HPLC - CRQ

CONSELHO REGIONAL DE QUMICA - IV REGIO (SP)
Conceitos fundamentais de Cromatografia a lquido de Alto Desempenho (HPLC)

Ministrante: Ayrton Argenton CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
Apoio
So Jos do Rio Preto, 29 de maio de 2010

Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
Minicursos CRQ-IV - 2010

Conceitos fundamentais de HPLC
CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LQUIDO DE ALTO DESEMPENHO(HPLC)

AYRTON ARGENTON
Prof. Ayrton Argenton: Qumico formado pela USP. Pesquisador Snior pela REPUSA Petrobrs, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de Pesquisas e Laboratrio da CGS Instrumentao Ltda. Ministrou treinamentos tcnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20 anos de experincia e especializao em treinamento de Cromatografia a Lquido e a Gs em Inds. Qumicas, Farmacuticas, Alimentcias, Destilarias e Usinas de Acar e lcool e Empresas relacionadas. Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS Centro de Educao Profissional www.cepcursos.com
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Nas indstrias qumicas, farmacuticas, alimentcias, refinarias, petroqumicas, laboratrios de anlises clnicas, ambiental e forense entre outras, frequentemente necessrio separar, isolar, purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas vezes bastante complexas.

SEPARAO Operao pela qual uma mistura dividida em pelo menos duas fraes com diferentes composies. obtida por meios fsicos embora reaes qumicas podem ser envolvidas no processo. Os mtodos fsico-quimicos de separao so baseados na utilizao de alguma propriedade fsica das substncias a serem separadas. Exemplos:
TIPO DE SEPARAO Destilao fracionada Extrao com solvente PROPRIEDADE FSICA Diferena de ponto de ebulio Diferena na constante de distribuio (partio) dos componentes em dois solventes Diferena de afinidade das substncias por um material ativo ou adsorvente
Cromatografia

IMPORTNCIA DA CROMATOGRAFIA Velocidade
Poder de resoluo
Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 10-15g)
Simplicidade da tcnica

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

VISO GERAL DE CROMATOGRAFIA
O objetivo da cromatografia separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substncias seja para identificao, quantificao ou obteno da substncia pura para os mais diversos fins. Tal separao d-se atravs da migrao da amostra atravs de uma fase estacionria por intermdio de um fluido (fase mvel). Aps a introduo da amostra no sistema cromatogrfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase mvel devido ao efeito retardante da fase estacionria. O equilbrio de distribuio determina a velocidade com a qual cada componente migra atravs do sistema.

COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO

FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO

FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO

FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO

FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO

CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA
TCNICA
PLANAR
EM COLUNA
FASE MVEL
LQUIDO
GS
FLUIDO SUPERCRTICO
LQUIDO
FASE ESTACIONRIA
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA

High Performance Liquid Chromatography

CLAD = Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho CLAE = Cromatografia a Lquido de Alta Eficincia DESCRIO GERAL DE HPLC A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica preenchida com a fase estacionria (FE) Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes da mistura atravs da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades As substncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. J as substncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma.

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC Mistura de aminocidos

High Performance Liquid Chromatography

APLICAO HPLC utilizada em anlises de compostos no volteis ou instveis termicamente onde a cromatografia a gs no pode ser utilizada. Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas caractersticas, o campo de aplicao de HPLC extremamente vasto. ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAES E ANALITOS Indstria Alimentos Tintas Qumica Clnicas Farmacutica Analitos Acares, cido ascrbico, cido benzico, parabenos, vitaminas, protenas, peptdeos, aminocidos Resinas, Tensoativos, biocidas Polmeros Metablitos, protenas, peptdeos, aminocidos Princpios ativos

COMPARATIVO HPLC / CG
Fator CG
Amostra ou derivado voltil estvel termicamente na temperatura de trabalho Gases, lquidos e slidos baixo peso molecular Em geral mais rpidas que HPLC
HPLC
Requisitos da amostra
Amostra solvel na fase mvel Lquidos e slidos Inicos ou covalentes Baixo e alto peso molecular Em geral mais lentas que CG
Tipo de Amostra
Tempo de anlise relativo
Pratos tericos por coluna Capacidade preparativa Sensibilidade
At 300000 Pobre 10-12 g (DIC / DCE)
At 30000 Boa 10-9 g (UV) 10-15 g (coulomtrico)

INSTRUMENTAO EM HPLC DIAGRAMA DE UM CROMATGRAFO A LQUIDO
RESERVATRIO FASE MVEL INJETOR COLUNA DETECTOR
BOMBA
AQUISIO DE DADOS
O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes componentes: 1. 2. 3. 4. 5. Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel Sistema de introduo de amostra Sistema analtico: coluna cromatogrfica e termostato Sistema de deteco (um ou mais detectores) Sistema de registro e tratamento de dados.

DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC

FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC

RESERVATRIO DA FASE MVEL A figura abaixo ilustra o reservatrio da fase mvel e seus componentes:
tampa de teflon

CONSIDERAO IMPORTANTE 1: A fase mvel no pode conter partculas para evitar danos bomba, injetor e coluna, logo necessrio filtrao antes de armazenar a fase mvel no reservatrio. A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:
A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel. Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m)

CONSIDERAO IMPORTANTE 2: A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo de separao o que pode interferir no desempenho da anlise. As tcnicas de degaseificao so: Ultrasom Refluxo com resistncia de aquecimento Vcuo (trompa dgua) Purga com Hlio Uso de membrana semipermevel e vcuo online.

BOMBA CARACTERSTICAS PRINCIPAIS
Leva a fase mvel desde o reservatrio at a coluna Alta reprodutibilidade e exatido Vazo contnua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min Vazo constante independentemente da presso Alta resistncia corroso inrcia qumica a solventes comuns Opera a altas presses (6000 psi)
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase estacionria. Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza pulsao. Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do processo em presses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos. importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.


BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE BOMBEAMENTO ISOCRTICO A composio da fase mvel mantida constante durante toda anlise cromatogrfica. Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para uma anlise isocrtica.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE Alguma anlises necessitam alterao da composio da fase mvel, sem alterao da vazo total, com a finalidade de diminuir tempo de anlise e/ou melhorar a separao dos componentes da amostra.
O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso. No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e a seleo do solvente a ser utilizado d-se atravs de vlvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema. J no caso do bombeamento de alta presso, cada solvente tem uma bomba especfica. A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para o a anlise por gradiente a baixa e alta presso.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSO
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSO

BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente. ISOCRTICA GRADIENTE

INJETOR SISTEMA DE INTRODUO DE AMOSTRA Em HPLC, a injeo de amostra realizada com auxlio de vlvulas especiais que permitem introduo com grande preciso e exatido de volumes que variam, em geral, de 5 a 20l. A figura abaixo, mostra um esquema de uma vlvula tpica nas posies de carga e de injeo.
A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de injeo.

COLUNAS CROMATOGRFICAS COLUNAS ANALTICAS E PRE-COLUNAS A separao efetuada nas colunas cromatogrficas, feitas em ao e resistentes a altas presses(at 500 atm) Os tubos das colunas so preenchidos com a fase estacionria conveniente, geralmente slica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, at de 1 m) de dimetro mdio. Devido a queda de presso elevada nos tubos, as colunas so relativamente curtas e de paredes espessas. COMPRIMENTO: 3 60 cm DIMETRO INTERNO: 0,2 8 mm As colunas normais apresentam dimetro interno variando de 4 6 mm e comprimento que depende da granulometria da fase estacionria como mostra a tabela abaixo. Granulometria (m) 3-5 7 10 Comprimento (cm) 10 15 At 25 cm (em casos especiais, at 60 cm)

COLUNAS CROMATOGRFICAS COLUNAS ANALTICAS CONSIDERAES IMPORTANTES: Como o tempo de reteno depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a separao. Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficincia, esto sendo introduzidas colunas de dimetro interno de 1 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos menores o que resulta em diminuio substancial do custo de operao e aumento de sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.

COLUNAS CROMATOGRFICAS PR-COLUNAS (GUARD COLUMNS) SEMPRE USE PR-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA ANALTICA CARACTERSTICAS PRINCIPAIS: Protege a coluna analtica contra contaminaes qumicas Mesmo material de empacotamento da coluna Comprimento Tpico: 25 mm Descartveis O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da fase mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas prejudiciais coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da amostra, pode acontecer o que se chama de reteno irreversvel, ou seja, a afinidade do contaminante pela coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros centmetros do empacotamento. Retido na cabea da coluna, o contaminate pode provocar perda da eficincia, aumento de presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o contaminante no atingir a coluna analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os mais comuns so aumento de presso e elevao no nvel de rudo), o analista substitui a pr-coluna, que em mdia custa 10 vezes menos que a coluna analtica.

DETECTORES
O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado. Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas: Alta Sensibilidade Estabilidade Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal Reprodutibilidade Resposta Linear A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa de concentrao Resposta rpida aos analitos No contribuir para o alargamento do pico O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade. Confiabilidade Facilidade de manuseio No destrutivo Condio necessria para cromatografia preparativa Seletividade Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro. Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
extensa faixa
do sistema.

DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC so: ndice de refrao Espectrofotometira UV-Visvel Fluorescncia Eletroqumico Espectrometria de massa LC/MS

DETECTORES NDICE DE REFRAO No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alterao do ndice de refrao. Essa alterao em relao ao valor da fase mvel livre de analito detectada. A deteco s possvel quando o ndice de refrao do analito diferente do IR da fase mvel. Esse detector normalmente utilizado quando os analitos no absorvem na regio de comprimento de onda do UV-VIS. Apresenta as seguintes desvantagens: baixa sensibilidade no permite a utilizao em anlises por gradiente (pois o IR varia com a composio da fase mvel) temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) APLICAO Anlises de carbohidratos e acares em geral.

DETECTORES ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS) Baseia-se na absorbncia da luz pelo analito ao passar pelo detector. um detector seletivo pois s detecta os compostos que absorvem no comprimento de onda em que o detector for ajustado. o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substncias absorvem radiao UV. Exemplos de substncias so: olefinas, aromticos, compostos contendo ligaes C=O, C=S, N=O. CONSIDERAES IMPORTANTES: A fase mvel utilizada no pode absorver no comprimento de onda selecionado A pureza da fase mvel extremamente importante (traos de impurezas podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Fotomtricos comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm Espectrofotomtricos comprimento de onda varivel: 00nm a190nm

DETECTORES
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS) TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Espectrofotomtricos O comprimento de onda varivel entre 190nm e 800nm selecionado atravs do monocromador (UV = lmpada de deutrio e VIS = lmpada de tungstnio). Possui maior aplicao pois permite selecionar o comprimento de onda mais adequado para os componentes a serem analisados. Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbncia. Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse absorve e outros no. Permite a utilizao de anlise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde os constituintes da fase mvel no apresentam variao de absorbncia. Permite obter o espectro de absorbncia de cada componente separado interrompendo o fluxo da fase mvel e assim selecionar o melhor comprimento de onda.

DETECTORES ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS)
Como mostra o esquema do detector, o comprimento de onda selecionado atravs do monocromador do feixe de luz emitido pela lmpada de deutrio ou tungstnio e incide na cela por onde passam os componentes da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua absortividade molar e concentrao. A quantidade de luz no absorvida detectada pela fotomultiplicadora.

DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Espectrofotomtricos (REDE DE DIODOS DIODE ARRAY)

Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente dispersada em uma grade hologrfica e os comprimentos de onda resultantes so focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a 1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxlio de um computador, pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma srie de espectros em intervalos de tempo fixos.
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DETECTORES REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM RELAO AO DETECTOR UV-VIS
No detector UV-VIS, seleciona-se o comprimento de onda que pode no ser o mais adequado para todos os componentes da amostra. Isso resulta na perda de sensibilidade de alguns componentes da amostra. A figura ao lado ilustra a diferena de intensidade do pico para um composto em funo do comprimento de onda. Com o DAD, pode-se selecionar o melhor comprimento de onda para cada um dos componentes, otimizando dessa forma a sensibilidade. Isso extremamente importante na determinao de impurezas nas snteses e controle de qualidade de princpios ativos de produtos farmacuticos.

DETECTORES ELETROQUMICOS Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial eltrico. Em um processo eletroqumico, um par de eletrodos colocado na cela e um potencial suficientemente elevado aplicado provocando uma reao de oxidao ou reduo gerando uma corrente que medida em um detector eletroqumico. A corrente gerada proporcional a concentrao do composto. TIPOS DE DETECTORES Amperomtrico O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%). Coulomtrico O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente 100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade muito maior (10-15 mol = fentomol) .

DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulomtrica:

DETECTORES ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY
possvel montar um conjuntos de detectores coulomtricos em srie o que permite aplicar um potencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente em cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar de no terem sidos separados. possvel o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais. Tais detectores tem grande aplicao na anlise de produtos farmacuticos, bebidas e alimentos, anlises ambientais e em neurocincia (neurotransmissores, drogas).

DETECTORES ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY

COMPARAO DE DETECTORES HPLC
ndice de Refrao Mudana do IR da fase mvel Universal Micrograma 103 104 3-15 Alta
Espectrofotometria UVVIS Absorbncia de luz UVVIS Seletivo Nanograma 104 105 1-20 Baixa Compostos que absorvem na regio UVVIS
Fluorescncia Excitao com luz produz emisso fluorescente Seletivo < picograma 103 105 8-25 Baixa Compostos ou derivados que fluorescem
Eletroqumico Oxidao ou reduo em um potencial fixo Seletivo Fentograma 105 5-10 Mdia Espcies que oxidam ou reduzem
Princpio de operao Tipo Quantidade mnima detectvel Faixa de linearidade Volume da cela (microlitro) Sensibilidade a temperatura Aplicaes
Geral

ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
Detector universal para compostos no volteis. Baseado na habilidade das partculas causarem espalhamento(scattering) de ftons, quando elas atravessam um feixe de luz policromtica. O lquido efluente do HPLC primeiro nebulizado e a mistura aerosol resultante contendo as partculas dos analitos dirigida a um feixe de luz. As partculas causam espalhamento da luz. gerado um sinal, que proporcional massa presente, e independe da presena ou ausncia de grupos cromforos, fluorforos ou eletroativos. Qualquer analito no voltil pode ser detectado. Pode ser usado acoplado a um espectrmetro de massa, para fornecer uma anlise completa da amostra. Aplicaes para o elsd: Lpidios, acidos graxos, carbohidratos, polmeros, esteroides, aminocidos, aditivos de plsticos, produtos farmacuticos, etc.

ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR

CHARGED AEROSOL DETECTOR CORONA
Este detector oferece os benefcios de desempenho que cada um dos detectores: ndice de refrao, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescncia de nitrognio num nico detector. O eluente primeiro nebulizado com nitrognio, e as gotas so secas para remover a fase mvel, produzindo as partculas dos analitos. Uma corrente secundria de nitrognio passa por um sistema de alta voltagem e carregado positivamente. Esta carga transferida para as partculas do analto, que flue em sentido oposto. A carga transferida para um coletor onde medida por um eletrmetro altamente sensvel, gerando um sinal que diretamente proporcional quantidade de analito presente. O fator de resposta do analito independente da estrutura qumica. Aplicaes do CAD: Ideal para uma larga faixa de aplicaes de compostos no volteis e semi-volteis: drogas, carbohidratos, lipdios, esterides, peptdios, protenas, polmeros. Indstrias farmacuticas, alimentcias, qumicas, pesquisa life science,etc.


QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES
Sensibilidade Faixa Dinmica Consistncia de Resposta Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade Cromatogrfica Facilidade de Uso
Charged Aerosol
UV
Evaporative Light Scattering Chemiluminescence Nitrogen
Refractive Index

AQUISIO DE DADOS
Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma Armazenar e registrar Controlar a composio da fase mvel (isocrtica e por gradiente), vazo da bomba, amostrador automtico, temperatura da coluna Realizar clculos para System Suitability Test (SST)

SEPARAO CROMATOGRFICA
Em funo da fase estacionria utilizada tem-se os seguintes mecanismos de separao: Adsoro Partio Troca inica Excluso Bioafinidade

ADSORO
A fase estacionria um slido contendo grupos (stios ativos) que podem adsorver certas substncias. Na adsoro tem-se o seguinte equilbrio:
Kads =
[adsorvido na FE] [desorvido na FM]
Compostos com diferentes constantes de adsoro so separados.
FM
FE

PARTIO A fase estacionria um lquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte slido. As molculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionria ligada e a fase mvel lquida de acordo com sua afinidade relativa:
Kpart =
[dissolvido na FE] [dissolvido na FM]
Compostos com diferentes constantes de partio so separados.

PARTIO
FM
FE
A FM carrega as molculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilbrio, molculas na FE passam para a FM e so arrastadas. Tem-se um equilbrio dinmico em cada segmento da coluna. Como a FM est em contnuo movimento, esta acaba retirando todas as molculas da coluna.

TROCA INICA
A fase estacionria uma resina catinica ou aninica. O esquema abaixo ilustra o processo:
+ + + -

POR EXCLUSO O esquema abaixo ilustra o processo:
A separao efetuada de acordo com o tamanho das molculas. A fase estacionria tem poros de tamanho controlado Molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de reteno Molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna pois no entram nos poros A tcnica utilizada na anlise de compostos de alta massa molecular O mecanismo da excluso forma a base da cromatografia gel (permeao de gel e filtrao de gel) utilizada na determinao de distribuio de peso molecular de polmeros e protenas

BIOAFINIDADE O esquema abaixo ilustra o processo:
Nessa tcnica somente componentes que possuem bioafinidade com a fase estacionria so retidos.

