: hay que cultivar entre 5 y 8 das para obtener un recuento fiable. Con objeto de acelerar la respuesta, se puede combinar la tcnica de cultivo con una hibridacin directa de las colonias mediante una sonda especfica de
Figura 3 - Deteccin precoz del desarrollo de Brettanomyces en vinos en barricas por la mtodo Suivi BRETT de EXCELL (en lnea de puntos = umbral de percepcin de etilfenoles # 430 g/l, en lnea continua __ = umbral de percepcin del etil4-fenol # 600 g/l)
Brettanomyces sp. acoplada a una peroxidasa (STENDER H., et al., 1999). Tras el filtrado del cultivo sobre una membrana durante al menos 40 h, tras la hibridacin con la sonda las microcolonias de Brettanomyces se detectan gracias a una reaccin quimiluminescente. MILLIPORE fabrica un kit comercial (Brettanomyces Assay) basado en este principio, que tericamente permite un recuento especfico en 48 h. La sensibilidad es de menos de 10 colonias/ml. Sus mediocres resultados parecen ser el motivo de la retirada temporal de este kit. Los ensayos de deteccin immunoqumicos (ELISA) siguen siendo pesados y poco sensibles. La reaccin de polimerizacin en cadena (PCR) permite amplificar especficamente determinados fragmentos de ADN. Tras la desnaturalizacin del ADN y la hibridacin con ciertos oligonucletidos para delimitar fragmentos especficos de ADN, se lleva a cabo la amplificacin mediante una enzima termosensible (Taq DNA Polimerasa) que permite realizar un gran nmero de ciclos de amplificacin con objeto de obtener una seal detectable en forma de una banda
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de electroforesis. Este mtodo permite un diagnstico de presencia / ausencia, pero no una cuantificacin de las poblaciones viables realmente presentes, ni siquiera la perfecta discriminacin entre grmenes vivos y muertos. Durante la crianza, en ltima instancia al vinificador no le interesa demasiado el recuento de las poblaciones de grmenes. Aparte del momento del embotellado, no se intenta ni se puede perseguir el "cero Brettanomyces"; el mantenimiento de las poblaciones a un nivel tolerable es perfectamente suficiente. Ahora bien, esta poblacin tolerable vara de un caldo a otro, y de una bodega a otra. Por ello, el seguimiento peridico de la evolucin del contenido de etilfenoles durante la crianza, y concretamente durante el periodo estival crtico (periodicidad de mensual a bimensual), permite dar una respuesta mucho ms adecuada a las necesidades del enlogo y del vinificador de terreno. El incremento del contenido de fenoles entre dos controles sucesivos es un indicio indudable de una multiplicacin anmala de Brettanomyces/Dekkera. Pero sobre todo, se puede comparar directamente el contenido de etilfenoles observado y su tasa de incremento con el umbral de alteracin mximo, con objeto de determinar la estrategia de accin ms adecuada para la situacin (sulfitacin de correccin sin trasiego, trasiego, trasiego y desinfeccin de recipientes, aislamiento de lotes). Se puede tomar una decisin eficaz en 48h. La Figura 3 presenta un ejemplo concreto de seguimiento de bodega en 1999. En el lote A, en todo el periodo estival propicio al desarrollo de grmenes de contaminacin, nunca hemos detectado contaminacin. El lote B de la misma bodega (Pomerol), pero guardado en barricas distintas (nuevas), ha presentado un ligero incremento del contenido de fenoles en el mes de agosto. Dado que la medicin del SO2 ha indicado un contenido un poco bajo (15 mg/l) y el trasiego no estaba programado hasta dos meses ms tarde, el reajuste del SO2 en la barrica a un nivel suficiente (25 mg/l) ha permitido detener la formacin de fenoles. En el lote C, procedente de otra bodega (Chteauneuf-duPape), se ha detectado un fuerte incremento durante el mismo periodo; tambin en este caso, el SO2 libre era demasiado escaso (12 mg/l) pero habida cuenta de la tasa de incremento de etilfenoles (rebasndose el umbral de percepcin de los etilfenoles), se ha preferido adelantar ms de un mes el trasiego del lote y desinfectar el tonel (lavado con agua caliente y azufrado a 5 g) antes de volver a embarrilar el vino sulfitado a 30 mg/l. El lote D corresponde al mismo caldo que el lote C pero sin ninguna intervencin: el contenido de etilfenoles ha aumentado rpidamente, superando considerablemente el umbral de alteracin (1780 g/l, indicio de carcter "fenolado" = 4 (concentracin / umbral de percepcin)); el vino presentaba un carcter "fenolado" caracterstico que alteraba gravemente su tipicidad aromtica. Se puede utilizar esta misma
tcnica para detectar las oxidaciones anmalas o el desarrollo de grmenes bacterianos aerobios. El desarrollo de tcnicas modernas de deteccin adecuadas para el seguimiento de la crianza de los vinos y la elabora-
Figura 4 - Evolucin de la temperatura de una barrica de 225 l a distintos niveles durante su lavado (cabezal EKINSA, 25 l/min, temperatura de salida del agua 85C, Generador de agua caliente KARCHER) La lnea de puntos indica el tiempo necesario para alcanzar 55C a 6 mm en el centro de las duelas
cin de mtodos de desinfeccin de los recipientes de madera eficaces y que respeten el material permitirn en un futuro prximo controlar perfectamente el desarrollo de estos grmenes de contaminacin con objeto de reducir sus efectos indeseables y de preservar la pureza y la tipicidad de nuestros vinos.
C- Medios de lucha contra Brettanomyces

