Gnotypage des papillomavirus humain : Etude pilote dans la ville de Douala

Projet de recherche labor par :

Elise Libert EMBOLO ENYEGUE

Etudiant chercheur en master II De biologie molculaire et cellulaire, Facult des sciences, universit de douala. Email : eliseeembolo@yahoo.fr http/eliseeembolo.blogvie.com Tel : (237) 99-34-75-70

Le papillomavirus humain (HPV), est largement impliqu dans la physiopathologie de nombreuses lsions pithliales, pr noplasique et noplasiques. Son rle dans la carcinognse des lsions aboutissant aux cancers anognitaux est bien tabli ; il est caractris par la prsence dADN de ce virus au sein de ces lsions. Il existe plusieurs gnotypes de HPV qui diffrent par leur pouvoir oncognique. Les patients infects par le VIH prsente un taux dinfections par HPV particulirement lev, caractris par une forte persistance de ce virus au sein des muqueuses, ainsi que les virmies plus leves par rapport la population gnrale ce qui pourrait expliquer laugmentation du risque de survenu dun cancer chez ces patients [1]. La connaissance de la distribution des HPV infectant les cols utrins, La tte et le cou, dans la population gnrale, et en particulier au Cameroun; reste un pralable indispensable pour : - dfinir le meilleur outil pour le dpistage des lsions. - valuer le rendement attendu de la mise en place des mthodes de Prophylaxies. - apporter un soutient aux essais cliniques pour la mise au point Des vaccins spcifiques aux gnotypes. - dvelopper une stratgie de surveillance dinfections persistantes Gnotypes haut risques - amliorer les donnes pidmiologiques au niveau molculaire Etc.

Problmatique

es HPV, sont des virus double brin dont le mode de contamination pour les muqueuses est essentiellement sexuel ; ils sont

responsable denviron 230 000 dcs et 500 000 nouveaux cas par an. Soit 80% dans les pays en voie de dveloppement daprs lOMS. La majorit des patients infects par le VIH (virus de limmunodficience humaine) sont aussi porteurs du HPV au niveau de leur muqueuse anale et/ou gnitale. Bien que le cancer du col utrin soit

compris dans les maladies associes au stade sida, lincidence et la mortalit associe restent assez basses dans les pays o le dpistage existe. Cependant, le HPV peut tre associ dautres cancers, non seulement chez des patients infects par le VIH mais galement chez des patients non infects par le VIH : cancers de la cavit orale [1], de la tte et du cou [1], de la vulve et du vagin, et dautres sites, avec une forte prvalence pour le gnotype HPV16 [1]. Il existe un vaccin le GARDASIL quadrivalent dirig contre 4 souches de HPV savoir 6, 11, 16 et 18; est un vaccin limit compte tenue de la multitude de gnotypes HPV rencontrs. Une tude trs circonscrite et spcifique aux femmes de 65 mene au Cameroun en 2006 par Edith WELTY et al. rvle que Les types HPV les plus courants faible risque dtectes sur tous les chantillons analyss ont t: 62 (20,0%), 11 (18,5%), 6 (15,4%), 70 (12,3%) et 61 (10,8%). Les types les plus courants haut risque ont t rencontrs: 45 (24,6%) et 58 (21,5%) [2]. Bien que ltude ait t ralise avec une population trs spcifique et un nombre trs restreint de personnes la gnralisation de ces rsultats au niveau national montre les limites de la vaccination au GARDASIL. Le PAP TEST, technique de prdilection des cytologistes pour le diagnostiques des atypies cellulaires malpighiennes de signification indtermin (ASCUS) et aussi latypie glandulaires (ASGUS) ; prsente des limites considrable au niveau de la modration de la sensibilit. Ceci limite son efficacit dans les rgions faible ressources. Cela signifie que les femmes atteintes seront tort identifies comme non atteintes. Pour avoir des rsultats souvent fiable il faudrait, un dpistage frquent des femmes

