1. Introduccin: La determinacin cuantitativa de la concentracin de protenas es una de las pruebas que ms frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioqumica.

Primitivamente, la cantidad de protenas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrgeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una protena. Este era un mtodo largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparicin de mtodos colorimtricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los mtodos colorimtricos destacan tres: el mtodo de Biuret, el mtodo de Lowry y el mtodo de Bradford. En esta prctica nos ocuparemos nicamente del segundo de ellos. Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de protena; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la protena (esencialmente los residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante vara entre las distintas protenas. Pero cuando tratamos con mezclas biolgicas complejas, podemos perfectamente calibrar el mtodo con alguna protena comercial como es la seroalbmina bovina. La reaccin que tiene lugar en el mtodo de lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1. Reaccin previa de la protena en medio alcalina con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitacin. Es esencialmente idntica a la reaccin del Biuret, formndose un complejo de coordinacin entre el cobre y el nitrgeno peptdico. 2. Reaccin con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (cido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol), presentes en la protena a un complejo de color oscuro, que se mide colorimtricamente. El complejo coloreado, cuya composicin es desconocida, presenta dos mximos de absorcin a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La eleccin de una u otra depende de la concentracin proteica de la muestra estudiada. Dado que este mtodo da resultados variables se requiere una curva de calibracin que se hace a partir de seroalbmina bovina. En la presente prctica haremos esta curva de calibracin, practicando la reaccin de Lowry y aprendiendo el uso del espectrmetro.

2. Protocolo experimental:

Solucin estndar de albmina bovina (1mg/ml)

Muestra problema, de concentracin desconocida (albmina)

Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el momento de su utilizacin, y que son las siguiente:

A: Carbonato sdico al 2% en NaOH 0,1 M

B: Sulfato cprico al 1%

C: Tartrato sdico-potsico al 2% En el momento de su uso se mezclan 50 ml. De A con 0.5 ml de B y 0.5 ml de C.

Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado comercialmente y se debe mantener en refrigeracin. Para su uso se diluye inmediatamente antes en la reaccin de 1 parte de reactivo por 2 de agua destilada.

3. Procedimientos:

USO DEL ESPECTRMETRO: 1. Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si la fuente de iluminacin y el fototubo corresponden a la misma. 2. Encender el aparato al menos a 30 minutos antes de su uso para obtener una perfecta estabilizacin en su lnea de base. 3. Ajustar el aparato de transmitancia a cero: con el receptculo de muestras vaco y la tapa del mismo cerrada, girar el botn izquierdo del aparato hasta hacer coincidir la aguja con el punto cero de la escala de transmitancia. 4. Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco (en su tubo adecuado) en el receptculo de muestras, habiendo cuidado de la limpieza y de la transparencia del tubo. Se baja la tapa del receptculo

y mediante el botn derecho se lleva la aguja hasta coincidir con el 100% de transmitancia. A continuacin se saca ese tubo y se comprueba que la aguja se coloca exactamente al cero. 5. Medir cada una de las muestras: a. Medir en la escala de absorbancia, ya que segn la ley de BeerLambert la concentracin es proporcional a la absorbancia, pero como esta escala es logartmica, para valores altos de absorbancia, las mediciones se hacen imprecisas; o bien b. Medir las trasmitancias, cuya escala es lineal, y convertirlas despus a absorbancia mediante la relacin.

A=log(100/T) Una vez obtenidas las absorbancias, encontrar la relacin entre la absorbancia y concentracin de protena 4. Discusin y resultados: y Despus de haber realizado el experimento anterior, obtenemos la absorbancia; cuya curva de calibracin es la siguiente:

Tubo de ensayo Muestra problema (mL) Agua (mL) Reactivo de Lowry (mL)

A
0,05 0,95 5,0

B
0,1 0,9 5,0

C
0,2 0.8 5,0

D
0,3 0,7 5,0

E
0,4 0,6 5,0

F
0,5 0,5 5,0

Agitar enrgicamente y dejar 15 minutos en reposo Reactivo de Folin (mL)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agitar enrgicamente y dejar 30 minutos en reposo

Medir la absorbancia a 500 nm Concentracin de protenas [mg/mL]

0,750

0,128

0,256

0,420

0,550

0,720

Tubo de ensayo

Para el caso de la cuantificacin de protenas de la muestra tambin podemos observar los siguientes resultados:

Muestra problema (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Agua (ml) 0.95 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Reactivo de Lowry (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Agitar energticamente y dejar 15min. En reposo Reactivo de Folin (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agitar energticamente y dejar 30 min. En reposo Medir la absorbancia a 0,075 0,128 0,256 0,420 0,550 0,720 500nm. Concentracin de protenas [mg/mL]

5. Conclusiones:

Una vez hecho todos estos procesos se puede concluir lo siguiente:

 Reaccin previa de la protena en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitacin. Es esencialmente idntica a la reaccin del Biuret, formndose un complejo de coordinacin entre el cobre y el nitrgeno peptdico  Muchos factores estabilizan la estructura tridimensional especfica (conformacin) de las protenas  Tanto los cambios de temperatura, pH, concentracin de sales y solvente ocasionan la desnaturalizacin de las protenas  La protena es un polmero de aminocidos  Las protenas pueden verse como un precipitado al desnaturalizarlas  La intensidad del color resultante varia entre las distintas protenas

6.

Bibliografa:  http://html.rincondelvago.com/determinacion-deproteinas_1.html

 http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Protein as.pdf  http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalu mno.pdf  http://personal.us.es/ruano/docs/practicas.pdf  http://webpages.ull.es/users/acasti/docencia/practi cas/4.pdf  http://shaker.umh.es/investigacion/protocolos/20.pdf  http://html.rincondelvago.com/determinacion-deproteinas_1.html