PARMETROS CROMATOGRFICOS
Uma srie de parmetros cromatogrficos so importantes para serem utilizados na identificao dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatogrfico e auxiliar na otimizao do processo de separao.
Os parmetros cromatogrficos a serem discutidos so:
TEMPO DE RETENO FATOR DE RETENO FATOR DE SEPARAO NMERO DE PRATOS RESOLUO

PARMETROS CROMATOGRFICOS TEMPO DE RETENO
Por definio chamamos de TEMPO DE RETENO, tr, de uma substncia ao tempo decorrido do instante em que a amostra foi introduzida at o instante do mximo do pico.
Na anlise cromatogrfica, mantido constantes a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna, o tempo de reteno constante.

PARMETROS CROMATOGRFICOS
A partir da figura acima, definimos os seguintes parmetros cromatogrficos de acordo com as equaes abaixo:
Parmetro Cromatogrfico Definio
Fator de reteno Fator de separao Nmero de pratos Resoluo Rs = N
k =
tr / to tr2 / tr1
= 16 ( tr / Wb )2
2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

PARMETROS CROMATOGRFICOS NMERO DE PRATOS N = 16 ( tr / Wb )2
Nmero indicativo da performance da coluna. a medida da largura do pico em relao ao seu tempo de reteno. o parmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatogrfico.
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um prato terico. onde L = comprimento da coluna L H= N = nmero de pratos N

PARMETROS CROMATOGRFICOS RESOLUO Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar duas substncias.

EFICINCIA DA COLUNA
A introduo da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilbrio entre FE e FM muito rpido, a largura dos picos tambm deveria ser aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso no ocorre devido a processos de transporte de massa que altera a velocidade das molculas de um mesmo composto dentro da coluna. Estatisticamente algumas molculas viajam mais rapidamente e outras mais lentamente que a mdia das molculas, atingindo o detector em tempos diferentes. Consequentemente, o pico registrado alargado. Alm dos processos de transporte de massa, causas externas coluna, tambm contribuem para o alargamento dos picos. Quanto maior o valor de N maior a eficincia da coluna. A altura equivalente a um prato terico outra maneira de considerar a eficincia da coluna. Quanto menor H, maior a eficincia da coluna. H o resultado da somatria das contribuies de cada um dos processos de alargamento intra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).

EFICINCIA DA COLUNA Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos: 1-Difuso catica(Eddy diffusion) caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce uma constante do processo e dp o dimetro da particula. 2- Transferncia de massa na fase mvel ao passar no interstcio das partculas, as molculas que viajam perto das paredes da FE tero velocidades menores das que viajam no centro H= Cm.dp2.u/Dm, onde u a velocidade da fase mvel, Dm o coeficiente de difuso da substncia na fase mvel. 3- Contribuio da FM estagnada.Dentro dos poros das partculas, algumas molculas so mais retidas do que outras. H = Csm.dp2.u/Dm 4- Influncia de transferncia de massa com a FE aps a difuso das molculas dentro dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da FE, tambm demoraro mais para sair e se atrasaro em relao a outras, consequentemente, o pico se alargar. H = s.u.df2/Ds, onde df a espessura do filme e Ds o coeficiente de difuso da substncia da fase estacionria.

EFICINCIA DA COLUNA Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.): 5- Difuso longitudinal na fase mvel H = Cd.Dm/u A somatria desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto diminuio da eficincia da coluna. De modo geral as seguintes variveis contribuem para o alargamento do pico: Substncia i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, dimetro do poro, rea superficial, Tcoluna). A velocidade da fase mvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benficos para outros. Portanto, a avaliao de H em funo da velocidade da FM passa por um mnimo. Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e dimetro interno dos tubos que ligam a vlvula de introduo da amostra coluna, volume das conexes envolvidas, volume da cela do detector, etc.

EFICINCIA DA COLUNA

EFICINCIA DA COLUNA
OTIMIZANDO EFICINCIA DA COLUNA Os seguintes fatores devem ser considerados na otimizao da eficincia da coluna: Tamanho de partcula Viscosidade da fase mvel Temperatura Empacotamento A equao de Van Deemter mostra que quanto menor a partcula, menor H e menor a influncia da vazo na eficincia da coluna:
10
5 3 Vazo

FASES ESTACIONRIAS
As FE so constitudas de material slido, granulado, finamente dividido e densamente empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente ao. O material slido pode estar revestido ou ligado quimicamente a um lquido.
TIPOS DE FASES ESTACIONRIA

FE SLIDA FE POR EXCLUSO FE POR TROCA INICA FE POR BIOAFINIDADE FE QUIMICAMENTE LIGADA NORMAL REVERSA

FASE ESTACIONRIA SLIDA
Separao realizada por mecanismo de adsoro Utiliza partculas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons Solventes mais utilizados so de mdia e baixa polaridade Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente slica SLICA A slica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, SiOH vicinal e germinal. Os grupos silanol so os mais importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o composto, maior a reteno. A ordem de eluio em slica : hidrocarbonetos saturados < olefinas < aromticos < teres< steres < aldedos cetonas < lcoois < aminas < amidas < cidos carboxlicos. Dependendo do procedimento de produo da slica, suas caractersticas, como volume de poro, dimetro de poro, rea superficial, nmero de grupos silanol, variam resultando em reteno varivel.

FASE ESTACIONRIA POR EXCLUSO
A separao baseia-se no tamanho das molculas dos componentes da amostra em relao ao dimetro dos poros da fase estacionria. As fases estacionrias podem ser slica ou polmeros de poliestireno-divinilbenzeno, poliacrilamidas e outros, com distribuio de dimetro dos poros controlada. Molculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as molculas grandes no conseguem entrar nos poros. Desta forma elas so permeadas seletivamente. A tcnica denominada cromatografia de excluso por tamanho.

