Bacterifagos: Nueva Arma para la Seguridad Alimentaria

Steven Hagens Mark L. Offerhaus

Seguridad Alimentaria

Los bacterifagos, significa literalmente comedores de bacterias, son muy abundantes en la naturaleza y es posible emplearlos potencialmente para destruir bacterias patgenas encontradas en alimentos

os bacterifagos naturales o fagos son los microorganismos ms abundantes en el ambiente y estn presentes en grandes cantidades en agua y alimentos de varios orgenes. Los fagos son bacterias especficas cada fago es especfico para una bacteria en particular y no puede atacar a otra bacteria.

Son inofensivos para los humanos, animales y plantas. Durante varios milenios, los humanos se han expuesto rutinariamente a niveles altos de fagos a travs de alimentos, agua y el medio ambiente, sin efectos adversos. En ciertos alimentos, se pueden encontrar 100 millones de fagos/g; y en ecosistemas acuosos, hasta 1000 millones de fagos/ml.

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Los bacterifagos contribuyen a la homeostasis bacteriana en la naturaleza, manteniendo a las bacterias bajo control. Gracias a la tecnologa actual, ahora podemos entender y utilizar esta herramienta natural. Los fagos no afectan a las bacterias deseadas en alimentos (ej., cultivos iniciadores), comensales en el tracto gastrointestinal y la flora bacteriana presente en el ambiente. No cambian las propiedades organolpticas de los alimentos (ej., sabor, estructura, color y olor), no dejan huellas ecolgicas los fagos se debilitan y desintegran en aminocidos y cidos nucleicos, y son comensales normales de humanos y animales. Esto los convierte en agentes naturales para el control de ciertas bacterias patgenas como la Listeria en alimentos. Con la emergencia de la resistencia a antibiticos, la principal prioridad actual para la seguridad de alimentos y el consumidor de productos verdes y naturales son las bacterias no deseadas, de manera que los fagos se pueden convertir en una nueva opcin.

proteolticos o por simple absorcin de partculas que las vuelven inactivas. Los bacterifagos son abundantes especialmente en ambientes con un gran nmero de bacterias. Las bacterias son abundantes en ecosistemas marinos y de agua fresca, y como consecuencia, el nmero de fagos generalmente alcanza los 107/ml y algunas veces exceden este nmero casi 300 veces ms (Fuhrman, 1999; Otawa, et al., 2007; Filippini et al., 2006). Muy pocos alimentos estn completamente estriles. Esto significa que la mayora de los alimentos consumidos contendrn bacterias y por tanto, los fagos estarn presentes. Esto es especialmente verdico para productos fermentados, as como para vegetales sin procesar. Los fagos se pueden aislar fcilmente de chucrut (Ion et al., 2002; Barrangou et al., 2002). En un estudio, se aislaron 26 fagos diferentes de 4 plantas fermentadoras de chucrut comercial (Lu et al., 2003). Se aislaron a los fagos que infectan a Probionibacterium freudenreichii de queso Suizo a niveles de hasta 7 x 105 PFU (unidades formadoras de placa)/g (Gautier et al., 1995). Los fagos que infectan a las bacterias cido lcticas termoflicas se aislaron de plantas lcteas en Argentina con muestras a niveles de hasta 109 PFU/ml (Surez et al., 2002). En gran medida, tambin se han aislado cultivos de bacterifagos no fermentativos de varias fuentes de alimentos. Los fagos de Escherichia coli se aislaron de un gran nmero de productos, incluyendo pollo fresco, cerdo, carne de res, championes, lechuga, vegetales crudos, pastel de pollo y alimentos delicatessen, encontrando un nmero de fagos tan alto como 104/g (Allwood et al., 2004). Tambin los fagos de Campylobacter se aislaron del pollo en niveles de 4 x 106 PFU/g (Atterbury et al., 2003), y en otro estudio se aislaron muchos otros fagos de Brocothrix thermosphacta de carne de res (Greer, 1983). En todos estos casos, los investigadores estaban buscando fagos que infectaban una bacteria en particular, pero cuando se consider un gran nmero de bacterias asociadas con la tierra y vegetales, se determin que tambin podra encontrarse fagos asociados con esta multitud de otras especies. Un artculo reciente sobre la presencia de fagos de E. coli y Campylobacter en vegetales de Nueva Zelanda y en pollo encontr colifagos en ms del 90% de las muestras en niveles de 250/g (Tsuei et al., 2007).

