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CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE LEXCIPIENT LUDIPRESS

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1. Objet
Lobjet de cette procdure est de dterminer les modalits de contrle du niveau de contamination microbienne de lexcipient LUDIPRESS.

2. Domaine dapplication
Cette procdure sapplique dans le cadre dun contrle normal port sur LUDIPRESS en poudre.

3. Documents associes et rfrences

- Handbook of pharmaceutical recipients 6Ed (2009). - Procdure : contrle microbiologique des produits non obligatoirement striles . - Procdure : lecture et interprtation des rsultats danalyse .

4. Responsabilits
- Lanalyste microbiologiste. - Le responsable du laboratoire de microbiologie. - Le Responsable de Contrle de qualit

5. Dfinitions et abrviations
- FAVT : Flore Arobie Viable Totale. - LMT : Levures et Moisissures Totales. - UFC : Unit Formant Colonie.

6. Contenu
6.1. Principe C'est lestimation de la flore arobie viable totale et la recherche et le dnombrement des microorganismes spcifiques, savoir : Staphyloccocus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et salmonella sp en utilisant une mthode de choix pour le dnombrement et la recherche des microorganismes. 6.2. Matriels quipement : Bain-marie. Balance de prcision. Agitateur. Compteur de colonies. tuves 30-35C, 20-25C, 44C. pH-mtre.

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Anse de platine Bec Bunsen. rampe filtration. Membranes filtration avec porosit de 0,45 m. Consommables et verrerie : Botes de Ptri. Pipettes Pasteur. Pipettes gradues de diffrents volumes. Pinces striles Tubes vis striles. portoirs. Flacons striles de 100, 300 et 500 ml, Erlenmeyers, bchers, fioles. Solutions : Eau distille strile. Eau javellise. Solution tampon peptone au chlorure de sodium pH= 7 strile. Solution de Polysorbate 80 1 g/l. Milieux de culture liquides : Milieu liquide A : milieu liquide aux peptones de casine et de soja. Milieu d'enrichissement E : milieu d'enrichissement pour les entrobactries, Mossel. Milieu liquide G : milieu liquide de Mac Conkey. Milieu I : milieu au ttrathionate bile vert brillant. Milieux de culture gloss : Milieu Glos B : milieu glos aux peptones de casine et de soja. Milieu Glos C : milieu Sabouraud glucos glos avec chloramphnicol. Milieu glos H : milieu glos de Mac Conkey. Milieu glos K : milieu glos xylose lysine dsoxycholate. Milieu glos M : milieu glos fer trois sucres. Milieu glos N : milieu glos ctrimide. Milieu glos O : milieu Baird Parker. Dfinition de lexcipient

6.3.

LUDIPRESS est une mixture entre le lactose monohydrate (96,5% 1,8%) et le povidon (3,5% 0,5%). Il se prsente sous forme de granules blancs coulement libre, inodore avec un got neutre. Il est soluble dans leau. 6.4. Echantillonnage et prparation de lchantillon pour essai

- Plan dchantillonnage : se rapporter lannexe02. - A laide dun chantillonneur, prlever 10g de la poudre de lexcipient en prenant en compte les prcautions mentionnes dans la procdure Echantillonnage et prlvement ,

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- Afin dobtenir 10g comme tant la quantit ncessaire pour le test, mlanger plusieurs prlvements effectus au hasard dans la masse du produit. - Prparer une dilution au 1/10me en dessoudant 10g de lexcipient dans 90 ml de la solution tampon peptone au chlorure de sodium pH7 ou dans un autre diluant appropri additionne de polysorbate 80 1 g/l. On doit donc obtenir 100 ml de suspension corresponde 10 g de lexcipient. - Ajuster pH de 6 8, si ncessaire. - Prparer dautres dilutions, si ncessaire, laide du mme diluant. 6.5. Dnombrement de la flore arobie viable totale en milieu solide en boites de Ptri (=comptage sur plaque de glose) 6.5.1. Dnombrement aprs ensemencement en masse (Mthode 01) Porter aseptiquement 1 ml de la suspension dans chaque boite de ptri vide : Pour le dnombrement des microorganismes totaux : Ajouter 15 ml 20 ml du milieu glos B fondu et refroidi 45C. Faire ensuite des mouvements circulaire et de va- et- vient en forme de 8 . Incuber 30 35 C pendant 24 48 heures. Pour dnombrement des levures et moisissures totales : Ajouter 15 20 ml du milieu glos C fondu puis refroidi 45C. Homogniser en faisant des mouvements circulaires. Incuber 20 25 C pendant 3 5 jours.