susceptibles ; ce qui nest pas chose facile dans un pays en voix de dveloppement

Hypothses
Plusieurs facteurs intervenant dans les altrations perturbant lquilibre entre stimulation et inhibition de la prolifration cellulaire, qui induisent les tumeurs HPV peuvent tre la cause de la recrudescence des infections HPV : entre autre on pourrait souponner : les murs et lhistoire individuelles qui influent sur le fonctionnement de lpignome . le manque de techniciens qualifis et dinfrastructures adquates. Le manque de campagnes de sensibilisation des populations sur le danger due aux infections HPV, et par consquent ngligence vis a vis du dpistage. Le vagabondage sexuels.

Cadre opratoire
Le gnotypage et la caractrisation des souches de HPV est une proccupation importante dans la lutte contre le cancer du col de lutrus. Il existe plusieurs faons didentifier la souche prsente lorigine de linfection grce diverses trousses de gnotypage. La trousse sollicit pour la ralisation de ce projet est marque : CE/IVD. Cest une trousse de dtermination de gnotypes de HPV partir des prlvements endocervicaux. Aprs amplification par Polymrase Chain Raction (PCR), lADN des virus HPV est hybrid laide de sondes nuclotidiques spcifiques. Cette hybridation est discriminante pour 37 gnotypes diffrents : 24 de bas risque et 13 de haut risque. Les gnotypes dtects sont les suivants :

HPV haut risque : 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. HPV bas risque : 6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 et CP6108. Pour raliser le gnotypage, les 3 kits suivants sont ncessaires : Amplilute Liquide Media Extraction Kit (50 ractions) : contient tous les ractifs qui permettent lextraction de lADN / HPV et le contrle interne. Linear Array HPV genotyping test (48 ractions) : se compose du Master mix pour raliser la PCR, les bande lettes de gnotypage, les contrles positifs et ngatifs. Linear Array detection kit (96 ractions) : contient tous les ractifs ncessaires la rvlation des bandelettes.

Conclusion
A lissue de ce projet, les techniques de biologie molculaires utilises, vont permettre spcialistes de divers domaines de : - dfinir le meilleur outil pour le dpistage des lsions. - valuer le rendement attendu de la mise en place des mthodes de Prophylaxies. - apporter un soutient aux essais cliniques pour la mise au point Des vaccins spcifiques aux gnotypes. - dvelopper une stratgie de surveillance dinfections persistantes Gnotypes haut risques - amliorer les donnes pidmiologiques au niveau molculaire des infection HPV. Etc.

Droulement analytique
Prparation de lchantillon : les cellules de lchantillon sont lyses pour librer lADN viral. Aprs cette phase de lyse, lextraction de lADN viral est ralise sur mini colonnes de silice. Amplification : lADN viral et le contrle interne sont amplifis en prsence damorces spcifiques de la rgion L1 du gne marques la biotine. Cette phase permet dobtenir les amplicons. Dtection : les amplicons sont hybrids sur une bandelette de nylon tapisse de 37 sondes spcifiques des gno types. Grce au marquage la biotine on peut rvler en colorimtrie les produits hybrids par un conjugu marqu la streptavidineperoxidase.[3]

Bibliographie
1. Jean-Philippe SPANO, Anne Gnvive MARCELIN, Guislaine CARCELIN. Cancer et infection papillomavirus humain. Bull cancer 2005 ; 92(1) : 59-64 2. Andrew J. Desruisseau, Delf SchmidtGrimminger, and Edith Welty. Epidemiology of HPV in HIV-Positive and HIV-Negative Fertile Women in Cameroon, West Africa. PMCID: PMC2821770. 3- Roche.com/une trousse marque CE/IVD. Veronique.mandran@rohe .com

Collecte des informations

A lissue dune campagne qui devrait tre organise, les individus dsireux participer devrons remplir un formulaire de consentement clair afin que les chantillons de prlvement soit utilis pour la science.