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EVALUACIN DE MATERIAS PRIMAS VEGETALES COMO FUENTES DE COMPUESTOS INHIBIDORES DE ACTIVIDAD DE LIPASA PANCRETICA EVALUATION OF VEGETAL RAW MATERIALS

AS SOURCES OF INHIBITOR COMPOUNDS OF PANCREATIC LIPASE ACTIVITY Carla Duarte Nass , Mnica Rubilar Diaz , Carolina Shene De Vidts
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Programa de Magster en Ciencias de la Ingeniera mencin Biotecnologa, Universidad de La Frontera, Av. Francisco Salazar 01145, Casilla 54-D, Chile. Email: c.duarte02@ufromail.cl. 2 Departamento de Ingeniera Qumica y Unidad de Tecnologa y Procesos del Centro de Genmica Nutricional Agro-acucola Universidad de La Frontera, Av. Francisco Salazar 01145, Casilla 54-D, Temuco, Chile. RESUMEN La ingesta excesiva de lpidos es una de las causas asociadas a la obesidad en los pases desarrollados. La mayor parte de la digestin de los lpidos es realizada por la lipasa pancretica. El objetivo de este trabajo fue evaluar materias primas vegetales como fuente de potenciales compuestos inhibidores de la actividad de lipasa pancretica en experimentos in vitro. Distintas fracciones de arveja, lupino, soya, trigo, canola, y linaza, fueron evaluadas. De cada material se obtuvieron tres extractos (acuoso, etanlico 50%v/v y 100%). Emulsiones de aceite en agua fueron preparadas con los extractos, utilizando goma arbiga y lecitina como agentes emulsificantes, y 1 mL de sales (cloruro de sodio 20%p/v, cloruro de calcio 0,72%p/v, taurocolato de sodio 0,06%p/v, y bilis 1,5%p/v). La actividad de lipasa pancretica de cerdo (Sigma) fue determinada mediante pH-stat. Como control positivo se utiliz una suspensin del frmaco Orlistat. Los extractos acuosos de cscara de trigo y germen de linaza, y los extractos etanlicos 100% de germen de soya, cscara de linaza y cscara de arveja favorecen la actividad de la lipasa. Los extractos etanlicos de germen de lupino y germen de linaza mostraron actividad inhibitoria (90% de confianza); estos extractos reducen la actividad de la enzima en 54% y 53%, respectivamente. Palabras clave: Lipasa, digestin lipdica, emulsin aceite en agua, extractos vegetales, pH-stat. SUMMARY Excessive lipid content in diet is one of the causes related to obesity in developed countries. Most of the lipid digestion is carried out by the pancreatic lipase. The objective of this work was to evaluate vegetal raw materials as source of inhibitor compounds of pancreatic lipase activity in in vitro experiments. Different fractions of pea, lupin, soy, wheat, canola, and flaxseed were evaluated. From each vegetal raw material, three extract were prepared (aqueous, 50% ethanolic and 100% ethanolic). Oil in water emulsions were prepared with those extracts, using Arabic gum and lecithin as emulsifiers, and 1 mL of salts (20% w/v sodium chloride, 0.72% w/v calcium chloride, 0.06% w/v sodium taurocholate and 1.5% w/v bile extract). Activity of pancreatic lipase (from porcine, Sigma) was measured by pH-stat method. As positive control Orlistat drug was used. Aqueous extracts from wheat hulls and flaxseed flour, and the 100% ethanolic extracts from soy flour, flax hulls and pea hulls increase lipase activity. Ethanolic extracts of lupin and flax flours showed inhibitory activity (90% confidence level); these extracts reduce the enzymatic activity in a 54% and 53%, respectively. Key words: Lipase, lipidic digestion, oil in water emulsion, vegetal extract, pH-stat.

INTRODUCCIN Los lpidos forman parte de la dieta habitual tanto en animales como en humanos; son fuente de energa y precursores de sustancias vitales, como hormonas y vitaminas liposolubles (Campbell y Farrell, 2004). En los seres humanos, la ingesta excesiva de alimentos ricos

en lpidos ha provocado condiciones de obesidad, especialmente en los pases desarrollados (Birari y Bhutani, 2007). La obesidad es una situacin preocupante, ya que trae consigo diversas enfermedades o desrdenes metablicos, tales como hipertensin, aterosclerosis y diabetes (Birari y Bhutani, 2007).