- Effectuer le travail en double. - Effectuer un contrle ngatif. 6.5.2. Dnombrement aprs filtration sur membrane (Mthode 03) - Prparer une dilution au 1/10me (cf. chapitre 7.4.) mais on augmente le volume jusqu 500. On doit donc obtenir 500 ml de suspension corresponde 50 g de lexcipient. - Vrifier limpuret de la solution mer pour ne pas affecter la rtention des microorganismes. - En utilisant un filtre 0.45 m, filtrer 100 ml de la solution prpare pour chaque boite. - Dposer aseptiquement la membrane destine la numration des FAVT sur la surface du milieu glos B coul dans une boite de Ptri. - Dposer aseptiquement la membrane destine la numration des LMT sur le milieu glos Sabouraud+ Chloramphnicol. - Incuber 30 35 C pendant 24 48 heures pour les germes totaux et 20 25 C pendant 3 5 jours pour les levures et moisissures. - Effectuer lopration en double pour chaque milieu de culture et pour chaque dilution. - Effectuer un contrle ngatif. 6.5.3. Lecture et interprtation des rsultats - Premire lecture : aprs 24 h pour FAVT et aprs 3 jours pour LMT. - Deuxime lecture : aprs 48 h pour FAMT et aprs 5 jours pour LMT.
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- Utiliser les boites qui prsentent un nombre de colonies inferieur ou gale 300 colonies pour FAVT et inferieur ou gale 100 colonies pour LMT. - Calculer le nombre dUFC / ml prsents dans la suspension dessai comme a t indiqu dans la procdure lecture et interprtation des rsultats danalyses - Rendre le rsultat en UFC par gramme de lexcipient. Remarque : Pour la technique de filtration sur membrane, calculer et exprimer les rsultats par rapport la quantit de liquide filtre, c.--d, en UFC/100 ml, puis rendre le rsultat en UFC/g de lexcipient. Recherche dEscherichia coli Test de prsomption : - Prparer lchantillon dessai (cf. chapitre 6.4). - Inoculer 100 ml du milieu TSB avec 10 ml de lchantillon dessai. - Mlanger. - incuber 30-35 C pendant 18-24 heurs (pr-enrichissement). - Aprs incubation, homogniser puis transfrer 1 ml du bouillon pour inoculer 100 ml du bouillon Mac Conkey (enrichissement). - Incuber 42 - 44 C pendant 24 h. - Aprs incubation, effectuer des subcultures sur milieu glos Mac Conkey. - Incuber 30 35 C pendant 18-48 h. - Effectuer un contrle ngatif. Lecture et interprtation : - Lapparition des colonies couleur jaune sur milieu glos Mac Conkey indique la prsence possible dE. coli, confirmer par le test de confirmation. Remarque : Le test de confirmation consiste identifier les germes par des tests complmentaires, par exemple test de production dindole et production du gaz ou on se contente directement une identification biochimique (galeries classiques ou Api) 6.6. 6.7. Recherche des salmonelles

Test de prsomption : Prparer lchantillon dessai (cf. chapitre 7.4). Utiliser toute la quantit (100 ml) pour inoculer 200 ml du bouillon TSB. Homogniser et incuber 30 35 C pendant 18-24h (pr-enrichissement). Aprs incubation, transfrer 0,1 ml et ensemencer 10 ml de Tetrathionate bile vert brillant (milieu liquide I) ou un autre milieu denrichissement des salmonelles (ex : le milieu SFB). Incuber 30 35 C pendant 18-24h. Aprs incubation, effectuer des subcultures sur le milieu solide K (milieu slectif XLD) et/ou dautres milieux slectifs. incuber 30 35 C pendant 18 48 h. Raliser un contrle ngatif.

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Lecture et interprtation des rsultats : - La prsence possible de Salmonelles sur le milieu glos K est indique par lapparition des colonies bien dveloppes, rouge, avec ou sans centre noir confirmer par le test de confirmation. Remarque : Le test de confirmation consiste ensemencer des colonies suspectes (5 colonies au minimum) sur le milieu glos TSI ou on se contente directement une identification biochimique (galeries classiques ou rapides). Lecture sur TSI : Les colonies de salmonelles apparaissent en profondeur et non pas en surface avec virage de rouge au jaune gnralement accompagn dune formation du gaz et avec ou sans production de H2S. 6.8. Recherche de Pseudomonas aeruginosa Mode opratoire : - Prparer lchantillon dessai (cf. chapitre 7.4.). - Ensemencer 100 ml de milieu liquide aux peptones de casine et de soja avec 10 ml de lchantillon dessai. - Homogniser. - Incuber 30 35 C pendant 18-24h. - Aprs incubation, effectuer des subcultures sur milieu glos Ctrimide. - Incuber 30 35 C pendant 18-48h. Lecture et interprtation : - Lapparition des colonies indique la prsence possible de Pseudomonas aeruginosa confirmer par le test de confirmation, pour cela : - Ensemencer le milieu liquide aux peptones de casine et de soja avec une partie de colonies morphologiquement diffrentes. - Incuber 41C pendant 18-24h pour augmenter la slectivit. Lexcipient est satisfait lessai sil ny a pas de croissance 41C. - Sil ya une croissance, procder des tests de confirmation ou une identification biochimique complte. 6.9. Recherche de Staphylococcus aureus Mode opratoire : Prparer lchantillon dessai (cf. chapitre 6.4.). Ensemencer 100 ml de milieu liquide TSB avec 10 ml de lchantillon dessai Homogniser.
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Incuber 30 - 35C pendant 18-48h. Effectuer des subcultures sur milieu glos Baird Parker (ou Chapman). Incuber 30 35 C pendant 18-48h. Effectuer un contrle ngatif.

Lecture et interprtation : - La prsence possible de Staphylococcus aureus sur le milieu glos Baird Parker est indique par la croissance de colonies noires brillantes entoures dun halo clair confirmer par des tests confirmatifs comme la recherche de coagulase.

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7. Annexes
Annexe 01 : normes

Germe cible

FAMT LM Escherichia coli Salmonelles Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

* : moyenne < 01 UFC/g

1000 UFC/g 100 UFC/g

00 UFC/g 00 UFC/10g 00 UFC/g 00 UFC/g

2000 UFC/g 200 UFC/g < 01 UFC/g* 00 UFC/10g < 01 UFC/g* < 01 UFC/g*

Annexe 02: plan dchantillonnage

Germes cibles

Quantit dexcipient minimale prlever pour un test 40 g 20 g 20 g 20 g 20 g

FAMT et LM Escherichia coli Salmonelles Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

1 1 0 1 1

Annexe 03 : Fiche de rsultats

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