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ORIGINALES Implicacin de los polimorfismos C677T y A1298C del gen MTHFR en el desarrollo de los defectos del tubo neural

en la poblacin espaola
Jos Ignacio Gutirrez Revillaa, Flora Prez Hernndezb, M. Teresa Calvo Martna, Manuel Tamparillas Salvadora y Jess Gracia Romeroc
a b c

50.086

Seccin de Gentica. Servicio de Bioqumica Clnica. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. Espaa. Farmacutica de Atencin Primaria. Gerencia Santander-Laredo. Espaa. Servicio de Ciruga Peditrica. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. Espaa.

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La etiologa de los defectos de tubo neural (DTN) es multifactorial. La presencia del genotipo mutado para los polimorfismos C677T y A1298C y su heterocigosidad combinada se han considerado factores de riesgo en determinadas poblaciones. SUJETOS Y MTODO: El estudio de casos y controles estuvo formado por 159 controles sanos, 27 pacientes afectados de espina bfida, 28 madres y 23 hermanos de pacientes con espina bfida. El estudio de los polimorfismos se realiz mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y digestin de los fragmentos obtenidos con las enzimas de restriccin Hind I (C677T) y MboII (A1298C). RESULTADOS: No se han encontrado diferencias estadsticamente significativas (p = 0,991) entre la prevalencia de los genotipos C677T del grupo control (CC: 35%; CT: 50%, y TT: 15%) y los obtenidos en el grupo de pacientes (37, 52 y 11%, respectivamente), grupo de madres de pacientes (39, 50 y 11%, respectivamente) y grupo de hermanos de pacientes (35, 48 y 17%, respectivamente). Asimismo, la prevalencia de los genotipos A1298C dentro del grupo control (AA: 49%; AC: 45%, y CC: 6%) fue similar (p = 0,917) a la encontrada en el grupo de pacientes (41, 56 y 4%, respectivamente), grupo de madres de pacientes (43, 50 y 7%, respectivamente) y grupo de hermanos de pacientes (52, 39 y 9%, respectivamente). CONCLUSIONES: La ausencia de diferencias estadsticamente significativas de los dos polimorfismos estudiados en los distintos grupos hace concluir que stos no participan en la etiologa de los DTN en la poblacin espaola. Palabras clave: Defectos del tubo neural. Metilentetrahidrofolato reductasa. C677T. A1298C.

C677T and A1298C MTHFR polymorphisms in the etiology of neural tube defects in Spanish population
BACKGROUND AND OBJECTIVE: The etiology of neural tube defects (NTDs) is multifactorial. The presence of mutated genotypes of C677T and A1298C polymorphisms, and their combined heterozygosity, have been considered risk factors for the occurrence and recurrence of NTDs in some populations. SUBJECTS AND METHOD: This case-control study included 159 healthy controls, 27 NTDs patients, 28 patients mothers and 23 siblings. The polymorphism study was performed by PCR. For fragment digestion, we used the restriction enzymes Hinf I (C677T) and Mbo II (A1298C). RESULTS: There was no significant difference (p = 0.991) in C677T genotypes between controls (CC: 35%, CT: 50% and TT: 15%) and patients (37, 52 and 11%, respectively), patients mothers (39, 50 and 11%, respectively) and siblings (35, 48 and 17%, respectively). The prevalence of A1298C genotypes in controls (AA: 49%, AC: 45% and CC: 6%) was similar (p = 0.917) to the prevalence in patients (41, 56 and 4%, respectively), patients mothers (43, 50 and 7%, respectively) and siblings (52, 39 and 9%, respectively). CONCLUSIONS: The absence of differences in the two polymorphisms between these groups makes us conclude that there is no association with NTDs in the Spanish population. Key words: Neural tube defects. Metilentetrahidrofolate reductase. C677T. A1298C.

Correspondencia: Dr. J.I. Gutirrez Revilla. Seccin de Gentica. Servicio de Bioqumica Clnica. Hospital Universitario Miguel Servet. P.o Isabel la Catlica, 1 y 3. 50009 Zaragoza. Espaa. Correo electrnico: joseignaciogutierrez@redfarma.org Recibido el 27-8-2002; aceptado para su publicacin el 12-11-2002.