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA POR EXCLUSO
A figura abaixo ilustra o processo de separao:

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA POR EXCLUSO
APLICAES: PERMEAO EM GEL (FM orgnica) Resinas alqudicas Epxidos Poliestirenos Borracha natural Silicones FILTRAO EM GEL (FM aquosa) Peptdeos Proteinas Enzimas cidos Nucleicos Lipdios
Colunas de permeao de gel fabricadas com sais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas com dimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e acares.

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA
A separao baseia-se na interao eletrosttica dos componentes da amostras com grupos inicos da FE. A FE normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual esto ligados grupos inicos, ou a FE slica recoberta com uma fina camada de poliestirenodivinilbenzeno onde grupos inicos esto ligados. Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca inica so: SO3- : trocadores fortes de ctions CO2- : trocadores fracos de ctions NR3+ : trocadores fortes de nions NH2R+ : trocadores fracos de nions

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA So as fases mais importantes da cromatografia lquida Obtidas pela reao dos grupos silanois da slica com compostos contendo grupos polares(Fase Normal) ou nao polares(Fase Reversa). Na Fase Quimicamente Ligada, a slica gel, atravs dos grupamentos Si - OH, se liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade qumica. A Cromatografia de Fase Ligada subdividida em Fase Normal e Fase Reversa de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados slica gel. As notveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase Ligada a mais utilizada em todo o mundo.

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R) -Si-OH -Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que provocam alargamento dos picos.

FASES ESTACIONRIAS FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA Para a produo das Fases Quimicamente Ligadas, a slica gel submetida a um processo de hidrlise formando grupos silanis SiOH, grupo quimicamente ativo no qual se ligar o grupo funcional atravs de reaes de silanizao, utilizando organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais, dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase monomrica ou polimrica. Infelizmente, devido a efeitos estricos, muitos grupos SiOH no reagem permanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos. Ligao qumica tradicional usando silano monofuncional alcana um mximo de 50% ou uma densidade de ligante de ~4mol/m2. Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como Endcapping.

FASES ESTACIONARIAS ENDCAPPING
Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais necessrio um passo secundrio de ligao para cobrir esses grupos ainda presentes na slica. O processo denominado endcapping efetua-se em geral trimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres com
As slicas usuais s podem ser utilizadas na faixa de pH 2 8, pois os grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a slica se dissolve em fase mvel contendo gua em pH maior que 8. Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos bsicos, limitao de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados atravs de desenvolvimentos mais recentes, tais como: slica de alta pureza, partculas hibridas, slica tipo C(slica hidreto) e novas quimicas ligantes.

ENDCAPPING

FASES ESTACIONRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA DE ALTA PUREZA(slica tipo B) maior que 99.995%, com menos de 50ppm de metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente cidos). PARTCULAS HBRIDAS desenvolvido pela Waters, essas partculas so um hbrido orgnico/inorgnico.Contm ambos slica e organosiloxane. produzida pela mistura de dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si + (RO)3SiR. O produto da reao contm unidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nvel molecular. O teor de carbono cerca de 7%, antes de modificaes da superfcie. Colunas Xterra so produzidas com essas partculas. Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficincia ou capacidade e devido ao teor reduzido de grupos silanol, fornecem excepcional forma de picos para analitos bsicos. slica TIPO C slica HIDRETO desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de slica ultra pura(baixo teor de metais), atravs de uma tecnologia prpria, a slica tipo B convertida em slica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contm menos de 3% de grupos SiOH. Por isso no forma ligaes fortes com gua o que permite utiliza-la como fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e at Agua/Acetonitrila com excelente preciso.

FASES ESTACIONARIAS NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA MONOLTICA MONOLITHIC slica GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS Grupos di-isopropil e di-isobutil incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligaes Si-O contra hidrlise cida. QUMICA SILANO POLIFUNCIONAL O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior estabilidade em baixo e alto pH e menor sangramento para LC/MS. Porm os silanos polifuncionais so de controle mais difcil. GRUPOS POLARES EMBEBIDOS A incorporao de um grupo polar( ex. Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidroflica de reagentes ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente seletividade e melhor forma de pico para analitos bsicos devido a blindagem dos silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas so geralmente menos retentivas do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e bsicos. Esto se tornando muito populares para o desenvolvimento de mtodos de difceis separaes.

SLICA DE ALTA PUREZA

PARTICULAS HIBRIDAS

SLICA MONOLITICA MONOLITHIC SLICA

SLICA FUSED CORE PARTICLE
Tecnologia de partcula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rpida. Uma camada de slica porosa fundida na superfcie de slica slida. A particula tem diametro total de 2.7m e a camada porosa 0.5m, rea superficial de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 9. As ligaes da fase estacionria so monomricas e endcapped maximinizado. Como o passo de difuso de apenas 0.5m, reduz a disperso axial e minimiza o alargamento de pico. Possui eficincia de particulas sub-2m sem a queda de presso que estas particulas apresentam e portanto no necessita de equipamento uhplc. www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl Site da sigmaaldrich supelco the report volume 25.2 Colunas ascentis express particle e colunas halo

GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS

ADSORVENTES DE HPLC E CARACTERSTICAS

FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA NORMAL

Grupos Funcionais Polares so ligados matriz de slica. A tcnica, em geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsoro. GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS: DIOL CIANO AMINO

FASE ESTACIONRIA REVERSA
Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados base de slica so apolares. Os analitos so atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais no polares. O analito mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em
fase reversa.
OCTADECIL
OCTIL
FENIL
Si- O - Si O O
C18 C18 C18 C18
Si- O - Si O O
C8 C8 C8 C8
Si- O - Si O O
CH2CH2CH2CH2-
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -

FASE MVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente. A escolha da composio da FM leva em conta vrios fatores, tais como:
Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade, partio e adsoro e, portanto, a separao Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de deteco dos componentes Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna Propriedades que afetam a segurana (toxidez e inflamabilidade) Custo

