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introduccin

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3.1

Separaciones quirales y enantiomerismo


Introduccin

Las publicaciones del siglo XIX de Vant Hoff y Le Bed intentando explicar la asimetra molecular, deducida por Pasteur aos antes, marcaron el principio de la estereoqumica. Este campo de estudio se define como la parte de la qumica que estudia las estructuras moleculares en tres dimensiones. Uno de los aspectos de la estereoqumica es el estereoisomerismo; los ismeros (compuestos de igual frmula molecular) que difieren entre s slo en la forma en que los tomos estn orientados en el espacio son llamados estereoismeros. La quiralidad es un atributo geomtrico, consecuencia de esa orientacin de los tomos en una molcula. Una molcula presenta quiralidad cuando no puede superponerse a su imagen especular. Los estereoismeros de un compuesto quiral se denominan enantimeros y poseen la misma energa interna. Los estereoismeros que no son enantimeros son denominados diasteroismeros. Los diasteroismeros se pueden superponer con su imagen especular y no poseen la misma energa interna.

Tabla 3.1 Clasificacin de las diferentes clases de isomera


ISOMEROS

Ismeros constitucionales

Estereoismeros Enantimeros Diastereoismeros

Diferente conectividad

Igual conectividad

La diferenciacin entre un enantimero y un diasteroismero tiene implicaciones desde el punto de vista bioqumico, farmacutico y analtico cruciales. Los enantimeros poseen las misma propiedades fsicoqumicas y slo se comportan de forma diferente frente a un entorno quiral como por ejemplo: la luz polarizada, las enzimas del metabolismo, otro compuesto quiral etc. En este captulo comentaremos el fenmero del enantiomerismo y explicaremos las tcnicas de anlisis de moleculas quirales. Estos mtodos de anlisis se basan en el uso de tcnicas quirpticas (aquellas que hacen uso de luz polarizada) o mediante la reaccin reversible o irreversible de los analitos quirales con otro compuesto quiral.

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3.2

Enantiomerismo y quiralidad

Como ya se ha comentado, se define como molcula quiral aquella que no puede superponerse a su reflexin especular, o lo que es lo mismo, una molcula es quiral cuando carece de simetra de reflexin. Esta propiedad es debida, en general, al diferente arreglo espacial de los grupos alrededor de un centro asimtrico o tambin llamado centro estereognico. Este tipo de quiralidad es la ms habitual y se denomina quiralidad central.

Figura 3.1. Enantimeros de un compuesto con quiralidad central. Comparacin con la quiralidad de las palmas de la mano. Las dos posibles orientaciones espaciales alrededor del centro estereognico da lugar a los dos enantimeros que presentan un comportamiento diferente respecto a la luz polarizada plana; cuando un rayo de luz polarizada plana pasa a travs de un compuesto quiral, el plano de polarizacin gira, siendo el grado de rotacin el mismo para ambos enantimeros, pero en direcciones opuestas.

Figura 3.2. Cambio del plano de polarizacin de la luz cuando atraviesa una disolucin de un compuesto quiral. Hablamos entonces que los enantimeros poseen actividad ptica que se mide a travs del poder ptico rotatorio (). Una disolucin racmica (mezcla de enantimeros a la misma concentracin) no presenta actividad ptica porque los poderes pticos rotatorios se compensan. 28

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existen ms de dos estereoismeros. Para n carbonos estereognicos el nmero mximo de estereoismeros es 2n. Puesto que los enantimeros existen en pares, algunos de los estereoismeros no tienen una relacin de imagen especular con otros, y entonces son diastereoismeros. Por ejemplo, una molcula con dos carbonos asimtricos tendr como mximo cuatro estereoismeros, de los cuales habr dos parejas de enantimeros. Cada enantimero de un grupo tendr una relacin diastereoisomrica con los del otro par de enantimeros. Sin embargo, existen tambin otras posibilidades como se representa en la figura 3.4 y se ejemplifica con el cido tartrico.

HO H

COOH H OH COOH

H HO

COOH OH H COOH

HO HO

COOH H H COOH

H H

COOH OH OH COOH

Plano de simetra

Signo de rotacin

(+)

(-)

ninguno

ninguno

Figura 3.4. Signo de la rotacin y estereoismeros del cido tartrico. En este caso slo son posible tres estereoismeros. Existe una pareja de enantimeros con signo de rotacin opuesto pero la otra pareja no presenta una relacin de enantiomerismo porque se pueden superponer al disponer de un plano de simetra. Estas formas se conocen como meso y se definen como aquellas formas que aun conteniendo centros estereognicos se pueden superponer con su imagen especular y por tanto no presentan actividad ptica. 3.3 Nomenclatura

La propiedad fsica que distingue especficamente a dos enantimeros de un compuesto es la rotacin de la luz polarizada plana; por este motivo, los enantimeros han sido histricamente llamados ismeros pticos. Para molculas simtricas el efecto neto de la rotacin de la luz polarizada plana es cero, puesto que la rotacin efectuada por una molcula es compensada por una rotacin opuesta debida al encuentro de la luz con una molcula que es la imagen especular de la primera. Para un enantimero, no existe ese efecto de cancelacin (no hay ninguna molcula que sea imagen especular de otra), por lo que s se da una rotacin del plano de la luz. Por tanto, es comprensible que el primer intento de sistematizar la nomenclatura de los enantimeros se basara en el signo de rotacin de la luz polarizada. El enantimero que rota el plano de la luz polarizada plana en sentido horario fue llamado dextrorrotatorio y designado con los smbolos (+) o (d). El otro enantimero produce el efecto contrario (levorrotatorio) y se designa con los smbolos (-) o (l). 30

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No obstante, el signo de la rotacin ptica no informa de la ordenacin espacial de los substituyentes alrededor del centro asimtrico y por tanto no se puede deducir la estructura espacial del enantimero. Fisher propuso una nomenclatura para solucionar este problema. A partir de unas proyecciones en dos dimensiones y siguiendo unas reglas de ordenacin denominaba los dos enantimeros como D y L (no confundir con d y l) atendiendo a como quedaban ordenados los sustituyentes respecto a una sustancia que tomaba como referencia. Esta nomenclatura, es totalmente arbitraria (no tiene que ver nada con el signo de rotacin) por lo que era comn su uso conjunto con la anterior dando lugar a nomenclaturas del tipo D(-), L(-) etc. La dificultad en su aplicacin limita el uso de esta nomenclatura aunque se ha conservado hasta nuestros das para indicar la estereoisomera de glcidos y aminocidos. El sistema actual de ordenacin aceptado por la IUPAC, es aquel conocido como de Cahn-Ingold-Prelog o tambin llamado sistema R-S (figura 3.5). ste se basa en establecer un orden de prioridad de los sustituyentes mediante una serie de reglas, las ms importantes de las cuales son: 1. Se asigna a cada grupo unido al carbono asimtrico un orden de prioridad decreciente. Esta prioridad se establece en funcin del nmero atmico de los tomos directamente unidos al carbono asimtrico, siendo el tomo prioritario el de mayor nmero atmico. 2. Para dos tomos de igual nmero atmico la prioridad se establece por los siguientes tomos de los grupos hasta que se observa una diferencia. Por ejemplo, CH2Cl > CH2OH > CH2CH3. Los enlaces dobles cuentan como dos enlaces simples. 3. Para asignar la configuracin, el centro asimtrico debe observarse con el grupo de menor prioridad en la posicin ms alejada del observador. Si la secuencia de prioridad decreciente se da en sentido horario, la configuracin es R; en caso que la secuencia sea en sentido antihorario, la configuracin es S.

