2010

X Congreso Nacional de Microscopa-Morelia

PARTICIPACIN DEL XIDO NTRICO EN PROCESOS DEL DESARROLLO EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana Y SU DETECCIN POR MICROSCOPA CONFOCAL
J. Raya-Gonzlez, A. Mndez-Bravo y J. Lpez-Bucio
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Instituto de Investigaciones Qumico-Biolgicas, UMSNH, Morelia, Mich., 58000, Mxico E-mail: jbucio@umich.mx

INTRODUCCIN El xido ntrico (ON) es una molcula bioactiva que regula una gran cantidad de procesos fisiolgicos y moleculares en organismos diversos filogenticamente incluyendo bacterias, animales y plantas. Por lo tanto la capacidad para detectar y determinar los niveles de ON in situ es crucial para entender su funcin en los procesos celulares. En las plantas, el ON participa como segundo mensajero en las vas de sealizacin que regulan diferentes aspectos del desarrollo como la germinacin, la formacin de rganos y la senescencia. Tambin modula las respuestas a condiciones de estrs, incluyendo la deficiencia de nutrientes y el ataque por patgenos [1]. Cuando las plantas enfrentan algn agobio ambiental, se incrementa la produccin de ON de manera tejido y tiempo-especfica, induciendo programas de muerte celular programada [2]. Sin embargo, durante el desarrollo normal de las plantas, se desconoce el grado de participacin del ON en los procesos de divisin, elongacin y diferenciacin celular que determinan la formacin de novo de rganos tales como las races, los tallos, las hojas, las ramas, las flores y los frutos. El uso de plantas modelo, en combinacin con tratamientos farmacolgicos adecuados y de herramientas analticas sensibles han abierto nuevas expectativas para el entendimiento del papel que juega el ON en especies vegetales. Este trabajo se enfoca en el estudio de la participacin del ON en el desarrollo de la raz de Arabidopsis thaliana y su deteccin en los diferentes tejidos radiculares mediante microscopa confocal en plantas bajo condiciones normales de crecimiento y en respuesta a tratamientos con donadores qumicos de ON. METODOLOGIA Plntulas de Arabidopsis thaliana del ecotipo Columbia-0 (Col-0) fueron crecidas in vitro en cajas de Petri con medio de Murashige-Skoog (MS) 0.2X solidificado con agar. Este medio contiene todos los nutrientes necesarios para el desarrollo normal de las plantas. A este medio se suministraron concentraciones micromolares del donador de ON nitroprusiato de sodio (SNP) y se evalu el desarrollo de la raz considerando diferentes parmetros morfogenticos tales como la longitud de la raz primaria, la formacin de las races laterales y la diferenciacin de las clulas epidrmicas. Tambin se utiliz una lnea transgnica de Arabidopsis que expresa una fusin de la histona H2 con la protena fluorescente amarilla (AtHistH2B:YFP) y por lo tanto emite una seal de fluorescencia en los ncleos ntegros de las clulas. Esta construccin representa un excelente marcador de viabilidad celular [3]. La deteccin de ON se realiz incubando plntulas de A. thaliana con el fluorocromo diacetato de diamino fluorescena (DAF-2DA) en concentracin de 10 M. La tincin se realiz durante 2 h, seguida por al menos tres lavados de 20 min con Tris 0.1 M (pH 7.4). La fluorescencia emitida se analiz mediante un escaneo por microscopia confocal lser en un microscopio modelo BX50 (Olympus, Japon). Para el estudio de viabilidad celular, se realizaron tinciones con yoduro de propidio (PI). Las plntulas se colectaron del medio dejando el sistema radicular intacto y se transfirieron a una solucin 10 M de PI para su anlisis. La deteccin de la fluorescencia se realiz utilizando longitudes de onda especficas, para el PI a 568-nm de excitacin y 585-610 nm de emisin, mientras que para YFP y DAF fueron a 505-550-nm de emisin y 488-nm de excitacin. RESULTADOS La fluorescencia emitida por el DAF-2DA revel la presencia del ON en diferentes regiones de la raz de Arabidopsis (Fig. 1A). Para determinar con mayor precisin el papel del ON en procesos celulares, analizamos a detalle la acumulacin de ON en cada una de las regiones de la raz, siendo evidente un incremento en la fluorescencia en la punta de la raz, particularmente en clulas de la cofia (Fig. 1B), las cuales son en su mayora clulas diferenciadas. Interesantemente, la fluorescencia tambin fue evidente en la regin de diferenciacin de la raz primaria, en la cual ocurre la formacin de pelos radicualres (Fig.1C). Los tricoblastos (clulas epidrmicas destinadas a la formacin de pelos radiculares) y los pelos radiculares mostraron una fluorescencia intensa (Fig. 1D).

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Para investigar el papel del ON sobre procesos del desarrollo, se analizaron los efectos de un donador de ON, el SNP, el cual inhibe el crecimiento de la raz primaria e induce la formacin de races laterales. Analizando los niveles de ON en plntulas tratadas con SNP por microscopa confocal, se observ un aumento de la acumulacin de ON en la regin meristemtica de la raz, de manera dependiente de la concentracin (Fig. 2A-D), este efecto fue acompaado por la induccin de procesos de diferenciacin, evidenciados por la formacin de pelos radiculares en la zona previa al meristemo de la raz primaria y races laterales (Fig. 2E-H). Adems se determin la viabilidad celular en respuesta al SNP, mediante el estudio de la expresin del marcador del ciclo celular AtHistH2B:YFP, teidas con yoduro de propidio, un fluorocromo que se difunde solo en clulas daadas o alteradas. La visualizacin de las clulas del mersitemo de plantas AtHistH2B:YFP tratadas con SNP indica que las clulas del meristemo fueron viables, ya que en estas mismas clulas el yoduro de propidio fue incapaz de penetrar (Fig. 2I-L). Estos resultados sugieren que los efectos del SNP sobre el desarrollo de la raz involucran cambios en procesos fisiolgicos sin afectar la viabilidad celular. CONCLUSION El xido ntrico participa como un regulador en los procesos de divisin, elongacin y diferenciacin celular en la raz de Arabidopsis thaliana.

Figura 1. El DAF-2DA revela la fluorescencia causada por la acumulacin de ON en clulas diferenciadas. (A) raz primaria, (B) clulas de la cofia de la raz primaria, (C) regin de diferenciacin de la raz, (D) Tricoblastos.

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Figura 2. Efecto de la acumulacin del ON sobre procesos de diferenciacin y en la viabilidad celular en el meristemo de la raz de Arabidopsis. (A-D) deteccin del ON en la zona meristemtica de la raz primaria y en las races laterales (E-H). (I-L) Zona meristemtica de plantas transgnicas de Arabidopsis que expresan el marcador AtHistH2B:YFP teidas con yoduro de propidio. REFERENCIAS [1] Wendehenne, D., Durner, J., and Klessig, D. F, Curr. Opin. Plant Biol. 7(2004) 449. [2] Delledonne, M., Zeier, J., Marocco, A., and Lamb, C, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(2001) 13454. [3] Boisnard-Lorig, C., Colon-Carmona, A., Bauch, M., Hodge, S., Doerner, P., Bancharel, E., Dumas, C., Haseloff, J., Berger, F. Plant Cell 13(2001) 495.