Un gen implicado en la etiologa de los defectos del tubo neural (DTN) es el codificante de la enzima N5,N10-metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), que participa en el metabolismo del folato y la homocistena, y se localiza en el brazo corto del cromosoma 1 (1p36.3)1. La MTHFR cataliza la reduccin de N5,N10metilentetrahidrofolato (est principalmente dentro de la clula) a N5-metiltetrahidrofolato, forma predominante de folato en la circulacin y donante de carbonos para la remetilacin de homocistena a metionina2. En condiciones fisiolgicas la reaccin es irreversible y su actividad est regulada por la concentracin de S-adenosil metionina (SAM). El dficit hereditario de MTHFR es una de las causas de homocistinuria, en general, menos grave que la observada en la homocistinuria clsica por deficiencia de la cistationina--sintasa (CBS). En 1994 Goyette et al1 aislaron el ADNc del gen MTHFR, en el que descubrieron 9 mutaciones3, y entre ellas identificaron una variante polimrfica en la posicin nucleotdica 677, que consista en un cambio de base de citosina a timina produciendo la sustitucin de alanina (GCC) por valina (GTC); denominaron a dicho polimorfismo Ala225Val (mutacin missence). Este defecto congnito tambin fue confirmado por Whitehead et al4 y Van der Put et al5. Adems, existe la hiptesis de que la regin del MTHFR que est relacionada con esta mutacin se halla implicada en la unin al folato y que la presencia de folato puede estabilizar a la enzima3. Entre un 5 y un 15% de las personas normales son homocigotas para la mutacin C677T en el gen MTHFR2,3,6,8. Esta variante est relacionada con un incremento de la homocistena en el suero9-11 y una redistribucin de los folatos, con aumento de los folatos en hemates2,12, folato en plasma disminuido (en el lmite bajo del intervalo de normalidad)2,13,14, y concentraciones bajas de cistena en plasma. Esta situacin tiene como consecuencia
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PM

CC

TT

TT

CC

CT

CT

CT 198 pb

175 pb

Fig. 1. Producto de la digestin del fragmento de 198 pb en el estudio de la mutacin C677T. PM: peso molecular. *No es visible la banda de 23 pb.

un riesgo aumentado de padecer una enfermedad cardiovascular, un riesgo de tres a 7,2 veces mayor de tener descendencia afectada de DTN2-5,8,15-17, as como su posible implicacin en enfermedades como la esquizofrenia, depresin y cncer18,19. Se ha descubierto una nueva mutacin en el gen MTHFR, la A1298C, que cambia un glutamato por una alanina20-23. Como resultado de esta mutacin se produce un descenso en la actividad de la enzima MTHFR, aunque ni el estado homocigoto ni el heterocigoto estn asociados con el aumento de la concentracin plasmtica de homocistena o disminucin de la concentracin de folato en plasma, fenmeno que es evidente en estado homocigoto 677TT. Sin embargo, parece haber una interaccin entre estas dos mutaciones. La heterocigosidad combinada para las mutaciones A1298C y C677T est asociada con una reduccin de la actividad especfica de la enzima MTHFR, homocistena elevada y descenso en las concentraciones plasmticas de

folato20,24. De esta forma, se producen unas caractersticas similares a las observadas en individuos homocigotos para la mutacin C677T, lo que induce a pensar que est relacionada con una proporcin de los DTN, que no son explicados por homocigosidad de la mutacin C677T y puede ser un factor de riesgo gentico adicional para DTN22, aunque existen otros estudios en los que no se ha encontrado tal relacin23. La mutacin C677T en el gen MTHFR y, secundariamente, las concentraciones altas de homocistena pueden contribuir al desarrollo de DTN cuando est presente tanto en la madre como en el hijo22. Esta mutacin aumenta la dependencia de cido flico para la adecuada remetilacin, debido a la reducida actividad enzimtica. Segn algunos estudios, los individuos portadores deberan aumentar la ingesta de cido flico para mantener las concentraciones normales de folato en plasma, en los hemates y las tasas de remetilacin, especialmente en perodos de