Aplicaciones Teraputicas.
Se emple ampliamente la terapia fgica y se reportaron varios xitos en el tratamiento de varias enfermedades, como la disentera, fiebres tifo y paratifoidea, clera e infecciones piognicas del tracto urinario. Con la llegada de antibiticos, se abandon la investigacin sobre fagos en la mayora del mundo occidental. Sin embargo, la aparicin a nivel mundial de la resistencia de bacterias a los antibitico ha sido responsable del inters renovado en la terapia fgica. Algunos experimentos indican que la terapia fgica puede ser superior a los tratamientos con antibiticos. Muchos de estos trabajos se han revisado (Levin y Bull, 1996; Barrow y Soothill, 1997). Artculos recientes sobre la terapia fgica cubren no slo el potencial en el tratamiento de enfermedades en humanos, sino tambin el anlisis de otras aplicaciones como el reemplazo o suplemento de antibiticos en acuacultura (Nakai y Park, 2002).

Abundancia natural de los fagos

El nmero de fagos en el planeta excede el nmero de bacterias. Mucha de la progiene de los fagos (50-200) se libera despus de la lisis del husped. Esto ocurre debido a que con el fin de no extinguirse por lo menos uno de los fagos necesita encontrar un nuevo husped, casi siempre en una matriz tridimensional antes de inactivarse por factores como luz UV, desnaturalizacin y compuestos

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 Evidencia sobre seguridad

Los fagos se encuentran en grandes cantidades en el ambiente y en nuestros alimentos. Existen millones de fagos en nuestro sistema digestivo y consumimos regularmente millones ms con los alimentos y el agua. Mientras que esto solo provee evidencia importante sobre su seguridad, datos adicionales lo pueden corroborar. Un estudio sobre toxicidad oral en ratas que recibieron altas dosis de fagos de Listeria Listex P100 no revel efectos adversos (Calton et al., 2005), y un estudio en humanos, con fagos especficos de E. coli capaces de infectar las cepas comensales de E. coli as como a cepas patgenas, no pudo demostrar algn efecto adverso (Bruttin y Brussow, 2005). Dos simples reglas de seguridad se deben tener en mente: se deben evitar los fagos templados fcilmente discernibles a travs del anlisis genmico --. Tambin se deben evitar los fagos capaces de una transduccin generalizada a menos que la produccin del husped no sea patognica.

DNA del fago circula y entonces la bacteria empieza a producir protenas del fago. Estas protenas secuestran la clula entera del husped y lo fuerza a producir solamente nuevos fagos. Despus del ensamblamiento de la progenie de fagos, dos protenas por separado rompen la membrana celular (lisis), como resultado se libera fago hijos listos para iniciar el ciclo siguiente. La especificidad extremadamente alta de los fagos para distinguir al husped se debe a que en cada etapa del proceso se requiere un sistema fago/husped compatible. Ser capaz de reconocer receptores de la pared celular de un tipo diferente es intil si la informacin gentica del fago no se puede leer por el husped. Estos sistemas fago/husped han evolucionado sobre los eras para ser compatibles. Tambin cada bacteria tiene su propio complemento de fagos especializados con los que compite y un fago no especializado recin llegado sera inefectivo. En la ausencia de una bacteria objetivo, los fagos se rompen en partculas biolgicas comunes que se absorben naturalmente en el ambiente. La temperatura y estado fsico del husped puede influir en el nmero de fagos de la progenie y en el tiempo total del ciclo, pero para aplicaciones en alimentos, es importante recordar que una infeccin exitosa produce inevitablemente la muerte celular. En la medida en que haya inters en aplicarlos en alimentos para eliminar una bacteria contaminante, es necesario reunirse con un bacterifago. Si este encuentro produce una infeccin, la bacteria morir. En trminos ecolgicos, las poblaciones de fago slo pueden aumentar cuando hay suficientes huspedes, pero este no es el objetivo cuando se utilizan fagos

Mecanismo de accin
Los bacterifagos no tienen su propio metabolismo sino que dependen de la bacteria husped donde se multiplican. Exhiben rangos limitados de huspedes, generalmente tienen como objetivo cepas especficas. El ciclo de reproduccin de los fagos despus de reconocer al husped se describe en la Figura 2. El primer paso es reconocer al receptor principal de un husped especfico, sigue la adsorcin del segundo receptor. La primera adhesin es reversible la clula puede no estar viva, entonces el acoplamiento no tendra sentido. La segunda etapa de adhesin es irreversible y por consecuencia, el

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Figura 2. Esquema de las etapas necesarias para que se libere un nuevo fago de una clula infectada.