1-Higiene de la bodega y los toneles La utilizacin de la madera facilita la contaminacin de los vinos, pues este material puede albergar y proteger fcilmente los grmenes. En caso de crianza prolongada en barricas (12 meses o ms), el mantenimiento de los toneles y la higiene de la bodega son las nicas herramientas profilcticas de que dispone el bodeguero. Ya hemos demostrado que, a dosis de sulfitacin equivalente, las condiciones de utilizacin del dixido de azufre tienen una influencia considerable en la proteccin del vino. As pues, el azufrado de las barricas, al permitir la desinfeccin simultnea de la madera y del vino, es la tcnica preferente cuando no se dispone de un medio eficaz para la limpieza de las barricas. La mera sulfitacin del vino no acta sobre la madera. Los lavabarricas clsicos no permiten una limpieza suficiente de las barricas. El lavado in situ, a menos que se utilice hidrolimpiadoras de alta presin con sistemas eficaces de elimi-
e incluso peligrosa. La limpieza de grandes contenedores por estabulacin de agua caliente durante varias horas y con agitacin a fin de reducir las diferencias de temperatura entre la par te superior y el fondo del recipiente resulta sencilla y ms eficaz (Figura 5). Para reducir significativamente las poblaciones microbianas, es deseable una temperatura mnima de 65 C en el corazn de la madera. El tratamiento de grandes contenedores por aspersin a baja o a alta presin permite limpiar adecuadamente las paredes de las cubas, pero no calentar la masa de la madera a una temperatura suficientemente elevada. Incluso despus del vaciado, la temperatura de las capas profundas sigue aumentando, pues el calor de las capas super ficiales se sigue difundiendo en la masa durante ms de una hora (Figura 5). El agua caliente se puede reciclar para tratar entre dos y tres cubas seguidas, siempre que stas hayan sido per fectamente limpiadas previamente.
Figura 5 - Desinfeccin de una cuba de 35 hl por estabulacin de agua caliente (temperatura de entrada 85 C, altura: 2,20 m). La flecha indica el comienzo del vaciado del contenedor
Si se compran barricas de ocasin, es imprescindible comprobar que no estn contaminadas por contaminantes qumicos ni microbiolgicos (bacterias acticas y
nacin del agua de lavado para evitar el impacto al fondo de la barrica y para reducir el agua residual, no asegura una limpieza suficientemente enrgica (Figura 2, Pag.89). Para reacondicionar las barricas para cambiar de caldo o de aada, es imprescindible utilizar agua caliente (85-95C), a ser posible a alta presin. Si se desea limpiar realmente la madera, siempre hay que preferir la utilizacin de alta presin (120-180 bar) a la baja presin. La alta presin permite acelerar la limpieza, pero por lo general, el tiempo de tratamiento que se suele dedicar a una barrica resulta insuficiente para desinfectar perfectamente todo el espesor (5 a 10 mm de profundidad) de las barricas usadas. No hay que temer ningn deterioro de la fibra de la madera por debajo de 200 bar de presin. Siempre que se utilice agua a temperaturas prximas a 80C, calentada mediante un generador adecuado, el aumento de la presin y la utilizacin de cabezales con rotacin tridimensional rpida equipados con tubos adecuados (chorro de pincel, chorro de pincel giratorio) permiten acortar el tiempo de tratamiento (que difcilmente podr ser inferior a 5 minutos/ barrica) y conseguir un importante ahorro de agua (45 a 75 l/ barrica) con un resultado satisfactorio (Figura 4). La desinfeccin profunda de las barricas contaminadas exige un lavado prolongado con agua caliente, o, mejor an, una pasada de vapor. Incluso al vapor, necesariamente aplicado a madera limpiada previamente, el tratamiento debe durar lo suficiente para eliminar totalidad de los grmenes, pues la madera los protege mucho contra la subida de temperatura. Sin embargo, la manipulacin del vapor en grandes cantidades resulta difcil
Figura 6 - Relacin entre el contenido de dixido de azufre y la formacin de etilfenoles en distintas barricas de un mismo vino en una misma bodega (segn CHATONNET et al, 1992)
Brettanomyces). La introduccin de barricas mal conocidas en un parque sano es una fuente clsica de contaminacin de bodegas cuyas condiciones de crianza y de trabajo de los vinos son por lo dems satisfactorias. El aclarado de barricas con agua cargada de ozono (O3), un gas dotado de importantes propiedades desinfectantes debido a su fuerte poder oxidante, se presenta actualmente como una tcnica revolucionaria. Si bien es cierto que esta solucin resulta eficaz en materiales lisos e impermeables (acero y resinas epoxias, por ejemplo), hasta ahora no se ha aportado ninguna prueba seria de su eficacia sobre las
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barricas de madera, material poroso por excelencia y que alberga grmenes a una profundidad de hasta varios milmetros! Por una parte, la reaccin muy rpida del ozono con los componentes de la madera y del vino en la superficie de las barricas puede impedir gravemente su difusin y su accin en profundidad. Por otra parte, la oxidacin subsiguiente puede favorecer la aparicin de ciertas sustancias voltiles (aunque no necesariamente nauseabundas) que pueden influir en el aroma de los vinos y de la madera de forma similar a lo observado en el caso del tratamiento del agua potable (produccin de aldehdos voltiles por oxidacin de materias orgnicas). El uso reiterado, as como con detergentes qumicos, tambin puede reducir ms rpidamente los aportes de la madera al vino. La utilizacin de productos de limpieza en las barricas se debe limitar a las barricas muy incrustadas o cuyo origen no se conozca bien. Los productos utilizados tienen que ser especficos para esta aplicacin, y no se deben utilizar en cada trasiego, sino slo para la recuperacin peridica (como mucho anual) del parque de barricas usadas. Hay
Figura 8 - Influencia de las condiciones de crianza en el contenido de etilfenoles de un vino (segn CHATONNET et al., 1990).
2-Utilizacin de dixido de azufre En la actualidad, el dixido de azufre es el nico antisptico activo sobre Brettanomyces sp. y autorizado en enologa. Por debajo de cierta cantidad de SO2 libre, ya no se inhibe el desarrollo de Brettanomyces y puede aumentar el contenido de etilfenol (Figura 6).
Figura 7 - Evolucin del SO2 molecular activo (A) y de la forma salificada (S) en funcin del pH del vino (log S/A = pH - pK con pK1 = 1,81 y pK2 = 6,91)
que descartar el uso de cualquier producto que contenga sales de cloro que puedan entrar en contacto directo con la madera, debido a la formacin sistemtica de 2,4,6-triclorofenol y al riesgo de degradacin de este ltimo en 2,4,6-tricloroanisol (TCA) especialmente maloliente (olor a "moho"). Las formulaciones bsicas que contienen fungicidas de amonio cuaternario son eficaces sobre Brettanomyces, aunque siempre resultan difciles de eliminar perfectamente en el aclarado. La utilizacin de detergentes qumicos exige siempre controlar la ausencia de residuos (control del pH del agua de aclarado y de la ausencia de residuos tensoactivos).
En realidad, lo que conviene considerar es el SO2 molecular activo, y no el SO2 libre dosificable propiamente dicho. La cantidad de SO2 molecular activo depende en buena parte en primer lugar del pH del vino (Figura 7) y en segundo lugar de la temperatura; tambin el contenido de etanol, aunque en menor medida. El aumento del contenido de etanol y de la temperatura de crianza del vino incrementa el pK1 del SO2 lo cual favorece un aumento del SO2 molecular activo y por lo tanto una mayor proteccin. Brettanomyces sp. se inhibe con valores de SO2 molecular activo superiores a 0,30 mg/l aproximadamente, y se destruye rpidamente por encima de 0,50 mg/l. As se explica que los vinos blancos, cuyo pH a menudo est comprendido entre 3,3 y 3,6 que permite entre un 2% y un 3% de SO2 molecular, rara vez sean terreno de desarrollo de Brettanomyces sp y en cualquier caso nunca "fenolado". Por ese mismo motivo, muchos de los vinos tintos, con pH comprendidos entre 3,6 y 4,0 y hoy en da a menudo entre 3,7 y 3,9, que permite como mximo entre un 1,5 y un 0,64% de SO2 activo, a menudo son terreno de importante desarrollo de esas mismas levaduras, pese al mantenimiento permanente de niveles de SO2 libre superiores a 25 mg/l. Para obtener la misma eficacia antisptica, un vino correctamente protegido por 25 mg/l de SO2 libre a pH 3,65 debe-