rpido crecimiento16,25. Alrededor de un 12% de los casos de DTN pueden ser atribuidos a la mutacin homocigota4,8 o un 27,4% como mximo5. Estos porcentajes estn por debajo de la tasa de reduccin del 70% de los casos de DTN debido a la suplementacin con cido flico. Este hecho claramente indica que, adems de la enzima MTHFR, existen otras enzimas implicadas en el metabolismo de la homocistena mediado por folato que podran participar en la etiologa de los DTN. El objetivo del presente trabajo ha sido demostrar la ausencia de participacin de los dos polimorfismos estudiados (C677T y A1298C) en la etiologa de los DTN en la poblacin espaola. Esta hiptesis se basa en las diferencias existentes en la prevalencia de ambos polimorfismos entre distintas reas geogrficas. En los pases del sur de Europa, su prevalencia es mayor en la poblacin general, aunque por la dieta existente su efecto puede estar enmascarado. Adems, el estudio no slo se ha centrado en los pacientes afectados de DTN y en individuos control, sino que se han introducido otros dos grupos de casos (madres de hijos afectados y hermanos de pacientes) con el fin de demostrar si la prevalencia de los dos polimorfismos era la misma que en la poblacin general. Sujetos y mtodo
Sujetos de estudio Se ha realizado un estudio de casos y controles. El grupo control estuvo formado por 159 varones y mujeres sanos, seleccionados entre las personas que llegaron al Servicio de Bioqumica Clnica del Hospital Universitario Miguel Servet de Zaragoza. Hubo una serie de factores de exclusin, como raza distinta de la caucsica, padecimiento de enfermedades vasculares (infarto de miocardio, trombopatas, etc.) y presencia de historia familiar de DTN. El grupo de pacientes y familiares estuvo formado por 27 pacientes afectados de espina bfida, 28 madres y 23 hermanos de pacientes con espina bfida procedentes de familias no emparentadas. Con la incorporacin del grupo de madres y hermanos se trat de buscar la posible existencia de diferencias en la prevalencia de ambos polimorfismos con respecto al grupo control, que explicaran su posible participacin en la etiologa de los DTN, ya que su herencia es de tipo mendeliano. Al conjunto de participantes se les inform de los propsitos del estudio mediante una charla informativa y se les pidi el consentimiento escrito para la utilizacin de las muestras biolgicas. Adems, el estudio fue aprobado por el Comit tico del hospital. Especmenes

60 50 Porcentaje 40 30 20 10 0

Controles Porcentaje
50 35

60 50 40 30 20 10 0

Pacientes
52

37

15

11

CC 60 50 Porcentaje 40 30 20 10 0 CC
39

CT C677T

TT 50

CC

CT C677T
48

TT

Madres Porcentaje
50

Hermanos

40 30 20
17 11 35

10 0

CT C677T

TT

CC

CT C677T

TT

Fig. 2. Prevalencia de los genotipos del polimorfismo C677T en las poblaciones estudiadas.

La extraccin de sangre se realiz en tubo con anticoagulante (EDTA tripotsico) y con sistema de vaco. La recoleccin y el almacenamiento de las muestras se llevaron a cabo de la misma forma en los controles, pacientes, madres de hijo afectado y hermanos de afectados. Cada muestra fue etiquetada con un nmero, que impidi saber en el momento del anlisis a qu categora perteneca (doble ciego). La extraccin de ADN se efectu mediante mtodos convencionales, mientras que el anlisis de los polimorfismos C677T y A1298C se realiz segn los mtodos descritos por Frosst et al3 y Van der Put et al22, respectivamente. La mutacin C677T crea una diana de restriccin para la enzima de restriccin Hinf I,

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que fue confirmada por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN genmico (PTC-100TM Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc.), seguido por un anlisis con la enzima de restriccin Hinf I en gel de agarosa al 3% teido con bromuro de etidio. Por otro lado, la mutacin A1298C elimina una diana de restriccin para la enzima de restriccin Mbo II, utilizando para su anlisis el mismo procedimiento que en el caso anterior. Anlisis estadstico Para el anlisis de las variables se han calculado las frecuencias absolutas y relativas. La comparacin entre las frecuencias relativas se ha llevado a cabo mediante la prueba de la 2, considerando valores estadsticamente significativos cuando la diferencia entre las variables tuvo un valor de p < 0,05. Los clculos estadsticos se realizaron con el programa SPSS para Windows (versin 10.0). Fig. 3. Producto de la digestin del fragmento de 163 pb en el estudio de la mutacin A1298C. PM: peso molecular. *No es visible la banda de 18 pb.