Commodities agrcolas, tales como harinas animales, oleaginosas y legumbres (Hua y Bureau, 2009; Pavasovic et al., 2007) estn disponibles a costos relativamente bajos, presentan perfiles nutricionales necesarios en la alimentacin animal con un reducido contenido de antinutrientes. Las lipasas son enzimas solubles en agua que juegan un rol clave en el metabolismo los lpidos (Reis et al., 2009); catalizan la hidrlisis de enlaces steres en triglicridos (Aloulou et al., 2006). La degradacin qumica de los lpidos emulsionados comienza en el estmago: en esta etapa, los lpidos son hidrolizados parcialmente por la lipasa gstrica, la cual es estable en medios cidos en un rango de pH entre 3 y 7. La lipasa gstrica humana completa entre 5-30% de la digestin lipdica (Golding y Wooster, 2010). En el intestino delgado, los lpidos emulsionados y parcialmente hidrolizados se mezclan con los jugos digestivos que contienen sales biliares, fosfolpidos, lipasa pancretica, colipasa, proteasas, sales, y bicarbonato de sodio (Hur et al., 2009). La lipasa pancretica presenta actividad entre pH 4,5 y 7,5, con un pH ptimo de alrededor 6,5 (Golding y Wooster, 2010); es responsable de entre 50-70% de la digestin de los lpidos (Birari y Bhutani, 2007). La actividad de las lipasas depende de la composicin de la interface en las gotas de lpidos emulsionados. As, las distintas sustancias anfiflicas (protenas, lpidos polares, polisacridos con carga) que se encuentren contenidas en los alimentos competirn con las molculas de los jugos gastrointestinales por un sitio en la interface de las emulsiones (Golding y Wooster, 2010). Estudios in vitro han demostrado que varios compuestos de superficie activa son capaces de inhibir la actividad de las lipasas en la interface lpidoagua, incluyendo las sales biliares, pequeas molculas de surfactantes, fosfolpidos y protenas (Mun et al., 2007). Las leguminosas se caracterizan por su alto contenido en protenas (Campos-Vega et al., 2010). Adems de sus propiedades nutricionales, tanto en la alimentacin humana como animal, las protenas provenientes de leguminosas poseen una serie de propiedades funcionales, tales como gelificantes, emulsionantes, de absorcin de grasas y de retencin de agua (Nunes et al., 2003). Estas caractersticas influiran en el desarrollo de la

digestin de los lpidos. Estudios han mostrado las pobres propiedades gelificantes y espesantes de las protenas de lupino en comparacin de la protena de soya (Chapleau y de Lamballerie-Anton, 2003). Segn estas afirmaciones, se podra suponer que un alimento rico en protena de lupino debera presentar algn grado de inhibicin de lipasa, ya que sus propiedades como emulsionante son dbiles y, por lo tanto, desestabilizaran las emulsiones interfiriendo con la accin de las sales biliares y la lipasa pancretica en la digestin de los lpidos. Las oleaginosas tambin ofreceran protenas con potencial inhibidor de lipasa, ya que sus semillas poseen protenas estructurales que encapsulan y almacenan el aceite en las clulas, formando cuerpos lipdicos. Las semillas de raps y linaza seran fuente de oleosinas (Purkrtova et al., 2008), las cuales podran actuar como desestabilizadoras de emulsiones durante el proceso digestivo debido a la competencia con las sales biliares en la interface lpido-agua. Las fibras dietticas tambin pueden interferir con la digestin lipdica. Las fibras pueden adsorberse en la superficie de los lpidos emulsionados y formar una cobertura protectora, la cual puede evitar que la lipasa se adsorba en la superficie (Beysseriat et al., 2006). Materiales vegetales ricos en fibra, tales como cscaras de semillas, podran ser una fuente potencial de inhibidores de lipasa. El inhibidor enzimtico ms conocido usado para el tratamiento de la obesidad es el frmaco Orlistat, un derivado de lipstatina aislado de la bacteria Streptomyces toxytricini (Aloulou et al., 2006). Esta sustancia acta como un inhibidor estequiomtrico covalente, formando un complejo enzima-inhibidor de larga duracin (Aloulou et al., 2006). La lipstatina modifica el sitio activo inhibiendo irreversiblemente a la lipasa pancretica, con un nivel de inactivacin IC50=0,75 g/mL (Yun, 2010). A pesar de los buenos resultados en la reduccin de grasa corporal, este frmaco presenta una serie de efectos secundarios, por lo que sera interesante identificar otras sustancias con actividad similar sin los efectos laterales (Birari y Bhutani, 2007). La actividad enzimtica se refiere a la cantidad de sustrato que es transformado o a la cantidad de producto generado por una enzima. Para cuantificar la actividad de lipasa se han