SO2 libre (mg/l)
Figura 9 - Evolucin del contenido de dixido de azufre libre de los vinos en barricas entre Junio y Septiembre - Influencia de la edad de barricas
ra contener ms de 35 mg/l de SO2 libre a partir de pH 3,80 y cerca de 60 mg/l con pH 4,0. El incremento regular del pH de los vinos durante estos ltimos aos sin duda es responsable en buena parte del sensible aumento de los vinos tintos "fenolados" La crianza en barricas no induce sistemticamente una contaminacin de los vinos ni la aparicin de un carcter "fenolado". No obstante, la conservacin en madera, la utilizacin de barricas usadas mal recuperadas, de salas de crianza inadecuadas (variaciones de temperaturas) y de trasiegos insuficientes (frecuencia, desinfeccin de las barricas), constituyen una suma de circunstancias que favorecen la contaminacin y el desarrollo excesivo de Brettanomyces. La utilizacin de barricas usadas mal recuperadas facilita la contaminacin de los vinos y los contamina precozmente, al aportar directamente etilfenoles atrapados en la masa de la madera (figura 8); este material es sumamente poroso y
Figura 10 - Hidrlisis del pirocarbonato de etilo en el vino
alberga las levaduras a mayor o menor profundidad, lo cual dificulta su eliminacin. Pero el uso de barricas nuevas tambin propicia el desarrollo de esos mismos grmenes. Circulan muchas hiptesis extravagantes para explicar la mayor frecuencia de contaminacin de barricas las nuevas en ciertas salas de crianza: segn se dice, las barricas nuevas se contaminan por Brettanomyces en la tonelera; o la madera aporta azcar asimilables en cantidades importantes... Pero nada de eso es cierto. La explicacin es mucho ms sencilla. En una situacin de contaminacin, nicamente el contenido de dixido de azufre libre y activo permite controlar las poblaciones de Brettanomyces. Debido su potencial oxidativo muy superior (mayor contenido de taninos elgicos), sobre todo durante el periodo estival, cuando
sube la temperatura en la bodega, el contenido de dixido de azufre libre tiene tendencia a disminuir mucho ms deprisa en las barricas nuevas que en las barricas usadas (Figura 9). Por debajo de cierto umbral, prximo a 20 mg/l con un pH normal (3,6-3,7), ya no se inhibe Brettanomyces y aparece una alteracin proporcional a la poblacin microbiana. Las condiciones de utilizacin del dixido de azufre pueden influir considerablemente en la eficacia de la proteccin (CHATONNET et al. 1993). Para los vinos en barrica, si no se utiliza regularmente el agua caliente o el vapor, la sulfitacin por sulfatado siempre es ms eficaz que el aporte directo al vino. La forma gaseosa del dixido de azufre en la barrica vaca permite una desinfeccin ms eficaz de la superficie interna de las barricas. La utilizacin de pastillas de azufre, siempre que se conserven perfectamente secas, es preferible a la de mechas, pues permite una dosificacin ms precisa. La utilizacin del SO2 licuado con un dispositivo dosificador adecuado es muy eficaz y de rpida aplicacin. Las pastillas efervescentes de metabisulfito de sodio son muy fciles de utilizar y permiten corregir sencillamente el contenido de dixido de azufre. No obstante, a veces la
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COMPARACIN ENTRE DOS TCNICAS DE TOSTADO DE BARRICAS DE ROBLE FRANCS PARA CHARDONNAY
La intensidad y la tcnica de tostado influyen de manera decisiva sobre las caractersticas organolpticas que la barrica va a conferir al vino. La tcnica sin circulacin de aire aporta una mejor concentracin de compuestos aromticos que la tcnica con circulacin de aire. Organolpticamente, el vino queda significativamente ms marcado por los aromas procedentes de la madera en el caso de la tcnica de tostado sin circulacin de aire, y en particular si la intensidad de tostado es fuerte.
J. Garca-Berro Montilla Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Peneds (Barcelona), Espaa. N. Mourey Tonnellerie Radoux. Jonzac. France. M. Torres Maczassek Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Peneds (Barcelona), Espaa. R. Bobet Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Peneds (Barcelona), Espaa.
Con la colaboracin de J.L. Puech, J.C. Boulet y A. Razungles de INRA de Montpellier.
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COMPARACIN ENTRE DOS TCNICAS DE TOSTADO DE BARRICAS DE ROBLE FRANCS PARA
e todas las fases de fabricacin de la barrica, una de las que tiene una mayor incidencia sobre el carcter organolptico final que se otorga al vino es, sin lugar a dudas, el tostado. Tradicionalmente, esta fase se confiaba al personal ms experimentado de la tonelera, cuyo juicio y "pericia tcnica" impriman una huella muy personal al resultado final. Durante el proceso de tostado se producen aldehdos furnicos (Furfural, 5-hidroxi-metil-furfural, metil-furfural) debido a la degradacin trmica de los polisacridos de las paredes celulares. Chatonnet et al. (1996) indican una gran concentracin de estos compuestos con los tostados de una intensidad considerada como "media", y una disminucin con una intensidad "fuerte". La degradacin de la lignina da lugar a la produccin de diferentes fenoles voltiles como el eugenol y el guayacol con aromas de especias y de tostado. Las concentraciones de ismeros Cis y Trans de la metil--octalactona tambin se ven afectadas por el proceso de tostado, disminuyendo con los tostados ms intensos (Prez Prieto et al. 2001) y consiguiendo un nivel ptimo con las intensidades "medias". La mayora de los compuestos sufren tambin los efectos de una pirlisis a altas temperaturas: al analizar las concentraciones de cido glico, de vanillina y de siringaldehdo en funcin de la temperatura de tratamiento de la madera, Gimenez Martnez R. et al. (1996) determinan que las concentraciones mximas aparecen a una temperatura prxima a los 165C para el cido glico y de 185C-215C para la vanillina y el siringaldehdo; Hale M.D. et al. (1999) llegan a una conclusin similar, precisando que la concentracin ptima de vanillina y de siringaldehdo se obtiene con temperaturas entre 180C200C. Los principales parmetros que el tonelero puede controlar durante el proceso de tostado son la intensidad del fuego y la circulacin de aire en el interior de la barrica. Estos parmetros condicionan la velocidad de incremento de la temperatura de las duelas, los umbrales de temperatura a que se llega y la penetracin del calor en el interior de la madera. Matricardi L. et al. (1999) han estudiado la influencia de estos parmetros, y han llegado a la conclusin de que limitando la circulacin de aire se producen temperaturas superiores en la superficie de la madera; una de las consecuencias de ello, entre otras, es una mayor degradacin de los elagitaninos. Tambin han analizado la variacin en el nivel de ennegrecimiento del interior de la barrica en relacin con la concentracin de elagitaninos, y han llegado a la conclusin de que el color no es un buen indicador de la concentracin de elagitaninos de la barrica. En el trabajo presentado aqu intentaremos caracterizar
dos tcnicas de tostado diferentes, prestando una atencin especial al carcter organolptico final del vino.
1.- Materiales y mtodos

