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TECNICAS GENERALES

EN MICROBIOLOGIA
vinificatum.blogspot.com
M Concepcin Chamorro Valencia

Aplicadas a la Industria de la Fermentacin
2
vinificatum.blogspot.com
Portada: Ilustracin de tcnica en cultivos anaerobios

Texto de: M Concepcin Chamorro Valencia
RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL
Todo laboratorio de microbiologa deber poseer un autoclave,
un horno Pasteur, un bao mara de temperatura regulable, estu-
fas de cultivo, frigorfico y microscopio.
Adems,deber poseer: placas de Petri, pipetas Pasteur, portas,
cubres hilos de platino, agujas y asas, esptula, platina calen-
tadora, micrmetro objetivo, micrmetro oGular y portas especiales
Este material es especfico de microbiologa. Adems se necesi-
tar otro tipo de material corriente en un laboratorio: tubos -
de ensayo, erlenmeyer, embudos, etc.
Otro tipo de material:
Algodn cardado.
Papel de Manila.
I
n
I
I
I
I
I
J I
- - ~ l
L - - - - - - - - ~ ~
\
3
Baos de agua con
temperatura regulable
Refrigerador para
cultivos
Autoclave de .sobremesa
para esterilizacin
4
Microscopio ptico binocular
Contador digital de
colonias, con lupa
de 2 aumentos.
5
*
~
!) n
1I
I
graduada
I 1.- Pipeta
'1
!I
ji
j
l'
2.- Pipeta con doble ilforo
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I
~
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3.- Pipeta Pasteur
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4.- Asa
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5.- Aguja 1,
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1 2 3 4 5
Mecheros de
alcohol y gas
.--
~
Mesa calentadora de
Malasset
. ! _ ~ . .7
Portaobjetos
Cajas de Petri
Cubreobjetos
6
Frascos para
cultivo
Sistemas de filtracin
De un solo uso.
Estril
Sistema de anaerobios
7
1U:. M1: eRoS eQEI [)
Tubo
ocular
Porta
Objetivos
Pl a tina -----1.]
mvil
Lmpara
Pie
El microscopio consta de:

- Pie
-----Soporte
Mando de ajuste

Mando de ajuste
fino
- Platina mvil fija/provista de una corredera,
Tubo del microscopio fijo o de inclinacin graduable.
- Un porta objetivos,tipo revolver
- Una cremallera para el movimiento rpido y otra para el
movimiento pequefio o micromtrico, cada una con su corres-
pendiente rueda manipuladora. La primertiene por objeto
situar el punto de aproximacin (enfocar aproximadamente)
y el segundo el punto definitivo (enfoque definitivo).
8
Un
_ Una serie de lentes objetivos: uno de ellos ser de inmersin,
e irn colocados en el revolver portaobjetivos.
- Una serie de lentes oculares intercambiables
- Un condensador con su diafragma
- Un sistema de iluminacin independiente o unido al soporte.
El aumento del microscopio es funcin de la potencia de la lente
objetivo, de la lente ocular y de la distancia entre ambas. Esta
suele ser corrientemente de 160 mm.
Para el examen de una preparacin, se coloca el porta sobre la -
platina del microscopio. Se trata de enfocar primeramente con el
tornillo de movimiento rpido y luego con el de movimiento lento,
hasta conseguir el enfoque deseado.
La distancia entre la lente y la preparacin/va disminuyendo a -
medida que crece el aumento de la lente objetivo.
Se deber comenzar utilizando el objetivo de menor aumento, con
el objeto de localizar, el campo que queremos observar. Luego se
girar el revolver portaobjetos e iremos cambiando los objetivos
de ms, en ms aumentos, hasta conseguir una buena observacin.
Con lentes de pocos aumentos, la luz que llega a la preparacin
es ms intensa que cuando se usan otros objetivos, sobre todo el
de inmersin, por eso a veces habr que hacer uso del diafragma,
cerrndolo, o alejar el condensador de la preparacin para que la
luz sea menor y el contraste sea el adecuado.
Cuando se el objetivo de inmersin, hay que anlicar la
mxima luminosidad: diafragma totalmente abierto y el condensa-
dor lo ms prximo a la platina.
Al usar este objetivo se pondr sobre el cubre,que protege la _
preparacin, si se trata de una preparacin en fresco, o sobre
ella si es en estado seco, una gota de aceite de cedro.
Con el tornillo de movimiento rpido, se pondr en contacto el
objetivo de inmersin con el aceite de cedro, despus con el --
tornillo de movimiento lento se enfocar, hasta conseguir una -
buena observacin.
9
Consejos:
El microscopio siempre estar protegido del polvo, humedad, va-
pores, etc., o bien en su caja o tapado con una funda.
Las lentes se limpiarn con papel manila o una tela -fina de al-
godn.
El objetivo de inmersin despus de usado, se limpiar con el -
xilol, para que el aceite de cedro se disuelva y despus se se-
ca bien.
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PREPARACION DEL MATERIAL DESTINADO AL ANALISrS MICROBIOLOGICO
-------------------------------------------------------------
Todo el material sucio -tubos y cajas de Petri- debe ser
lizado en el autoclave a durante 20 de ser
lavados, para ser otra vez utilizados posteriormente. Las cajas
de Petri de plstico se colocan en unas bolsas para esterilizar
y se tiran despus.
Los tubos de ensayo se lavan con agua caliente que tenga un de-
tergente y un mojante -5% de fosfato tris6dico o carbonato sdi-
co y de 10 a 20 ml. de detergente comercial-o Despus se les co-
loca en un bao de Acido clorhIdrico al 1% y luego se les aclara
bien con agua.
Las cajas de Petri de vIdrio vacias, una vez esterilizadas, debe-
rn ser enseguida lavadas a mano o mecnicamente, en las mismas -
condiciones que los tubos.
Las pipetas son despojadas de su algodones, puestas a remojar en
una solucin detergente y, finalmente, se mantienen 24 horas en
una mezcla sulfocrmica. Despus se lavan y aclaran como el mate-
rial anterior.
Mezcla sulfocrmica: Dicromato potsico: 60 grs.
Acido sulfrico: 500 ml.
Agua hasta completar 1000 ml.
Disolver el dicromato en el agua y luego --
aadir el sulfrico.
Los tubos centrifugar, tambin se pasan por una mezcla sulfo--
crmica, se lavan y se aclaran.
Las pipetas Pasteur se colocan, despus de usadas, en un recipien-
te conteniendo una solucin de agua clorada. Despus se esterili-
zan en el autoclave y se tiran.
Los filtros de porcelana porosa, una vez usados, se lavan con --
agua caliente, se secan y luego se regeneran en el horno a 1000C.
Despus de enfriados se les aclara con agua destilada.
De una manera general no son buenas las limpiezas sin detergente,
pero hay que tener mucho cuidado de aclarar muy bien/para que no
queden residuos de l.
11
El material de vidrio grasiento se desengrasa/con una solucin
detergente,a la que se le aade silicato potsico.
Una vez limpio el material, se coloca una o dns horas a SO-lOOC.
en estufas para secado y a continuacin, pasaremos a esterilizar-
lo para usarlo de nuevo.
El material nuevo se aclarar con agua, se secar y pasaremos a
esterilizarlo.
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Esterilizacin del material:
Definicin: Esterilizacin es la destruccin de todas las for-
mas de vida.
Los mtodos ms corrientes,usados en el laboratorio, para este-
rilizar son:el empleo del calor, la filtracin y la irradiacin.
El calor Se puede aplicar:
-------------------------
- directamente (incineracin)
- en de aire seco
- en un ambiente de vapor de agua
Incineracin: La aplicamos cuando ponemos el asa o la aguja
j
-
en contacto con la llama del mechero.
En un ambiente de aire seco: Esta esterilizacin,mediante ca-
lor seco, se consigue introduciendo el material a esterilizar,-
en un horno llamado Pasteur, en el cual, por las altas tempera-
turas, se producen oxidaciones de los componentes qumicos de
las clulas, por lo cual stas mueren.
El horno Pasteur consta de
.---_.------------- -
1
dos cmaras,que dejan entre
s,un espacio destinado a
la circulacin del aire ca-
liente. La calefaccin del
aire se realiza por medio -
de una resistencia elctri-
a I
I
1
,
o

---."""'--:
TI
ca,dispuesta sobre el fondo
del aparato. Los ms moder-
nos llevan, adems de un --
term6metro, un termostato/-
que mantiene la temperatura
el tiempo deseado, transcu-
rrido el cual se desconecta
solo. Una vez puerta,la temperatura empezar a subir
hasta 180C., momento en que empieza la esterilizacin, y man--
tendremos esta temperatura de 30 a 45 minutos.
No se debe abrir el horno:hasta que no est fro y entonces pro-
cederemos a sacar el material que
se guardar en un armario
dispuesto para usar.
13
Preparacin del material de vdrio a introducir en el horno Pas-
teur:
Las cajas de Petri
pel "manila". Si se
de vdrio se envuelven individualmente en pa-
tienen cestillas o porta cajas metlicos,
se colocan en ellos.
Las pipetas se embalan individualmente, se les coloca un pequeo
algodn en el extremo superior o "boca" y se envuelven en papel
"manila". Luego, se juntan varias, para meterlas en unos recipien-
tes especiales metlicos. Si se va a utilizar ms de una se emba-
lan juntas en estos recipientes metlicos.
Si las pipetas se desenvuelven y no se usan, deben ser esterili-
zadas de nuevo.
Los tubos deben ser tapados con un tapn de algodn cardado y
todos los recipientes que se usen sern tapados igualmente con -
algodn.
A las ampollas o tubos de decantacin les taparemos las bocas --
con algodn y les envolveremos en papel.
No se utilizar esta forma de esterilizar por calor seco, cuando
los objetos, medios de cultivo, etc. puedan carbonizarse a una -
temperatura de 170-180
Q
C.
14
En este caso, la esterilizacin
podemos conseguirla siguiendo dos procedimientos: uno utilizan-
do vapor de agua a presin y otro lOa vapor fluente".
X condicionantes de la esterilizacin con vapor a
presin:
La esterilizacin por calor hmedo se consigue,por la desnatura-
lizacin de las protenas de los microorganismos/que producir
la coagulacin del protoplasma. Esta precipitacin de protenas
se debe a las altas temperaturas alcanzadas.
Para eliminar las endosporas bacterianas, que son las formas de
vida ms resistentes a la muerte por el calor, hay que aplicar
temperaturas superiores a lOOC., que es la temperatura de ebu-
llicin del agua. El vapor de agua, sometido a presinpuede al-
canzar temperaturas mayores y esto es lo que queremos conseguir:
temperaturas moderadas (121C.) que junto con la presencia de -
vapor de agua (humedad) coagulen el protoplasma bacteriano (de-
naturalizacin de las protenas, enzimas, etc.).
Si la temperatura del vapor de agua se eleva mucho, el vapor se
hace ms seco y el tiempo de exposicin aumentar, se ir acer-
cando a la temperatura y tiempo de la esterilizacin por aire -
seco, con las consecuencias que esto lleva consigo: deterioros
en el material que se va a esterilizar, etc.
Por ello es importante que el vapor no se caliente excesivamen-
te pues si no, pierde su accin letal.
La temperatura que normalmente se emplea,para esterilizar por -
este mtodo es de 121C. (250F) que es la que suele conseguir-
se cuando el manmetro del aparato que utilizamos (llamado auto-
clave) marca 1 atm. de presin.
Normalmente se le tiene un tiempo de exposicin de 15 minutos.
Este es el tiempo que se considera necesario}para matar las en-
dosporas bacterianas termfilas, pues no todas mueren a la vez.
Otro condicionante,para conseguir una buena esterilizacin}es -
que no debe haber aire en la cmara del autoclaveJcuando cerra-
mos la espita para conseguir la sobrepresin, pues este aire,
que est ms fro que el vapor, a la temperatura de esteriliza-
cin,pesa ms y se estratifica en el fondo.
15
Las capas superiores estarn a distintas temperaturas que las
inferiores y, aunque terminen mezclndose, la temperatura no
ser la adecuada)a pesar de que el manmetro marque 1 atmsfera.
Por esto,es importante eliminar todo el aire de la cmara y,
sobre todo, fijarse en la temperatura que marca el termmetro.
Antes de cerrar la espita d ~ l autoclave el termmetro deber
marcar 100 2 C. y cuando se consiga 1 atm. de sobrepresin ser
de 121
2
C.
Este tipo de esterilizacin se emplea para: el material de v-
drio, los objetos de goma, aparatos que llevan montajes con --
goma, los medios de cultivo, para destruir cultivos microbia--
nos,cuando queremos deshacernos de ellos, para el material con-
taminado sucio (como tubos y cajas de Petri), etc ..
El material a esterilizar deber ir tapado con tapones de algo-
dn y envuelto en papel sulfurizado o metlico para evitar
que, al enfriarse, el agua de condensacin moje el tapn de
algodn de los tubos y recipientes. En el caso de utilizar ta-
pones metlicos,no ser necesario envolver el material.
Autoclave:
Es un aparato que consta de un cuerpo cilndrico de doble p a r e d ~
dividido en dos partes,de volmen diferente,por una placa met-
lica perforada. En la parte inferior es donde ponemos el agua
que, al ser calentada, va a transformarse en vapor y ~ a parte
superior es la cmara de vapor, la cual se cierra hermticamen-
te,mediante una tapadera provista de una arandela de goma y --
unos bulones.
Tambin lleva un manmetro, un termmetro y una vlvula de se-
guridad.
El sistema de calefaccin va en la parte inferior del autocla-
ve y puede ser una resistencia elctrica,o una serie de meche-
ros de gas.
16
Autoclave automtico
.
3
4
1 .... Bulones
2.- Manmetro
5
3.- Vlvula de seguridad
4.- Tapa
~ ..
5.- Salida de Gases
/ J-'
6.- Salida de agua
6
.7.- Llave de vapor de
agua.
17
Manejo del autoc10ve:
Se compueba que tiene agua hasta la rejilla. Se coloca el mate-
rial a esterilizar. Se cierra bien la tapadera apretando los -
bulones en cruz. Se abre la vlvula (salida del aire) para per-
mitir que el aire existente en el reciento salga empujado por
el vapor que se produce. s enciende el foco de calor. Se abre
la vlvula de suministro de calor. Se vigila el termmetro has-
ta que la temperatura se acerque a los 100C. y luego se cierra
la primera vlvula, asegurndose antes de que el chorro de va--
por, que sale por ella, no contiene gotas de agua. Esto indica,--
que todo el aire que contena el autoclave,ha sido eliminado.
Se cierra la espita y se sigue calentando, hasta que el manme--
tro senale 1 atmsfera de, presin y el termmetro marque 121C.,
ya que, si no ha sido eliminado todo el aire y el agua condensa-
da, el manmetro sealar 1 atmsfera pero la temperatura no --
ser de 121C.
Desde este momento, se empieza a contar el tiempo de esteriliza-
cin, regulando el calor, se mantiene constante la presin in--
terna del aparato y por lo tanto, la temperatura.
Pasados 20 mino se apaga, se deja que descienda la temperatura
hasta que el manmetro marque O atm.
Se abre la espita. Si no sale vapor quiere decir que ya no hay
sobrepresin. Se quitan los bulones, se abre el autoclave y se
retira el material esterilizado.
18
Fundamento y de la esterilizacin a vapor fluen-
te:
En este caso, la tapadera del autoclave se cierra hermticamen-
te con los bulones, pero no se cierra la espita con lo que no -
se genera sobrepresin, y la temperatura que se consigue es la
del agua hirviendo. El vapor fluye durante todo el tiempo que -
se quiera tener en exposicin
Como aplicacin de este sistema tenemos la 11tindalizacin".
Se trata de una esterilizacin a vapor fluente durante una
hora, despus se enfra el material a esterilizar y se in--
cuba durante 24 horas a 37C. Esto se repite tres veces en
una estufa de cultivo durante tres das, para que las formas
esporuladas de vida (endosporas bacterianas) duran-
te los espacios de incubacin, germinen, se desarrollen y pa-
sen a clulas vegetativas, f"ormas en que si sern destruidas -
al someterlas de nuevo al vapor fluente. Al tercer da se su-
pone que no existen esporas. A esto se le llama tambin "este-
rilizacin fraccionada".
Con este mtodo, el material a esterilizar, no se degrada tan-
to al ser la temperatura a la que se somete menor.
19
Muchos materiales termolbiles, azcares, sueros sanguneos,
etc., se destruyen al calentarlos a las temperaturas utiliza--
das para esterilizar. Para esterilizarlos, como normalmente son
lquidos o sustancias en solucin, usamos la filtracin.
Los filtros eliminan las bacterias de dos maneras: una por em--
plearse como colador, accin mecnica ejercida por los peque-
simos poros que no dejan pasar a los microorganismos, y otra --
por la adsorcin de los microbios al filtro, debido a la dife--
rencia de sus cargas elctricas.
Se utilizan:
- Filtros de membrana, de celulosa o de plstico, con un tama-
o de poro de 0
1
45 ~ m .
- Filtros de vdrio poroso.
- Filtros de asbesto
- Filtros de bujas de tipo Chamberland.
Todos estos filtros se usan unindolos a un matraz estril y --
por medio de una bomba de vaco, se obliga a pasar el lquido a
esterilizar, quedando los microorganismos en el filtro y el l-
quido estril en el matraz.
de sujeccin
20
Liquido que se va a esterilizar
Vaso de metal en forma de embudo
en forma de disco de asbesto prensa-
de alambre
de. goma
Estas unidades se adaptan
a un r;itasatos.
Base pyrex
Goma
Filtro de membrana
Filtro de membrana
Plataforma de vidrio poroso
Base pyrex
21
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son imprescindibles para el cultivo de los
microorganismos, pues son la fuente de energa que ellos necesi-
tan para su crecimiento y reproduccin.
Los medios de cultivo pueden ser simples soluciones de sales inor-
gnicas junto a hidratos de carbono o sustancias complejas que -
han sido obtenidas de tejidos animales o vegetales, e incluso ex-
tractos de clulas.
Un medio de cultivo, necesita contener todas aquellas sustancias
que el microorganismo requiere; ha de estar estril y ha de en--
contrarseJen recipientes cmodos para su posterior manejo, y que
nole hagan perder su sterilidad.
Como ejemplo de un medio lquido corriente, citaremos un caldo -
nutritivo:
Extracto de carne
Peptona
CINa
Agua destilada
5 grs.
10 grs.
5 grs.
Hasta 1.000 cc
Los medios de cultivo se encuentran en una de las dos formas: l-
quido o slido. Para esta segunda forma, lo que hacemos es aadir
a un caldo nutritivo, un componente como el agar o gelatina, con
lo que a temperatura ambiente el medio nutritivo ser slido.
medios comerciales que ya vienen preparados, por lo cual no -
hace falta pesar uno a uno sus componentes, slo con seguir las
instrucciones del fabricante bastar para obtener la cantidad --
deseada.
Tanto en un caso como en el otro, una vez disuelto en agua desti-
lada los componentes o el se agita hasta completa diso-
lucin. A continuacin se mide el pH, que ha de ser el que el mi-
croorganismo que vamos a cultivar requiera para su desarrollo.
En cada medio de cultivo se especifica cual ha de ser el pH.
Se envasa esta disolucin en un matraz. Se tapa con algodn y se
seala con un lpiz el nivel de lquido. Se esteriliza en el au-
22
toclave a 1 atm. durante 15 mino (para precipitar fosfatos). Si
el medio ileva un componente gelificante, este calentamiento
r desnaturalizar las protenas y pasar al estado de gel (slido)
Una vez fro, se restablece el volmen con agua destilada, ya
que al esterilizarlD)el lquido mengua algo. Se filtra en ca-
si hace falta y se distribuye en tubos o matraces que
nuevamente vuelven a ser esterilizados. Una vez stos fros,
se retiran del autoclave y s conservan en nevera.
Se puede comprobar si han sido bien esterilizados1si tomamos
una muestra ( dos tubos) y la incubamos en una estufa a 37C.,
durante 48 horas y no se observa desarrollo microbiano.
Para algunas utilizaciones, los medios nutritivos slidos con
agar, hay que utilizarlos fluidos. Para ello funden en un
bao maria hierviendo.
- El punto de fusin suele estar entre 97-100C.
- El punto de solidificacin es alrededor de los 42C.
Si bien han de enfriarse hasta 45C., para su utilizacin, pues
esta temperatura puede ser soportada por las bacterias durante
poco tiempo,y ha'! que trabajar deprisa,para que no se solidifi-
que. Esta temperatura de 45C., no es degradable para la mayo--
ra de las bacterias.
El tanto por ciento de agar en los medios nutritivos est entre
1,5-1,8 %.
El otro componente gelificante ms usado es la gelatina. Se usa
a una concentracin de 12-15 %.
- Es lquido por encima de los 25C.
- y es hidrolizable por muchas bacterias.
23
CONSEJOS Y REGLAS DE TRABAJO
Las operaciones que se realizan en microbiologa: siembra, dilu-
ciones, repicados, aislamientos, se realizan de manera que se -
evite toda posible contaminacin. Por eso se debe trabajar cer-
ca de una llama y a ser posible dentro de un campo delimitado -
por las tres llamas de tres mecheros, sobre todo cuando se ha--
gan siembras de microorganismos.
El aire de este campo se
puede considerar libre de
grmenes.
Otro factor importante a la hora de trabajo es la rapidez, jun-
to con las formas de coger y usar los instrumentos, que ha de -
llegar a ser de forma automtica.
Cuando se quiere traspasar microor-
ganismos de un tubo de ensayo a ---
otro recipiente o a otro tubo, se -
colocar la mano izquierda con la
palma hacia arriba, y se pondr un
tubo de ensayo entre el ndice y el
dedo corazn y el otro tubo de en--
sayo entre lQs dedos corazn y anu-
lar; el dedo pulgar nos servir para
retirar o acercar el tubo que este--
mas manipulando.
24
Con la mano el
tapn del tubo que vayamos a uti-
lizar, sujetndolo con el dedo
meique y la palma de la mano.
Pues los deben de--
jarse encima de la mesa de traba-
jo, para que no se contaminen.
Las bocas de los tubos y recipientes estriles,se flamean inme-
diatamente antes y despus de ser sembrados, as como los tapo-
nes, antes de ser vueltos a colocar.
En la mano derecha, tambin
tendremos el instrumento -
correspondiente: aguja, asa,
pipeta, etc., a la opera--
cin que estemos realizan-
do, siembra, dilucin. Es-
te instrumento deber es--
tar estril. En el caso de
1 a a g u j a o e 1 a s a" 1 a e s t e-
rilizacin se realizar --
por incineracin del hilo
metlico, que sometido al
calor de la llama del me-
chero, se pondr incandes-
cente, luego se espera un
pequeo espacio de tiempo!
para que se enfre y no
pueda destruir aquellos
microorganismos con que
queremos trabajar. Mientras.
la aguja debe estar cerca
de la llama del mechero, para que no se contamine.
25
Una vez terminado el trabajo con la aguja o el asa, se volver
a acercar a la llama hasta incandescencia
1
para matar los micro-
o r g a ni s mo s q u e p u d. e 03 n e o n t a g it r e 1 me dio.
La aguja o el asa se colocarn con respecto a la llama, para -
ser esterilizadas, con un ngulo de 45 hacia abajo y as tam-
bin calentar la parte inferior del mango.
En el caso de usar pipetas estriles, se absorber a travs del
taponcito de algodn, que protege el extremo superior, pero an-
tes y despus de usarla se flamear a la llama,en toda su lon-
gitud, con dos o tres pasadas.
Dejar unos sewndos que se
enfre. para evitar la muer-
te de los microorganismos,
'" y mientras, se mantendr cer-
ca de la llama del mechero,
para que no se contamine.
Una vez usadas,se depositan
en un recipiente en cuyo -
fondo habr un antisptico.
26
Las placas de Petri, sern entreabiertas o abiertas el tiempo
mnimo requerido en las manipulaciones y dentro del campo de
trabajo.
~
.
. .X
-- .
~ .
/
27
EXAMEN DE MICROORGANISMOS EN ESTADO FRESCO
El examen de los microorganismos al estado fresco
J
se realiza
colocando una suspensin de ellos,entre un porta y un cubre.
Se debe examinar los cultivos jvenes y viejos, pues puede -
haber cambios morfolgicos.
En esta forma, se observa el aspecto celular la motilidad o
ausencia de la misma, las dimensiones y el modo de agruparse.
Solucin Ringer 1/4:
CINa
CIK
9 grs.
0'42 grs.
a la observacin microsc--
C1
2
Ca 0
1
24 grs.
C0
3
HNa 0'2 grs.
Agua destilada. 4.000 ml.
Se disuelve, calentando ligeramente. tarde,se distribuye en
tubos de ensayo a razn de 9 ml. por tubo, se tapan los tubos y
se esteriliza a 121
Q
C. durante minutos.
Los microorganismos a observar, se pueden encontrar sobre un me-
dio slido o en suspensin en un medio nutritivo lquido. Depen-
diendo de esto,procederemos de diferente forma para conseguir --
colocarlos sobre un porta que nos de soporte (a esto se
le denomina "frotis") f someterlos
pica.
Si los microorganismos se encuentran en suspensin, se
as:
Se muy bien el porta con alcohol , se con un pa-
o de algodn o papel fino se una pequea cantidad de
suspensin,ayudados con una pipeta estril o con el asa y se de-
en el del porta. Despus.colocaremos un cubre --
con cuidado de que no queden burbujas de tre er.tre el porta y -
el cubre; esto se logra posando el cubre sobre el porta,tangen--
cialmente ; caer. Si la cantidad de suspensin fuera -
muy grande y sobresaliera de la superficie del cubre, se retira-
el exceso succionando con una pipeta o un papel de filtro. A
continuacin procederemos a observar al microscopio.
28
~ ~ ~ E ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ _ E ~ ~ ~ _ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ _ ~ ~ _ ! ~ ~ ~ ~ ~ _ ~ ~ ~ _ ~ ~ ~ E ~ ~ ~ ~ ~ ~ _ ~ ~
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ : 2 ~ ~ ~ ~ ~
Se deposita sobre
el portaobjetos
Tomarcon pipeta esteril de
la suspensin de microorganismo
Colocacin del cubre
sobre la suspensin.
29

encuentran en un medio slido
Se deposita sobre el portaobjetos,
solucin Ringer 1/4 estril.
/ 7'

Se toma una pequea
cantidad de micro--
organismos



/-/7
-'----------i/
Se deposita sobre el diluyente
mezclando bien
Se coloca el cubreobjetos
30
Si los microorganismos se encontraran en un medio slido,debemos
primero, colocar unas gotas o asas de una solucin estril,(que
puede ser; agua destilada estril, solucin fisiolgica, solucin
Ringer diluda a 1/4), sobre un porta limpio.
Con ayuda de una aguja, se toma una pequesima cantidad de micro-
organismos, la punta de la aguja es suficiente, y se distribuyen
sobre la cantidad de solucin,que se encuentra en el porta. Una
vez distribuidos se coloca el "cubre" y ya est listo para obser-
val'.
Todas estas manipulaciones se harn con asepsia, trabajando en -
campo estril y observando todas las reglas de trabajo anterior-
mente descritas.
Hay otra forma de observar a los microorganismos en estado fres-
co y sus movimientos,. y es la de gota pendiente. Se utiliza un -
porta excavado. La preparacin de la muestra a observar, si est
en medio slido, se puede hacer una sus--
pensin de los microorganismos en un tubo de ensayo, que contenga
una solucin estril y de aqu, al igual que los microorganismos
en medio lquido, tomar con ayuda de una pipeta una pequea can-
tidad.
En este caso, se depositar en el una o dos gotas de la --
suspensin.
Se invierte el cubre, cuidando de que no se caiga la gota, y se -
coloca sobre el porta excavado. Se puede dar vaselina a los bor-
des del ubre para que no entre aire y haya corrientes que impi-
dan una buena observacin.
zona exclvada
anillo de vaselina
Portaobjetos excavado
Gota de
Cubreobjetos cultivo
. /
\

"\" .\' \,\,'
,'\.;, '
'" , ......
Gota de Cll] tivo
bacteriano
Cubreobjetos
Preparacin en gota pendiente
31
EXAMEN DE MICROOGANISMOS MEDIANTE UNA COLORACION
Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente con-
traste con el agua en la cual estn suspendidas, por lo que no se
ven claramente. Tiindolasse las da contraste en color, respecto
al medio que las rodea, as se hacen visibles.
La tincin por tanto tiene varios objetivos:
lQ) Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que
le rodea, permitindo diferenciar varios tipos morfolgicos.
2
Q
) Permite el estudio de estructuras internas de la clula, ta-
les como paredes celulares, vacuolas o cuerpos nucleares.
3
Q
) Permite al bacterilogo emplear mayores ampliaciones, al usar
el objetivo de inmersin.
\
:" " .. ' '-

\",,-. ".
(1) Para diferenciar entre distintas formas de microorganismos
(2) Para diferenciar
celular
1
m ,(:HMaterial nuclear
, ,/ ' I,"!/
/
' / '.' . l e mb r a n a c 1 t o p 1 a s -
, I
/. mtlca
/ :l-fI n c 1 u s i
nes itoplasma
distintas estructuras de la clula .

.' /
, /
(/
Cpsula
----.-.
990X 430X
.
\
lOOX
"
(3) Para poder emplear amplificaciones mayores.
32
TECNICAS DE TINCION SJMPLE _________ __
Los colorantes son sales a menudo complejas, en las
que uno de sus iones tiene color. Por tanto habr colorantes ci-
dos o bsicos, segn sea cido o bsico el ion que da el color.
Este ion reaccionar con las partes de la clula cargadas con sig-
no contrario al que l colorendolas.
Tincin directa con colorantes bsicos
Las clulas tienen una dbil carga negativa cuando el pH del me-
dio externo est cerca de la neutralidadJque es lo que normalmen-
te ocurre. Al ponerla en contacto con un colorante bsico, por -
ejemplo el Azul de metileno (CIAM --7 Cl-+ Azl de
la clula con carga negativa se combina con el cation AM+ tiin-
dose.
Mtodo
Primeramente el frotis, (suspensi6n de microorganismos colocada -
sobre el porta) ha de ser secado y despus fijado al portaobje--
tos, bien por el calor o por el alcohol y despus coloreado.
Tcnica:
Frotis: Extender sobre un porta una gota de la suspensin micro-
biata obtenida de:
directamente de un cultivo de microorganismos, que se encuen--
en medio lquido.
de la suspensi6n conseguida al distribuir una pequea canti--
dad de microorganismos/que se encuentran en un medio slido,
sobre una gota de agua estril.
Secado: Para teir el frotis, primero hay que desecar,colocando
el porta en una mesita calentadora hasta que desaparezca el agua,
o acercando el porta a una llama.
Fijacin: una vez seco el frotis, se corta la llama de un meche-
ro por su parte amarilla, con el porta, 3 6 4 veces, rpidamente.
Tambin se puede fijar con alcohol, aadiendo al frotis, bien --
seco, unas gotas de alcohol de 90
2
Se acerca a la llama, sujetn-
do el porta con ayuda de una pinza, se inf1amar'y se dejar ar--
der hasta que se extinga.
33
Coloraci0: Con cualquier colorante como el azul de metileno,
rojo de ziehl, violeta de genciana. Trabajaremos colocando el
porta sobre una varilla de vidrio en forma de V, que pondre--
mos sobre un cristalizador.
Extender sobre el porta que lleva el frotis, previamente fija-
do, unas gotas del colorante.
Dejar que actue durante 30 segundos.
Pasado el tiempo/se retira el exceso de colorante, lavando con
abundante agua.
Secarel porta,colocndolo de nuevo en la mesita o bien entre
dos hojas de papel secante.
Examinar al microscopio
CO'
-'- ..- .....
- -=----
Colocar un asa del cultivo
enun
Extenderla formando una
capa fina sobre el porta-
objetos
Secar al aire
Fijar pasando veces
Ja llama
de un mechero Busen
34
Al frotis se le aade
el colorante, se le
deja actuar 30 seg.
Se retira el colorante
con agua.
Secar al aire,el agua en exceso
35
TINCION NEGATIVA O INDIRECTA
En esta tincin se utilizan colorantes cidos,como el eosinato
sdico o la nigrosina, que en el caso de microorganismos, cuyas
clulas estn cargadas negativamentefno sern teidos, y se de-
positar alrededor de la clula, quedando sta incolora y el -
medio que le rodea coloreado. Por esto, este proceso no es una
tincin, aunque se le conoce como tincin negativa o indirecta.
Proporciona este mtodo una visin ms exacta de la clula.
TECNICA:
Se coloca una pequea cantidad de suspensin de microorganis-
mos en un porta, por ejemplo, una gota o dos asas.
Se le aade una gota pequea,de la solucin de nigrosina,mez-
cIada cuidadosamente con el asa, y se extiende una capa final
con el borde de un protaobjeto.
...._. nzrr
Porta ;fI
capa.
/
/
El grosor de la capa deber de ir
disminuyendo, para luego encontrar
el grosor adecuado, pues mucho
grosor impedira el paso de la -
luz del microscopio y no se observara nada. Por otro lado,
una capa demasiado fina ofrecera poco contraste entre las
clulas incoloras y el medio que las rodea.
- Se deja secar al aire la preparacin. Nunca se seca por el
calor.
Se observa al microscopio.
Solucin de Nigrosina:
Nigrosina 1 grs.
Agua destilada .. 10 mI.
Se pon e a h e r v i r 1 e n t a me n t e d u r a n t e 10mi n u t o s, ~ , e e r f l' i. a j :.; e a; 1a -
den despus dos gotas de formol del 38%. Se filtra sobre papel
y se conserva en un frasco bien tapado.
36
Tincin negativa o indirecta
(7) MUCLAR DOS ASAS DEL CULTIVO OUE SE VA A TEIR. CON UNA GOTA DE NIGROSINA
(2) CON LA M/SMA ASA OC INOCULACION O CON UN PORTA08JfrOS
EXTENDER EL COLORANTE SOBRE LA SUPERfiCIE DEL f'ORTAOBJfrOS
(3) SECAR AL AIRE
ASPECTO DE LA PREPARAC/ON EN EL MICROSCOPIO
MEDIO EXTERiOr
CASI INCOL ORO
UN fROTlS DEMASIADO fINO
frlOflS CORRECTO
GRIETAS
EN UNA
CAPA GRUESA
PASA POCA LUI
A TRAVES DE LOS
OIIGANISMOS CUBIfRTOS'
POR LA CAPA GRUESA
DE COLORANTE
UN fROTlS DEMASIADO GRUESO
37
TINcrON DIFERENCIAL
Es un mtodo para distinguir bacterias,pues tambin los micro-
organismos, adems de diferir qumicamente con respecto del me-
dio que les rodea, difieren qumica y fisicamente entre si, y -
por eso reaccionan de una manera distinta}frente a un determina-
do procedimiento de tinci6n.
Este es el fundamento de estas tinciones.
MErODO DE TINCrN DE GRAM:
Es una tinci6n que sirve para separar bacterias en dos grupos:
las Gram + y las
El distinto a esta tinci6n
J
de las bacterias,
se cree que est en la distinta composici6n de su pared celular.
En el caso de las Gram +, su pared est constituida en un 90% de -
glucopptidos.
En el caso je las Gram(-) la pared est formada por una capa de
glucopptidos ms delgada que representa del 5 al 20% de la pared
celular, y posee otra de 1ipopo1isacridos y proteinas.
El carcter Gram es comn para todas las especies de un gnero
y de una familia, R4nque a veces cambia este carcter, segn la
edad del cultivo.
En esta tcnica de Gram se emplean cuatro reactivos:
- Un colorante bsio: cristal violeta, que se aade a la pre-
paraci6n fijada. Se deja actuar 30 segundos. La clula se --
tie de violeta. A continuaci6n se lava suavemente con agua.
- Un mordiente: sustancia que aumenta la afinidad entre el co-
lorante y la clula, en este caso usaremos una soluci6n de -
iodo iodurada, llamada "lugol". Estejjunto con el cristal --
violetaJforme. un complejo cristal violeta-ioduro "CVI". Este
reactivo se deja actuar 30 segundos y Se lava.
38
- Un agente decolorante: alcohol de 95. En el caso de las
bacterias, que en su pared celular el contenido en
polisacridos es pequeo, el alcohol ejerce una accin des-
hidratante, con lo cual los poros de la pared se cierran, y
el complejo CVI queda en el interior de la clula, y no sa-
le al exterior en el lavado posterior con agua. La clula
permanece teida de violeta. En el caso de las clulas que
en su pared el contenido en lipopolisacridos es muy impor-
tante, el alcohol ejerce un papel desengrasante, disuelve
los corpsculos grasos que hay en la pared,con lo que
J
los
poros se harn mayores y el complejo aVI sale al exterior,
en el posterior lavado con agua, por lo que la clula que-
da incolora. Este reactivo tambin se le deja actuar 30 se-
gundos, y despus se lava con agua.
- Un colorante de contraste: cuya misin es teir, de un color
diferente las clulas que han quedado decoloradas. Su tiem-
po de actuacin es de 30 segundos, y una vez pasados estos,
se lava con agua la preparacin y se seca. Usaremos el co-
lorante de safranina, que dar un color rosa a las clulas.
A continuacin se pasa a obsevar al microscopio.
Las clulas que quedan teidas del primer colorante, color
violeta, sern las Gram (+)y las que quedan teidas del se-
gundo colorante, color rosa, sern las
39
Mtodo cE d G
_ e ram
A.-TEtiIfR CON CRISTAL VIOLO 1
DUfiANTE JO SEGUNDOS '
\
,
C CUBRIR CON LUGOL
DURANTE 30 SEGUNDOS ',-'o
E .. DECOL ORAR CON AlcOHOL
Df '15" o DURANTE
IV la SEGUNDOS y
LAVAR CON AGUA
(
!
F CONTRAST'-R CON SAfRANINA
OURA.VI[ JO SEGUNDOS , \
tf?
- .. ;.' \
- . ..... :.---"
. , .
'\ ... '1 "

H SECAR EL AGUA EN [XCiSO
. . Me/oda de /lnCln d G
y W. F. Whl//ln h t: lam. (TomJdo de .Plan( P
9 amo W. H. Fleeman and Ca S In '/5pec/lve. pOI E H Ne b mpJn f CapYIIgh/. J964 ) wcam . G C Cedall
40
DE ACIDO-RESISTENTES.
Es una tinci6n di:erencialque demuestra la iesistencia de
una clula teida,a ser decolorada por los cidos.
En este mtodo se tie con fucsina fenicada, se decolora -
con una soluci6n de cido-alcohol y luego se da contraste a
las clulas.
Las bacterias cido-resistentes se decoloran ms lentamente
por el cido-alcohol que otros organismos y retienen el co-
lor de la tinci6n inicial despus de contrastar.
Tcnica:
Se prepara un frotis, se seca y se fija por el calor. Se pre-
para un bao de agua .hi'rviendo y mediante una gradilla met-
lica,se coloca el portaobjeto dentro de l,sin que el agua --
lo toque.
Se tie con fucsina fenicada, colocando primer un trozo de -
papel de filtro, sobre el frotis, e inundndolo con el coloran-
te. Se deja actuar durante 5 a 10 minutos.
El frotis no debe secarse durante el proceso de tinci6n, tam-
bin hay que evitar,un exceso de colorante.
Se lava con agua.
Se decolora durante diez a treinta segundos con cido-alcohol.
Se lava con agua.
Se aade azul de metileno, para contrastar, durante 30 segun-
dos. Ya sin calentar.
Volvemos a lavar con agua y se seca con papel de filtro.
Se observa con el objetivo de inmersi6n.
Los organismos cido resistentes, aparecern de color rojo y -
los no cido resistentes, de color azul.
Soluci6n de cido-alcohol
---- --- -- -- .. _._--- ----_.. _----------
Alcohol etilico 95ml.
N0
3
H --- 2
1
5 mI.
Enrasar con H
2
0 a 100ml.
Fucsina fenicada
Fucsina
Alcohol 952
Acido fnico
Enrasar con H
2
0
1 !,r.
1 () jl1.!
:)

100 rnl
41
TINCION DE ESTRUCTURAS
Para observar con el microscopio ptico)diversas estructuras
de la clula. se usan mtodos de tinciones especiales.

Las endosporas se tien facilmenteJpero una vez teidas resis-
ten fuertemente la decoloracin y el contraste.
Mtodo de Dorner:
Un tubo de ensayo conteniendo cinco gotas de agua estril, se
le inocula con el cultivo que vamos a observar. A
se aade fucsina fenicada,para teir las endosporas resisten--
tes. El tubo se coloca,en un bao de agua durante -
diez minutos.
Pasado este se hace una preparacin con nigrosina. La -
nigrosina se emplea a la vez,como agente decolorante para la -
tincin negativa del frotis.
Examine con objetivo de inmersin.
Las endosporas presentarn color rojo y la parte vegetativa de
la clula se ver sin sobre un fondo oscuro.
42
MEDIDA DE LrlS DIMENSIONES DE LOS
----------------------------------------------
Para realizar esta Riedida,deberemos usar un micr6metro ocular,
que es un disco de vidrio -que se coloca en la lente ocular-,
en el cual se han grabado divisiones, equidistantes entre s.
Dicho micr6metro, deber ser contrastado con un micr6metro obje-
tivo (o portaobjetos micromtrico), en el cual estn grabadas
lneas paralelas con una separacin de 0'01 mm.
Calibrado del micr6metro ocular
- Colocar el micrmetro ocular de tal manera, que sus trazos de
divisi6n,sean paralelos a los del micrmetro objetivo, colo-
cado en el plano focal del campo microsc6pico, es decir en -
el lugar de la preparacin a observar.
- Contar el nmero de divisiones del ocular, N ocular, que se
corresponde exactamente con n, nmero de divisiones del mi--
crmetro objetivo.
_o_1
Micr6metro objetivo
Divisiones micr6metro
objetivo
e
Micr6metro ocular
11111/11111111111111111111111111111
Divisiones micrmetro
ocular
Divisiones del micr6metro
superpuestas & las
del micr6metro objetivo.
43
1 divisin del objetivo
n
ob
x 0'01 mm.
x
N divisiones del ocular
0'01 m'n.
N
oc
1
oc
x - mm. que mide una divisin del micrmetrocular
mm
Cada vez que cambia el objetivo, o se coloca en otro microsco-
pio, hay que calibrar el micrmetro ocular de nuevo.
Se sustituye el micrmetro objetivo por la preparacin que con-
tiene los microorganismos a medir. Se miden las dimensiones de
stos; en el caso de clulas redondas,el d i ~ m e t r o y en el caso
de clulas alargadas, sus dos dimensiones, largo y ancho.
El nmero de dimensiones obtenidas en cada caso, se multiplica
por lo que mide en mm.
44
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
La separacin y aislamiento de los microorganismos,tiene como
finalidad la determinacin, cualitativa y cuantitativa, de la
flora microbiana. Antes oe realizarlo se deber observar al -
microscopio la para tener una idea de la poblacin
microbiana.
Haya diferentes tipos de mtodos de aislamiento, desde el que
llega a separar por tcnicas complicadas, con un micromanipu-
lador, una sola clula, hasta los que a continuacin vamos a
ver.
Todos los mtodos de aislamiento, si se hacen con cantidades
exactas de muestra, pueden servir como mtodos de conteo de -

El aislamiento de se encuentran presentes
en un producto cualquiera, debe ser practicado lo ms rpida-
mente posible despus de la recogida de la mueSTra que vamos
a estudiur .Si no es posible, se deber mantener
rfico.
en un frigo-
45
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACAS DE PETRI
-------------------------------------------------
El objetivo es aislar clulas, que al encontrarse en un medio
nutritivo slido, se desarrollan y darn lugar a colonias: --
(poblacin de clulas, todas procedentes de una sla, que lle-
gan a hacerse visibles).
Hay varios mtodos para conseguir aislarlas. si el
en microorganismos en grande, partiremos de dilucin de -
la muestra, para obtener,una concentracin de blulas por ca-
ja adecuado; entre 30 y 300 colonias.
Para los aislamientos sobre placas de Petri, necesitaremos me-
dios nutritivos slidos. Para ello, primero tenemos que fundir-
los y dejarlos enfriar hasta 45C. Estos medios se encontrarn
en tubos de ensayo, conteniendo aproximadamente unos lOcc. de -
medio nutritivo, en ellos depositaremos una pequea cantidad -
de la muestra diluda y agitaremos bien. A continuacin verte-
remos esta mezcla en un caja de Petri estril, levantando lo -
menos posible la tapa.
Despus se repartir el medio por toda la superifice, agitando
la caja, sin levantar de la mesa, cinco veces hacia la derecha
y cinco veces hacia la izquierda. Se deja enfriar y se la in--
vierte con la tapa hacia abajo y luego se introduce en una es-
tufa de cultivo a la temperatura adecuada hasta que transcurri-
do un tiempo aparezcan colonias.
Una modificacin de este mtodo es: Colocar una gota de la mues-
tra diluda en el centro de la caja Petri estril y se vierte -
el medio nutritivo fundido a 45C sobre ella; se agita la caja
sobre la mesa girndola hacia e izquierda. para que se --
mezcle bien y se distribuya por toda la superficie de la placa.
A continuacin se procede como en el caso anterior.
Las colonias de cada tipo de microorganismos difierenfen tamao,
forma, consistencia y color, esto es importante para su posterior
identificacin.
En este mtodo las colonias se desarrollan,no slo en la super-
fiece, sino en todo el medio.
46
Caracteres que se observarn en las colonias
Entero Ondulado Lobulado
Bordes
Dentado Rizoide
o o.
Circular Irregular
Forma
Rizoide
/ \
P l ~ n o Elevd Convexo Prominente
Elevaciones
47
Aislamiento por siem6ra de placas en superficie
----------_._------------------------------------
Otro mtodo de aislamiento distribuir la muestra so-
bre un medio de cultivo slido, que se encuentra previamente dis-
puesto en la caja Petri
Hay varias maneras de
distribuir la suspen-
sin de microorganis-
la superfi-
cie.
Primero de todo, tene-
mos que disponer de -
cajas Petri estriles,
en las cuales hemos -
depositado unos 10 cc
de medio nutritivo
Preparacin de una
caja de Petri para
ser luego sembrada
slido fundido. Se
distribuye por toda -
la superficie del fon-
do, y se deja enfriar
24 horas, cuidando de
secar bien el tubo antes de verterlo, para evitar contaminacio--
nes,debidas al agua del bao mara.
A continuacin aplicaremos los cultivos microbianos/extendindo-
los con un asa, una aguja curvada o una varilla de vdrio dobla-
da en ngulo recto.
@===========
Instrumentos de siembra
::::1
A sto se le llama "siembra por estra". Hay varias tcnicas pa-
ra sembrar.
El objetivo aqu, es obtener clulas aisladas, para que al cre--
cer formen colonias, y de ellas podamos obtener cultivos puros.
Se una pequea cantidad de la suspensin de microorganis-
mos
l
en un borde (punto perifrico de la caja) y con el instrumen-
to que deseemos, se distribuye de borde a borde en lneas parale-
las hasta llegar al centro de la caja (dimetro mayor), aqu se
48
gira 180
Q
la caja y se sigue de igual formaJhasta acabar en el
punto opuesto del principio.
Pasos de siembra por estrias, en
una caja Petri.
Se mantiene la tapa de la caja.levantada lo suficiente
7
para po-
der trabajar.
49
En las primeras estrias, las clulas quedaron unas al lado de
otras, pero cada vezjen el instrumento quedaron menos clulas,
que se ir6n depositandoren las ltimas estras. Estas
quedarn muy aisladas unas de otras, dando lugar a colonias -
bien separadas.
Distribucin de colo-
nias, en una caja de -
Petri, sembrada por --
estrias.
Otra manera de sembraG sera la que, partiendo tambin;de una
pequea cantidad de suspensin de microorganismos, con un asa
o guja,se va distribuyendo en unas cuantas estras paralelas,
y partiendo del ltimo punto. empezar otra serie de estrias, y
que a su vez, partiendo del ltimo punto se forme otra serie -
de estras, etc.
Ij

)
Se flamea y se enfra el asa cada vez que iniciamos una tanda
de estrias
Se supone que, en principio, las clulas estarn muy juntas -
porque su nmero es grande, pero las que haya en el ltimo --
menor que las iniciales y esas van a ser distri--
budas en la tanda de estras. En el ltimo punto de stas
ya habr menos, y sern distribuidas en la tanda de estras,
as cada vez ser mayor la posibilidad de que las clulas de-
po&tadas en las estras estn ms separadas.
Las cajas se marcarn con la fecha y la identificacin del --
contenido.
Se suele dejar una placa sin incubar, de testigo de esterili-
dad. A continuacin se incuban a 30.
50
El medio selectivo es un medio bsico que puede favorecer el
crecimiento de diferentes tipos de bacterias, pero, que ha sido
alterado y contiene uno o ms agentes inhibidores, limitando -
as el desarrollo de bacterias no interesantes, y favorecer el
desarrollo de las interesantes.
Entre las sustancias inhibidoras que se utilizan,se encuentran
colorantes, antibiticos, sales biliares y diversos
que pueden afectar al metabolismo) o a los sistemas enzimticos
de ciertas especies.
Una alteracin de pH, puede hacer que determinado tipo de bacte-
rias no crezcan.
Tcnica:
Se utiliza un medio selectivo, por ejemplo el Violet Red Bile -
Agar, que sirve para aislar bacterias coliformes, pues contiene
sales biliares que actan como inhibidor. Las bacterias colifor-
mes se inhiben menos ante ellas, que otras bacterias, y se desa-
rrollan.
Se colocar unas gotas de la muestra en una caja Petri y a con-
tinuacin se le aade un tubo de medio selectivo fundido, se --
mezcla, se deja enfrar y se aade otra capa de mediopara impe-
dir que nazcan las aerobias. Se y se deja incubar 24 -
horas a 30C.
Pasado el tiempo, las colonias que haya sern, las que pertenez-
can a las bacterias coliformes.
Si su n es excesivo y no se pueden aislar, debern partirse de
una dilucin mayor.
51
OBTENCION y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS PUROS
Una vez que tengamos aisladas en una caja de Petri,
procederemos a traspasarlas a un medio nutritivo, bien slido
o lquido, que sea adecuado al tipo de microorganismo aislado.
Cultivo puro:es aquella poblacin de clulas que se han desa-
------------
rrollado a partir de una s6la. Tenemos que estar bien seguros
a la hora de traspasar una colonia, que no est contaminada -
con otra prxima.
Si vamos a traspasarla a un tubo de ensayo, conteniendo un me-
dio N. liquido, se tomar en la mano izquierda el tubo y con -
ella levantaremos la tapa de la caja, que se encontrar en el
campo estril. Antes probaremos que el tap6n del tubo,no est
atascado. En la mano derecha tendremos la aguja y con ella to-
maremos,un poquito de la colonia. Destaparemos el tubo e intro-
ducimos el cultivo, se agita la aguja para que se despnnda de
ella, se pasa por la llama el tap6n, se tapa el tubo y a conti-
nuaci6n se incinera el hubiera en la aguja.
Se agita el tubo rotndolo, para que el cultivo se distribuya
bien dentro del medio de cultivo; se mete en estufa de
a la temperatura adecuada, aproximadamente 302.
Este cultivo, para mantenerlo en el laboratorio, hay que tras-
pasarlo, cada cierto tiempo a otro medio de cultivo, pues llega-
ra un momento, que los principios nutritivos se agotaran, y -
el cultivose hace viejo. Siempre se conserva en nevera.
Si el traspaso del cultivo puro lo hacemos a un medio slido,
ste puede encontrarse en un tubo de ensayo o en matraces espe-
ciales.
52
Una vez esterilimdos los tubos de ensayoJconteniendo medio nutri-
tivo slido, y cuando an estn calientes, se les coloca en una
mesa, de forma que queden casi tumbados, con objeto de que la su-
perficie sobre la que vamos a depostiar el cultivo puro, sea la
mayor posible. Esto se llama "siembra sobre agar inclinado".
Sobre esta superficie, se deposita el cultivo con ayuda de la --
aguja, sta se introduce hasta el extremo opuesto a la boca, y
se va arrastrando hacia la salida y, al final, se introduce en
el medio de cultivo; se pasa la boca del tubo y el tapn por la
llama, se tapa y se incuba a la temperatura adecuada. A continua-
cin se estiliza la aguja para evitar contaminaciones.
Siembra, sobre agar
inclinado.
Matraces
para cultivos aero-
bios
Matral de Fernbach
Mal/al Kolle
53
Los tubos de medio s1ido,que no se les pone inclinados a enfrar,
suelen ser inoculados introduciendo la agua perpendicularmente a
la superficie. A esto se le llama "siembra en picadura".
n
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u
III
(1)
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o
.o
s...
.
Una vez que los cultivos han crecido, se les debe observar
7
la --
forma que tienen de desarrollarse.
54
Los cultivos anaer0bios no se desarrollan sobre la superficie,
por lo que hay que aadir al medioJunas sustancias que produzc8n
anaerobiosis (reductoras), o poner stos en unos paratos para --
conseguir estas condiciones.
. (,---.....
PIROGALOL1fr-. ,jI
NaOH .,.. .
.. .
Al
u
..J
,.
,. 0_"
..
I
3
1
1.- Inocular en superficie el agar inclinado
2.- Cortar la parte del algodn que del tubo
3.- Introducir la porcin restante unos 4cms.
4.- pirogalol y NaOH rpidamente y tapar con tapn de
caucho.
5. - In e u h i1 r en p o sic in inver ti da
Uso del Pirogalol y NaOH para conseguir condiciones anaerobias.
r.rpcimiento en suoerficie de
Agar con
aire
en el espacio con-
finado
Placa de nrewer para cultiVo de anaerobios.
55
PINZA A ROSCA
CATALIZADOR
PLACAS DE CUL TlVD
Ilftl'f!..}-- ARANDELA DE GOMA
SOPORTE DEL CATALIZADOR
HIDROGENO
Vasija anaerobia de
Brewer que utiliza,
una fuente externa
de hidrgeno
rentes gases.
Incubador anaerobio utilizado,para
proporcionar atmsferas con dife--
AJUSlE
SALIDA DE GASES
CAI,.!,lAOOfl DE PLATINO
TUBO DE GOMA <-',XI EUMENTO DE
PINZA DE TOh'NlUJ ENCERRADO
EN TUBO OE LATON
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Vasija anaerobia de
Br e vle r,1 u t i 1 izan d o -
hidrgeno gas en --
sobre
56
Mantenimiento de cultivos puros.
Los cultivos puros,una vez obtenidos
7
se pueden conservar de
diferentes formas:
- Transferindolos a medios nutritivos, cada cierto tiempo
- Cubrindolos por completo con parafina lquida estril,
o aceite mineral (para esterilizar la parafina lquida,
se distribuye sta m en capas finas, y se este-
el horno Pasteur durante 1-2 horas a 160
Q
C.).
As los cultivos se pueden durante varios aRos
r
sin necesidad de hacer pases.
- Se pueden conservar tambin, liofilizados (una vez conge-
lados, se deshidratan mediante alto vaco, y se almace--
nan en ampollas de vdrio, que se cierran al vaco; es--
tas ampollas se pueden guardar en neveras o a temperatu-
ras ambiente, durante varios aRos).
57
MEDIDA DEL NQ DE MICROORGANISMOS TOTALES POR RECUENTO MICROSCOPICO
DIRECTO
Aqu medimos el n
Q
total de clulas de una suspensin, sean via-
bles o no.
La preparaci6n puede teirse o no. En el caso de una suspensi6n
de leche y otros alimentos con un alto contenido graso, es necesa-
rio eliminarlo antes, por ejemplo, lavando el frotis seco con xi-
101. El colorante Newman elimina la grasa y a la vez tie, pero -
no sirve para cuando queremos hacer una prueba de Gram.
Mtodo de Bred
Esta prueba llamada "mtodo de Bred", se utiliza mucho en la in-
dustria tener una idea rpida del n
Q
de microorganis-
mos de un producto lcteo.
Se parte de una suspensin, sea dilucin o no, que contenga unas
20 clulas por campo.
En un porta desgrasado, se delimita un rea de 1 cm
2
con una cua-
2
drcula metlica. Sobre este cm se coloca una cantidad, 0,01 mI.
de leche, o de muestra. Despus de fijada y teida se observa al
microscopio, con objetivo de inmersin.
Se leen varios campos y se haya la media de microorganismos por
campo.
Con un micrmetro ocular contrastado, se mide el radio del cam-
po microscpico; sea este r , la superficie del campo ser ---
2 2 mm
r x 3,1416 mm , en sta habr (A) microorganismos.
2
tn 1 cm, en el cual, hemos depos i tado O I al mI. de. muestra} habr
microorganismos.
2
r x 3,1416
100 mm
2
2
mm (A)
a
58
2
100 mm x A microorg.
a ------------------------
r
2
x 3'1416mm
2
M
--- 0'01 ml.
1 ml.
M -
100 x 100 x A
--------------- =
2
r x 3,1416
10.000 x A
r
2
x 3'146
de microorg/ml.
El n
Q
de campos que deben contarse depende de la media de micro-
organismos por campo.

n de microorganismos
por campo
0-3
4 - 6
7 - 12
n
Q
de campos que deben
contarse
64
32
16
13 25 8
Al contar se consideran los grupos de clulas (grumos), por ejem-
plo, una cadena de estreptococos, como una clula sola. Los gru--
mos los forman aquellas clulas que no distan entre s ms de 5m.
Se consideran como una sola,Pues grupos darn,una co-
lonia sola, al igual que la clula individual.
Las bacterias muertas tambin se tiRen, pero muerto al apli-
carles calor se desintegran pronto o pierden la capacidad de te--
Rirse. Hay tambin colorantes que permiten las clu--
las muertas.
59
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r--...
,
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,
I
\
..
I
l' ,
1
\
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, "
\
J

# V
......
.....v
Otro modo de hacer un conteo microsc6pico directo es: utilizando
cimeras eSpeciales como las de Thomas, de Pettroff-Hauser, etc.
Crestas que sostienen el cubreobjetos


@ .---

Observacin
Estas son unos portas especiales que tienen grabados una superfi-
cie cuadriculada,exactamente medida. Sobre ella se pone la suspen-
si6n de muestra a observar y al ser cubierta por un cubreobje-
delimita un volmen exacto sobre cada cuadro, la altura de
este volmen viene indicado en el mismo porta, as como la
cie del cuadrado ms pequeo,
Se observa con objetivo de inmersi6n si las clulas son bacterias
y se procede a contarlas.
Se halla la media de microorganismos por cuadrado. Si los microor-
ganismos son contarin en el cuadrado formado por 16 de
los pequeos.
II lado del cuadrado ms pequeo mide 0'05 mm.
El lado del cuadrado grande mide 0'2 mm.
El espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos es de 0'02 mm.
El retculo formado por 25 cuadros grandes mide'l mm
2

Ejemplo: Si la media de microorganismos por cua9ro grande es de -


12.
12 microorg. hay en una superficie de 0'04 mm
2
11 11 11 11 un volmen de 0'04mm
2
xO
'
02mm.=8.10-
4
mm
3
Por m1. habr:
12
x
8.10-
4
1000mm
3
3
mm
x -
1000 . 12
0'0008
15.000.000 de microorg./pl.
Si la muestra fuera una diluci6n de la muestra madre, se multipli-
ca por el factor de dilucin.
60
DETERMINACION DEL NQ DE CELULAS DE UNA SUSPENSION MICROBIANA
------------------_._--------------.----._--------------------_... _--
POR METODOS TURBIDIMETRICOS.
Un cultivo de microorganismos actua como una suspensin coloidalt
bloqueando y reflejando la luz que pasa a travs de l. Dentro -
de ciertos lmites, la luz absorbida o reflejada por una suspen-
sin bacteriana, es directamente proporcional a la concentracin
de clulas que hay en el cultivo. Por tanto?aplicando la turbidi-
metra (medida del porcentaje de absorcin de luz) a una suspen-
sin microbiana,se podr estimar el n de clulas presentes.
Se emplea un fotocolormetro, que medir el % de la luz transmi-
tida,despus de atravesar la suspensin/aunque se suele expresar
tambin la turbidez?como densidad ptica (0.0.)
0.0. ~ lag. 100 - log. de la lectura del galvanometro.
Tambin,se puede medir la reflexin de los rayos de luz,al atra-
vesar la suspensin microbiana, esto es por nefelometra.
En ambos Casos el esquema del proceso sera este:
LUZ
MONOCROMATlCA
AL GAL VANOMETRO
PARA NEfELOMETRIA
FILTRO o:
LUZ
FUENTE
DE LUZ
Diagrama esquernMico dI! IJn fOlocolorlmetro, que podrla funcionar como nefelmelro o como lurbidimelro
61
Tcnica.
Se toman 5 tubos con 9 ml medio nutritvo estril, se hacen dilu-
ciones del cultivo a examinar, aadiendo 1 ml. de la suspensin -
madre a un primer tubo y de stE- 1 ml. a otro tubo etc. consiguien-
do as diluciones -1, -2, -3, -4.
Se ajusta el fotocolormetro con el quinto tubo, con medio nutri--
tivo estril
j
consiguiendo as el 100 por 100 de transmisin. A --
continuacin se sustituye el tubo sin el de la suspen-
sin madre y los de las diferentes diluciones;anotaremos la D.O.
de cada una.
Paralelamente se habr hecho un conteo en esta suspensin
objeto de estudio.
Todos estos datos se llevan a unos ejes de coordenadasyrelacionan-
do las D.O. de las diversas diluciones con los nmeros de clulas
correspondientes, que se han obtenido en la caja. Esta grfica nos
servir para posteriores determinaciones, turbidimtricas, siem--
pre que usemos el mismo tipo de muestra a estudiar.
62
DETERMINACION DEL N DE CELULAS VIABLES EN UNA MUESTRA

Cuando se quieren medir el n de clulas viables en una muestra,
las tcnicas que ms se aplican son la de recuento de colnias y
1 a d e e 1 n me r o m s !) [' o b a b 1 e .
Recuento de colonias, por vertido en placas
-------------------------------------------
Fundamento: Este mtodo recuento del nmero de clulas
vivas o de los grupos de clulas de se encuen-
tran presentes en una muestra, siempre que se utilice un medio -
adecuado y que las condiciones de incubacin sean correctas.
Para examinar los materiales slidos;que son solubles en el agua
o que forman suspensiones finas en ella (tierra, harina, leche -
en polvo, etc.), se agitaJen un diluyente estril)una cantidad -
exacta de muestra.
En el caso de ciertos materiales slidos (carne, queso, etc.),
deben ser macerados en diluyentes de preparar la
suspensin.
Una vez obtenida la suspensin y diluida si es necesario, se pro-
cede a contar las colonias;que han el n de colonias de-
ber estar entre 30 y 300.
Tcnica.
Tomaremos 1 mI. exactamente medido de la suspensin madreJcon --
una pipeta estril, y haremos una a un tubo
conteniendo 9ml. de diluyente}8 esta dilucin 1/10 se le llama -
d i 1 u cin -1 d e e s t a t o ma r e mo s 1 mi. e x a c t a me n t e y/lo 1 1 e v a r e mo s a -
otro tubo de diluyente; con lo que conseguiremos una dilucin 1/100
-2, asi sucesivamente hasta la dilucin apropiada. (Aquella que
al nacer las colonias/va a dar en las cajas de Petri entre 30 y
300 colOnias). Se puede, conociendo la muestra, 'calcular aproxi-
madamente que dilucin ser la adecuada, sino se conoce, habr __
q u e ha c e r a 1 g u n a e x p e r' i en c i a d e tan t e o .
Una vez hechas las diluciones se tomar 1 mI. de ellas y se pon-
dr en una caja de PetrL a la cual aadiremos el medio nutritivo
con agar l fundido y a 45C. Se suele poner dos placas por dilu--
63
A continuacin se deja enfriar, se invierte la caja y se incuba
en la estufa el tiempo necesario,para que se desarrollen los mi-
croorganismos.
En las tapas.. se debe consignar la fecha, el n de la muestra y -
la dilucin que hemos puesto en ella.

Cuando se han preparado varias placas por cada dilucin, el cl-
culo de la concentracin microbiana de la muestra originaljse -
realiza,averiguando la media aritmtica de los recuentos de co-
la dilucin elegida y multiplicando luego, por el fac-
tor de dilucin.
El recuento se deber realizar con una lupaJo amplificador de -
mesa:con buena luz y la placa sobre fondo oscuro.
Se cuentan todas las colonias
1
hasta las de "punta de alfiler" -
y aquellos grupos compactos de colonias se contarn como una --
sola ,pues pueden proceder de bacterias individuales,contenidas
en un gr umo o de una cadena y que se han separado, pero se consi-
deran como una unidad viable sencilla.
En el cuaderno de datos se apuntar:
Fecha
Muestra
Tipo de recuento
Diluciones analizadas
Incubacin, tiempo y temperatura
Diluyente
N de colonias por dilucin
N total de colonias/gr mI. -demuestra.
64
Diluci6n - 2
1/10 1/100 1/1000 1/10.000
~
-2 @
--3 @
-4
Diluc6n- 3
Dilucil- 4
65
automticos de colonias.
La mayora de estos contadores consisten,en una cmara de tele-
visin para detectar las colonias de una placa de Petri ilumi--
nada y de una pequefia computadora electrnica para la deteccin,
recuento y control.
Un inconveniente es) que el contador detecta como colonias, impu-
rezas, porciones de medio sin disolver, burbujas de aire, pero
esto se supera si se trabaja bien, y se tiene cuidado.
Otro inconveniente que no tiene tan fcil solucin, es el que -
el contador detecta colonias pequefisimas, formadas a veces por
bacterias termodricas que no puede ver el ojo humano, entonces
los resultados no son ccmparables. El dato del contador sera -
mucho mayor
J
que el conteo manual. Otro inconveniente los
contadores no distinguen los colores ni las colonias coloreadas.
Las colonias de los medios que absorben la luz
l
como el agar,
siempre son difciles de contar, mientras que los difusos/como
los medios de agar con leche,no ofrecen contraste entre las co-
lonias y el fondo.
Pero si se eliminan las placas de Petri, que presentan dificul-
tad para ser contadas por un contador automtico, los resultados
obtenidos,son tan exactos como los conseguidos manualmente.
Otra forma de contar las colonias es,el recuento electrnico de
microcolonias, empleando contadores de partculas.
Las microcolonias crecen en un medio nutritivo slido que con--
tiene gelatina, se incuba 20h. a 20C. Despus se funde para el
recuentu ,usando el contador de partculas electrnico.
Este mtodo tambin sirvejpara contar colonias desarrolladas en
medios selectivos.
66
/
~ . ~
t;:)
..:.
f;.-
..:.
Muestra de leche
cruda.
+0,2ml.
Estabilizador para
CEe.
~
~
0'02 ml.
de leche.
+lml. de solucin
de CINa.
Incubacin
20rr a 20C.
1,
" ~
+Sml. Gelatina
nutritiva.
/
Preparacin de muestras para el contaje electrnico de clulas y microcolonias.
67
(o recuento del nmero ms pro-
bable, NMP) Da una idea n
2
de clulas
sentes en una muestra que pueden multiplicarse en un medio
quido determinado. Se elige un medio lquido que contribuya al
crecimiento de los microorganismos que se estn estudiando. Es-
te mtodo se utiliza para muestras con bajo contenido de micro-
organismos, y si no hay que hacer diluciones.
Los tubos que contienen el medio se siembran. por --
lml. de las diluciones sucesivas de la muestra. Despus de la -
incubaci6n,se anota la diluci6n ms alta o sea la que tiene una
concentraci6n ms bajaJen la que hay crecimiento, lo cual, permi-
te el nde bacterias contenidas en la muestra original.
-1 -2-3-4
Campana de Durham.,Se coloca invertida
/'en los antes de esterilizarlos y
+ +
no debe presentar ninguna burbuja de
aire.
El gas producido al crecer los micro-
org.nismos, ljquido que -
. I
llena la campana de Durham haciendo -
que esta suba a la super.ficie indican-
do crecimiento positivo.
Crecimiento
En este crecimiento tiene lugar en los tubos sembra-
dos con la dilucin 10-
1
y 10-
2
no en el 10-
3
y 10-
4
. Se
puede deducir de esto que en la muestra-original, el n
2
de bac-
terias es al menos de lOO, pero no llega a 1000, puesto que el
tubo 10-
3
no ni una sola clula que haya podido desa-
rrollarse.
Este mtodo tiene un margen grande de error, por ello con cada
re inoculan tres tubos y el n
2
de clulas vivas conteni-
das en la muestra original se calcula utilizando unas tablas de
probabilidades. (Tablas de JC De Man)
Ejemplo:
Podemos partir de una muestra lquida o
diluiramos un gramo de ella en 9ml. de diluyente y entonces
68
partiral1U3 de l/lo "ce' la solucin madre original. Em ambos CB-
sos cogeramos 1 m]
diluciones.
de la suspensin y procederamos a hacer
De tres a cinco diluciones sucesivas)vamos a inocular. por tri-
plicado;tubos de ensayo que contienen medio estril y una cam-
panita Durham
Suspensin
madre = 1ml.
Di.lucin
1/10
Dilucin
1/100
n
+ + + + + +

examinadas
Apreciacin de
resultados
1 ml. -1
+ + + ++ -
-2
+ - -
Total resultados
positivos 3 2 1
Formacin de un
nmero de tres
cifras
3 2 1
Con ayuda de unas tablas se ve que el n de microorganismos
corresponde a la cifra 321 es 15.
15 microorganismos se encontrarn en un 1ml. de muestra ori-
ginal. Si hubiramos partido de una dilucin -1 de 19rs. de
muestra slida original. 15 microorganismos en 1ml. y
en este ml. hay 0'1 grs. de muestra original.
69
En el caso de hacer ms de 3 Jiluciones consecutivas, slo se
consideran significativos los resultados de tres de las dilu-
ciones sucesivas, debe elegirse la dilucin que da el resulta-
do positivo ms alto, y las dos diluciones mayores que la si-
guen.
A veces se puede inocular las diluciones en medio slidos o -
semislidos. El proceso es el mismo/se mirar si ha habido de-
sarrollo en los tres tubos de cada dilucin y se anota de la
misma manera que cuando el medio de cultivo es lquido.
Suspensin
madre 1ml.
Dilucin
1/10
_. I ".'
Dilucin
1/100
Dilucin
1/1000
....
i ':
;.. ..
:,
..
..
~ . I
.... ,
+ + + +
+ - - -
70
Tabla para hallar el Nmero Ms (NMP) para 1 gr. de muestra
-------------------------------------------------------------------
Tubos positivos .Tubos positivos Tubos positivos Tubos positivos
O. I 0.01 O.(lOl MI'N 0.1 0.01 O()o:lI MPN 0.1 0.01 0.001 MPN 0.1 001 0001 t-IPN
o
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3.
6
9.
3.
6.1
9.2
12.
11.2
9.3
12.
l.
9.4
13.
16.
19.
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O
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11. '
15.
7.3
11.
15.
19.
11.
15.
20.
24.
16.
20.
24.
29.
2
2
2
2
2 .
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2
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2
2
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20.
Z6.
15.
20.
27-
34.
21.
211.
35.
42.
29.
36.
44.
53.
3
3
3
3
3
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3
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3
3
3.
3
3
3
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3
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o
o
I
I
1
1
2
2
2
2
3
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3
3
o 23.
1 39.
6-1.
3 95.
o 43.
I 75.
2 120.
3 160.
o 93.
1 150..
2 210.
3 290.
o 240.
I 460.
oo.
>1100.
Tabla oara hallat el (N.M.P) para 100 ml. de muestra usando 5 tubos


Tubos
positivos
Tubos
positivos
Tubos
positivos
Tubos
positivos
Tubos
positivos
Tubos
positivos
10 1 o 1 10 1 o 1 10 I 0.1 10 I 0.1 10 I 0.1 10 1 o I
mL. mL. mL. MPN mL mL ",L. MI'N mL. mL. mL MPN mL mL. mL. MPN mL. mL. ",L MPN mL. mL. mL. MPN
l' O
I 1
1 2
1 3
I 4
1 5
2 O
2 I
2 2
2 3
2
2 5
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2
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250
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5
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5
5
5
5
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5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
34
40
47
54
62
69
17
21-
26
31
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17
21
25
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32
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10
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13
15
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