Figura 3.5. Sistema R,S para la nomenclatura de enantiomeros.

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3.4

Enantiomerismo y actividad biolgica

Los enantimeros de un compuesto presentan las misma propiedades fsico-qumicas en un entorno aquiral sin embargo los organismos vivos son inherentemente quirales. La naturaleza ha seleccionado los levoaminoacidos para formar las protenas mientras que todos los glcidos del DNA y RNA son dextrorotatorios. En consecuencia, las enzimas, receptores celurares y todas las especies bioqumicas que intervienen en el metabolismo presentan una estereoqumica definida y por tanto los enantimeros de una sustancia presentaran en el organismo humano un comportamiento distinto. Esto se debe a que las interacciones biolgicas son estereoespecficas y necesitan de una interaccin triple (3D point interaction) para producirse. La figura 3.6 representa este tipo de interacciones y como puede observarse slo uno de los enantimeros posee la configuracin espacial adecuada para enlazarse adecuadamente.
D D

B
Interaccin fuerte

B
Interaccin dbil

Figura 3.6. Esquema de la interaccin trpode de dos enantimeros con un receptor stereoespecfico. Por tanto, los enantimeros de un compuesto presentarn una reactividad distinta (velocidad de reaccin, interacciones con receptores diferentes, efectos secundarios, etc). El fenmeno del enantiomerismo es muy importante en la industria farmacutica. La pureza enantiomrica de los frmacos ha sido estudiada y legislada1 desde el desastre de la talidomida a principios de los aos setenta. Slo uno de los enantimeros de la talidomida posee efecto teraputico mientras que el otro presenta un efecto teratgeno indeseado. Esto no es una situacin aislada y son muchos los ejemplos que podemos encontrar donde existe un enantimero con la actividad biolgica buscada (eutmero) mientras que el otro enantimero no la posee (distmero). Sin embargo, podemos distinguir varias situaciones: El distmero es txico, por ejemplo el caso de la talidomida. El distmero es inactivo o menos activo. Se define entonces una relacin eutomrica que expresa cuanto ms activo es el eutmero. Esto ocurre por ejemplo en la epinefrina cuya relacin eutomrica es igual a 100 a favor del enantimero levorotatorio.

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Los dos enantimeros poseen una actividad biolgica distinta. El dextropropoxifeno es una analgsico mientras que el levopropoxifeno no tiene propiedades analgsicas pero si antitusivas. La combinacin de ambos enantimeros es beneficiosa. Bien, porque poseen efectos teraputicos complementarios o bien porque el distmero reduce los efectos secundarios del eutmero. Por ejemplo, los cuatro esteroismeros del labetalol poseen diferentes capacidad y bloqueadoras La combinacin de los cuatro proporciona un excelente ,-bloqueador. El diurtico indacrinona es un ejemplo del segundo caso. El enantimero R es el eutmero pero posee un efecto secundario indeseado de retencin del cido rico que puede evitarse si se administra el enantimero S que favorece su eliminacin.

En el primer caso la comercializacin del frmaco en forma racmica est totalmente prohibido y es imprescindible demostrar que bajo ninguna condicin de almacenamiento y uso se puede producir una inversin de configuracin. Esto ocurre, en la talidomida que aun administrada en forma enantiomricamente pura racemiza in vivo generando el enantimero indeseado. El segundo caso, el distmero es inactivo, parece un caso ms favorable y por tanto era habitual la comercializacin de estos frmacos hasta la ltima dcada en forma racmica. Sin embargo, estos productos han evolucionado en la ltima dcada haca su comercializacin en su forma enantiomricamente pura, en una evolucin conocida como racemic switch2 . Este cambio no es obligado pero son varios los motivos relacionados entre s que lo han promovido: La obtencin de nuevos procesos de sntesis quiral, o de purificacin de enantimeros a partir del racmico, ms econmicos y sencillos. La obligacin por parte de los organismo reguladores a realizar todos los estudios previos (farmacocintica, estabilidad, ensayos clnicos...) a la comercializacin del frmaco para los dos enantimeros aunque el frmaco vaya ser administrado en forma racmica. La necesidad de una dosis menor en el frmaco. Como consecuencia de la reduccin de la dosis, se reducen los efectos secundarios del frmaco. Los dos primeros motivos son puramente econmicos, lanzar al mercado un producto enantiomricamente puro permite reducir a la mitad los costes porque implica un menor nmero de estudios farmacolgicos y es tcnologicamente factible. El frmaco racmico necesita doblar la dosis para conseguir el mismo efecto que el frmaco enantiomricamente puro. Pero lo qu pasa con el ismero inactivo, es una problema que preocupa a la industria farmacutica. No es descartable su acumulacin innecesaria en el organismo humano provocando efectos secundarios a largo plazo. Las palabras de Simonyi3 son adecuadas en este contexto: Si una sustancia se acumula en el organismo y no es un 33

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frmaco, entonces es un veneno. Un ejemplo de lo explicado hasta ahora es la familia de los profenos que ha sido objeto de estudio en esta tesis doctoral. Estos compuestos son antinflamatorios no esteroidales (NSAIDs) aunque tambin presentan accin antipirtica y analgsica. Esta familia de compuestos tiene como estructura comn el grupo cido 2-arilpropinico y la diferencia en los sustituyentes de este grupo da lugar a una variedad de profenos, siendo el naproxeno, el ibuprofeno y el ketoprofeno los ms significativos comercialmente. Todos los profenos contienen un centro asimtrico, que es el tomo de carbono unido al grupo carboxlico. En todos lo casos el ismero S(+) es ms activo farmacolgicamente que el R(-), aunque este ltimo no es txico. Estos frmacos han pasado a comercializarse en los ltimos aos en forma enantiomricamente pura porque se ha comprobado que el isomero S(-) sufre un proceso de acumulacin indeseado en el tejido adiposo por reaccin con los triacilgliceroles endgenos4 . El caso de enantimeros con efecto teraputico diferente o con efectos teraputicos complementarios son casos ms favorable. Los enantimeros que poseen diferentes propiedades farmacolgicas se administran en forma enantiomricamente pura y hemos de pensar en ellos como dos principios activos distintos. Por el contrario, cuando sus efectos son complementarios se administran en forma conjunta y slo es deseable que la proporcin de ambos sea tal que maximice el efecto teraputico y minimice los efectos secundarios. Tabla 3.2. Distribucin de los frmacos segn su estereisomera.
Nmero de drogas totales (1850 en 1990) Naturales o Semisintticas 28 % Aquirales 0.3% Quirales 28% Rac 0.4 %

Sintnticas 72%

Aquirales 43% Ent 3%

Quirales 29%

Rac 26 %

Ent 28%

Racmicos (rac) 25% ; enantimero (ent) 31% ; aquirales= 44%

La incidencia del enantiomrismo en la industria farmacutica, tal y como se muestra en la tabla 3.2, es importante2. Como puede observarse, un 31% de los frmacos totales se comercializan en su forma enantiomericamente pura, y este porcentaje ha ido en aumento debido al proceso de racemic switch. Este ha sido el caso del ibuprofeno o del atenolol dos de los principios activos de mayores ventas2 (tabla 3.3).