1.1.-Fabricacin de las barricas Las barricas han sido fabricadas por la Tonelera Radoux en roble francs "Tradition Radoux". Las dos tcnicas de tostado que evaluaremos son las conocidas como "Tipo Bordeaux" (BU) y "Tipo Bourgogne" (BO). Estas tcnicas se diferencian, en la prctica, por el control de la evacuacin del aire caliente en el momento del tostado. En efecto, en la tcnica "Tipo Bordeaux" se limita la evacuacin del aire caliente y la circulacin de aire fresco. Los objetivos son dobles: - por un lado, conseguir una temperatura elevada en la superficie de la madera (> 230C) que permita una generacin ms rpida de aromas de tostado - por otro lado, mantener una actividad moderada del fuego que permita un mantenimiento prolongado de la superficie de la madera a la temperatura de tostado y, en consecuencia, una buena penetracin del calor en el interior de las duelas. En la tcnica "Tipo Bourgogne" se permite una evacuacin continua del aire caliente y una circulacin de aire fresco manteniendo abierta la barrica durante el tostado. De esta manera, la temperatura obtenida en la superficie interior de la madera es menor (<230C) que en el "Tipo Bordeaux". La intensidad de tostado se controla mediante la duracin de la fase de tostado. Aqu comparamos dos intensidades: Tostado Medio (TM) y Tostado Fuerte (TF). Los fondos no se tuestan en ninguno de los dos casos. La codificacin de las muestras de ensayo es la siguiente: - CHNM Tostado medio tcnica Bordeaux - CHNF Tostado fuerte tcnica Bordeaux - CHNB Tostado medio tcnica Bourgogne - CHNC Tostado fuerte tcnica Bourgogne Para preparar las barricas antes de su uso, estas se llenan con agua fra a la que se han aadido 25 ppm de SO2, y se guardan 24 horas de esta manera antes de vaciarse y entonelarse. 1.2.- Vinificacin La vinificacin empez al final de la vendimia de 2000 en una partida de Chardonnay. Despus del prensado y desburbado, la fermentacin alcohlica tuvo lugar en una cuba de acero inoxidable hasta una densidad 1050. A continuacin pusimos el vino en barrica para terminar la fermentacin alcohlica hasta un azcar residual inferior a los 2 g/l. Una vez terminadas las fermentaciones alcohlica y malolctica, aadimos 5 g/Hl de SO2 y los vinos
se guardaron en las, sin trasiego, y con un bastoneado regular. La duracin total de la crianza en barrica fue de 8 meses antes de la clarificacin (0,5 g/Hl de cola de pescado y 30 g/Hl de bentonita) y embotellado de las muestras. Los anlisis qumicos y sensoriales que se presentan aqu se realizaron despus de una conservacin de 6,5 meses en botella. 1.3.- Anlisis qumicos Para los anlisis por CLAR (cromatografa lquida de alta resolucin) se ha utilizado un sistema compuesto por: - Bombas Waters 510 - Inyectores Waters 712WISP - Detector de fluorescencia Waters 474 - Detector Diodo-Array PDA 996
Inyeccin directa para Columna Teknokroma Tracer Excel 120 ODSA 5mx0,25x0,46. Para los anlisis por GC-FID hemos realizado una extraccin con fren, con el n-decanol como patrn interno. La cromatografa utilizada es un HP 5890 Serie II con una columna TR-WAX (60m x 0,25mm x 0,25 m) Tracer Ref TR-140262. Para los anlisis por GC-MS hemos realizado una extraccin con cartucho LiChrolut Merck EN 200 mg/3ml Ref 1.19870.000, con el n-octanol como patrn interno. La cromatografa utilizada es un detector Agilent 6890 MS Ref 5973 con una columna DB-WAX (30m x 0,32mm x 0,50 m) J&W Ref 123-7333 1.4.- Anlisis sensorial Para el anlisis sensorial, el formulario presentaba siete descriptores olfativos y cuatro descriptores gustativos, que deban valorarse sobre una escala continua de 0 a 5 para cada muestra. Los descriptores utilizados eran: - Carcter de madera en nariz - Especias - Vainilla - Mantequilla - Madera verde - Tostado - Ahumado - Carcter de madera en boca - Astringencia - Amargor - Persistencia Al final de la degustacin, cada miembro del jurado (once personas en total) tena que clasificar las muestras por orden de preferencia (1, 2, 3, 4). Para eliminar el desvo ligado a la amplitud de notacin propia de cada miem-
DESCRIPTOR
Carcter de madera en nariz Especias Vainilla Mantequilla Madera verde Tostado Ahumado Carcter de madera en boca Astringencia Amargor Persistencia
p 0,000013** 0,903966 0,069021* 0,085139* 0,550241 0,160454 0,090739* 0,016336** 0,423483 0,251211 0,000007*
Tcnica Bourdeaux Tostado medio Tostado fuerte 5-HMF Metil-furfural Trans-w-lactona Cis-w-lactona Eugenol Guayacol Siringol Siringaldehdo Vainillina Escopoletina Almendra tostada Herbceo Coco Especias, clavo Especias Ahumado Vainilla Vainilla 3,24 0,42 0,047 0,129 0,033 0,009 0,027 0,330 0,070 0,013 2,98 0,49 0,039 0,135 0,032 0,018 0,058 0,380 0,073 0,010
Tcnica Bourgogne Tostado medio 2,33 0,21 0,022 0,057 0,024 0,007 0,028 0,290 0,060 0,013 Tostado fuerte 2,36 0,39 0,025 0,063 0,029 0,012 0,051 0,345 0,061 0,009
Informe Tcnico 101
Figura 17
Figura 18
Figura 19
5,00 4,00
0,06 0,05 0,04
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06
3,00 2,00 1,00 0,00
0,03 0,02 0,01 0,00

