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ELECTROFORESIS DE DIGERIDOS CON ENZIMAS DE RESTRICCION
ELECTROFORESIS DE
DIGERIDOS CON ENZIMAS
DE RESTRICCION

ADRIANA MARIA GIL ZAPATA

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
ELECTROFORESIS DE DIGERIDOS CON ENZIMAS DE RESTRICCION ADRIANA MARIA GIL ZAPATA Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

ENZIMAS DE RESTRICCIÒN

ENZIMAS DE RESTRICCIÒN

SECUENCIAS

PALINDRÓMICAS
PALINDRÓMICAS
SECUENCIAS PALINDRÓMICAS EcoRI 5’ -GAATTC- 3’ 3’ -CTTAAG- 5 ’ hidroliza los enlaces fosfodiéster que unen

EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5 ’

hidroliza los enlaces fosfodiéster que unen las bases G y A de cada hebra, de este modo los cortes que crea son escalonados y dan lugar a la formación de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta región monocatenaria que resultará complementaria a las de los otros fragmentos.

Polimorfismos de longitud de Fragmentos de Restriccion (RFLP „s)

Polimorfismos de longitud de Fragmentos de Restriccion (RFLP„s)

Polimorfismos de longitud de Fragmentos de Restriccion (RFLP „s)
ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO I Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO I

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO I Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia

Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia específica de ADN, metila y restringe.

Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II

La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en genética molecular

puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar

secuencias conocidas.

ENZIMAS DE RESTRICCION

TIPO II

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II

ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y

rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.

ENZIMAS DE RESTRICCION

  • Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

  • Se han identificado más de 200 endonucleasas de restricción. http://www.neb.com/nebecomm/products/category

1.asp

ENZIMAS DE RESTRICCION

  • Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes:

  • A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I.

  • B. Cortes Romos (Desoxinucleotidil transferasa

terminal).

ENZIMAS DE RESTRICCION

ENZIMAS DE RESTRICCION

EXTREMOS PEGAJOSOS O

COHESIVOS

EXTREMOS PEGAJOSOS O COHESIVOS

EXTREMOS ROMOS

EXTREMOS ROMOS

CORTES ENZIMAS DE RESTRICCION

CORTES ENZIMAS DE RESTRICCION
APLICACIONES ENZIMAS DE RESTRICCION
APLICACIONES ENZIMAS DE
RESTRICCION
  • Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

  • Fragmentar DNA genómico para separación de

electroforesis y “Southern Blot”.

  • Generación de fragmentos para ser usados

como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.

  • Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

APLICACIONES ENZIMAS DE

RESTRICCION
RESTRICCION
  • Desarrollo ADN Recombinante y biotecnologia.

  • Mecanismos de regulación y expresión

génica.

  • Mapeo y cartografía de genes.

  • Diagnostico enfermedades geneticas con

cambio en la secuencia de ADN.

  • Desarrollo proteínas recombinantes.

APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR

ENZIMAS

DE

RESTRICCIÓN

APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR

ENFERMEDAD GÉNICA

GANANCIA O PÉRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIÓN

APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR ENFERMEDAD GÉNICA GANANCIA O PÉRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIÓN
Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción Enzima de restricción Polimorfismo Secuencia de Reconocimiento 1711C>T HhaI

Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción

Enzima de restricción
Enzima de
restricción
Polimorfismo
Polimorfismo
Secuencia de Reconocimiento
Secuencia de
Reconocimiento

1711C>T

HhaI

5- GCG^C- 3 3- C^GCG- 5

1711C>T

(A486V)

2,825 µl

1 µl

0,1 µl

HhaI

1 U

6 µl

10 µl

Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción Enzima de restricción Polimorfismo Secuencia de Reconocimiento 1711C>T HhaI

Reactivo / Polimorfismo

H 2 0 bidestilada Buffer 10X

Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción Enzima de restricción Polimorfismo Secuencia de Reconocimiento 1711C>T HhaI

BSA

Acetylated

100

µg/µl

Enzima de restricción U/µl

10

Amplificado

Volumen final

Protocolo de Digestión con Enzimas de Restricción Enzima de restricción Polimorfismo Secuencia de Reconocimiento 1711C>T HhaI

Incubación a 37°C

4 horas

Separaración:

Gel de agarosa al 3%

Visualización:

Bromuro de Etidio

P 1711C>T Electroforesis Enzima de Polimorfismo Tamaño del Amplificado (bp) Genotipo Restricción Tamaño del Producto de
P 1711C>T
Electroforesis
Enzima de
Polimorfismo
Tamaño del
Amplificado
(bp)
Genotipo
Restricción
Tamaño del
Producto de
Restricción (bp)
 

TT

185

1711C>T

185

HhaI

CC

161 / 24

 
 

CT

161 / 24

-

185

PCR ANGIOTENSINOGENO

AGT
AGT
  • H 2 0:

1 0

ul

  • Buffer:

5.0 ul

  • MgCl 2 :

6.0 ul

  • dNTPs:

4.0 ul

  • Primers:

  • Taq:

6.4/6.4ul

0.2 ul

_________ 38 ul + 12 ul ADN.

DIGESTICON CON LA

ENZIMA NcoI
ENZIMA NcoI

Descriptin

Features

C

CATG G

G GTAC C

Blue/White Cloning Qualified: Promega's blue/white cloning assay provides a higher level of quality control for enzymes used in cloning applications.

Protocol

Storage

Conditions

Storage

Buffer

Source

Incubatin

Conditions

Store at 20 C.

10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM

DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol.

Nocardia corallina.

Buffer D. 37 C.

Percent

A

B

C

D

MULTI-CORE™

Activity in

5075%

75100%

75100%

100%

75100%

 

Frequency of Cutting

λ

Ad-2

ΦX174

pUC18

M13mp18

pBR322

Percent D MULTI- CORE™ Activit <a href=y in 50 – 75% 75 – 100% 75 – 100% 100% 75 – 100% 4-CORE Buffer System Frequency of Cutting λ Ad-2 ΦX174 pUC18 M13mp18 pBR322 4 20 0 0 0 0 Notes For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22 , 3640 – 59. " id="pdf-obj-22-73" src="pdf-obj-22-73.jpg">

4

20

0

0

0

0

Percent D MULTI- CORE™ Activit <a href=y in 50 – 75% 75 – 100% 75 – 100% 100% 75 – 100% 4-CORE Buffer System Frequency of Cutting λ Ad-2 ΦX174 pUC18 M13mp18 pBR322 4 20 0 0 0 0 Notes For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22 , 3640 – 59. " id="pdf-obj-22-87" src="pdf-obj-22-87.jpg">

Notes

For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 364059.

PROTOCOLO DIGESTION NcoI
PROTOCOLO DIGESTION NcoI
  • Enzima: 0,2 ul

  • Bufffer : 0,5 ul

  • H 2 0

: 4,3 ul

________ 5,0 ul + 15ul Amplificado

Llevar a 37°C.

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN ELECTROFORESIS CONVENCIONAL ELECTROFORESIS CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA ELECTROFORESIS CAPILAR

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN ELECTROFORESIS CONVENCIONAL ELECTROFORESIS CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA ELECTROFORESIS CAPILAR

ELECTROFORESIS

CAMARA DE ELECTROFORESIS

GEL DE AGAROSA

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN ELECTROFORESIS CONVENCIONAL ELECTROFORESIS CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA ELECTROFORESIS CAPILAR

ELECTROFORESIS CAPILAR

METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN ELECTROFORESIS CONVENCIONAL ELECTROFORESIS CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA ELECTROFORESIS CAPILAR

EQUIPO ABI PRISM 310

ELECTROFORESIS Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio

ELECTROFORESIS

Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un

campo eléctrico.

La velocidad de migración es

función

de

la

densidad de carga y

ésta a su vez es función

de una serie de parámetros que marcan las

condiciones experimentales como: pH, fuerza iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
condiciones experimentales como: pH, fuerza
iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO
MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL
CAMPO ELECTRICO

Catión ( carga + )

Anión

( carga - )

Migra al polo negativo. CATODO Migra al polo positivo. ANODO

La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la

partícula cargada, es proporcional a la carga de la partícula y al voltaje del campo eléctrico aplicado.

F = Q

X

V

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO Otra fuerza se opone al movimiento de la
MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO Otra fuerza se opone al movimiento de la

Otra fuerza se opone al movimiento de la partícula

y es proporcional al tamaño y la forma de ella la viscosidad del buffer.

y a

Fr = F X V Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula empieza a migrar
Fr = F
X
V
Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula
empieza
a
migrar
y
hace
que
alcance
una

velocidad constante.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Carga neta de la partícula: Efecto del pH

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS

Carga neta de la partícula: Efecto del pH del tampón.

Cuando

las

partículas

se

colocan

 

en

un

campo eléctrico, estas migrarán hacia el

ánodo o el cátodo

en función

de

la

carga

neta que posean y ésta depende del pH de

la solución en que se encuentran.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Tamaño y Forma de la partícula: Según el

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Tamaño y Forma de la partícula: Según el
Tamaño y Forma de la partícula:
Tamaño y Forma de la partícula:

Según el tipo de electroforesis, el tamaño y la

forma

de

la

partícula pueden tener mayor o

menor importancia.

Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de moléculas, según el tamaño,

retienen las grandes pequeñas.

y

dejan

pasar las

más

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Fuerza iónica del tampón: En la electroforesis, la

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Fuerza iónica del tampón: En la electroforesis, la

Fuerza iónica del tampón:

En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampón como de las partículas en solución, por tanto

cuanto más concentrado es el tampón, mayor

la proporción de corriente que transportan, menor la migración de las partículas y peor la

separación.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE
LAS PARTICULAS

Potencial del campo eléctrico:

A mayor potencial

del

velocidad de la partícula.

campo

eléctrico

mayor

Según el método electroforético se elige trabajar manteniendo constante el V o A.

Si

aumenta

el

voltaje,

aumenta

velocidad

de

separación, pero también la temperatura aparecen efectos indeseables como: desnaturalización de pr, evaporación del buffer, aumento de la fuerza iónica.

TIPOS DE SOPORTES El procedimiento electroforético se lleva a cabo sobre dos soportes:: 1. Soportes No

TIPOS DE SOPORTES

El procedimiento electroforético se lleva a

cabo sobre dos soportes::

TIPOS DE SOPORTES El procedimiento electroforético se lleva a cabo sobre dos soportes:: 1. Soportes No

1. Soportes No Restrictivos:

Las partículas colocadas sobre ellos, se separan únicamente en función de su carga eléctrica. Los principales soportes son:

Papel Acetato de Celulosa Agarosa

TIPOS DE SOPORTES 2. Soportes Restrictivos : El soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento
TIPOS DE SOPORTES
TIPOS DE SOPORTES

2. Soportes Restrictivos:

El soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento de las moléculas de la muestra. La resistencia estará dada por el tamaño del poro del soporte y por el tamaño y características de las moléculas que deben desplazarse sobre el soporte.

Los principales tipos de soportes son:

Geles de Almidón Geles de Poliacrilamida

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL AGAROSA: Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
AGAROSA: Es uno de
AGAROSA:
Es
uno
de

los

componentes

del

agar. Se

prepara como un gel de concentración entre

0.5 2 gr %. y permite

el

El tamaño del poro es grande

paso de moléculas de peso

molecular relativamente alto, por lo cual

migran tan solo en función de su carga. Su

aspecto claro y transparente facilita cuantificación por densitometría.

la

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL POLIACRILAMIDA Se forman por polimerización de la acrilamida con un agente enlazante. El tamaño

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

POLIACRILAMIDA

Se forman por polimerización de la acrilamida con un

agente enlazante. El tamaño del poro varía, según la concentración de la acrilamida y las moléculas puedan

ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaños.

Soporte ideal para obtener mayor y mejor número de separaciones electroforéticas. Se puede leer por

densitometría.

Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
Fragmentos obtenidos de la digestión de AGT con la enzima NcoI El fragmento del amplificado de

Fragmentos obtenidos de la digestión de AGT con la enzima NcoI

El fragmento del amplificado de AGT sin digerir pesa: 303 pb

T: 303 pb

M: 211 pb + 92pb

El polimorfismo: T174M Resultado de la electroforesis:

TT 0.83,

TM 0.15,

MM 0.02

ELECTROFORESIS CAPILAR POLIMERO POP 4 Soporte restrictivo que permite la separación de moléculas de ADN adelante.
ELECTROFORESIS CAPILAR
ELECTROFORESIS CAPILAR
POLIMERO POP 4
POLIMERO POP 4

Soporte restrictivo que permite la separación de

moléculas de ADN

adelante.

desde un

par

de

bases en

Se deposita en un capilar de 1 mm de diámetro y este se introduce en un equipo automatizado que

posee una placa de calentamiento y un laser que

detecta la señal de los fluorocromos.

ABI PRISM 310
ABI PRISM 310
ABI PRISM 310

ABI PRISM 310

ABI PRISM 310
FLUOROCROMOS

FLUOROCROMOS

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS Montaje de la jeringa Obtención de la Muestra Montaje de la muestra
REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS
REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS

Montaje de la
jeringa

Obtención de la Muestra

Montaje de la muestra

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS Montaje de la jeringa Obtención de la Muestra Montaje de la muestra

Electroforesis capilar

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS Montaje de la jeringa Obtención de la Muestra Montaje de la muestra

Detección por el laser

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS Montaje de la jeringa Obtención de la Muestra Montaje de la muestra

Lectura de electroferogramas

ELECTROFEROGRAMA
ELECTROFEROGRAMA
ELECTROFEROGRAMA
ELECTROFEROGRAMA
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
LADDER ALÉLICO
LADDER ALÉLICO
PERFIL GENÉTICO
PERFIL GENÉTICO