FASE MVEL
SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS Os seguintes parmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da FM: Viscosidade Compressibilidade Presso de vapor Toxidez ndice de Refrao Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes Fora dos Solventes

FASE MVEL SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS VISCOSIDADE A viscosidade do solvente ou misturas de solventes tem importncia fundamental durante o bombeamento isocrtico ou por gradiente. A figura abaixo apresenta a viscosidade de alguns solventes.
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FASE MVEL SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS VISCOSIDADE
P da coluna depende da vazo, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento da coluna. Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e elevam o P.
Exemplo da influncia da viscosidade em coluna fase reversa C8- 5 m 25cm 4.6mm:

Solvente Metanol Isopropanol Viscosidade (cP) 1.1 2.2 Vazo (ml/min) 1.00 1.00 P (atm) 102 460

FASE MVEL SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS VISCOSIDADE
gua, metanol, hidrocarbonetos e outros compostos com viscosidade menor que 1cP so timos solventes no parmetro viscosidade. A viscosidade influncia na eficincia pois afeta o coeficiente de difuso acarretando em perda de nmero de pratos tericos da coluna. A viscosidade de misturas de solventes no varia linearmente com a composio.

FASE MVEL SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS CORTE UV (CUT OFF)
O UV cut off o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma unidade de absorbncia em uma cela de 1cm de caminho ptico. uma referncia para a seleo do solvente da FM quando se usa detector UV. importante determinar o espectro de absoro do solvente antes de us-lo como FM, pois eventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.

SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERSTICAS
Alm das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolha dos solventes: Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados atravs da coluna Imiscibilidade com a FE Inrcia qumica com a FE e os componentes da amostra Pureza condizente com o detector utilizado. Mistura de solventes devem produzir solues homogneas fator importante nas anlises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de solventes; em caso de troca de dois solventes imiscveis, deve-se usar um solvente intermedirio solvel em ambos). Sistemas no miscveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e induzem rudos no detector alm de alterar os tempos de reteno e prejudicar anlises quantitativas.

SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS FORA DOS SOLVENTES
A interao das molculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes foras de interao: Disperso Interao dieltrica Dipolos Pontes de hidrognio

SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS
Miscibilidade em gua Hexano Isooctano Tetracloreto de carbono Clorofrmio Cloreto de metileno Tetrahidrofurano ter dietlico Acetona Acetato de etila Dioxano Acetonitrila 2-Propanol Metanol gua no no no no no sim no sim pobre sim sim sim sim sim Fora do Solvente 0.00 0.01 0.14 0.31 0.32 0.35 0.29 0.43 0.45 0.49 0.50 0.63 0.73 >0.73 Viscosidade a 20C, cP 0.33 0.50 0.97 0.57 0.44 0.55 0.23 0.32 0.45 1.54 0.37 2.30 0.60 1.00
UV cut off 200 200 263 245 235 215 215 330 260 215 190 210 205 -
IR 20C 1.3750 1.3910 1.4595 1.4460 1.4240 1.4070 1.3530 1.3590 1.3720 1.4220 1.3440 1.3770 1.3290 1.3328

FASE MVEL
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da fase mvel, varia o fator capacidade(k=tr/to) e consequentemente a seletividade na separao. Variao de tr e resoluo com a composio do solvente em anlise de metil, etil, propil e butil parabenos. coluna ODS (10cm x 0.6 cm), UV 254nm, 40C, gua/metanol

SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Variao do fator capacidade com a composio da fase mvel

FASE MVEL
SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODO ANALTICO

Abaixo descreve-se um procedimento tpico para seleo de FM em separaes isocrticas com fase reversa: Escolher a coluna conveniente (C8 C18) Fixar a temperatura da coluna (40C) Para compostos cidos ou bsicos ajustar a FM gua com cido fosfrico 0.05M ajustando o pH a 3.5 com hidrxido de sdio Equilibrar a coluna com solvente orgnico puro (acetonitrila ou metanol, vazo = 1.5ml/min) Injetar 10-20 l da amostra Se os componentes elurem perto de to, repetir as anlises alterando a concentrao de gua crescentemente at o obter separao satisfatria. A figura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:

SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODO ANALTICO
Constata-se a fora do solvente na separao.


FASE ESTACIONRIA REVERSA ORIENTAO PARA OTIMIZAO DA SEPARAO
picos muito rpidos
Fase mvel 100% Orgnica
picos muito lentos
Adicione gua (incrementos de 20%) at k = 5

injete amostra
Utilizar Fase Normal Adicione pequenas quantidades de modificadores orgnicos fortes Ajuste pH para os compostos parcialmente inicos; fora inica Ajuste Temperatura Altere o modificador
fator reteno : k = tR / tM fator separao: = k2 / k1 = tR2 / tR1
Ajuste a > 1.2

picos muito prximos
Diminua vazo Aumente a coluna Diminua as partculas

ainda no separa
Tente outra Fase estacionria

REAES PS-COLUNAS
Para a deteco de alguns componentes, principalmente a baixas concentraes, preciso transform-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado detector. Isso necessrio quando o componente: No bom cromforo No bom fluorforo No eletroquimicamente ativo Nestes casos efetua-se reaes especficas, formando derivados que possam apresentar algumas das seguintes propriedades: Alta constante de equilbrio de formao Rpida velocidade de formao Espectro UV-VIS de alta sensibilidade Fluorescncia Eletroquimicamente ativos

REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO Caracterstica original: um mau cromforo e um mau fluorforo Reao ps coluna: reao com hipoclorito e o-ftalaldedo (OPA) e mercaptoetanol (MERC) Glifosato
OCl-
Glicina
OClMERC
Isoindol
Deteco: fluorimetricamente do isoindol (excitao a 230-240 nm, emisso a 420-450nm)

injetor bomba 50C coluna reactor reactor fluormetro
registrador bomba bomba
OCl-
OPA / MERC

REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITRICOS caracterstica original: baixa absorbncia no UV reao ps coluna: elevao de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a absorbncia mxima de barbitricos se desloca para comprimentos de onda mais altos, porm, nessa condio, a FM dissolve a slica da FE, assim, o problema resolvido elevando-se pH somente aps a coluna.) deteco: UV a 240 nm
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PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia. Particularmente na separao de compostos bsicos e portanto um problema constante na anlise de produtos farmacuticos. Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade reduzida , preciso e quantificao inadequada. A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com cauda. A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.