CHNM CHNF CHNB CHNC
0,04 0,02 0,00
CHNM
CHNF
CHNB
Eugenol
CHNC
Siringol
CHNM
CHNF
CHNB
CHNC
5-HMF
Metil-Furfural x 10
Guayacol
t-w-Lactona
c-w-Lactona
Figura 20
Figura 21
Figura 22
0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
0,016
0,012
0,008
0,004
0,000
CHNM
CHNF
CHNB
CHNC
CHNM
CHNF
CHNB
Vainillina
CHNC
CHNM
CHNF
CHNB
CHNC
Siringaldehdo
Escopoletina
bro del jurado, las notas se han centrado y reducido por miembro y por descriptor antes de su procesamiento estadstico, tal como ha sido explicado por X. Toms et al. (2002). La obtencin de los resultados del anlisis sensorial y el procesamiento estadstico de los datos se ha realizado con la aplicacin FIZZ. Las grficas se han realizado con Microsoft Graph 2000.
2.- Resultados
2.1.- Anlisis sensorial Despus de la normalizacin de los datos y la aplicacin de un anlisis de varianza, aparecen diferencias significativas para los descriptores Carcter de madera en nariz, Carcter de madera en boca y Persistencia para un umbral de confianza del 95% (marcados **) y para los descriptores Vainilla, Mantequilla y Ahumado para un umbral de confianza del 90% (marcados *). La p representa la probabilidad del ensayo F. Las figuras 1 a 6 nos muestran estas diferencias con la media y el intervalo de confianza (95%) para cada uno de los descriptores. Si comparamos las tcnicas de tostado a una intensidad
de tostado equivalente con el ensayo de Student, constatamos que para la intensidad Media aparecen diferencias significativas para el descriptor Carcter de madera en nariz en el umbral del 95% y para el descriptor Carcter de madera en boca en el umbral del 90%, y que los dos son ms evidentes con la tcnica "Bordeaux". Las figuras 7 y 8 nos muestran estas diferencias. Para la intensidad de tostado "Fuerte", aparecen diferencias significativas en el umbral del 95% entre las dos tcnicas para los descriptores Carcter de madera en nariz, Vainilla, Mantequilla, Carcter de madera en boca y Persistencia; para el descriptor Tostado las diferencias son significativas en el lmite del umbral del 90%. Todos los descriptores significativos son ms marcados con la tcnica de tostado "Bordeaux". Las figuras 9 a 14 nos muestran estas diferencias. Si analizamos las preferencias de los catadores, podemos ver muy bien que se prefieren los tostados "Tipo Bordeaux" (CH1NM y CH1NF) a los tostados "Tipo Bourgogne" (CH1NB y CH1NC), y que la modalidad menos apreciada es la Fuerte "Tipo Bourgogne" (ver las figuras 15 y 16). 2.2.- Anlisis qumico Los resultados analticos ms significativos son los siguientes: La tcnica de tostado "Tipo Bordeaux" presenta las concen-
GRFICAS
Figura 1. Carcter de madera en nariz.