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rentes maneras. Esto significa que habr un mnimo de fagos requerido para lograr cierta reduccin. Esto se ilustra en la Figura 4, en donde se muestra el efecto de un tratamiento con diferentes niveles de fagos P100 en salmn artificialmente contaminado con Listeria. Con un nivel de tratamiento de 3 x 105 PFU/cm2, virtualmente los fagos no tienen ningn impacto, a pesar de que nominalmente superan en nmero a las bacterias. Con un nivel de tratamiento de 2 x 107 PFU/cm2, se observa una reduccin de casi 3 log10. Con este nivel de tratamiento hay una buena posibilidad de que el fago encuentre una bacteria.

El trmino MOI (multiplicidad de la infeccin) slo tiene sentido cuando se habla de un alto nmero de huspedes en un sistema lquido. Para aplicaciones en alimentos, tiene ms sentido calcular la concentracin necesaria de fagos para infectar una sola clula en una superficie o volumen dado. Este principio se ilustra en la Figura 3. Describe una sola clula en una superficie tratada con 1 x 107 PFU/cm2. La superficie visible en esta figura tiene un rea de una millonsima parte de un cm cuadrado, as que estadsticamente 10 fagos estn en dicha rea cuando se usa este tratamiento. Dependiendo de la superficie y de la cantidad de fluido depositado, los fagos tienen una movilidad limitada, permitindoles buscar en ciertas reas huspedes susceptibles. A menor fluido, menor movilidad y ms rpidamente los fagos se adsorbern a la superficie y se dejarn de mover todos juntos. Tambin, los fagos se van a desactivar completamente con el tiempo por degradacin estructural a travs de dife-

Figura 3. Representacin esquemtica de una millonsima de cm cuadrado en donde se sita una sola

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Foto: ASM Microlibrary.org

en alimentos. Aqu, el objetivo es erradicar los patgenos como una medida apropiada para prevenir un desarrollo posterior de patgenos. Estos estaran slo presentes en pequeas cantidades bajo las condiciones higinicas que se encuentran en el procesamiento moderno de alimentos, lo que significa que se deben suministrar los fagos suficientes para que haya una probable interaccin fago/husped. Los aproximadamente 50 fagos de la progenie obtenidos de dicho encuentro no tendrn influencia estadstica en la poblacin total de fagos.

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Figura 4. Reduccin de bacterias por fagos a diferentes concentraciones. El salmn se contamin artificial-

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la mayora de estos estudios, se observaron reducciones significativas de las cargas bacterianas. Una reduccin cercana al sacrificio puede disminuir significativamente riesgos subsecuentes de seguridad y, en cualquier caso, no se excluye un tratamiento adicional con fagos en etapas posteriores de la produccin del alimento, hecho que varios estudios han demostrado ser altamente efectivo (Lverentz et al., 2001; Whichard et al, 2003). Investigadores Goode et al (2003) reportaron una erradicacin completa en la contaminacin artificial con Campylobacter en piel de pollo.

Bacterifagos en la Seguridad Alimentaria Microorganismos Objetivo

La industria de alimentos est interesado en gran medida en los cuatro grandes patgenos: Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter y E. coli. De stos, slo la Listeria coloniza las instalaciones de las plantas y por tanto es capaz de contaminar el alimento mucho despus del proceso de produccin. Por esto, la conclusin lgica es aplicar el tratamiento con fagos en la etapa en donde surge la contaminacin. Para muchos alimentos, esto sera en un punto antes del empacado, pero el queso, por ejemplo, puede ser vulnerable a la contaminacin durante la etapa de maduracin. Se han publicado varios estudios sobre la eficiencia del tratamiento con fagos en diferentes tipos de alimentos contaminados con Listeria (Leverentz et al., 2003; Leverentz et al., 2004). Los otros tres microorganismos generalmente no colonizan las instalaciones, son usualmente las materias primas las que introducen la contaminacin. De hecho, estos organismos colonizan animales cuya carne se utiliza para el consumo humano. Por tanto, un posible tratamiento es la aplicacin de fagos durante la cra de ganado, adems o como alternativa adel tratamiento a la carne despus del sacrificio. Se han realizado estudios para tratar pollos con fagos contra Salmonella (Fiorentin et al., 2005) y Campylobacter (Atterbury et al., 2007; Wagenarr et al., 2005) y para tratar rumiantes con fagos contra E.Coli patognica (Bach et al., 2003; Raya et al., 2006; Sheng et al., 2006). En
Foto: Food Life

