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Clasificacin de los microorganismos atreves del tiempo

Reino vegetal- rgida Reino animal- flexible Los microorganismos estaban en el reino vegetal. Del S.XVII pasamos al S.XXI en el que hay tres reinos o dominios que son: Dominios archaea- procariotas Dominios bacteria- procariotas Dominios eukaya- eucariota Los microorganismos estn incluidos en los tres dominios. Las archaeas estn formadas por microorganismos procariotas en habitats muy extremos. Desde el punto de vista evolutivo tendramos que por un lado habran evolucionado las bacterias y por otro lado las archaea y eucariotas. Diferencias entre procariotas y eucariotas. Las procariotas carecen de compartimentalizacin de funciones, carecen demembrana y de retculo endoplasmtico. Presentan notables diferencias entre los mecanismos de sntesis de protenas. Los procariotas presentan ribosomas de 70s y los eucariotas de 80s (s=coeficientede sedimentacin). Mayor simplicidad en la organizacin del material gentico. Los eucariotas tienen ms de 1 cromosoma y los procariotas solo uno que puede ser circular o lineal. Los procariotas tienen una sola histona y las eucariotas varias. Tambin hay diferencias en la divisin celular, las eucariotas tienen un proceso complejo y en los procariotas es muy sencillo y se define como fisin binaria o escisin simple. Los procariotas tienen pared protectora exterior de murena y las eucariotas solo tienen los vegetales y son de celulosa. MORFOLOGA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS. Tipos de morfologa. Coco (esfrica) Bacilo (alargada) Espiroqueta Espirilo Gemadoras o bacterias con apndices Filamentosas Tamao de las bacterias. El tamao medio de las bacterias es aproximadamente de 2 micras. Superficie/volumen de los procariotas es> que las de los eucariotas. Esto hace que los procariotas tengan mayor superficie para sus funciones metablicas y estas funciones son: Para transportar nutrientes al interior Para eliminar sustancias de desecho al exterior.

Esto es importante porque los procariotas pueden crecer mucho ms que los eucariotas y se pueden obtener densidades de poblacin mucho ms grandes.

Importancia de la microbiologa

La Microbiologa es una ciencia biolgica extraordinariamente relevante para la humanidad, dado que los microorganismos estn presentes en todos los hbitats y ecosistemas de la Tierra y sus actividades presentan una gran incidencia en numerossimos mbitos de inters: Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la evolucin, y constituyen seguramente la mayor parte de la biomasa de nuestro planeta. Se calcula que slo hemos descrito menos del 10% de los microorganismos existentes, por lo que los bilogos tienen una gran tarea por delante para estudiar esta parte de la biodiversidad. Las actividades microbianas sustentan los ciclos biogeoqumicos de la Tierra: los ciclos del carbono, del nitrgeno, del azufre o del fsforo dependen de modo fundamental de los microorganismos. Las actividades metablicas microbianas son excepcionalmente variadas, siendo algunas de ellas exclusivas del mundo procaritico. La biolologa bsica tiene aqu un gran campo de estudio. El aspecto aplicado y la incidencia econmica y social de los microorganismos ingentes, y aqu hay unas breves pinceladas: Aspectos beneficiosos: Todas las culturas desarrollaron de modo emprico multitud de bebibas y alimentos derivados de fermentaciones microbianas: vino, cerveza, pan, verduras fermentadas, etc. Produccin de multitud de productos industriales: alcoholes, cidos orgnicos, antibiticos, enzimas, polmeros, etc. La ingeniera gentica empez con los microorganismos, que siguen desempeando un papel fundamental en la nueva generacin de medicamentos recombinantes y de terapias novedosas.

En su aspecto perjudicial, la Microbiologa dedica una especial atencin a los microorganismos patgenos, sobre todo a los que afectan a la humanidad.

Las enfermedades microbianas han sido causa de grandes males a nuestra especie.

Baste recordar que la peste (muerte negra) caus a mediados del siglo XIV la muerte de la tercera parte de la poblacin europea, y ya en la primera mitad del siglo XV lleg a afectar a ms del 75%. Basta leer la literatura o ver las pinturas de la poca para darse cuenta del impacto terrorfico que supuso, lo que a su vez supuso un factor esencial en el surgimiento de las ideas del Renacimiento. Desde la poca del descubrimiento de Amrica, las exploraciones han conllevado el intenso trasiego de agentes patgenos de un lugar a otro. La desaparicin de buena parte de la poblacin indgena se debi en buena parte a no tener defensas frente a la viruela europea, pero a su vez los descubridores importaron la sfilis a Europa. No hace falta resaltar el papel que ha tenido la microbiologa mdica, desde la poca de Pasteur y Koch, en la lucha contra las enfermedades infecciosas (antisepsia, desinfeccin, esterilizacin, quimioterapia). Y aunque ahora tengamos nuevos retos (SIDA, fiebres hemorrgicas, etc.), no cabe duda de que la Microbiologa est contribuyendo a no perder esta permanente batalla contra los grmenes patgenos. Aparte de todas estas actividades de los microorganismos sobre los humanos, hay que tener en cuenta que existen grmenes que afectan a animales, plantas, instalaciones industriales, que afectan a alimentos, etc., representando otras tantas reas de atencin para la Microbiologa.

