Manual de Procedimientos

Diagnstico y caracterizacin de Shigella spp.

2007

AUTORES
Raquel Terragno Mara Ins Caffer Norma Binsztein

Departamento Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para Amrica del Sur

INDICE CAPTULO I- INTRODUCCIN CAPTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SHIGELLA spp. 1.-ESPECMENES
2.-PROCESAMIENTO 2.1.-AISLAMIENTO

5 7 7 7 7 9

Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica de Shigella spp a partir de heces.

2.2.-IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp. 10

2.2.1.- Pruebas Bioqumicas Diferenciales 2.2.2.-Pruebas bioqumicas Agar Hierro Tres Azcares y Agar Kligler Agar Lisina Hierro Prueba del Indol Prueba de la Beta Galactosidasa Test de Utilizacin de Azcares Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa Prueba del Acetato Prueba del Mucato Citrato de Christensen 2.3.-SEROTIPIFICACIN DE SHIGELLA spp. Flujograma para Serotipificacin de Shigella spp. CAPTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD 1.- NIVEL DE LABORATORIOS 2.-ELEMENTOS DE PROTECCIN. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS

12 13 13 16 17 19 21 23 25 26 27 28 31 33 33 34 35 35 36 36

CAPTULO IV-MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUMICAS Agar McConkey Agar EMB Agar SS Agar XLD Agar Hektoen CAPTULO V - PLANILLAS DE RESULTADOS

38 38 38 39 39 40 42

CAPTULO I - INTRODUCCIN
Las bacterias del gnero Shigella, de la familia Enterobacteriaceae, son bastones Gram negativos, de 0.3 a 1 m de dimetro y de 1 a 6 m de longitud, que pueden estar solos, en cadenas o de a pares. Son no mviles, no esporulados, anaerobios facultativos, oxidasa negativo, fermentan la glucosa y otros azcares sin produccin de gas, Voges-Proskauer negativo y rojo de metilo positivo. No utilizan citrato de Simmons, no producen SH2 y son lisina descarboxilasa, arginina dehidrolasa y ureasa negativos (Tabla 1). La temperatura de crecimiento ptima es 37 C. El gnero est formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B); Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D). La shigellosis, infeccin causada por Shigella spp., est distribuida en todo el mundo, pero es endmica en pases tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano. Es causa de infeccin intestinal aguda en nios pequeos. Las 2/3 partes de los casos y la mayora de las defunciones ocurren en nios de 6 meses a 10 aos. Representan tambin un riesgo para viajeros que se trasladan hacia reas endmicas y son frecuentes los brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento como crceles, hospitales psiquitricos, geritricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella tiene como nicos huspedes al ser humano y a los primates. La enfermedad se transmite de persona a persona por la va fecal-oral, por alimentos contaminados donde el vector de transmisin son las moscas, o por el uso de aguas contaminadas para la preparacin de los mismos. La bacteria es altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestin de tan slo 10 a 100 organismos produce infeccin en voluntarios. La gravedad y la letalidad de la infeccin dependen de la edad de la persona, del estado nutricional, de la magnitud de la dosis infectante y del serotipo del microorganismo. Shigella dysenteriae produce la forma ms severa de la enfermedad, con una tasa de letalidad del 20%. En cambio las infecciones por otras especies de Shigella se autolimitan y rara vez son fatales, excepto en huspedes inmunocomprometidos, ancianos y nios pequeos. Shigella flexneri tambin puede producir disentera. Shigella sonnei puede producir brotes

espordicos por alimentos semi-cocidos o mal cocidos y aguas contaminadas. Shigella boydii se asla con menor frecuencia que las otras tres.
TABLA 1. Propiedades Bioqumicas de Shigella spp. Ensayo o Sustrato Sulfuro de hidrgeno Glucosa (gas) Glucosa (cido) Movilidad Citrato de Simmons Adonitol Mucato Rojo de metilo Voges-Proskauer Arginina dihidrolasa Lisine decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Urea (hidrlisis) Fenilalanina deaminasa Salicina Lactosa Sacarosa Xilosa Resultado + + Sh. sonnei +; otras Shigella -

Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th. CDC/NIH (Ver Captulo III - Precauciones de Bioseguridad)

CAPTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SHIGELLA spp. 1.-. ESPECMENES Las muestras se deben obtener en el perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Para muestras humanas se puede utilizar un hisopo de algodn para recoger material mucoso o sanguinolento de la materia fecal. Las muestras que no se van a procesar en dos horas se deben mantener en medio de transporte Cary-Blair con tioglicolato que reduce la tensin de oxgeno. Este medio tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses despus de su preparacin, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas y las muestras se pueden conservar hasta 5 das, siempre en refrigeracin. 2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento Ansas descartables (10l) Placas de Petri (9 cm dimetro) estriles Balanza Estufa de incubacin a 37C Mechero Bunsen Pipetas para 0.1 ml (pipetas de 1 ml) Hisopos de algodn

Medios TSA agar (estras) TSI agar (estras) LIA agar (estras) MacConkey agar (placas) EMB agar (placas) SS agar (placas) XLD agar (placas) Hektoen agar (placas)

Procedimiento No hay un medio de enriquecimiento especfico para el cultivo y aislamiento de Shigella spp. de materia fecal. Si se dispone de caldo GN se lo puede usar para el enriquecimiento. Otra posibilidad es resuspender el hisopo con materia fecal en un caldo tioglicolato y luego sembrar una placa de agar XLD. Da 1 Realizar la siembra en los medios SS, XLD, McConkey, Hektoen, EMB, con heces frescas suspendidas en solucin salina o directamente a partir del hisopo. Incubar las placas por 18-24 horas a 37 C Da 2 Seleccionar colonias convexas de 2 a 4 mm de dimetro. Leer placas de SS: colonias translcidas, ligeramente rosadas, a veces con un centro ms oscuro. Leer placas de XLD: colonias translcidas con un tono rojizo. Leer placas de McConkey: colonias translcidas, ligeramente rosadas. Leer placas de Hektoen: colonias verdes, elevadas y hmedas. Leer placas de EMB: colonias translcidas de color ambar. Sembrar las colonias sospechosas en agar TSI, agar LIA y agar TSA. A partir de la estra en TSA se realiza la confirmacin bioqumica y la serotipificacin (ver da 3).

Comentarios

Seleccionar uno o dos de los medios de aislamiento.

FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE SHIGELLA spp. A PARTIR DE HECES Camino II
1er. da MATERIA FECAL (HISOPO)

Camino I
Suspensin en solucin fisiolgica

Caldo de enriquecimiento (1) 18-24 hs, 37C Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Colonias tpicas (3)

2do. da
TSI LIA Estra

18-24 hs, 37C

3er. da
Colonias tpicas (3) Lectura (4) Serotip. O

P. Bioq. (5) TSI LIA Estra 18-24 hs, 37C

Lectura (4)

Serotip. O

Lectura

4to. da

P. Bioq. (5)

(1) Caldo de enriquecimiento: Ver 2.1.- Aislamiento (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar eosina azul de metileno. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Shigella, se siembran pruebas bioqumicas complementarias y se realiza la serotipificacin somtica O (Serotipo O) (5) Pruebas bioqumicas complementarias: acetato de sodio, mucato de sodio, citrato de Christensen, manita.

2.2.- IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE SHIGELLA spp. Materiales y equipamiento Ansas descartables Mechero Bunsen Estufa a 37C

Medios Medio base para azcares Solucin madre de Manitol 10% Solucin madre de Glucosa 10% Solucin madre de Sacarosa 10% Solucin madre de Salicina 10% Medio base con arginina, lisina y ornitina y medio base sin agregados para control Vaselina estril Discos de ONPG para ensayo de - galactosidasa SIM Mucato de sodio Acetato de sodio Citrato de Christensen

Cepas bacterianas Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.

