Estudio de la actividad de la peroxidasa, pectinesterasa y polifeniloxidasa en extracto enzimtico de sanda (Citrullus vulgaris Schard)

Avallone, Carmen M. - Cravzov, Alicia L. - Montenegro, Susana B. - Pellizzari, Esther E. Laboratorio de Tecnologa Industrial III - Laboratorio de Qumica Analtica Instrumental Facultad de Agroindustrias - UNNE. Cdte. Fernndez 755 - (3700) Pcia. R. Senz Pea - Chaco - Argentina. E-mail: acravzov@fai.unne.edu.ar

INTRODUCCION

El consumo de Citrullus vulgaris Schard (sanda) se destaca por el gran crecimiento en popularidad en los pases ms desarrollados. El mercado americano, segn el Dpto. de Agricultura del Gobierno de Espaa, considera que el consumo de sanda per cpita se cifraba en 7,4 K/persona/ao (1996). Las causas de este crecimiento se deben en primer lugar por el inters de consumo de productos bajos en grasas, detrs de una interesante campaa con mltiples facetas de promocin y marketing ofrecida conjuntamente por varios industriales, donde se exponan las delicias y ventajas para la salud (Internet, 2000). La cintica de la inactivacin trmica de la peroxidasa en productos fruto-hotcolas ha sido muy estudiada y est constituda por dos fases, cada una de las cuales caracterizada por una cintica de primer orden (CHANG et alii., 1988). Esas dos fases se deben a la existencia de isoenzimas de diferentes estabilidades trmicas, las cuales pueden ser lbiles o resistentes al calor (LING & LUND, 1978). De manera semejante, el estudio cintico de la inactivacin trmica de la pectinestera en jugo de agrios se mostr la presencia de isoenzimas con estabilidades trmicas diferentes (SEYMOUR et alii., 1991).

MATERIALES Y METODO

Se utiliz la fruta de sanda (Citrullus vulgaris Schrad), variedad negra Sugar Boby con fruto redondo de cscara oscura y con corazn muy rojo y Triploide con fruto alargado, cscara jaspeda y corazn rojo. Las dos variedades fueron compradas en comercios de la localidad de Pcia. Roque Senz Pea, Chaco, Argentina; la mencionada en primer lugar tiene procedencia brasilera. La actividad de las enzimas polifenoloxidasa (PFO), peroxidasa (PO) y pectinesterasa se efectuaron en el Extracto Enzimtico, el mismo fue conservado en recipientes de vidrio, previamente esterilizados, refrigerador a 5C y durante seis meses. Extracto Enzimtico: Se prepar en una proporcin de 40 gramos de pulpa de sanda y 160 ml agua destilada helada (a 4C), la trituracin se realiz mediante una procesadora marca Minipimer durante 3 minutos y luego se centrifugo por 15 minutos a 1500 rpm., el lquido sobrenadante fue pasado a un erlenmeyer con tapa de 250 ml, previamente esterilizado, y colacado en bao de hielo picado para ser utilizado como fuente enzimtica. Se mantuvo en refrigerador a 5 C durante cuatro meses. Determinacin de la actividad de la polifenoloxidasa (PFO) (Mtodo de POTIG & JOSLYN 1948): En un erlenmeyer de 250 ml se adiciona 3 ml de catecol 0,1M y 96ml de tampn fosfato 0,2M, pH6 (sustrato), se etabiliza la temperatura a Bao Mara y 30C. Al sustrato se le adiciona 1 ml del extracto enzimtico, luego se homogeniza rpidamente y se realizan 10 lecturas cada minuto en espectrofotmetro a 425 nm, usando agua destilada como blanco. El equipo utilizado fue un Espectrofotmetro UV-Visible Metrolab 325 Digital . Una unidad de la enzima (PPO), se defini como la cantidad de extracto enzimtico que acus un aumento en la absorbancia de 0,001 unidades por minuto. Determinacin de la actividad de peroxidasa (PO): - Mtodo Cualitativo (NEVESKY, 1950): A 1 ml de extracto enzimtico se le adiciona 9 ml de agua destilada ,1 ml de H202 al 3% y 1 ml de guayacol al 1% en etanol. Si desarrolla color marrn, indica la presencia de peroxidasa activa.