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Tabla 3.3. Lista de los frmacos ms vendidos en 1990


Droga Ranitidina (aq) Amoxicilina (aq) Captopril (en) Enalapril (en) Ibuprofeno (rac) Nifedipina (aq) Cimetidina (aq) Atenolol (rac) Diclofenaco (aq) Dilitiazem (en) Naproxeno (en) Cefalexin (en) Actividad teraputica Antiulceroso Antibitico Antihipertensivo Antihipertensivo NSAID Antagonista del calcio Antiulceroso Beta-bloqueador NSAID Antagonista del calcio NSAID Antibitico

(aq)=aquirales, (en)=enantiomricamente puros, (rac)=racmico

No obstante, el enantiomerismo no es slo importante en la industria farmacutica sino que tiene implicaciones en otros campos como la cosmtica, los plaguicidas y pesticidas o la industria alimentaria (figura 3.7).
H2 NCO CH2 H2N CO2H Asparagina H NH2 (R) sabor dulce H HO2C CH2CO NH2

(S) sabor amargo H O O

H3C

CF3 N

BuOOC Fluazifop (R) herbicida, (S) inactivo O Carvona

(S) aroma de alcaravea

(R) aroma de menta

Figura 3.7. Ejemplos no farmacuticos de diferencias de comportamiento entre enantimeros. Adems el fenmeno del enantiomerismo est despertando un inters especial en los ltimos tiempos y se investiga su papel en el origen de la vida5 o su utilidad como trazadores biolgicos6 . El movimiento en la 35

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biosfera de pesticidas quirales y sus residuos puede ser trazado a travs de determinaciones de excesos enantimericos (ee) Los fenmenos de transporte habituales (volatilizacin, lixiviacin, deposicin atmosfrica) y las reacciones abiticas (fotolsis, hidrlisis) no alteran el ee. Sin embargo, el metabolismo de los pesticidas por parte de microorganismos y enzimas en animales superiores si lo altera. Por lo tanto, la determinacin del ee indica la degradacin biolgica de estos productos y puede informar sobre el origen de los pesticidas en algunos puntos de la atmsfera. En definitiva, este creciente inters provoca una demanda de mtodos de anlisis para determinar la pureza enantiomrica de productos basados en tcnicas fiables, rpidas y selectivas. Esta necesidad, es especialmente importante en la industria farmacutica ya que es necesario disponer de herramientas de anlisis para controlar la pureza ptica de frmacos durante su produccin, uso y almacenamiento. 3.5 3.5.1 Control y determinacin de enantimeros Introduccin

Los mtodos de anlisis de sustancias quirales los podemos dividir segn se basen en tcnicas espectroscpicas o en tcnicas de separacin. Dentro de las tcnicas espectroscpicas destacan las tcnicas quirpticas, es decir aquellas basadas en la interaccin de los analitos con un haz de luz polarizada. El grupo de tcnicas de separacin est constituido por las tcnicas habituales y destaca entre ellas la electroforesis capilar. La aplicacin de esta tcnica a las separaciones quirales y a la determinacin de purezas enantiomricas ha sido objeto de estudio de esta memoria. En consecuencia, ser tratada con detenimiento y de forma individual. No obstante, tambin podemos establecer un segundo criterio basado en el fundamento de la determinacin. Distinguimos, as los mtodos que necesitan de un auxiliar quiral para proporcionar informacin analtica de los enantimeros y los que no. Estos ltimos, son mtodos basados en tcnicas inherentemente quirales como las quirpticas. El resto de tcnicas analticas necesitan de la interaccin con un auxiliar quiral. Esta interaccin se puede establecer mediante el mtodo directo y el indirecto. El mtodo indirecto, consiste en la transformacin de los enantimeros en diasteroismeros por reaccin previa con el auxiliar quiral. Los diasteroismeros formados poseen diferentes propiedades fsico-qumicas y pueden ser separados, por ejemplo, en una columna convencional de HPLC. El mtodo directo consiste en la interaccin diferencial del auxiliar quiral con los enantimeros del analito formando complejos diasteroismericos transitorios fruto de un equilibrio dinmico. El auxiliar quiral puede ponerse en

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contacto bien porque es aadido al medio o porque forma parte de la fase estacionaria en las tcnicas separativas. En el mtodo indirecto, los enantimeros de un compuesto A se hacen reaccionar con un enantimero puro del auxiliar quiral B. Entonces, segn la siguiente ecuacin se forman dos especies qumicas que guardan una relacin de diasteroisomerismo.
R,S-A

+ R -B [R -A,R -B] + [S-A,R -B] I II

(3.1)

Las especies I y II pueden ser diferenciadas mediante una tcnica convencional de anlisis y en el caso de las tcnicas de separacin generan dos picos resueltos en mayor o menor medida en funcin de las condiciones cromatogrficas. Si se dispone del otro enantimero del auxiliar quiral ( en nuestro caso S-B) entonces el orden de elucin de los enantimeros puede ser invertido. Este mtodo presenta los inconvenientes tpicos de cualquier derivatizacin (aumento del coste y tiempo de anlisis, derivatizacin incompleta..) y adems es necesario, en el caso de determinaciones de pureza enantiomrica, de un auxiliar quiral de pureza ptica muy elevada. Para estudiar esto ltimo, vamos a ver que ocurre si el racmico del analito A reacciona con el rcemico del auxiliar B (figura 3.8).

R,S -A

R -B

I S-A,R -B II
R -A,R-B

Pares de enantimeros

S-B

III S-A,S-B IV
R -A,S-B

Figura 3.8. Especies que se forman en la reaccin de A con el racmico del auxiliar quiral B. En este caso se formaran cuatro especies, pero solo observaremos dos picos en el cromatograma aquellos correspondientes a los picos de I y II (diasteroismeros) pero cada uno de ellos contendr solapados sus respectivos enantimeros IV y III. Una situacin similar ocurre en las determinaciones de pureza enantiomrica. Si suponemos que el enantimero mayoritario de A es el R y que usamos tambin el enantimero R del auxiliar quiral, intentaremos hallar la relacin de reas ( y as de concentraciones) entre el pico minoritario
S,A-R ,B

(II) y el pco mayoritario R ,A-R ,B (I). No obstante estas reas se vern desvirtuadas por la

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contribucin de los picos III y IV provinentes de la reaccin entre los enantimeros de A con el enantimero minoritario del auxiliar quiral B. En definitiva, cometeremos un error en la determinacin si el auxiliar quiral no es de una pureza enantiomrica muy elevada. Esto an limita ms el nmero de auxiliares quirales disponibles y favorece que el mtodo directo sea ms utilizado. El mtodo directo consiste en aadir a la disolucin (donde se har la medida en una tcnica espectroscpica o a la fase mvil en una tcnica separativa), un auxiliar quiral que establecer un equilibrio dinmico para formar con los enantimeros del analito (en diferente extensin) unos complejos diasteroismericos. Estos complejos transitorios provocaran un diferente comportamiento espectroscpico o cromatogrfico en base al cual se podr hacer una determinacin del contenido de ambos enantimeros en la muestra original. Alternativamente, en las tcnicas cromatogrficas el auxiliar quiral puede ser la misma fase estacionaria (columnas quirales) y la diferente distribucin de los enantimeros en esta fase estacionaria ser la responsable de la separacin. El contenido enantiomrico de una mezcla de esteroismeros se puede expresar de distintas maneras7 . En polarimetra es habitual expresarlos como pureza ptica P (%), segn la siguiente frmula:

P (%) =


max

100

(3.2)

Donde max es el poder ptico rotatorio especfico del compuesto puro y el poder ptico rotatorio especfico de la mezcla. El exceso enantiomrico (ee, ecuacin 3.3) y la pureza enantiomrica (pe, ecuacin 3.4) son otras formas habituales. R -S 100 R +S R 100 R +S (3.3)

ee = pe =

(3.4)

Siendo S el enantimero minoritario en ambos casos. 3.5.2 Tcnicas de anlisis espectroscpicas

Las tcnicas quirpticas que incluyen la polarimetra, la dispersin ptica rotatoria (ORD) y el dicrosmo circular (DC) son las tcnicas espectroscpicas de anlisis ms habituales aunque tambin otras tcnicas como la resonancia magntica nuclear (RMN) ha sido aplicada. La polarimetra es el mtodo de anlisis ms comn para la determinacin de purezas pticas. La nica propiedad fsica que distingue entre substancias quirales y aquirales es la capacidad de las primeras de rotar el plano de la luz polarizada plana (LPP). Un rayo de luz consta de dos planos oscilantes perpendiculares, correspondientes a los campos 38

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elctrico y magntico; estos planos, a su vez, son perpendiculares a la direccin de propagacin del rayo de luz. En un rayo de luz ordinaria se observa como las oscilaciones de los campos elctrico y magntico ocurren en todos los planos posibles, mientras que la LPP slo oscila en un plano. La LPP es la suma de dos componentes polarizados circularmente, uno a la izquierda (LPCI) y otro a la derecha (LPCD), de la misma amplitud (figura 3.9). El fenmeno de la actividad ptica viene determinado por los ndices de refraccin para la luz polarizada circularmente a la derecha (LPCD) y la polarizada circularmente a la izquierda (LPCI) del medio considerado.
y

T T E

T T

EL

ER

Figura 3.9. Representacin del vector elctrico E como resultante de dos vectores rotatorios EL y ER En un medio pticamente inactivo los ndices de refraccin para ambos componentes de la luz polarizada son iguales. Sin embargo, en un medio pticamente activo, los ndices de refraccin son diferentes, por lo que los dos componentes de la LPP se desfasan uno con respecto al otro (viajan en el medio a diferente velocidad), dando lugar a un vector resultante igual al de incidencia pero con el plano de polarizacin rotado grados (ecuacin 3.5).

1800 b ( L - R ) 100

(3.5)

Donde b es el camino ptico de la celda de medida, L y R los ndices de refraccin para la componente polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha, respectivamente, y la longitud de onda de la radiacin utilizada. La rotacin especfica, a una determinada longitud de onda y temperatura, viene dada por:

[]T =
]

100 bC

(3.6)

donde C representa la concentracin y b el camino ptico. Este valor es el que se compara con la rotacin especfica del enantimero puro (segn ecuacin 3.2) y se estima as la pureza ptica de la mezcla problema. 39

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Figura 3.10 Esquema de un polarmetro La polarimetra proporciona datos de pureza ptica rpidos y de forma sencilla, sin embargo su aplicacin a la determinacin exacta de excesos enantiomricos elevados es muy limitada por una serie de razones8 : El conocimiento de la rotacin ptica especfica del enantimero puro es imprescindible Este valor (como cualquier otra rotacin ptica) depende de mltiples factores: pH, concentracin del analito, temperatura, naturaleza o pureza del solvente. El analito debe poseer un poder ptico rotatorio medio o alto para poder determinar correctamente pequeas diferencias de excesos enantiomricos Una cantidad relativamente elevada de muestra es necesaria La muestra no debe contener ningn otro analito quiral que contribuye al poder ptico rotatorio total. La dispersin ptica rotatoria (ORD) es una extensin de la polarimetra a n longitudes de onda por lo que tambin es denominada espectropolarimetra. Comparte entonces sus ventajas y limitaciones. Las curvas de ORD muestran un aumento hiperblico de intensidad al disminuir la sin observarse cambio en la direccin de rotacin, siempre y cuando el medio quiral no absorba luz. En este caso se trata de una ORD normal. No obstante, cuando se mide a una longitud de onda en una banda de absorcin del compuesto se puede observar una dispersin anmala, una curva sigmoidal que se superpone a la curva normal de ORD. Esta anomala en la dispersin, que supone un cambio en la direccin de la rotacin, es llamado efecto Cotton. En el caso ms sencillo, cuando slo existe un efecto Cotton, la distancia entre el mximo y el mnimo de la curva puede utilizarse para medidas cuantitativas. 40

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La espectroscopia de dicroismo circular (DC)9 es la ms sofisticada de las tcnicas quirpticas porque consiste en una medida simultnea de una rotacin y una absorcin de la radiacin polarizada. Cuando un medio quiral absorbe luz no slo tiene lugar la rotacin del plano de la LPP, sino que adems los dos componentes circulares del haz pueden ser absorbidos en diferente grado ( L- R) de forma que el rayo incidente de luz polarizada plana emerge como un rayo polarizado elpticamente, cuyo eje mayor est rotado grados (figura 3.11). El hecho que los dos componentes de la luz polarizada plana se absorban en diferente extensin provoca que su suma ya no genere una luz polarizada en un plano sino una elipse cuya relacin entre ejes es denominada elipticidad (). Por convencin, la diferencia = L- R es denominada dicrosmo y se mide mediante o bien mediante la diferencia de absorbancia medida para ambos componentes.
y " $ E b

EL ER

x a

Figura 3.11. Representacin de las componentes circularmente polarizadas a la derecha y a la izquierda de la LLP al atravesar una sustancia pticamente activa cuando hay absorcin de radiacin. La elipticidad (en radianes )puede calcularse a travs de la siguiente expresin:

= 2.303( L - R ) bC

(3.7)

Siendo b el camino ptico y C la concentracin del soluto quiral absorbente. Como puede observarse, la relacin entre la elipticidad y la concentracin es anloga a la ley de Lambert-Beer. Los dos enantimeros de un compuesto presentan un espectro de DC idntico pero de signo contrario de tal manera que una mezcla de ambos presenta una seal que es la diferencia de ambos espectros. Si se conoce la elipticidad de un enantimero puro por comparacin puede calcularse la pureza ptica de una mezcla. No obstante, este tipo de anlisis tiene los mismos inconvenientes expuestos para la polarimetra. 41