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 2. Vainilla
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Figura 3. Mantequilla.
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 4. Ahumado.
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Figura 5. Carcter de madera en boca.

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Informe Tcnico 103
Figura 6. Persistencia.
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 7. Carcter de madera en nariz. Tostado medio.

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 8. Carcter de madera en nariz. Tostado medio.

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 9. Carcter de madera en nariz. Tostado fuerte
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 10. Vainilla Tostado fuerte

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 11. Mantequilla. Tostado fuerte

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 12. Tostado. Tostado fuerte
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 13. Carcter de madera en boca. Tostado fuerte

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
Figura 14. Persistencia. Tostado fuerte
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Tipo Bourgogne
Tipo Bourdeaux
Figura 15. Preferencias

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
CH1NB
CH1NC
CH1NM
CH1NF
Informe Tcnico 105
Figura 16. Preferencias

10 8 6 4 2 10 8 6 4 2 0
N de observaciones
2 CH1NB
2 CH1NC
10 8 6 4 2 0
10 8 6 4 2 0
2 CH1NM
2 CH1NF
Bibliografa
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Pretratamiento de datos en anlisis sensorial

Introduccin
a colaboracin entre Tonnellerie Radoux y Bodegas Torres nos ha conducido a llevar a cabo un estudio sobre los diferentes tipos de tostado (tipo Burdeos y tipo Borgoa), las diferentes intensidades de tostado (tostado mediano y tostado fuerte) y los diferentes orgenes de la madera de las barricas. Los tostados tipo " Burdeos " o " Borgoa " se diferencian en la prctica en el control de la evacuacin del aire caliente y en el control de la circulacin del aire fresco, rico en oxgeno. El tostado tipo " Burdeos " limita la evacuacin del aire caliente y la circulacin del aire fresco. Los objetivos son dobles:
-Por un lado alcanzar un nivel de temperatura elevado en la superficie de la madera (> 230C), lo que permite una generacin ms rpida de los aromas de tostado. -Por otro lado mantener una actividad moderada del fuego (ambiente de combustin progresivamente empobrecido en O2) que permite un mantenimiento prolongado de la superficie de la madera a esta temperatura, una mayor degradacin de los taninos elgicos y la generacin en la madera de aromas en profundidad (Matricardi (1)). La consecuencia principal es una cantidad de aromas de tostado extrables ms importante. El tostado tipo " Borgoa " permite una evacuacin continua del aire caliente y una circulacin ligeramente ms importante de aire fresco. La temperatura alcanzada en la superficie de la madera es menor (<230C); la actividad moderada del fuego permite un mantenimiento prolongado a esta temperatura. La cantidad de aromas generados es ms dbil y la gama de aromas ligeramente diferente. Los tostados mediano y fuerte se diferencian al final del proceso por un calentamiento (bousinage) ms o menos prolongado a niveles de temperatura diferentes (situndose el tostado mediano a niveles de temperatura ms moderados). Para el estudio de los diferentes orgenes de las maderas,
Informe Tcnico 107
PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL
comparamos una seleccin de robles de la Europa del Este de grano fino (" Tradition Centre Europe ") con una seleccin de robles del Centro de Francia igualmente de grano fino (" Tradition Centre France ") efectuadas segn las especificaciones de requisitos de la Tonnellerie Radoux. En principio, es conveniente suponer que las puntuaciones de cada juez en la valoracin sensorial de las diferentes muestras sern homogneas, de manera que cualquier diferencia en la puntuacin no se deber ms que al tipo, a la intensidad del tostado o al origen del roble. Tambin es conveniente suponer que los jueces que tengan un sentido crtico utilizarn un nivel de puntuacin ms desfavorable que los jueces que tengan un sentido crtico menos estricto. Este hecho puede introducir en los resultados de cualquier degustacin una desviacin debida al criterio previo y subjetivo propio de cada juez. La posible existencia de esta heterogeneidad obliga, cuando se analizan los resultados de una degustacin, a considerar a los jueces como un posible factor de influencia sobre los resultados, pudiendo llegar a desnaturalizar las conclusiones sobre la posible existencia de diferencias significativas entre las muestras. Aparte de esta heterogeneidad, se debe considerar igualmente la que puede provenir de las diferentes sensibilidades (precisiones) con las cuales los distintos jueces puntan (evalan) las muestras. Otra hiptesis ideal de trabajo, muy utilizada en los numerosos tests estadsticos, como por ejemplo el anlisis de la varianza, es que esta variabilidad en la puntuacin de cada juez sea tambin estadsticamente homognea para todos ellos (Bowker (2)). Todo lo que ha sido expuesto hasta el presente puede ser comprendido ms fcilmente si se considera a cada juez como a un complejo instrumento de medida dotado de su exactitud y precisin propias. Con el fin de evitar estas dificultades, la Quimiometra ofrece la posibilidad de realizar, sobre los resultados de
un anlisis sensorial, tratamientos previos a su anlisis estadstico, eliminando de esta forma estas posibles heterogeneidades y facilitando su estudio posterior (Meloun (3)). En este trabajo en curso exponemos dos tratamientos preventivos de los datos, el centrado y la normalizacin de stos (en ingls " autoscaling "), aplicados a pruebas de puntuacin sensorial realizadas sobre muestras del mismo vino, otorgadas por diez jueces expertos
Tcnicas experimentales y material utilizado Las pruebas han sido llevadas a cabo con el vino de variedad Merlot, habiendo realizado su fermentacin malolctica en barrica y que en el momento de la degustacin de control haba permanecido 2 meses en madera. El vino va a mantenerse todava 10 meses en contacto con la barrica y va a estar sometido a otras degustaciones de control. Ha sido creado un panel de cata compuesto por personal de dos organizaciones y del INRA y que, adems de la caracterizacin de cada muestra (ADQ), ha procedido a dar una puntuacin global (escala predefinida 0-10). Resultados La codificacin de las diferentes muestras es la siguiente : VINO VINO VINO VINO VINO VINO VINO VINO 1 2 3 4 5 6 7 8 Madera francesa Tostado mediano tipo Borgoa Madera francesa Tostado fuerte tipo Borgoa Madera francesa Tostado fuerte tipo Burdeos Madera francesa Tostado mediano tipo Burdeos Madera del Este Tostado fuerte tipo Burdeos Madera del Este Tostado mediano tipo Burdeos Madera francesa Tostado fuerte tipo Burdeos Madera francesa Tostado mediano tipo Burdeos
El cuadro 1 resume los resultados experimentales obteniCuadro 1.- Datos brutos tras la degustacin de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces:
N Juez
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
VINO 1
7,8 7,6 8 8,2 7,4 7,6 6 4 5 5
VINO 2
7,5 7,5 7,2 7 7,2 7,2 5 5 3,5 2
VINO 3
7,6 7,5 7,7 8,1 7,6 7,7 6 7 4,5 3
VINO 4
7,7 7,6 7,3 8,3 7 7,9 4 5 3 3
VINO 5
7,8 7,8 8,2 8,7 8 7,5 7 5 5 6
VINO 6
7,6 7,7 8 8 7,1 8 5 7 4,5 6
VINO 7
7,7 7,9 8,2 7,9 7,2 7,6 5 6 4 3
VINO 8
7,5 7,7 7,8 7,5 7 7 4 6 4 3
Comentarios
1. El centrado de los datos
Puede ser til transformar las muestras brutas en muestras centradas para minimizar los efectos de escaln producidos entre los degustadores que puntan con severidad y los que lo hacen de una forma ms generosa (Samson (4)). Si se admite que su percepcin para diferenciar los vinos ser la misma, pero utilizando de manera diferente la escala de puntuacin, el centrado de los datos puede minimizar esta diferencia y su tratamiento estadstico tendr ms posibilidad de determinar las diferencias entre los vinos. El proceso consiste en calcular la puntuacin media global ( x ) y las puntuaciones medias de cada uno de los i jueces ( xi ). Se obtendr la nota centrada segn la transformacin : cij=xij + ( x - xi ) donde xij es la j-sima nota del i-simo juez y donde ( x - xi ) es el punto de vista del juez i. De este modo, sobre los datos brutos obtenidos en los
Cuadro 2.- Notas medias, desviacin tpica y desvo de cada juez.
N de Juez 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GLOBAL
Nota Media 7.65 7.66 7.80 7.96 7.31 7.56 5.25 5.63 4.19 3.88 6.49
Desviacin tpica 0.1195 0.1408 0.3817 0.5181 0.3441 0.3335 1.0351 1.0607 0.7039 1.5527 1.6813
Desvo 1.16 1.17 1.31 1.47 0.82 1.07 1.24 0.86 2.30 2.61
Lo cual nos conduce a los datos centrados (Cuadro 3).
Cuadro 3.- Datos centrados tras la degustacin de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.
N Juez
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
VINO 1
6,64 6,43 6,69 6,73 6,58 6,53 7,24 4,86 7,30 7,61
VINO 2
6,34 6,33 5,89 5,53 6,38 6,13 6,24 5,86 5,80 4,61
VINO 3
6,44 6,33 6,39 6,63 6,78 6,63 7,24 7,86 6,80 5,61
VINO 4
6,54 6,43 5,99 6,83 6,18 6,83 5,24 5,86 5,30 5,61
VINO 5
6,64 6,63 6,89 7,23 7,18 6,43 8,24 5,86 7,30 8,61
VINO 6
6,44 6,53 6,69 6,53 6,28 6,93 6,24 7,86 6,80 8,61
VINO 7
6,54 6,73 6,89 6,43 6,38 6,53 6,24 6,86 6,30 5,61
VINO 8
6,34 6,53 6,49 6,03 6,18 5,93 5,24 6,86 6,30 5,61
Informe Tcnico 109
Las figuras 1 y 2 nos muestran, con la ayuda de diagramas de cajas, el efecto de estos procedimientos. Hay que resaltar la homogeneizacin de la escala de puntuacin, siempre conservando la variabilidad propia de cada juez. Figura 1.- Datos brutos, diagramas de cajas para cada juez.
10 8
Nota bruta
6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
JUEZ
Figura 2.- Datos centrados, diagramas de cajas para cada juez.
10
Nota centrada
8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
JUEZ
Se puede apreciar la homogeneizacin de las notas centradas sobre la media global 6,49 y la conservacin de la variabilidad de cada juez. Si se comprueba la homocedasticidad de los jueces, el test de Bartlett conduce a desestimar la hiptesis de la homogeneidad de las varianzas (Discriminante = 2.6899 ; p < 9,997 10 -11). Esto puede ser un problema para la aplicacin posterior de otras pruebas estadsticas destinadas a la deteccin de las diferencias entre las muestras, como en el caso del anlisis de varianza, debido a la no ejecucin de las hiptesis de trabajo. las variables de diferentes magnitudes y/o variabilidad diferente, es la normalizacin. Esto consiste en evaluar para cada juez la puntuacin media ( xi ) y su desviacin tpica (si), transformando a continuacin cada nota siguiendo la formula : zij = (xij - xi ) / si Este tratamiento previo pretende otorgar a cada juez la misma importancia, independientemente de su percepcin para diferenciar las muestras y de su poder de discriminacin, dado que las nuevas puntuaciones transformadas corresponden, desde el punto de vista estadstico, a variables centradas y reducidas. De este modo, a partir de los datos brutos obtenidos en los casos del vino Merlot, se obtienen los datos transformados indicados en el cuadro 4.
2. Normalizacin
Un tratamiento alternativo anterior de los datos, muy frecuentemente utilizado en Quimiometra si se trabaja con
Cuadro 4.- Normalizacin. Notas transformadas (Z) tras la degustacin de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.
N Juez
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
VINO 1
1,255 -0,444 0,524 0,458 0,254 0,112 0,725 -1,532 1,154 0,725
VINO 2
-1,255 -1,154 -1,572 -1,858 -0,327 -1,087 -0,242 -0,589 -0,977 -1,208
VINO 3
-0,418 -1,154 -0,262 0,265 0,836 0,412 0,725 1,296 0,444 -0,564
VINO 4
0,418 -0,444 -1,310 0,651 -0,908 1,012 -1,208 -0,589 -1,687 -0,564
VINO 5
1,255 0,977 1,048 1,424 1,998 -0,187 1,691 -0,589 1,154 1,369
VINO 6
-0,418 0,266 0,524 0,072 -0,618 1,312 -0,242 1,296 0,444 1,369
VINO 7
0,418 1,687 1,048 -0,121 -0,327 0,112 -0,242 0,354 -0,266 -0,564
VINO 8
-1,255 0,266 0,000 -0,893 -0,908 -1,686 -1,208 0,354 -0,266 -0,564
La figura 3 nos muestra los diagramas de cajas del efecto de estos procedimientos. Es preciso destacar la homogenizacin de la escala de puntuacin y la variabilidad propia de cada juez. Figura 3.- Notas transformadas (Z), diagramas de cajas para cada juez.
2.5 1.5
Nota Z
0.5 -0.5 -1.5 -2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
JUEZ
Como era de esperar, se puede apreciar la homogenizacin de las puntuaciones tanto en lo que concierne al valor medio como en lo que concierne a la dispersin de cada juez. Si se realiza la prueba de Bartlett sobre estas puntuaciones Z se aprecia que no hay diferencias significativas entre las varianzas de las puntuaciones de cada juez. En consecuencia, estas puntuaciones han sido analizadas por medio de un ANOVA con dos factores (jueces, vinos) y se han obtenido los resultados siguientes : Anlisis de varianza: Nota Z para Vinos Merlot
Fuente de variabilidad Total JUECES VINOS Residual
Suma de los cuadrados 69.9998 1.8624 10 30.0961 39.0937

