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PRCTICA 5 DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES EN SUERO POR REFRACTOMETRIA 1.

Introduccin terica Cuando una radiacin electromagntica alcanza un medio material, el vector campo elctrico de la radiacin interacciona con los tomos y molculas del medio, pudiendo dicha radiacin ser transmitida, absorbida o dispersada. Experimentalmente, se ha observado que la velocidad con que se propaga la radiacin a travs de una sustancia transparente, es menor que su velocidad en el vaco y depende adems de las especies y concentracin de los tomos, iones o molculas, pero no observndose variacin en la frecuencia de la radiacin. Entre los distintos mtodos para la determinacin del contenido proteico de fluidos biolgicos (fundamentalmente, suero sanguneo), el de refractometra es uno de los ms utilizados, cuando no se precisa una elevada exactitud. El ndice de refraccin del agua a 20 C (n=1.3330) se incrementa con una cierta proporcionalidad con la concentracin de soluto en diluciones acuosas de concentracin moderada. Este hecho ha encontrado aplicacin clnica para la determinacin rpida del contenido total de protenas en el suero sanguneo, para lo cual se parte del hecho de que prcticamente el ndice de refraccin de un suero a otro vara en funcin de su contenido en protenas y no difieren entre s apreciablemente en lo que respecta a solutos, electrolitos u otros metabolitos simples de carcter orgnico. Las ventajas de este mtodo radican en la rapidez, mnima cantidad de muestra y facilidad operatoria, si bien, como queda indicado, su exactitud no es muy elevada, pero cubre correctamente las necesidades clnicas de carcter rutinario. El ndice de refraccin de un medio es, en cierta manera, una medida de la magnitud de dicha interaccin, y se define por:

n=

c v1

donde n es el ndice de refraccin a una frecuencia determinada, v1 la velocidad de la radiacin en el medio considerado y c su velocidad en el vaco, donde es mxima. El ndice de refraccin de una sustancia se determina, midiendo el cambio de direccin de una radiacin cuando pasa de un medio a otro:

n2 v1 sen (1 ) = = n1 v2 sen ( 2 )

donde v1 es la velocidad de propagacin en el medio menos denso. v2 es la velocidad de propagacin en el medio ms denso. n1 y n2 los ndices de refraccin respectivos. 1y 2los ngulos de incidencia y de refraccin respectivamente. Para la determinacin del ndice de refraccin se utilizan los aparatos denominados Refractmetros, siendo el ms utilizado el de Abbe, basado en la medida del ngulo lmite. Si se hace que el ngulo de incidencia sea prcticamente igual a 90 (incidencia rasante), el ngulo de refraccin alcanza su valor mximo, recibiendo el nombre de ngulo lmite de refraccin. El refractomtro de Abbe, contiene dos prismas rectangulares, opuestos por sus hipotenusas, fijo el superior y mvil el inferior, sobre el que se coloca la muestra problema. La luz procedente de una lmpara se hace incidir, de modo que el haz atraviese los prismas con la muestra problema situada entre ambos y son enviados hacia el tubo telescpico donde se encuentra un retculo marcado con un aspa. Observando por el ocular y moviendo el mando giratorio de los prismas, se hace coincidir la divisoria del campo con el centro del retculo, lo que ocurrir exactamente cuando se observe la mitad del campo clara y la otra mitad oscura. En ese momento, con ayuda del flexo auxiliar, iluminamos por reflexin una escala graduada en la que directamente se observa el ndice de refraccin de la muestra problema. Cuando se utiliza una luz no monocromtica, se produce una dispersin cromtica en el campo, que debe eliminarse mediante el acromatizador que lleva incorporado el instrumento. La lectura debe realizarse bajo termostatizacin.

2. Parte experimental a. Instrumentacin y productos 2 Pipetas Pasteur 2 Chupetes 1 Gradilla 1 Frasco lavador Refractmetro de Abbe Flexo Suero problema b. Procedimiento experimental Colocar el refractmetro frente a una buena fuente de iluminacin. Una vez comprobado que los prismas estn perfectamente limpios, con una pipeta Pasteur y sobre la superficie del prisma inferior (en posicin horizontal), se ponen 1 2 gotas de suero problema, se cierra el prisma. Abriendo la ventana se hace incidir un haz de radiacin. Observando por el ocular, con el acromatizador (mando situado a la derecha), corregimos la aberracin cromtica y a continuacin ajustamos la medida del ndice de refraccin con el mando situado abajo a la derecha. La escala de lectura situada en la parte inferior del campo se ilumina con el flexo auxiliar. Datos, medidas y clculos Tabla de lectura de ndices de refraccin correspondientes a distintas concentraciones proteicas realizadas a 17.5 C. ndice de refraccin 1.3431 1.3435 1.3438 1.3442 1.3446 1.3450 1.3453 1.3457 1.3461 1.3465 1.3468 1.3472 1.3476 1.3479 1.3483 1.3487 1.3491 1.3494 1.3498 1.3502 1.3505 1.3509 1.3513 1.3516 1.3520 1.3524 1.3527 g% de protenas 3.96 4.15 4.34 4.53 4.71 4.90 5.08 5.27 5.46 5.65 5.83 6.02 6.20 6.39 6.58 6.76 6.95 7.13 7.32 7.50 7.69 7.87 8.06 8.24 8.42 8.61 8.79