Perspectivas de la microbiologa a nivel mundial y nacional

En la actualidad, el comercio internacional de alimentos representa una actividad cada vez ms importante en la provisin de regmenes alimentarios inocuos y nutritivos para las poblaciones del mundo. Este comercio internacional genera adems un beneficio doble, no solamente introduce una mayor variedad de productos en la oferta alimentaria aumentando las posibilidades de eleccin de los consumidores, sino que tambin proporciona divisas a los pases exportadores. Sin embargo, esta situacin ha aumentado las posibilidades de transmisin de agentes infecciosos y pone de relieve la necesidad de adoptar un criterio internacional, para estimar el riesgo potencial de estos patgenos microbianos y establecer las medidas apropiadas para su reduccin y/o eliminacin. Ms de tres millones de personas mueren anualmente de enfermedades diarreicas, mientras que cientos de millones padecen episodios frecuentes de diarrea y sus consecuencias debilitantes. Son motivo de preocupacin especial, los alcances y la naturaleza potencialmente mortal de tales enfermedades en los grupos sensibles de la poblacin (infantes, ancianos, embarazadas e inmunodeprimidos) principalmente de los pases en desarrollo. El mundo ha experimentado un aumento continuo de la incidencia de las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) y es probable que la carga mayor de ellas recaiga sobre los pases en desarrollo. Junto a esto es necesario considerar grandes prdidas econmicas, por alteracin de alimentos causada por el desarrollo de microorganismos de carcter alterador. Esto afecta no slo a la

exportacin de productos alimenticios, sino que tambin a nivel regional, donde adems del costo monetario que esto implica, se disminuye considerablemente la oferta de alimentos. La Microbiologa de los Alimentos se ha transformado en una herramienta de gran utilidad y se perfila como una ciencia en evolucin permanente destinada a solucionar los problemas anteriormente mencionados, a travs de metodologas cada da ms avanzadas y eficaces.

METODOS DE ESTERILIZACION
Mtodos qumicos
Son aquellos que involucran el empleo de sustancias letales para los microorganismos, como el xido de etileno y el etanol. Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Elimina los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles (goma, plstico, papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es peligroso por ser altamente inflamable, explosivo y adems cancergeno. Con aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehdo: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc. Formaldehdo: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodn, que despus pueden ser expuestas al calor para una rpida esterilizacin (accin del gas formaldehdo). Tambin pueden ser usadas en estufas de formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60 C y pueden esterilizar materiales de ltex, goma, plsticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs. Esterilizacin por gas-plasma de Perxido de Hidrgeno, es proceso de esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin de perxido de hidrgeno en fase plasma (estado entre lquido y gas), que ejerce la accin biocida.

Mtodos fsicos
Son aquellos que no involucran el empleo de sustancias letales para los m.o.s, sino procedimientos fsicos como la radiacin ionizante, el calor o la ultrafiltracin de soluciones con membranas que impiden el paso de m.o.s, incluyendo virus. Calor La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: El tiempo de la temperatura. Todos los m.o.s son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Hmedo: Produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: *El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua. *El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Autoclave Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. Equipo: Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metlica, que en la parte inferior recibe calor por combustin de gas o por una resistencia elctrica, esta se cierra en la parte superior por una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manmetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, para una vlvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte. Tyndalizacin Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndal. Las bacterias que resisten una sesin de calefaccin, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operacin se repite con intervalos separados y en varias sesiones. Se efecta por medio de autoclave de Chamberland, dejando abierta la vlvula de

escape, o sea funcionando a la presin normal. Puede tambin realizarse a temperaturas ms bajas, 56 u 80 ocupara evitar la descomposicin de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas. Calor seco: Produce desecacin de la clula, es esto txico por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los m.o.s. que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Estufas Doble cmara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cmaras, a temperatura de 170 C para el instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito elctrico. Ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se utiliza para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. Rayos Ultravioletas: Afectan a las molculas de DNA de los m.o.s. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en quirfanos. Rayos Gamma: Su empleo est basado en los conocimientos sobre la energa atmica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos. Filtracin Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice. La filtracin se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolbiles. Se usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftlmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnsticas, radiofrmacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibiticos y vitaminas. Existen tres tipos bsicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de profundidad:

Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las partculas se produce por una combinacin de absorcin y de retencin mecnica en la matriz. Membranas filtrantes:

Tienen una estructura continua, y la retencin se debe principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostticos. Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo):

Son pelculas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiacin y sustancias qumicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partcula con un tamao mayor al del poro.

Pruebas Bioqumicas
Consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos m.o.s. presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Prueba de la Oxidasa El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Procedimiento: Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra.

Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli Prueba de la Catalasa El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2). Prodecimiento: Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacin tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercarse a la muestra de la solucin liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta. La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus ( - ) Streptococcus spp. Prueba de la Coagulasa La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar m.o.s. del genero Staphylococcus. Procedimiento: Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazn) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidroflico y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeos cogulos no organizados

2: pequeos cogulos organizados 3: gran cogulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus ( - ) Staphylococcus epidermis. Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro) El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas

bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre. Procedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. Del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados: Pico alcalino/fondo alcalino: no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp.

Pico alcalino/fondo cido: fermentadas. Shigella spp.


Glucosa

fermentada,

lactosa

ni

sacarosa

Pico alcalino/fondo negro: Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentada, produccin de cido sulfhdrico. Salmonella spp.

Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.

Pruebas Bioqumicas IMViC:


Agar Citrato La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. ( - ) Escherichia Coli Indol El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano. Procedimiento: Inocular el caldo triptfano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interface del

reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Klebsiella pneumoniae Rojo Metilo Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes