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Alagn A. Anticuerpos seguros y eficaces: La revolucin de los nuevos antivenenos. Suplemento: Del DNA a la genmica: la revolucin biolgica contempornea.

Universidad de Mxico. Revista de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Nmero 617, noviembre (2002).

Anticuerpos Seguros y Eficaces: La Revolucin de los Nuevos Antivenenos Alejandro Alagn, Instituto de Biotecnologa, UNAM

Envenenamientos por animales y sus venenos Los envenenamientos por animales ponzoosos son un verdadero problema de salud pblica. En el ao 2000 la Secretara de Salud report 261,754 intoxicados por picaduras o mordeduras de animales; 208,444 fueron causados por alacranes y, el resto, por abejas, araas y serpientes. El tratamiento de eleccin es la aplicacin del antiveneno especfico. Nuestro pas dispone de antivenenos de gran calidad contra vipridos (cascabeles, nauyacas y cantiles), coralillos, la araa viuda negra (o capulina) y los alacranes (o escorpiones), por lo que la mortalidad es ms bien baja y contina descendiendo. Como corolario de lo hasta aqu mencionado, Mxico cuenta con la mayor experiencia clnica, a nivel mundial, en el manejo con anticuerpos de pacientes emponzoados (Fig. 1). Los venenos son mezclas altamente heterogneas de compuestos biolgica y farmacolgicamente especializados. Los compuestos txicos son mayormente de naturaleza peptdica o proteica. Los pptidos ms importantes de los venenos de los alacranes peligrosos son neurotoxinas que bloquean y/o modifican el mecanismo de apertura y cierre de canales inicos de las membranas excitables (Dehesa-Dvila et al.,

1995; Possani et al., 1999). Los venenos de las vboras poseen protenas con actividades necrticas, miotxicas, edematizantes y hemolticas, mientras que las serpientes de coral tienen neurotoxinas de mediano y bajo masa molecular que inhiben la unin neuromuscular. El veneno de la viuda negra se distingue de los anteriores ya que una sola protena de enorme tamao es la responsable de la toxicidad en mamferos. Esta brevsima descripcin de los venenos sirve para entender porqu el nico recurso eficaz en el tratamiento de estos accidentes son los antivenenos ya que poseen la variedad necesaria de anticuerpos que neutralizan a los distintos componentes txicos presentes en un veneno.

Los primeros antivenenos eran sueros El desarrollo de la inmunologa y los avances en la seroterapia han estado muy ligados. Los anticuerpos fueron descubiertos en 1890, cuando Behring y Kitasato demostraron que el suero (la porcin fluda de la sangre coagulada) de animales inmunizados con toxina diftrica o con toxina tetnica contena agentes protectores. Al inyectar suero inmune junto con una dosis letal de toxina a animales susceptibles stos sobrevivieron, en tanto que los animales control, que recibieron toxina pero no suero, murieron. El mismo Emil von Behring, a finales de 1891, trat con suero de oveja inmunizada a un nio Berlins con difteria que se debata entre la vida y la muerte; el resultado fue espectacular. En Pars, otro Emilio, de apellido Roux, repite la experiencia el 1o. de Febrero de 1894; esta vez utiliza antitoxina diftrica producida en caballos. De manera vertiginosa se producen los primeros antivenenos; Phisalix y Bertrand por un lado y

Calmette por otro, tambin en 1894, inmunizan caballos con veneno de serpientes europeas y cobras asiticas, y demuestran la utilidad de los sueros equinos en el tratamiento de mordidos por serpientes. Haba nacido la seroterapia. Cuando un paciente recibe un suero inmune se dice que ha sido inmunizado pasivamente, condicin que contrasta con la inmunizacin activa que resulta de la exposicin directa a un patgeno o toxina. Los principios activos de los sueros inmunes (antisueros) son los anticuerpos. Un anticuerpo es una protena que se une especficamente a una substancia en particular, su antgeno. Cada molcula de anticuerpo tiene dos sitios capaces de interaccionar con el antgeno correspondiente, sin embargo, todos los anticuerpos tienen la misma estructura general y a su conjunto se les llama inmunoglobulinas (Fig. 2). El papel principal de los anticuerpos es el de incrementar grandemente la eficacia de los mecanismos normales de resistencia hacia un agente especfico. Por ejemplo, un antisuero dirigido contra una bacteria contiene anticuerpos que cubren la superficie de la clula bacteriana y la vuelven ms susceptible a la fagocitosis; en muchos casos, la cubierta de anticuerpos, permite tambin que la bacteria pueda ser destruda por el sistema del complemento. Los anticuerpos protegen no slo contra las invasiones bacterianas sino tambin contra la accin de toxinas bacterianas y de ponzoas de animales venenosos. Si un animal es inmunizado con una toxina desarrollar anticuerpos capaces de combinarse con la misma y neutralizarla, esto es, la har no txica. Un suero que contiene tales anticuerpos es llamado antitoxina (e.g., contra la toxina tetnica); un suero con

anticuerpos dirigidos contra los diferentes componentes de un veneno animal es llamado antiveneno (e.g., contra el veneno de alacrn).

Muchos antivenenos son inmunoglobulinas purificadas Los seroterpicos de primera generacin, como los de Behring y Roux, se utilizaron hasta los primeros aos de la dcada de los 30s, si bien an quedan productores que los siguen preparando Hasta entonces, las antitoxinas y antivenenos eran los sueros crudos provenientes de caballos hiperinmunizados. Es decir, a los pacientes se les administraban multitud de protenas sricas irrelevantes que acompaaban a los anticuerpos. Con tales seroterpicos, las reacciones alrgicas y la enfermedad del suero eran muy frecuentes; por ejemplo, se estima que la frecuencia de la enfermedad del suero en los cientos de miles de nios tratados con antitoxina diftrica fue de alrededor del 50%. Esta incidencia se redujo substancialmente con el fraccionamiento de las inmunoglobulinas mediante su precipitacin con diversas sales y otros agentes precipitantes. El proceso de precipitacin separa, de manera muy eficiente, a las inmunoglobulinas de otras protenas sricas entre las que destaca la albmina por su capacidad de inducir reacciones adversas. Los productos constituidos por inmunoglobulinas altamente enriquecidas son la base para la seroterapia de segunda generacin que todava se utiliza ampliamente a nivel mundial. Antivenenos ms seguros: los faboterpicos Posteriormente, en las dcadas de los 40s y 50s, se estudi el efecto de varias enzimas proteolticas sobre las inmunoglobulinas (Fig. 3). El resultado principal de estas investigaciones fue el conocimiento de que la funcin neutralizante de los anticuerpos (la

que interacciona con las toxinas y molculas de los venenos) puede disociarse de las llamadas funciones efectoras de los anticuerpos (que son las responsables de varios de los efectos secundarios de la seroterapia). La modificacin proteoltica, adems, reduce el tamao de las inmunoglobulinas y sus propiedades inmunognicas y antignicas. Las inmunoglobulinas purificadas y digeridas con pepsina, es decir, como fragmentos F(ab)2, constituyen el estado del arte en la seroterapia de tercera generacin o faboterapia. El uso de faboterpicos prcticamente ha eliminado las reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato (anafilaxia) y de tipo tardo (enfermedad del suero). En ms de 250,000 pacientes tratados en el IMSS con faboterpicos (Alacramyn y Antivipmyn) no ha habido una sla reaccin aguda grave o alguna enfermedad del suero, aun entre los varios miles de pacientes tratados con mltiples dosis o los varios cientos tratados en varias ocasiones en un mismo ao (Maraboto-Martnez et al, 1997). Las estadsticas de la Cruz Roja de Len, Gto., con varias decenas de miles de pacientes picados por alacrn, confirman la seguridad de los faboterpicos (Caldern-Arana et al., 1996). Otra ventaja de los fragmentos F(ab)2 sobre las inmunoglobulinas es que llegan mejor al compartimento extravascular, lo que permite la neutralizacin eficiente de muchos componentes de los venenos que actan fuera del torrente circulatorio. Hace casi 4 aos propuse los trminos faboterapia y faboterpico para reemplazar los de seroterapia y antisuero asociados por mdicos y pacientes a reacciones secundarias de alta peligrosidad. Junto con un grupo de expertos clnicos, epidemilogos y productores hicimos la solicitud a las autoridades correspondientes; recientemente la faboterapia logr ya un lugar propio en la Farmacopea Mexicana. Este cambio conceptual

ha favorecido su empleo en muchos casos en que su utilidad para salvar vidas, reducir sufrimientos o limitar secuelas es indiscutible.

Las grandes avenidas para los antivenenos del futuro Actualmente la industria biotecnolgica tiene ms de una centena de anticuerpos recombinantes en ensayos clnicos. Slo en terapias contra el cncer hay ms de 40 anticuerpos en evaluacin por la Food & Drug Administration (FDA). De stos, unos 10 anticuerpos ya estn en fase III de estudio. As, varios de ellos seguramente se sumarn al arsenal teraputico de las dos docenas de anticuerpos recombinantes ya aprobados para su uso abierto por la FDA . Si bien los antivenenos existentes son eficaces y seguros tienen algunas limitantes. La principal es que, de origen, son heterlogos. Esto conlleva el riesgo, si bien minimizado en los faboterpicos, de posibles reacciones de hipersensibilidad inmediata o tarda. Otra limitante, no menos importante, es que se cae dentro de la respuesta inmune variable individual, es decir, hay caballos que responden muy bien y otros que no; adems, no se garantiza (an con esquemas de inmunizacin optimizados) una respuesta inmune adecuada y sostenida en los caballos respondedores. Dentro de este marco resulta difcil y dispendioso uniformizar la produccin de antivenenos. Otra desventaja es el nmero enorme de ratones que son utilizados para el seguimiento y control de calidad de la produccin de antivenenos. La tendencia actual en la produccin y el control de calidad de frmacos y biolgicos es la reduccin del nmero de animales involucrados. Es de esperarse, por tanto, legislaciones y reglamentos que restrinjan cada

vez ms la utilizacin de caballos como fuente de anticuerpos y de ratones en su valoracin. Otro problema asociado al uso de cualquier mamfero como fuente de anticuerpos teraputicos es la posibilidad, si bien baja, de la trasmisin hacia los pacientes de virus y priones; cada vez es mayor la lista de virus de los que hay que demostrar su ausencia en los caballos productores. Finalmente, ciertos venenos (como el de abeja) no inducen una respuesta policlonal protectora adecuada dada la pobre inmunogenicidad de algunos de sus componentes por lo que es difcil producir los antivenenos respectivos. Algunos de los desarrollos tecnolgicos de los ltimos aos pudieran aplicarse al campo de los antivenenos, si bien para aquellos venenos con mltiples componentes txicos an es muy difcil hacerlo. El uso de anticuerpos recombinantes humanos (o lo ms humanizados posible) eliminara muchas de las limitantes antes mencionadas. Se puede partir de anticuerpos monoclonales (Fig 4a) de ratn cuya capacidad neutralizante est bien valorada; mediante tcnicas de ingeniera gentica es posible lograr quimeras en las que el reconocimiento del antgeno est dado por los dominios V murinos y el resto del anticuerpo es de origen humano (Fig. 4b). Tambin es posible humanizarlos an ms (Fig 4c). Otra alternativa es generar construcciones de anticuerpos a partir de bibliotecas de genes que codifican para dominios V humanos. El despliegue en fagos (phage display) brinda esta posibilidad (Burton & Barbas, 1994). En su versin ms frecuente los anticuerpos se expresan como Fabs o Fvs (slo las regiones V H y VL) sobre la superficie de un fago filamentoso. Los Fabs o Fvs de inters se aislan a travs de rondas de seleccin contra el antgeno deseado por un proceso llamado seleccin por

pegado especfico de los fago-anticuerpos al antgeno unido a una fase slida, lavado exhaustivo y elucin de los mismos (biopanning); los fagos recuperados llevan la informacin gentica del anticuerpo con lo que puede llevarse a bacterias para su produccin. Las bibliotecas de anticuerpos humanos pueden construirse a partir del ARN que codifica para anticuerpos de linfocitos presentes en la sangre de individuos inmunizados naturalmente contra algn veneno; por ejemplo, hay cuidadores de colmenas que son resistentes al ataque de cientos de abejas y que tienen cantidades muy grandes de anticuerpos. Como puede verse an no se ha dicho la ltima palabra sobre antivenenos. Bibliografa