desarrollado distintas metodologas a partir de aquella propuesta por Cherry y Crandll (1932), en las cuales se cuantifican los cidos grasos liberados. La tcnica de pH-stat suministra el lcali en forma continua a la solucin de reaccin para mantener constante el pH. MATERIALES Y MTODOS Las materias primas vegetales evaluadas fueron germen de soya, germen de lupino, germen de arveja verde, germen de arveja forrajera, cscara de arveja forrajera, germen de linaza, cscara de linaza, germen y cscara de raps, y cscara de trigo. Todas las materias primas fueron obtenidas en el mercado local como semillas enteras. El sustrato utilizado fue aceite de oliva, adquirido en el mercado local. Las semillas fueron trituradas y tamizada para separar una fraccin rica en cscara y una rica en germen. El material vegetal fue suspendido en el solvente de extraccin (agua, agua/etanol 50%/50% p/v, y etanol) en cantidad de 5% p/v. La suspensin se dej en agitacin durante 2 h a temperatura ambiente (20C aproximadamente). Los extractos acuoso (EA) y etanol 50% (EE 50%) fueron centrifugados (20 min, 3000 rpm) y se conserv el sobrenadante. El extracto etanol 100% (EE 100%) se filtr con papel Whatman n1 y se conserv el filtrado. Los extractos etanol 50% y 100% se evaporaron en rotavapor a 90C, hasta reducir el volumen en un 50% y 90%, respectivamente. Los extractos acuosos y etanlicos 50% fueron liofilizados y mantenidos a -20C hasta su uso; el extracto etanol 100% se mantuvo a 4C. La actividad se midi segn la metodologa descrita por Jurado et al. (2006) con modificaciones, en un equipo de titulacin automtica con el programa pH-Stat a pH igual a 8. Para ello se utiliz una solucin de hidrxido de sodio 50 mM. La muestra analizada contena 10 mL de emulsin, 1 mL de solucin de sales (cloruro de sodio 20% p/v, cloruro de calcio 0,72% p/v, taurocolato de sodio 0,06% p/v y extracto de bilis 1,5% p/v) y 5 mL de solucin de lipasa (2% p/v lipasa pancretica de cerdo (Sigma) en buffer fosfato pH 8, 10 mM). Cada ensayo se realiz por triplicado. La actividad enzimtica se calcul segn la ecuacin (1): 3 A = v * NNaOH * 10 / Ce(1) Donde A es la actividad enzimtica (moles de cidos grasos generados por min) por g de enzima; v es la pendiente de la curva de gasto

de NaOH (50 m M) (mL/min); NNaOH es la normalidad del lcali en eq/L; y Ce es la masa de enzima utilizada en la reaccin (g). La emulsin se prepar segn la metodologa propuesta por Mun et al. (2006) con modificaciones. El agente emulsionante (en solucin buffer fosfato pH 8, 10 mM), el extracto evaluado, y el aceite (9% p/v considerando la densidad del aceite era de 0,9 g/mL) se agitaron a alta velocidad, y se incub por 10 min a 25C bajo agitacin (250 rpm). El pH de la emulsin se ajust a 8 con NaOH 5 mM antes de iniciar la reaccin. En la evaluacin de actividad de los extractos se consider un ensayo control que no contena el extracto a evaluar. En el caso de evaluacin de actividad enzimtica del frmaco Orlistat, se utiliz la cantidad contenida en una cpsula. La concentracin del compuesto en la solucin de emulsin fue de 0,43% p/v. Se utiliz anlisis de varianza para determinar la significancia de los efectos de los distintos extractos sobre la actividad enzimtica. RESULTADOS Y DISCUSIN Los extractos de los materiales vegetales mostraron diferentes respuestas (ver Figuras 1, 2 y 3).

Figura 1. Actividad enzimtica de lipasa pancretica en emulsiones con presencia de distintos extractos vegetales acuosos. La emulsin control no presenta ningn extracto.

El EA el germen de linaza tuvo un efecto positivo en la actividad lipoltica, mientras sus extractos etanlicos (50% y 100%) presentaron efectos de inhibicin. En promedio los extractos etanlicos 50% y 100% tienden a inhibir a la enzima si se comparan estos resultados con las respuestas obtenidas con los extractos acuosos. Esto podra atribuirse a la mayor capacidad del etanol para solubilizar sustancias descritas como inhibidores de lipasa (saponinas, polifenoles, protenas apolares, fibra soluble, etc.). Esta hiptesis deber comprobarse con anlisis que no se incluyen en este trabajo.