Aplicaciones ambientales
Tambin es posible tratar las superficies de las instalaciones. Las superficies en contacto con el alimento, en particular, se pueden limpiar efectivamente usando fagos, an durante la produccin, sin interrumpir el proceso de elaboracin. Tambin se pueden tratar las superficies que no estn en contacto con el alimento. Sin embargo, el beneficio adicional de esto parece incierto porque los fagos no pueden alcanzar ciertos lugares que los qumicos s pueden. Por esto, los qumicos, que ya se utilizan con este fin, se pueden considerar tan efectivos y a un costo menor.

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Uso en campo
La proteccin del cultivo es una aplicacin adicional para los fagos. Las enfermedades de plantas causadas por bacterias, como las manchas en jitomates y pimiento, o fuego bacteriano en rboles de manzana son candidatos para el uso de fagos contra dichos patgenos. Otra aplicacin es el uso de fagos para tratamiento externo del animal antes del sacrificio. Si, por ejemplo, E. coli coloniza los intestinos de un animal, se pueden encontrar bacterias en su excremento, lo que puede depositarse en pliegues de su piel. El polvo de la piel puede contaminar la carne despus o durante el sacrificio. En el caso de que se enjuague la piel con una solucin con fagos, se puede evitar este problema. Se han publicado pocos datos sobre esta aplicacin en revistas cientficas.

Perspectivas
En la lucha contra bacterias peligrosas y no deseadas, los fagos ofrecen una oportunidad nica. El concepto de usar fagos no es nuevo, pero sabemos que posee lo necesario para aprovechar su potencial. Los fagos se usan fcilmente y pueden mejorar la seguridad del alimento sin afectar sus propiedades organolpticas, o es ms, sin efectos secundarios negativos. Ofrecen una solucin completamente natural al problema de contaminacin con patgenos y tienden a proporcionar una contribucin positiva a la industria de alimentos y a la salud pblica.

Fuente del material seleccionado para este artculo: Bacteriophages New Weapons for Food Safety. Food Technology. IFT: April 2008. IFT. Traduccin: I.A. Violeta Morales V.

Productos bacterifagos y su regulacin

Hace dos aos, en Estados Unidos se aprobaron varias aplicaciones de bacterifagos. En 2006, EBI Food Safety Listex, una sustancia natural y orgnica de fagos anti-Listeria que se puede usar como ayuda en el procesamiento en todos los productos alimenticios susceptibles a L.monocytogenes, se aprob como GRAS por la FDA y el Departamento de Agricultura. En noviembre del 2007, Listex gan el premio de Oro como Ingrediente de Alimentos en Europa por ser la mejor innovacin en la industria. EBI Food Safety, en los Pases Bajos (www.ebifoodsafety.com), conocido como el lder en la tecnologa de fagos, tambin est desarrollando productos de fagos contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Salmonela, E. coli y Campylobacter. En 2007, OmniLytics Inc., Salt Lake City, Utah (www.omnilytics.com), recibi la aprobacin de la FDA para el lavado de piel anti-E.coli y anti-Salmonella con solucin de lavado/vapor/spray en el tratamiento de animales vivos antes de su sacrificio. En 2006, la Agencia de Proteccin Ambiental de Estados Unidos concedi la aprobacin de productos OmniLytics antifgicos para combatir manchas en jitomate y pimiento. La FDA concedi la autorizacin a Intralytics Inc., Baltimore, MD. (wwww.intralytics.com), para LMP 102, una mezcla de seis fagos diferentes que se usan como aditivo contra L. monocytogenes durante el empacado de pollo y productos crnicos listos para consumirse. Varias compaas y docenas de grupos de investigacinestn desarrollando tecnologa de fagos para diferentes aplicaciones.

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