-10
Grados de libertad 79 9 7 63
Cuadrado medio
Factor F
Valor P
2.06934 10 1.29944 0.633393
-11
0.00 6.79
1.0000 0.0000
Informe Tcnico 111
Por consiguiente, se puede llegar a la conclusin de que no existen diferencias significativas entre las puntuaciones de los jueces, mientras que se detectan diferencias significativas entre las 8 muestras de vino Merlot, como lo demuestran las figuras 4 y 5. Figura 4.-Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada juez.
1 0,5 0 -0,5 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
JUEZ
Figura 5.- Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada muestra.
2 1 0 -1 -2 1 2 3 4 5 6 7 8
Vino Marlet
La muestra mejor calificada es la de roble del Este tostado fuerte tipo Burdeos (Vino 5). Despus viene un grupo formado por el roble del Este tostado mediano tipo Burdeos (Vino 6) y el roble francs tostado mediano tipo Borgoa (Vino 1), seguido de cerca por un grupo formado por el roble francs tostado fuerte tipo Burdeos (Vinos 3 y 7). Como grupo menos bien clasificado encontramos al de roble francs tostado mediano tipo Burdeos (Vinos 4 y 8) y al de roble francs tostado fuerte tipo Borgoa (Vino 2). para diferenciar los vinos ser la misma, pero utilizando diferentemente la escala de puntuacin, el centrado de los datos puede minimizar esta diferencia y su tratamiento estadstico tendr ms oportunidad de determinar la diferencia entre los vinos. Si adems de esta heterogeneidad se pretende minimizar la que puede derivarse de las diferentes sensibilidades (precisiones) con las cuales los distintos jueces puntan (evalan) las muestras, la normalizacin ofrece una posibilidad alternativa a la utilizacin de otros tests estadsticos para el anlisis de resultados, como por ejemplo el test de Kruskal - Wallis o bien el test de Wilcoxon. En este caso, el tratamiento de normalizacin permite (a pesar de la heterogeneidad de las puntuaciones) clasificar las muestras con diferencias significativas ( = 0.05). La muestra mejor calificada despus de dos meses es la de roble del Este tostado fuerte tipo Burdeos y un grupo formado por roble del Este tostado mediano tipo Burdeos y roble francs tostado mediano tipo Borgoa, seguido de cerca por un grupo formado por roble francs tostado
3. Conclusiones
Este estudio describe dos formas de realizar un pretratamiento de los datos provenientes del anlisis sensorial de diferentes muestras de un mismo vino. Por medio del centrado de los datos brutos, se minimizan los efectos de escaln producidos entre los degustadores que puntan con severidad y los que lo hacen de una forma ms generosa. Si se admite que su percepcin
fuerte tipo Burdeos. Los grupos con la peor nota son los de roble francs tostado mediano tipo Burdeos y roble francs tostado fuerte tipo Borgoa. Conviene hacer notar que los resultados son provisionales puesto que el vino permanece durante un ao en barricas, pero son coherentes a pesar de todo puesto que muestras diferentes del mismo lote son calificadas de la misma manera. Huelga decir que la normalizacin confiere la misma importancia a los jueces con un poder de discriminacin bajo que a los que poseen una mayor sensibilidad. Cada situacin concreta implicar el estimar la utilizacin de este pretratamiento de las calificaciones.
Agradecimientos
Hacemos presente nuestro ms vivo agradecimiento a J.L Puech, A.Razungles y J.C. Boulet del INRA(*) de Montpellier.
(1): Matricardi L y Waterhouse A.L. 1999. Influence of Toasting Technique on Color and Ellagitanins of Oak in Barrel Making. Am. J. Enol. Vitic, vol 50, n 4, 519-526. (2): Bowker A.H. y Lieberman G.J. 1965. Mthodes statistiques de l'ingnieur. Dunod. Paris (3): Meloun M., Militky J et Forina M. 1992. Chemometrics for Analytical Chemistry. Ellis Horwood. New York. (4): Samson A.et Saint-Pierre B. 2000. Les systmes de saisie et d'acquisition des donnes de l'analyse sensorielle. Revue Franaise d'Enologie.n 182, 25-30.
(*) Institute National de la Recherche Agronomique.
Resumen
En un estudio sobre la incidencia de los diferentes tipos de tostado (Burdeos y Borgoa), de las diferentes intensidades de tostado (tostado mediano y fuerte) y de los diferentes orgenes (roble francs y del Este) sobre un vino de Merlot, se han llevado a cabo diferentes pretratamientos estadsticos de los datos resultantes y del anlisis sensorial. El centrado de los datos ha sido comparado con la normalizacin. Palabras clave : Anlisis sensorial, Pretratamiento, Normalizacin, Centrado, Vino Merlot. Dos tcnicas de pretratamientos de datos, centrado y normalizacin son comparadas en el estudio del efecto del tostado (tipo Burdeos y Borgoa), la intensidad de tostado (mediano y fuerte) y el origen (roble francs o del Este) en la evaluacin sensorial de una muestra de vino Merlot. Palabras clave : Evaluacin sensorial, Pretratamiento de datos, Normalizacin, Centrado, Vino Merlot.
Informe Tcnico 113