- Mtodo Cantitativo (SILVA ,1984 ): En un erlenmeyer de 50 ml se adiciona 20 ml de tampn fosfato 0,2M, pH 6,0 y 2 ml de extracto enzimtico, luego se deja en Bao-Mara a 25C hasta estabilizar la temperatura. Posteriormente se adiciona 1 ml de guayacol al 0,5% y l ml de H202 al 0,08%, se homogeniza rpidamente y se realiza 10 lecturas , una por minuto, en espectrofotmetro a 470nm utilizando como blanco la mezcla reactiva sin peroxido de hidrgeno. Como en el caso de la PFO, una unidad de la enzima (PO), se defini como la cantidad de extracto enzimtico que acus un aumento en la absorbancia de 0,001 unidades por minuto. Determinacin de la actividad de la pectinesterasa (PE) (Metodo de KETESZ): El mtodo consiste en la titulacin de los grupos carboxlicos liberados en 50 ml de una solucin de pectina ctrica al 1% en NaCl 0,1M, en la cual se adiciona 2 ml del extracto enzimtico. El pH de la mezcla de reaccin fue mantenido a 7,5 durante 5 minutos por la adicin de NaOH 0,01N, con agitacin contnua y se mantuvo la temperatura en 30C mediante el uso de agitador magntico con temperatura. La unidad de pectinesterasa (u) fue definida como el nmero de miliequivalentes de ster hidrolizado por minuto a pH 7,5 y a 30C; la actividad de la pectinesterasa se expres como Peu x 104/ml de extracto enzimtico. Peu x 104/ml = miliequiv. De NaOH/ml x volumen de NaOH gastado x 104 Tiempo de reaccin x volumen de la muestra

DISCUSION Y RESULTADOS

Se trabaj con la misma metodologa empleada en Carica papaya L. (Estudio de la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa mnimamente procesada), ya que las tcnicas son vlidas para todo tipo de frutas y hortalizas. De los anlisis efectuados se comprueba que, en el extracto enzimtico de sanda, la actividad de la peroxidasa es positiva, en todas las frutas analizadas y el pH se mantuvo entre 5,2 y 5, 6. Para chequear la metodologa empleda, se utiliz extracto enzimtico de manzana, ya que es una de las fruta que presenta muy alta actividad de peroxidasa (AYLWARD & HAISMAN ,1969). En la tabla N 1 se observan los diferentes valores de PO y su comparacin con manzana sin y con escaldado.

Tabla 1: Actividad de Peroxidass en Citrullus vulgaris Schard (sanda) y Golden Delicious (manzana)

MUESTRA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Extracto de Manzana sin escaldar Extracto Manzana escaldado

Actividad Peroxidasa Mtodo .NEVESKY Mtodo SILVA + 2,81 U/ml + 3,05 U/ml + + + + + + + + + 3,58 U/ml 2,89 U/ml 2,20 U/ml 2,73 U/ml 3,52, U/ml 3,35 U/ml 2,98 U/ml 3,14 U/ml 0,95 U/ml

En el caso del oscurecimiento enzimtico, las reacciones son catalizadas por complejos enzimticos naturales en los alimentos que envuelven la formacin de pigmentos oscuros, liberacin de gases y la reduccin del volumen de la fruta (MONSALVE-GONZALEZ et al., 1993). Una de las enzimas que participa en este tipo de reaccin es la polifenoloxidasa y que pertenece al grupo de las oxidoreductasas y que son conocidas con diferentes nombres. Los sustratos generalmente asociados a las reacciones de oscurecimiento enzimtico son compuestos insaturados como monofenoles y o-difenoles. La polifenoloxidasa es responsable del oscurecimiento de frutas y vegetales cortados o trozados cuando stos son expuestos al aire. La participacin de la enzima en la reaccin consiste en la catlisis de la oxidacin de 2-o-quinona (VEGA-MERCADO, 1994). Analizando los resultados obtenidos para polifenoloxidas, se comprueba que se presenta baja concentracin activa en esta fruta y los resultados coinciden con la fisiologa de esta fruta que evidencia mnimo pardeamiento enzimtico (Tabla 2). Segn SMOCK & NEUBERT (1950) los valores de la actividad de la PFO en manzana es un 30 % superior que la actividad de la PO, lo que concuerda con nuestras determinaciones.

Tabla 2:Actividad de polifenoloxidasa en Citrullus vulgaris Schard y (sanda) y Golden Delicious (manzana)

MUESTRA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Extracto de Manzana

Actividad de Polifenoloxidasa Met. PONTING & JOSLYN (1948) 0,09 U/ml 0,11 U/ml 0,05 U/ml 0,12 U/ml 0,04 U/ml 0,08 U/ml 0,07 U/ml 0,09 U/ml 0,05 U/ml 0,08 UMl 4,65 U/ML

Los resultados obtenidos por SMOCK &NEUBERT (1950) en manzana son algo superior 7,3 U/ml, al encontrado en los anlisis realizados;adems, dichos autores determinaron que la actividad de la PFO en manzana era un 30 % superior que la actividad de la PO, lo que concuerda con nuestras determinaciones. La actividad de la pectinesterasa vara con el tiempo de exposicin al calor y la temperatura. Se puede establecer que al pH de la fruta (5,2-5,6) y sin someterla al calor, los valores del extracto enzimtico fueron de 0,0023 Peu, por lo que el porcentaje de inactivacin es de un cien por ciento.

CONCLUSIONES

Se pudo comprobar la actividad de la peroxidasa y de polifenoloxidasa en todas las muestras de sanda analizadas, obsevando que la peroxidasa activa es muy superior a la de polifeniloxidasa y la inactivacin del 100% de la pectinesterasa sin ningn proceso trmico aplicado.

BIBLIOGRAFIA

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