CAUSAS DE CAUDA NO PICO AO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE MVEL
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU REDUZA A FORA DO SOLVENTE REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES COLUNAS. REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3 AUMENTE A FORA INICA DA FASE MVEL, 25mM A 50mM RECOMENDADO ADICIONE UMA AMINA COMPETITIVA NA FASE MVEL 10mM DE TEA SUFICIENTE. SELECIONE FASE ESTACIONRIA COM MENOR ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6 AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MVEL. 25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE. REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3. ADICIONE UM CIDO ORGNICO COMPETITIVO. 1% DE ACIDO ACTICO OU 0.1% DE TFA USUALMENTE SUFICIENTE. SUBSTITUA A COLUNA. TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS RARAMENTE VALE A PENA.
EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA
INTERAO DE SILANOL COM AMINAS
ADSORO DE CIDOS NA slica
VAZIOS NA COLUNA

ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmente comuns. Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente a forma do pico de bases: 1- Selecione uma coluna base-slica desativada. 2- Usar fase mvel com baixo ph. 3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel. 4 Selecione uma coluna heavily endcapped. 5 Adicione uma base competitiva.







ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS
1 Adicione um cido orgnico competitivo. Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar as interaes soluto-silanol, pela ao de um cido competidor. Os resultados foram notveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente gaussiano fator cauda 1.0. 2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico tfa. A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo da linha de base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase mvel mais transparente, menos rudo, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda simtrica, fator cauda 1.09. Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar a reprodutibilidade cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar ainda mais a forma do pico.


HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
Tempo de reteno no reprodutvel um problema comum quando se usa fase mvel altamente aquosa. Na separao de compostos muito polares, solveis em gua no incomum usar fm com menos de 10% de modificador orgnico(metanol, acetonitrila, etc.) Para conseguir reteno suficiente. Entretanto, nestas condies a reprodutibilidade ruim. Com o tempo, os picos eluiro com tempo de reteno cada vez menores e a resoluo piora. A figura mostra cromatogramas de anlise de vitaminas em coluna ymc odsfm:5meoh 95% 0.1M KH2PO4 f:1ml/min Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 nicotinamida

HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominado colapso de fase de fases alqulicas hidrofbicas c18 ou c8 em condies de fase mvel altamente aquosas. A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com solutos diminui e o tempo de reteno decresce. H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos e portanto reduzindo os tempos de reteno. Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente e molculas da amostra tem total acesso a fe. Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de reteno afetado.

HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base desativada; Aps deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo de reteno de amoxicilina diminuiu de 5 min. Indicando colapso da fase; Purgando a coluna com solvente orgnico a fase alquilica novamente extendida e o tempo de reteno restaurado.

HPLC REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA

COLUNAS QUE NO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema usando silanos polares com fase ligada ou usando endcapping hidrofilico. Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS quando se usa fase mvel 100% aquosa. Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ

CROMATOGRAFIA POR INTERAO INICA ION PAIR CHROMATOGRAPHY
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel. Determinao do pH timo da fase mvel em supresso de ion frequentemente requer trabalho extensivo no desenvolvimento do mtodo. Para amostras contendo mais de um componente ionizvel, o mtodo frequentemente nao adequado. As limitaes da supresso de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma metodologia mais adequada para a separao de componentes ionizados: cromatografia por interao inica ion pair chromatography. A tcnica envolve a adio de composto inico na fase mvel para promover a formao de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes so constituidos de uma cadeia alqulica com terminal ionizvel. Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.

FASES MVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
QUANDO UMA FASE MVEL DEVE SER TAMPONADA?
Em HPLC com fase reversa, a reteno dos analitos est relacionada com sua hidrofobicidade. Quanto mais hidrofbico o analito, mais ele ser retido. Quando um analito ionizado, ele torna -se menos hidrofbico e portanto sua reteno diminui. cidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta. Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce. Portanto, nas separaes contendo cidos e/ou bases utilizando fase reversa, necessrio controlar o ph da faxe mvel, usando um tampo apropriado para se obter resultados reprodutveis.
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A figura 2 mostra que metilamfetamina totalmente protonada em pH menor que 3 e sua reteno no afetada por pequena mudana no pH da fase mvel. J a pH 7, prximo de seu pKa, uma mudana de apenas 0.2 unidades de pH desloca a reteno de quase 9% .
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ANLISE QUALITATIVA
A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificao dos analitos de interesse. Existem dois casos a serem considerados para anlise qualitativa com HPLC: Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
Anlise Qualitativa em identificaes no rotineiras

ANLISE QUALITATIVA Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
normalmente efetuada atravs da comparao do tempo de reteno ou reteno relativa dos analitos de interesse com esses parmetros de padres. Tais anlises so realizadas com metodologias j estabelecidas. fundamental o controle e monitoramento das condies analticas para evitar concluses errneas.
Anlise qualitativa em identificaes no rotineiras

Neste caso importante conhecer o mximo da histria da amostra e utilizar detectores que auxiliam a identificao da estrutura do composto, como detector de espectrometria de massa.

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e so detectveis Existem dois procedimentos: Normalizao de rea (% em rea) Normalizao utilizando-se a rea corrigida

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO Normalizao de rea (% em rea)
%i
Ai x100 Ai
Ai = rea do composto i Ai = somatria das reas de todos componentes Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em reas iguais (o que dificilmente ocorre).