Informe Técnico: Anisoles y Brettanomyces

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ANISOLES Y BRETTANOMYCES

Causas, efectos y mecanismos de control

PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL...............................107

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

Pascal CHATONNET Laboratoire EXCELL MERIGNAC Francia

ndole, origen y consecuencia de la presencia de anisoles en el mundo vincola

vinos considerados "mohosos" o "con sabor a corcho" en la cata.

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

MUESTRAS DE CALDOS ( NG L-1 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd trazas 2,9 nd nd 2,6 trazas trazas nd nd nd nd nd nd nd nd nd

nd nd 22,4 13,2 71,0 7,5 6,9 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 23,9 nd nd nd 27,0 nd nd nd nd 59,2 nd

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

Figura 4 - estructura molecular del 2,4,6-tribromoanisol (TBA)

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

ATMSFERA ( NG G-1 ABSORBENTE) 1 2 3 4 5

TCP TeCA TeCP PCA

PCP TBA TBP TeBP PBP

trazas 675 trazas 148

trazas 143 902 224 1158 6 nd nd nd 33 nd 835

trazas: > DL, < QL

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

TCP TeCA TeCP PCA

PCP TBA TBP TeBP PBP

nd nd trazas trand zas nd 2

trazas: > DL, < QL

TCP TeCA TeCP PCA

TBP TeBP PBP

trazas trazas 6 trazas trazas nd

22 143 224 1973 2185 1337

240 902 1158 2943 13127 57

234 82363 201 963 tra39 zas 4933

trazas: > DL, < QL

TCP TeCA TeCP PCA

PCP TBA TBP TeBP PBP

tra- trazas trazas zas

cera pues investigaciones ms amplias.

NDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINCOLA

Defecto grave NQA = 1,5

Defecto crtico NQA = 0,65

Clasificacin de la calidad del lote

Buena (1) Media (2)

Media (2) Mala (3)

Figura 1 - TCA total en diver-

Figura 3 - Relacin entre el TCA total de los tapo-

nes de corcho natural y el TCA dosificado en los vinos embotellados

Figura 4 - Estimacin de la variabili-

Figura 5 - Distribucin del TCA total en

los discos de corcho natural y en el cuerpo aglomerado de diversos tapones de Champagne

2- Utilizacin de la dosificacin de contaminantes considerados fcilmente extrables o "TCA liberable"

frecuencia de contaminacin medida en el lote para diversos tipos de tapones

3 [14, 17, 21ng/l]

Riesgo real de utilizacin % TCA liberable en la maceracin conjunta Terico (ng/l)

4 4 nd 4,8 trazas ** 13 5 1,7 8

Medido nd* (ng/l)

Riesgo evaluado (1) %

Figura 12 - Variabilidad y niveles de contaminacin de diver-

Figura 11 - Correlaciones existentes entre el contenido de

Origen y biosntesis de TCA en el corcho

ORIGEN Y BIOSNTESIS DE TCA EN EL CORCHO

1.3.- Microbiota del corcho.

ORIGEN Y BIOSNTESIS DE TCA EN EL CORCHO

Tabla 1.1.- Microorganismos detectados con mayor frecuencia en muestras de corcho.

POSIBLES MICROORGANISMOS PRODUCTORES

ORIGEN Y BIOSNTESIS DE TCA EN EL CORCHO