PM

AC

AA

CC

AA

AA

AC

AC

84 pb 56 pb 30/31 pb

Resultado La mutacin C677T crea una diana de restriccin para la enzima Hinf I, que permite la digestin del fragmento silvestre de 198 pb en fragmentos de 175 y 23 pb, tal como aparece representado en la figura 1. Las personas con genotipo CC presentan una sola banda a 198 pb, mientras que en el genotipo CT aparecen tres fragmentos de 198, 175 y 23 pb. Por ltimo, el genotipo homocigoto mutado TT presenta dos bandas de 175 y 23 pb. En la figura 2 se representan las frecuencias relativas de los genotipos obtenidos del polimorfismo C677T en funcin de los grupos estudiados. No se observaron diferencias estadsticamente significativas en la distribucin de los genotipos segn el grupo de estudio (p = 0,991). Por otra parte, la mutacin A1298C elimina una diana de restriccin para la enzima de restriccin Mbo II, por lo que el fragmento de PCR amplificado de 163 pb slo digiri en individuos portadores del alelo A. Los genotipos fueron clasificados por la presencia de 4 bandas de 56, 31, 30 y 18 pb (genotipo AA), 4 bandas de 84, 31, 30 y 18 pb (genotipo AC) y 5 bandas de 84, 56, 31, 30 y 18 pb (genotipo CC), tal como aparece representado en la figura 3. Al igual que suceda en el caso del polimorfismo C677T, en la figura 4 se observa cmo la distribucin de las frecuencias relativas de los genotipos no dependa del grupo de estudio (p = 0,917). El estudio estadstico comparativo de la prevalencia de ambas mutaciones en conjunto dependiendo de los grupos no pudo llevarse a cabo debido al reducido tamao de algunos de ellos, que podran dar lugar a la aparicin de relaciones espurias. En la tabla 1 se recogen las frecuencias absolutas y relativas de la clasificacin de las poblaciones de estudio en funcin de los genotipos para ambas mutaciones. Se observ que los individuos con genotipo 1298CC siempre presentaban genotipo 677CC, lo que confirma que los alelos 677T y 1298C estn siem-

pre en trans, adems de que 1298C no aparece nunca en el alelo 677C. Finalmente, se estudi la transferencia de los alelos 677T y 1298C de los padres a los hijos con DTN, encontrndose que la frecuencia de distribucin genotpica para ambas mutaciones cumpla la prueba de Hardy-Weinberg (datos no expuestos). TABLA 1

Discusin En el presente trabajo no se ha encontrado asociacin entre los genotipos 677TT y 1298CC con la aparicin de DTN en las poblaciones estudiadas. Existen al menos 4 estudios, realizados en Holanda2, Irlanda4,8, Italia6 y Norteamrica15, en los que se ha encontrado aso-

Tabla de contingencia de los polimorfismos C677T y A1298C en los grupos estudiados


A1298C AA AC CC

Controles Pacientes Madres Hermanos

C677T C677T C677T C677T

CC CT TT CC CT TT CC CT TT CC CT TT

10,1% (16) 23,9% (38) 15,1% (24) 11,1% (3) 18,5% (5) 11,1% (3) 14,3% (4) 21,4% (6) 7,1% (2) 4,3% (1) 30,4% (7) 17,4% (4)

18,9% (30) 25,6% (41) ND 22,2% (6) 33,3% (9) ND 17,9% (5) 28,6% (8) 3,6% (1) 21,7% (5) 17,4% (4) ND

6,3% (10) ND ND 3,7% (1) ND ND 7,1% (2) ND ND 8,7% (2) ND ND

Entre parntesis se indica el nmero de sujetos. ND: no detectado.

60 50 Porcentaje 40 30 20 10 0

Controles
45

60 50 Porcentaje

Pacientes
56 41

49

40 30 20 10

0 AA 60 AC A1298C

AA 60 50 Porcentaje 40 30 20 10 0 AA
43

AC A1298C

CC

CC

Madres
50

Hermanos
52 39

50 Porcentaje 40 30 20 10
7

0 AC A1298C CC AA AC A1298C CC

Fig. 4. Prevalencia de los genotipos del polimorfismo A1298C en las poblaciones estudiadas. Med Clin (Barc) 2003;120(12):441-5

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ciacin entre el polimorfismo C677T y la aparicin de DTN. Sin embargo, en otros 5 estudios, llevados a cabo en Reino Unido7, Francia26, Turqua27, Alemania28 y Norteamrica29, no se ha encontrado tal asociacin. El genotipo 677TT podra por tanto ser el principal factor de riesgo de presentar DTN en algunas poblaciones y no en otras. En el presente estudio tampoco se han podido establecer diferencias estadsticamente significativas en la prevalencia de los genotipos C677T en funcin de los grupos de estudio, ya que las prevalencias resultaron ser similares en los pacientes afectados de DTN, as como en sus madres y hermanos con respecto al grupo control. Es curioso que en poblaciones donde el polimorfismo C677T se ha implicado en la susceptibilidad a DTN la frecuencia del alelo 677T en el grupo control es relativamente baja (Holanda, p = 0,26; Irlanda, p = 0,28), mientras que en el Reino Unido es ms alta (p = 0,36)7. Una de las posibles explicaciones dadas a este hecho es la correcta eleccin del grupo control y las variaciones geogrficas existentes en la frecuencia de distribucin del alelo 677T7, por lo que en el presente estudio se ha recogido una muestra lo ms representativa posible de la poblacin de estudio. Por una parte, se ha incluido a personas dentro de todo el abanico de edades (3 meses hasta 85 aos), siendo la composicin por sexo lo ms parecida a la poblacin real (49% varones y 51% mujeres). Adems, debido a las variaciones tnicas descritas, todas las personas que compusieron el grupo control eran de raza caucsica. Con el fin de evitar la influencia de otra serie de enfermedades en la prevalencia de ambas mutaciones, se ha excluido a personas para las que se hubiera descrito algn tipo de enfermedad que pudiera tener alguna influencia en el momento del estudio. La eleccin de los controles fue adecuada, a diferencia de lo atribuido a los estudios realizados en Holanda5 e Irlanda4,8, donde se encontr asociacin entre el genotipo 677TT y la aparicin de DTN, pero las poblaciones eran homogneas tanto en el grupo de casos como en los controles29. La frecuencia del genotipo 677TT en individuos sanos vara geogrficamente en Europa, desde un 6-10% en los pases del norte a un 13-18% en la poblacin mediterrnea20. En el presente estudio la prevalencia de la mutacin C677T (p = 15,1%) observada en la muestra control es comparable a la encontrada por otros autores en la poblacin alemana28, britnica7, francesa26, turca27, italiana6 y americana19,29. Si la asociacin entre la homocigosidad C677T y DTN fuera una sola causa, esta causa podra explicar el 19% de todos los DTN, o cerca del 40-50% de DTN que son prevenibles mediante cido flico. La

enzima MTHFR termolbil, como factor de riesgo, puede explicar las concentraciones anormales de homocistena encontradas en embarazos afectados. Sin embargo, el genotipo no puede ser solamente el determinante crtico del resultado final, pero s el efecto interactivo entre el genotipo y el estado de folato, como recientemente se ha planteado30. El genotipo TT influye en las concentraciones de homocistena slo cuando las de folato estn por debajo del valor medio. Este efecto interactivo gentico-nutriente es consistente con el modelo multifactorial propuesto para los DTN y apunta a un mecanismo por el cual el cido flico puede salvar la predisposicin gentica a este desarrollo mental anmalo. La mutacin A1298C influye en la actividad especfica de la enzima MTHFR y en las concentraciones de folato y homocistena, pero en menor medida que la mutacin C677T, por lo que se considera un factor de riesgo menor22, siendo especialmente importante en condiciones de baja ingesta de folato o cuando los requerimientos de ste sean altos. En el presente estudio, la prevalencia del genotipo 1298CC en la poblacin control fue relativamente baja (p = 6,3%), aunque estos resultados no difieren de los obtenidos en otros estudios22,23. Sin embargo, al igual que en el estudio publicado por Barber et al23, no se ha encontrado asociacin entre la presencia del genotipo mutado 1298CC y la aparicin de DTN. Adems, algunos autores establecen que la heterocigosidad combinada para ambas mutaciones provoca una disminucin en la actividad de la enzima MTHFR mayor que la obtenida para las formas heterocigotas por separado, produciendo unas concentraciones plasmticas altas de homocistena y bajas de folato22. Esta situacin podra considerarse un factor de riesgo adicional en la aparicin de DTN, aunque en el presente estudio no se han encontrado diferencias estadsticamente significativas en la prevalencia de las dos formas heterocigotas asociadas en funcin del grupo de estudio (tabla 1). Por otro lado, la ausencia del haplotipo 677TT/1298CC viene a confirmar que los alelos 677T y 1298C estn siempre en trans, adems de que 1298C no aparece nunca en el alelo 677C. Este hecho confirma los resultados aportados por otros autores como Van der Put et al22, Barber et al23 y Urano et al24. Los estudios en los que se ha encontrado relacin entre la presencia de mutacin C677T y A1298C en el gen MTHFR, se han realizado en pases con una prevalencia de DTN alta y sobre todo en pases del norte de Europa2,4,5,15. Por el contrario, en pases con una prevalencia menor no se han encontrado esas asociaciones6,7,23,29. Una posible explicacin es la

presencia de factores medioambientales, como los hbitos dietticos, que pudiesen ser la causa de tales diferencias. Las dietas ricas en alimentos con folato, seguidas en pases del rea mediterrnea, podran ser suficientes para prevenir los DTN sensibles al cido flico y aparecer slo aquellos cuya etiologa se desconoce. Adems, debido a que los polimorfismos C677T y A1298C no explican el total de casos de DTN sensibles a la prevencin periconcepcional con cido flico, debe de existir otra serie de mutaciones en el gen MTHFR o en otros genes relacionados con el metabolismo del cido flico que expliquen su efecto protector.

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