Figura 3. Actividad enzimtica de lipasa pancretica en emulsiones con presencia de distintos extractos vegetales etanlicos al 100%. La emulsin control no presenta ningn extracto.

Figura 2. Actividad enzimtica de lipasa pancretica en emulsiones con presencia de distintos extractos vegetales etanlicos al 50%. La emulsin control no presenta ningn extracto.

Los 3 extractos del germen de lupino y de arveja forrajera se presentan como los mayores inhibidores de la enzima. Sin embargo, las fracciones etanlicas de raps y germen de linaza tambin mostraron ser fuente de inhibidores de lipasa. Por otro lado, los resultados muestran que hay materiales vegetales que actan como potenciadores de la digestin lipdica, como la cscara de trigo, cscara de linaza y germen de soya. Un caso especial es el extracto acuoso del germen de linaza que mostr potenciar la actividad enzimtica a diferencia de los otros extractos del mismo material vegetal.

Los extractos acuosos presentan menos actividad inhibitoria que ambos extractos etanlicos, excepto en el germen de arveja forrajera. Esto podra deberse a que las sustancias solubles en agua no interactan con el sustrato y no interferiran con la accin de las sales biliares en la interfase de las emulsiones. La inhibicin relativa (Tabla 1) indica que los distintos extractos etanlicos 50% y 100% no presentan diferencias importantes, salvo en el caso del germen de arveja forrajera. Es necesaria la identificacin de estos compuestos inhibitorios de lipasa pancretica contenidos en los extractos etanlicos para poder determinar su mecanismo de accin y as desarrollar alimentos funcionales para el control del metabolismo de los lpidos. Segn el anlisis estadstico, los extractos acuosos de cscara de trigo (453,8128,38 U/g) y de germen de linaza (426,7435,40 U/g), al igual que los extractos etanlicos 100% de germen de soya (406,8257,81 U/g) y de cscaras de arveja forrajera (407,9939,99 U/g) y de linaza (436,8177,60 U/g), tienen un significativo (p<0,05) efecto positivo en la actividad de lipasa pancretica.

Tabla 1. Inhibicin relativa de la lipasa pancretica por el frmaco Orlistat y los extractos del germen (G) y cscara (C )de las materias primas. Actividad de control 219,05 U/g83,30. Inhibicin relativa Material EE vegetal EA EE 50% 100% Lupino (G) 41,5% 55,1% 52,5% Arveja (G) 45,9% 31,5% 47,7% Linaza (G) 51,1% 55,5% Raps 18,8% 46,6% 44,8% (C+G) Orlistat 96,5%

En cuanto a la identificacin de materiales vegetales con caracterstica de inhibidor, no fue posible hallar diferencias significativas en los extractos evaluados. Los mejores resultados fueron aquellos obtenidos de los extractos etanlicos 50% y 100% de germen de lupino (98,300,01 U/g y 103,952,89 U/g, respectivamente) y de linaza (107,175,79 U/g y 97,511,67 U/g, respectivamente), con nivel de significancia del 10%. La identificacin de estas materias primas como fuente de compuestos con actividad inhibitoria de la lipasa pancretica es el primer paso para estudios posteriores. La concentracin de los extractos evaluados en este estudio no fue suficiente para conseguir resultados concluyentes acerca de la inhibicin del lupino o de la linaza sobre la lipasa pancretica. CONCLUSIONES A travs de los anlisis estadsticos fue posible dilucidar qu materias primas son fuente potencial de inhibidores. Entre estas materias primas se encuentra el germen de lupino y el germen de linaza, ya que stas arrojaron los menores resultados de actividad enzimtica en sus extractos etanlicos. Alternativamente, el raps y el germen de arveja forrajera tambin presentaron disminucin de actividad de lipasa, aunque menor. El frmaco Orlistat mostr la mayor inhibicin sobre la enzima lipasa pancretica, por lo que es un punto de referencia para poder comparar los resultados medidos en los extractos vegetales. La obtencin de valores de inhibicin similares entre Orlistat y los extractos indicara que estos ltimos podran reemplazar al frmaco en tratamientos contra la obesidad, representando una alternativa tecnolgica de menor costo.

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