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La resonancia magntica nuclear (RMN) ha sido otras de las tcnicas espectroscpicas usadas en el anlisis de sustancias quirales. Esta tcnica no diferencia entre enantimeros al menos que stos hayan sido convertidos en diastereoismeros por reaccin con un reactivo quiral. De esta forma, los picos idnticos que aparecen en el espectro de ambos enantimeros, aparecen con un desplazamiento qumico diferente al formarse los diastereoismeros. La relacin molar de stos (y, por tanto, de los enantimeros) puede ser determinada por las intensidades relativas de los picos. La derivatizacin de enantimeros con un auxiliar quiral formar disteroismeros (mtodo directo) es la opcin ms usada para la determinacin de purezas pticas mediante RMN en contra de los reactivos quirales lantnidos o los agentes quirales solvatantes que forman complejos diasteroisomricos transitorios (mtodo indirecto). La tabla 3.4 resume los agentes derivatizantes quirales ms usuales en RMN de hidrgeno y fluor-19. Tabla 3.4. Algunos agentes derivatizantes quirales usados en RMN cido R-O-acetilmandlico R,R-2,3-butandiol cido camfnico R-2-fluoro-2-feniletilamina cido S-O-metilmandlico Los reactivos lantnidos quirales son compuestos de coordinacin seis que forman complejos de adicin dbiles con una gran cantidad de sustancias orgnicas. La tabla 3.5 indica alguno de estos agentes quirales: Tabla 3.5 Ejemplos de reactivos lantanidos quirales L en LnL3 Dicamfoil-d-metanatoheptafluorodihidroximetilenod-camforato Pivaloil-d-camforatotrifluorohidroximetileno-dcamforato Eu Yb Pr Eu(hfc)3 Yb(hfc)3 Pr(hfc)3 Eu Eu(dcm)3 Lantnido (L) Abreviatura

Estos agentes quirales provocan desplazamientos diferenciados para los enantimeros de un analito en el espectro de RMN de 1H y 13C.

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Los agentes

quirales solvatantes son la otra alternativa para diferenciar la seal de RMN de dos

enantimeros. Estos solventes forman complejos diastereoisomricos de solvatacin de diferente extensin con los dos enantimeros del analito va un rpido equilibrio reversible. Este mtodo es simple y ha sido usado para la determinacin de la pureza enantiomrica de lactonas o teres. El agente solvatante ms habitual es el 1-(9-antril)-2,2,2-trifluoroetanol (TFAE) que provoca desplazamientos qumicos de los espectros de RMN de 1H y 19C. 3.5.3 Tcnicas de anlisis cromatogrficas

Las tcnicas cromatogrficas son tcnicas habituales usadas para la separacin y posterior determinacin de los enantimeros de un compuesto. Entre ellas destacan por el nmero de aplicaciones la cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y la cromatografa de gases (GC). Sin embargo, tambin existen aportaciones interesantes de la cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) o la cromatografa de capa fina (CCF)10 . A pesar del gran xito de las tcnicas cromatogrficas en el anlisis quiral existen tambin algunas fuentes potenciales de error en la determinacin de excesos enantiomricos: (ee). Por ejemplo; enantiomerizacin de compuestos lbiles en la fase estaciona quiral: algunos analitos pueden invertir su configuracin cuando interactan con la fase estacionaria quiral. En este caso el ee se desplazar hacia el primer enantimero en eluir (el de menor retencin). contaminacin del pico del analito con impurezas: la matriz que acompaa al analito, puede contener alguna especie interferente. La adecuada seleccin de los parmetros cromatogrficos que afectan a la separacin evita este problema. respuesta no-lineal del detector: para poder determinar el ee, es necesario conocer la concentracin del enantimero mayoritario y minoritario. Puede ocurrir que algunas de las dos determinaciones se produzca fuera del intervalo de linealidad del mtodo. HPLC es una tcnica exitosa en la separacin de enantimeros tanto por el mtodo directo como por el indirecto. Las sustancias quirales habitualmente separadas en forma de diasteroismeros son aminas, alcoholes y cidos carboxlicos porque poseen grupos funcionales que facilitan su derivatizacin. Esta derivatizacin tiene como objetivo permitir la resolucin quiral pero tambin puede aprovecharse para mejorar las propiedades de deteccin del analito (derivatizacin con un cromforo o fluoroforo quiral). Algunos agentes derivatizantes quirales se muestran en la tabla 3.5.

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separaciones quirales y enantiomerismo

Sin embargo, siempre que es posible, el mtodo directo es la opcin elegida. Podemos distinguir dos posibilidades: la adicin de un reactivo quiral a la fase mvil o el uso de una fase estacionaria quiral. Estos aditivos quirales aadidos a la fase mvil se conocen como selectores quirales y hablamos entonces de interacciones selector-selectante (analito). Entre los selectores quirales ms habituales en HPLC podemos incluir a los complejos metlicos, las ciclodextrinas y los contraiones quirales. La separacin quiral mediante complejos metlicos se fundamenta en el fenmeno del intercambio de ligandos entre un quelato consistente en un cation central (Cu(II), Zn(II o Ni(II) ) ms dos ligandos quirales bifuncionales (normalmente aminocidos) y los enantimeros del analito. El analito sustituye uno de los ligandos quirales para formar un complejo ternario mixto. La enantioseparacin es posible debido a la diferente estabilidad de los complejos con los enantimeros R y S. Este intercambio de ligandos se produce en la fase mvil y la separacin se lleva a cabo en fases estacionarias tradicionales (C8 ,C18). Tabla 3.6. Complejos metlicos usados en la resolucin de compuestos quirales mediante cromatografa de intercambio de ligandos Ligando L-prolina L-fenilalanina L-histidina R,R-cido tartrico Catin Metlico Cu2+ Cu2+ Cu2+ Cu2+,Ni2+ Fase Estacionaria Octilo-silica Octadecilo-silica Octilo-silica Octadecilo-silica Analito Aminocidos Acido mandlico y derivados Aminocidos Aminocidos

Las ciclodextrinas (, o ) son oligosacridos cclicos consistente en seis, siete u ocho anillos de glucopiranosa respectivamente. Tienen una forma de cono truncado con una cavidad relativamente hidrofbica que puede albergar a una gran variedad de compuestos (complejos host-guest). Las ciclodextrinas son quirales y en consecuencia cuando actan como husped incluyen en su interior en diferente extensin a los enantimeros de un compuesto. Por tanto, aadidas como un aditivo a la fase mvil permiten la separacin de enantimeros en columnas aquirales. Otra posibilidad, es la separacin de enantimeros haciendo uso de la formacin de pares inicos. Analitos que contienen un grupo amino pueden formar un par inico con un contrain como el cido (+)-10-camforsulfnico. Si el analito es quiral, sus enantimeros formaran complejos de diferente estabilidad y su separacin ser posible.