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO Normalizao com rea corrigida

%i Ai xF i x100 Ai xFi
Ai = rea do composto i Fi = fator de resposta do componente i AiFi = somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos fatores de resposta necessrio conhecer todos os componentes da amostra para determinao dos fatores de resposta de cada componente

ANLISE QUANTITATIVA MTODOS ABSOLUTOS
Utiliza-se mtodos absolutos quando: O objetivo da anlise quantificar um ou alguns dos componentes da amostra. Ao utilizar detectores especficos ou seletivos que detectam somente os componentes de interesse Existncia de compostos na amostra que no so eludos nas condies de anlise ou no so detectados e que no haja interesse de quantific-los. Quantificao de componentes em baixa concentrao. Existem dois procedimentos: Padronizao externa Padronizao interna

ANLISE QUANTITATIVA MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao externa
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas padres injetando-se um determinado volume. 2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentrao do analito atravs da urva dec calibrao.
Ai
Ci
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna

Para minimizar os problemas da padronizao externa, a amostra e a mistura padro so modificadas pela adio de um composto considerado como padro interno. O padro interno deve ter as seguintes caractersticas: 1. No estar presente na amostra original, ser estvel e no reativa. 2. Pico separado dos componentes da amostra 3. Eluir prximo dos componentes de interesse 4. Deteco semelhante dos picos de interesse 5. Concentrao que produza rea similar aos picos analisados 6. Pureza elevada ou conhecida (possveis impurezas no devem eluir com os picos de interesse).

ANLISE QUANTITATIVA MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas padres contendo o padro interno. Nessa curva de calibrao utiliza-se a relao entre rea do componente i e rea do padro interno em funo das relaes de suas concentraes. 2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padro interno (preferencialmente na mesma concentrao utilizada na calibrao) e obtem-se a concentrao do analito atravs da curva de calibrao. Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibrao, ou se algum parmetro analtico for alterado resultando em reas diferentes daquelas esperadas nas condies de calibrao, a relao de rea entre analito e padro interno no ser afetada.
Ai / Api
Ci / Cpi

UHPLC ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPY

A tecnica utiliza particulas menores que 2m o que fornece colunas com maior eficincia( maior nmero de pratos) e consequentemente melhor separao, desde que os analitos tenham coeficiente de partio diferentes. Normalmente utiliza-se colunas com 1.7m o que acarreta maior presso no sistema, sendo necessrio utilizar equipamento configurado para isso. O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com presses maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela. Em analises rpidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de 0.05 seg. SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS Waters Corporation Acquity UPLC System 6 FE BEH/slica Thermo Scientific Accela High Speed LC 3 FE Hypersil Gold Agilent 1200 Series 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond Restek(colunas) Pinnacle DB 1.9m Grace/ Alltech - colunas

V ERIFICAO DE EQUIVALNCIA DE COLUNAS HPLC
Dois grupos projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parmetros para caracterizar colunas HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas. PROJETO USP Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersilKeystone, Waters Parmetros avaliados: Hidrofobicidade Quelao de metais Atividade do grupo silanol Seletividade Densidade de ligaes Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informao obtida em Wyeth, Eli Lilly, FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras Parmetros avaliados: Hidrofobicidade Seletividade Acidez pontes de H Basicidade pontes de H Capacidade de troca inica Site: www.usp.org/USPNF/columns.html

DESENVOLVIMENTO DE MTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento de mtodo de anlise por HPLC. So softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas, pois cada mtodo desenvolvido em pouco tempo. Dependendo da experincia em cromatografia e da complexidade da amostra, um mtodo desenvolvido manualmente(mtodo convencional), pode levar um ms ou mais. Com um desses programas eletronicos, o mtodo pode ser desenvolvido em algumas horas ou poucos dias.
ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS: DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) www.molnar-institut.com/www.rheodyne.com CHROMSWORD AUTO - (Hitachi Agilent Iris) www.chromsword-auto.com ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE www.acdlabs.com POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography BISCHOFF CHROMATOGRAPHY www.poplc.def

REFERNCIAS PARA CONSULTA
HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis George Lunn Norman Schmulf Wiley Interscience 1997 (1632 pag.) ISBN 0471181765 HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals George Lunn Wiley 2005 (717 pag.) ISBN 9780471669418 HPLC for Pharmaceutical Scientists Yuri Kazakevich Rosario Lobrutto Wiley Jan 2007(1104 pag.) ISBN 9780471681625 HPLC Made to Measure Stravos Kromidas Wiley 2006 ISBN 352731377X Validation Chromatographic Methods A Practical Guide David M. Bliesner Wiley 2006 (304 pag.) ISBN 9780471741473 HPLC Practical and Industrial Applications Joel Swadesh Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006 HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons - 2007

REFERNCIAS PARA CONSULTA
Fundamentos da Cromatografia a lquido de alto desempenho REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a Ed. Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html The Reporter, Optimizing HPLC Separations, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, nmero 3, junho 1998, Validao de mtodos cromatogrficos, pg. 12

FONTES DE INTERNET
www.chem.agilent.com www.alltech.web www.dionex.com www.esind.com www.gls.co.jp www.hamiltoncompany.com www.macherey-nagel.com www.mac-mod.com www.merck.de www.microlc.com www.microsolvtech.com/ www.phenomenex.com www.instruments.perkinelmer.com www.polymerlabs.com www.restekcorp.com/h www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco www.thermo.com www.tosoh.com/ www.varianinc.com www.vydac.com/ www.waters.com www.zirchrom.com/ Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Agradecimentos
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Dentro das diversas reas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentao e Desenvolvimento Analtico, Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatrios, Pesquisa e Desenvolvimento, Microbiologia e Habilidades Gerenciais. Informaes: www.cepcursos.com / info@cepcursos.com Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755

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At 300000 Pobre 10-12 g (DIC / DCE)

At 30000 Boa 10-9 g (UV) 10-15 g (coulomtrico)

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