Burton, D.R. & Barbas, C.F., III (1994). Human antibodies from combinatorial libraries. Advan. Immunol. 57: 191-280.

Caldern-Aranda, E.S., Dehesa-Dvila, M., Chvez-Haro, A., & Possani, L.D. (1996) Scorpion stings and their treatment in Mexico. In "Envenomings and Their Treatments" (C. Bon and M. Goyffon, eds.), pp. 311-320, Editions Fondation Marcel Mrieux, Lyon, France.

Dehesa-Davila, M., Alagon, A. C., & Possani, L.D. (1995) "Clinical Toxicology of scorpion stings" In: CRC Handbook of Human Toxicology Series (Meier, J. & White, J. Eds.), pp. 221-238 CRC Press (New York).

Maraboto-Martnez, J.A., Chvez-Haro, A., Garca-Willis, C. Rivas, M. and Alagn, A. "Mexican Institute of Social Security: Epidemiological data on scorpion and snake accidents and their treatment".12th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins, Cuernavaca, Mor. September 21-26, 1997.

Possani, L. D., Becerril, B., Delepierre, M. & Tytgat, J. (1999) Scorpion toxins specific for Na+-channels. Eur. J. Biochem. 263: 1-15.

Pis de Figura Figura 1. Algunos animales para los que existen antivenenos. (a) Postabdomen (cola) de un alacrn Centruroides; el ltimo segmento, o telson, posee dos glndulas venenosas cuya secrecin desemboca en el aguijn. (b) Araa viuda negra o capulina (Latrodectus mactans); en la parte ventral del abdomen se localiza la marca caracterstica de la especie: una silueta roja en forma de reloj de arena; la tela que tejen es muy desorganizada y es de las ms resistentes. (c) Serpiente de cascabel del gnero Crotalus; ntese la lengua bfida, la cabeza triangular y la estructura al final de la cola que le da el nombre. (d) Coralillo de la especie Micrurus browni alimentndose de una culebra; esta especie posee el patrn colorido tpico para este grupo de serpientes el que tiene varias excepciones que pueden resultar peligrosas.

Figura 2. Esquema de la estructura de una molcula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas estn formadas por cuatro cadenas, dos pesadas (H, en azul) y dos ligeras (L, en amarillo). La cadena pesada tiene 4 dominios (uno variable y tres constantes) mientras que la ligera tiene 2 (uno variable y otro constante). Cada dominio variable, tanto de la cadena L como de la H, posee 3 regiones hipervariables que son las que directamente establecen los contactos moleculares para pegarse al antgeno correspondiente. Dada la simetra de la molcula cada anticuerpo tiene la capacidad de reconocer a dos molculas de antgenos. Varios puentes disulfuro ayudan a estabilizar la estructura. La regin de la bisagra de las cadenas H es altamente flexible.

Figura 3. Modificacin enzimtica de las inmunoglobulinas. La regin bisagra es muy susceptible al ataque de enzimas proteolticas. La papana corta de manera tal que genera dos fragmentos Fab (con capacidad de reconocer a su antgeno) y un fragmento Fc. La pepsina corta por abajo del puente disulfuro de la bisagra dejando a los dos fragmentos Fab unidos covalentemente en lo que se conoce como el fragmento F(ab) 2 mientras que degrada al fragmento Fc.

Figura 4. (a) Anticuerpo murino. (b) Anticuerpo quimrico (dominios C humanos, dominios V de ratn). (c) Anticuerpo humanizado (las regiones hipervariables que reconocen al antgeno de ratn han sido injertadas en un anticuerpo humano). (d) Anticuerpo humano.