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introduccin

No obstante, la opcin ms habitual para conseguir la separacin es el uso de fases estacionarias quirales (CSP). Estas separaciones consisten en la diferente particin que presentan los analitos con estas fases estacionarias capaces de reconocer diferencias estereoqumicas. El nmero de CSPs disponibles comercialmente y las posibilidades de separacin son mltiples por lo que existe en la bibliografa tratados especficos sobre el tema11 . En esta memoria, slo se comenta brevemente la divisin y el fundamento de las CSP ms comunes. Tabla 3.7 Fases estacionarias quirales disponibles comercialmente (DNB=dinitrobenzoilo) Tipo Pirkle Nombre BakerbondChiral Spherisorb Chiral 2 Covalent L-leucina Ligando Celulosa Chiralpak WM Chiralcel CA-1 Chiralcel OD Inclusin ChiraDex CrownPack CR Protena Chiral-AGP Unidad Quiral S-DNB-leucina R-Naftiletilurea S-DNB-leucina Aminoacido-Cu(II) Triacetato de celulosa Carbamato de trifenilcelulosa -ciclodextrina ter quiral -glicoprotena Fase mvil habitual Hexano/isopropanol Hexano/isopropanol Hexano/isopropanol Tampn acuoso Tampn acuoso Tampn acuoso Tampn acuoso HClO4 (aq) Tampn fosfatosolvente orgnico Distribuidor Baker PhaseSep Regis/Alltech Daicel Daicel Daicel Merck Daicel Baker

Las columnas quirales tipo Pirkle o brush-type CSP son las ms extendidas porque son ms baratas y resistentes que aquellas basadas en polmeros naturales (protenas, celulosa,ciclodextrinas..). Adems estn disponibles en su forma R y S, lo que permite invertir el orden de elucin de los enantimeros si es necesario y permiten adems usarlas en modo preparativo. No obstante presentan algunas desventajas que limitan su uso como la necesidad de analitos con algn grupo aromtico y de polaridad baja o media. Esto se debe al mecanismo de enantiodiscriminacin que se esquematiza en la figura 3.12.

Zona de interaccin

R H
Anillo aromtico

Si
H N O H N O H N

Figura 3.12. Representacin esquemtica de una columna tipo Pirkle. 45

separaciones quirales y enantiomerismo

La enantiodiscrminacin se basa en una interaccin triple de carcter secundario como fuezas de Van der Waals, puentes de hidrgeno o interacciones cido-base. No obstante, la interaccin ms importante en este tipo de columnas son las interacciones electoestticas - entre el anillo aromtico del analito y el grupo amida, carbomato o urea de la zona de interaccin de la columna. Este enlace secundario no es estereoespecifco pero ancla el analito a la columna. La parte quiral del analito entonces interacciona de forma estereoespecifca con la cadena terminal de la columna. Las fases estacionarias basadas en el fenmeno del intercambio de ligandos se fundamentan en el mismo fenmeno explicado para el selector libre adicionado a la fase mvil (pg 20). El inconveniente de estas columnas es su poco universalidad ya que slo se pueden enantioseparar analitos capaces de intercambiarse con los ligandos del complejo de Cu (II) como los aminocidos o aminoalcoholes. Otro tipo de columnas de elevado uso son las de celulosa o derivados como unidad quiral. La celulosa es un polmero compuesto por unidades de D-(+)-glucosa y por tanto puede discriminar entre los enantimeros de un compuesto. Las propiedades de adsorcin o de discrminacin quiral pueden ser modificadas derivatizando los grupos OH de la celulosa con grupos como el acetato, el benzoato o el carbamato generndose as una gran variedad de fases estacionarias quirales. El fenmeno de la inclusin tambien ha sido aprovechado para proponer fases estacionarias con ciclodextrinas o teres coronas quirales. Las columnas de ciclodextrinas son relativamente estables y pueden ser diseadas en unas dimensiones que permitan su uso en modo preparativo. Sin embargo, presentan una capacidad de enantiodiscriminacn menor que aadidas como selector quiral a la fase mvil probablemente porque su unin a la fase estacionaria implica que queden ligadas en una conformacin fija que dificulta ms la inclusin que cuando estn libres en disolucin. Las columnas de teres corona quirales se emplean para enantiodiscriminar analitos que contengan algn grupo amino primario y presentan el inconveniente de su elevado coste econmico. Fases estacionarias con protenas como elemento de reconocimiento quiral tambin han sido descritas siendo la de -glicoprotena y la de albmina srica humana las ms habituales. Un gran nmero de monografas y revisones bibliogrficas sobre la aplicacin de la CG a las separaciones quirales han sido publicadas12 ,13 . El desarrollo de la CG como tcnica de anlisis quiral viene ligada a separciones enantiomrias de aromas y feromonas. En la actualidad, algunos pesticidas, insecticidas y auxiliares quirales en sntesis de naturaleza voltil han sido analizados por Chiral GC. Esta enantioseparaciones son dependientes de la temperatura e incluso puede haber un cambio del orden de elucin de los enantimeros a una temperatura dada ( Tiso o temperatura isoenantioselectiva). Durante un largo periodo de tiempo, la conversin a diasteroismeros fue el nico mtodo de anlisis disponible para

46

introduccin

separar enantimeros. Estas aplicaciones hacen uso de auxiliares quirales como el (-)-mentol o el R,R-2,3butandiol (tabla 3.8). Tabla 3.8. Algunos auxiliares quirales usados en GC y HPLC para separaciones quirales indirectas. Auxiliar quiral Acido 2-acetil- D-lctico R-(-)-2-Butanol 1R,3R,4S-(-)-Mentol 2R,3R-(-)-Butandiol Comentario Para formar estres con alcoholes quirales Para formar steres con cidos o glicsidos con monosacridos Idem con amionocidos o hidroxicidos Para forma acetales cclicos con cicloalcanonas o hidrocarburos con un grupo carbonilo. Sin embargo, est opcin est actualmente en desuso y se prefiere la separacin directa de los enantimeros en columnas quirales. El mtodo indirecto slo se aplica cuando se consigue una mejora en la sensibilidad o en la volatilidad del analito como por ejemplo haciendo uso de auxiliares quirales con tomos de halgeno en su estructura que permiten mejorar los lmites de deteccin en el detector de captura electrnica (ECD). Las columnas quirales en GC se fundamentan en los mismos principios de separacin expuestos para las columnas de HPLC siendo las columnas de ciclodextrinas y las tipo Pirkle las ms habituales. La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) y tcnicas relacionadas14 se ha mostrado desde su introduccin como tcnica de anlisis de molculas quirales como una alternativa vlida a la tcnicas cromatogrficas ms establecidas (HPLC y GC). Los fluidos supercrticos tienen un poder de solvatacin cercano al de los lquidos pero mantienen la baja viscosidad de los gases. Estas propiedades permiten el anlisis de compuestos no volatiles o trmicamente inestables que no son adecuados para GC y mantener una buena eficiencia de la separacin (superior a la que se obtiene en HPLC). En el campo de las separaciones quirales, SFC se lleva a cabo usualmente con dixido de carbono supercrtico como eluyente (ms algn modificador orgnico) y las misma columnas quirales descritas para HPLC (tabla 3.7). En general, SFC permite obtener mejores resoluciones quirales (picos ms estrechos) y menores tiempos de anlisis. Esta reduccin del tiempo de anlisis est relacionada con la menor viscosidad del fluido supercrtico (comparado con el lquido) lo que permite el uso de caudales ms elevados y de columnas ms largas (o incluso varias columnas en serie) porque la cada de presin a lo largo del sistema es menor. Otra ventaja de la tcnica es la posibilidad de usarla en modo preparativo y obtener as pequeas cantidades de los enantimeros puros. Sin embargo, tambin presenta inconvenientes bsicamente relacionados con su alto coste porque a parte del uso de CSPs de precio elevado y estabilidad reducida hay que aadir los costes instrumentales derivados de utilizar un fluido supercrtico (dispensador de dixido de carbono, reguladores de presin que eviten su expansin a gas, celdas especiales de medida etc). 47

separaciones quirales y enantiomerismo

3.5.4

Aplicacin de la electroforesis capilar a las separaciones quirales

En el captulo 2 se han expuesto las ventajas generales de la CE como tcnica de separacin y sus campos de aplicacin. En el campo de las separaciones quirales, CE es una tcnica muy exitosa, prueba de ello son las mltiples revisiones bibliogrficas aparecidas15 ,16 ,17 o la publicacin de tratados especficos del tema18 . Entre estas revisiones destacan la de Verleysen19 et al. que incluye ms de 350 referencias y la de Gbitz20 et al. que reporta condiciones de separacin de ms de 250 analitos quirales. Estas separaciones se llevan a cabo bsicamente en el modo CZE o MEKC aadiendo al BGE un selector quiral que discrimina entre los dos enantimeros (mtodo directo). Las ventajas que ofrece la CE en las separaciones quirales son varias: Su alta eficacia en la separacin permite que una pequea diferencia de estabilidad entre los enantimeros del selectante y del selector provoque enantioseparacin. Esta pequea discriminacin quiral probablemente no sera detectada mediante otra tcnica cromatogrfica La concentracin y naturaleza del BGE puede ser rpidamente modificada lo que aumenta la capacidad de resolucin de la tcnica. Esta versatilidad no es posible con tcnicas que usan selectores quirales inmovilizados El hecho que el selector quiral este libre en disolucin favorece la interaccin con el selectante porque no est en una conformacin fija como cuando est inmovilizado Una combinacin de selectores quirales puede ser usada para mejorar la resolucin quiral El mnimo consumo de muestra y reactivos permite el uso de selectores quirales caros

No obstante, todas estas ventajas pueden ser resumidas en una sola, la probabilidad de xito. Comparada con otras tcnicas anlogas, la probabilidad de conseguir la separacin quiral de un analito mediante CE es superior. Esto es an ms evidente cuando se pretende separar y enantioseparar simultneamente una mezcla de compuestos quirales (por ejemplo metabolitos de un frmaco). Este problema analtico es difcil de abordar con tcnicas de menor poder de resolucin o la solucin puede necesitar de condiciones de separacin diferentes para algunos analitos de la mezcla. Sin embargo, las separaciones quirales mediante CE tambin presentan inconvenientes: La separacin quiral depende de mltiples factores; pH del BGE, concentracin y naturaleza del BGE , fuerza inica del BGE o temperatura del capilar. La optimizacin de estos parmetros es bsicamente emprica lo que dificulta el desarrollo del mtodo.

48

introduccin

La presencia del selector quiral en el BGE complica el acoplamiento de la tcnica con detectores como el polarimtrico, el dicrosmo circular o el espectrmetro de masas (MS). Esto ltimo es una limitacin importante para la aplicacin de la Chiral CE a muestras con matrices complejas donde el uso de un detector tan selectivo como el MS es necesario.

No es posible su uso en modo preparativo para obtener fracciones de los enantimeros puros.

Los principios de la separacin quiral mediante CE son varios de los cuales los ms importantes son: 1.Complejacin por intercambio de ligandos . Como ya se ha comentado, los enantimeros de un compuesto pueden formar complejos de diferente estabilidad con un complejo constituido por un in metlico (Cu2+, Ni2+) y un aminocido pticamente puro. La adicin del analito provoca la sustitucin de uno de estos amianocidos por el analito para formar un complejo ternario. 2.Complejacin host-guest o de inclusin: los complejos en los que el analito (molcula guest) es espacialmente incluido en el interior de un ligando (molcula host) son llamados complejos host-guest o de inclusin. De esta forma, ciertos compuestos quirales que tienen la capacidad de actuar como host son utilizados para formar complejos con un elevado nmero de compuestos de inters, con el fin de conseguir su resolucin enantiomrica. Estos compuestos son los siguientes: - teres corona21 . Los teres corona son politeres macrocclicos consistentes en un cierto nmero de tomos de oxgeno , que forman un plano, unidos por cadenas de dos carbonos, algunos de los cuales contienen grupos -COOH. El anillo crea una cavidad capaz de formar complejos con cationes alcalinos y alcalinotrreos, as como aminas primarias protonadas. La amina primaria puede penetrar en la cavidad formando enlaces de hidrgeno con los tomos de O; no obstante, la enantioseparacin proviene, en general, de la interaccin entre los substituyentes del centro asimtrico y los grupos -COOH del anillo mediante interacciones de enlace de hidrgeno y/o electrostticas.

HOOC

O O O O O O

COOH COOH

HOOC

Figura 3.13. Estructura del (+)-(18-Crown-6)-2,3,11,12-tetra-carboxylic acid

49

separaciones quirales y enantiomerismo

- Antibiticos macrocclicos22 :como el Rifamycin B, Vancomycin o Teicoplanin. Estos compuestos pueden exhibir una enatioselelectividad superior a las de las ciclodextrinas. Las interacciones principales entre estos selectores quirales y los analitos son interacciones electrostticas, mientras que las secundarias son interacciones de puente de hidrgeno, hidrofbicas, dipolo-dipolo o 6-6 . A pesar de su alta enantioselectividad y poder de resolucin, tambin presentan ciertos problemas como una alta absorcin en el UV, adsorcin en la pared del capilar e inestabilidad a ciertos pHs y temperaturas. - Ciclodextrinas (CDs)12. Las ciclodextrinas naturales , y -CD o sus anlogas modificadas qumicamente han sido ampliamente utilizadas. Su forma es la de un cono truncado de extremos abiertos, con un dimetro de la cavidad determinado por el nmero de unidades de glucosa (tabla 3.8). Las ciclodextrinas son muy estables, resistentes a la luz y no absorben apreciablemente en el UV-visible. Tabla 3.8. Propiedades fsico-qumcas de las ciclodextrinas naturales Parmetro Unidades de glucosa Masa molecular Dimetro interno de la cavidad () Dimetro externo de la cavidad () Solubilidad en agua (25C) (% w/v) 13,7 14,5 15,3 1,8 16,9 23,2 5,7 7,8 9,5 -CD 6 972 -CD 7 1135 -CD 8 1297

La cavidad de las CDs es relativamente hidrofbica, mientras que la superficie es hidroflica. Los substituyentes hidroxilo en las posiciones 2 y 3 (hidroxilos secundarios), y 6 (hidroxilos primarios) de cada unidad de glucosa son los responsables de las interacciones quirales, puesto que estn unidos a carbonos asimtricos. La separacin enantiomrica se basa en la inclusin de una funcin aromtica o alqulica en la cavidad, ms enlaces de hidrgeno adicionales entre los grupos hidroxilo secundarios de la ciclodextrina y substituyentes de la molcula guest. Los cinco tomos de carbono asimtricos de cada unidad de glucosa confieren a las ciclodextrinas sus propiedades quirales. Las ciclodextrinas naturales, especialmente la CD, pueden ser derivatizadas para dar nuevos selectores quirales, tanto neutros como cargados, con una capacidad enantioselectiva diferente a la de la ciclodextrina natural.

50

introduccin

OR1

OR2

OR3

Figura 3.14. Estructura general de una ciclodextrina y esquema de su cavidad - Calixarenos quirales23 . Los calixarenos forman tambin complejos de inclusin, pero hasta ahora su utilizacin ha sido mnima. 3. Interacciones de afinidad con polisacridos lineales24 . Estos selectores son de origen biolgico y consisten en varias unidades de monosacridos quirales. A este grupo pertenecen las maltodextrinas, los maltooligosacridos como el dextrn y el dextrn. La estructura helicoidal de las dextrinas podra ser la responsable del reconocimiento quiral, siendo las interacciones principales los enlaces de hidrgeno y las interacciones dipolo-dipolo. 4. Interacciones de afinidad con protenas25 . Estos selectores quirales son compuestos naturales formados por aminocidos en su estructura polimrica, que pueden estar cargados positiva o negativamente, o neutros, dependiendo del pH del BGE. En funcin del pH los puntos de interaccin entre analito y protena cambian, modificndose as la estereoselectividad. Entre las protenas utilizadas para la separacin enantiomrica destacan la albumna srica humana o el avidin. 5. Utilizacin de micelas26 . En el caso de la MEKC la separacin de enantimeros puede realizarse por medio del uso de micelas quirales (sales biliares como colato o taurocolato sdico, o derivados de aminocidos, como el N-dodecanoil-L-valinato o N-dodecanoil-L-alalinato sdico), o mediante la combinacin de micelas y ciclodextrinas (CD-MEKC). En esta ltima modalidad, el analito se distribuye entre la fase micelar y la ciclodextrina, y prcticamente no existe en la fase acuosa. 6. Interaccin con un selector quiral enlazado a la pared del capilar o con un capilar relleno de una fase estacionaria quiral en CEC27 .

51

separaciones quirales y enantiomerismo

Desde su aparicin como tcnica de anlisis quiral, la eleccin de un principio de separacin o utro de los anteriormente expuestos ha sido bsicamente emprica. Sin embargo, despus de ms de una dcada de investigacin en este campo se observan en la literatura algunas tendencias que ayudan a elegir el tipo de selector quiral ms adecuado para un analito dado. Este es el objetivo del anexo VI de esta memoria, donde se proponen pautas para la correcta eleccin del selector quiral en funcin de la estructura del selectante y se discuten las posibilidades de los selectores quirales expuestos anteriormente. Para las CDs, que constituyen los selectores quirales de mayor uso, se ha desarrollado un modelo tericos para explicar la enantioseparacin28 . No obstante, es un modelo genrico que puede ser aplicado a cualquier otro selector neutro que forma complejos 1:1 con el analito. Para dos enantimeros A y B, que interaccionan con un selector quiral C, para dar los complejos AC y BC pueden escribirse las siguientes ecuaciones qumicas: A + C D AC B + C D BC K1= [AC]/[A][C] K2= [BC]/[B][C] (3.8) (3.9)

La movilidad electrofortica de cada enantimero ser funcin lineal de su movilidad en forma libre y de la movilidad del complejo segn:

A= A1 + AC2 B= B1 + BC3

(3.10)

(3.11)

Donde A , AC, B , BC son las fracciones molares de las especies A, AC, B y BC respectivamente: 1, la movilidad del soluto libre, y 2 la movilidad del complejo AC. Obsrvese en la ecuacin 3.11, que el trmino 3, la movilidad del complejo BC es igual al trmino 2 ya que ambos complejos tienen la misma relacin carga-radio por lo que denominaremos a partir de ahora 2 a la movilidad de cualquiera de los dos complejos. Los trminos de las fracciones molares pueden expresarse como:

A =

[A ] [A] + [AC] [B] [B] + [BC ]

(3.12) (3.13)

B =
52

introduccin

Expresiones anlogas pueden encontrarse para los trminos AC y BC. Si sustituimos estos trminos en la ecuacin 3.10 obtenemos :

A =

1 + 2 K1 [C] 1 + K1 [C]

(3.14)

donde K1 es la constante de equilibrio del complejo AC (tambin llamada constante de inclusin) y [C] la concentracin de selector quiral. Se pude hallar una expresin similar para el enantimero B si sustitumos K1 por K2. La resolucin ser proporcional a la diferencia de movilidades entre los dos enantimeros (=A -B ). Si remplazamos en esta expresin las movilidades descritas por la ecuacin 3.14 llegamos a:

[C]( 2 1 )(K 1 - K 2 ) 2 1 + (K 1 + K 2 )[C] + K1 K 2 [C]

(3.15)

Se deduce que en medio aquiral donde no existe selector quiral ([C]=0) la separacin quiral no es posible porque ambos enantimeros presentarn igual movilidad electrofortica. Esta separacin ser mayor cuanto mayor sea la diferencia en las constantes de inclusin de ambos analitos (K1-K2) y cuanto mayor sea la diferencia de movilidad entre las forma complejadas y los enantimeros libres. Como la diferencia de movilidad entre los enantimeros es funcin de la concentracin de selector quiral si derivamos la expresin 3.15 respecto a esta concentracin e igualamos a cero podemos hallar para que concentracin de selector quiral la diferencia de movilidad electrofortica es mxima. Esta operacin conduce a la siguiente expresin:

C ptima =

1 K1K 2

(3.16)

El modelo predice entonces que los enantimeros con una alta afinidad por el selector quiral necesitarn una concentracin de ste ms baja para ptimizar la resolucin quiral.

La aplicacin de la CE en las separaciones quirales fue calificada por Vespalec15 en 1999 como una tcnica madura con un nmero de publicaciones que crece exponencialmente cada ao y con un fundamento terico y una descripcin matemtica disponible. En definitiva, consideraban que el perodo de investigacin inicial de la CE en este campo haba llegado a su fin. Recientemente, Chankvetadze17 se expresa en trminos parecidos y reflexiona sobre la necesidad de aplicar la Chiral CE a problemticas como la determinacin de purezas enantiomricas en muestras reales que ayuden a la aceptacin de la Chiral CE no slo a nivel acadmico sino tambin industrial. 53

separaciones quirales y enantiomerismo

La aplicacin de la CE a la determinacin de purezas enantiomricas ha sido reducida5 y algunos ejemplos se muestran en la tabla 3.9. La gran resolucin necesaria y otros problemas relacionadas con la sensibilidad han sido en parte las causa de este desinters. Aquellas aplicaciones que reportan resoluciones a lnea base no podran aplicarse a la determinacin de excesos enantiomricos. En el caso de muestras reales(no mezclas sintticas como la mayora de los ejemplos de la tabla 3.9) pueden aparecer otros problemas relacionados con la matriz puede contener analitos interferentes. Tabla 3.9. Algunas determinaciones de purezas enantiomricas mediante CE Enantimero detectado D-Loxiglumida (+)-Fluparoxan
29 30

Impureza Enantiomrica (%) 0.2 0.1 1.0 0.05 0.25 0.20

Selector quiral usado 1mM Vancomycin 25 mM Ryfamicin 150mM -CD 75mM -CD 100mg/ml Met -CD a 50mM TM--CD a

Deteccin UV 255 nm Indirecta UV 350 nm UV 214 nm UV 214 nm CE-MS UV 254 nm

(-)-Isoproterenol

31

D-Triptofano32 (R)-Ropivacaina33 (R)-Ketoprofeno


34

a Derivados

metilados de la -CD; mometilada (Met--CD) y trimetilada (TM--CD)

54

introduccin

Referencias
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

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Heidelberg.
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

36, 58-41.
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

55