Procedimiento Da 3 Leer los tubos de agar TSI y LIA de acuerdo a la Tabla 2 y realizar la prueba de ONPG a partir del TSI. Del cultivo en agar TSA inocular: medio SIM; medios con arginina, lisina y ornitina y control; medios base con manita, sacarosa, xilosa y dulcita; agar acetato de sodio, agar Christensen, caldo mucato. Incubar todas las pruebas por 18 a 10

Comentarios

Colocar una capa de vaselina lquida sobre los medios con aminocidos y el tubo control.

24 horas a 37C. Realizar la partir del agar Serotipificacin)

serotipificacin a TSA (ver 2.3

La confirmacin bioqumica y la serotipificacin se pueden realizar al mismo tiempo.

Dia 4 Leer los resultados de las pruebas bioqumicas de acuerdo a la Tabla 2 y anotar los mismos en la Planilla de Resultados. Realizar la prueba de ONPG utilizando discos de ONPG segn lo indicado por el fabricante. Realizar la prueba de indol agregando 1 ml de reactivo de Erlich al medio.

TABLA 2. Pruebas Bioqumicas para identificacin de Shigella spp. Interpretacin de Resultados Medio TSI Reacciones Produccin de cido (si la base es amarilla y la estra roja, la produccin de cido se debe a la glucosa) Produccin de cido de lactosa y/o sacarosa Produccin de gas Resultados Negativo Base roja Positivo Base amarilla

TSI TSI TSI LIA LIA

Estra roja

Estra amarilla Burbujas de gas en la base Color negro Color negro Botn prpura Superficie prpura

Ensayo de Aminocidos ONPG Medio base con azcares Indol

No hay burbujas de gas en la base Produccin de H2S Sin color negro Produccin de H2S Sin color negro Reaccin alcalina, color violeta Botn prpura a travs del medio. Organismos Superficie amarilla que no descarboxilan la lisina producen una estra alcalina y un fondo cido Lisina/ornitina decarboxilasa, Color amarillo arginina dehidrolasa -galactosidasa Sin color Fermentacin Azul Produccin de indol Anillo amarillo

Color prpura amarillo Rosa Anillo rojo-rosado

Las siguientes caractersticas pueden ayudar en la identificacin de Shigella spp.: a) Los aislamientos son siempre inmviles y lisina negativo. 11

b)

La produccin de gas es rara aunque se puede observar ocasionalmente en cepas de

Sh.flexneri, Sh. boydii y Sh. dysenteriae.

2.2.1.- PRUEBAS BIOQUMICAS DIFERENCIALES a) Entre especies de Shigella En la diferenciacin de los cuatro miembros del gnero se deben tener en cuenta algunas propiedades bioqumicas: - Shigella dysenteriae: la mayora de las cepas no fermentan el manitol, son ornitina descarboxilasa negativa y tienen propiedades bioqumicas diferenciales entre los serotipos. Particularmente, Sh dysenteriae 1 es arabinosa e indol negativo y ONPG positivo muy rpido. - Shigella flexneri: la gran mayora de las cepas fermentan manitol y son ornitina descarboxilasa negativo. - Shigella boydii: la gran mayora de las cepas fermentan manitol, son ornitina descarboxilasa negativo y tienen propiedades bioqumicas diferenciales entre los serotipos. - Shigella sonnei: indol negativo, ornitina descarboxilasa positivo, ONPG positivo y manitol positivo. Los caracteres diferenciales se resumen en la TABLA 3.1
TABLA 3.1. Reacciones Bioqumicas de Shigella spp. Especie Sh. dysenteriae Sh. flexneri Sh. sonnei Sh. boydii D-Manitol + + + ONPG + Ornitina decarboxilasa + -

Tabla 3.2. Reacciones Bioqumicas de Serotipos de Shigella. Ver pgina 45

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b) Entre Shigella spp. y Escherichia coli La diferenciacin de Shigella spp respecto a E. coli es uno de los problemas con que se enfrenta el laboratorio de microbiologa y refleja el hecho que E. coli y las cuatro especies de Shigella estn estrechamente relacionadas sobre la base de estudios de hibridacin DNADNA. La mejor aproximacin es realizar un conjunto de pruebas bioqumicas. En Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae, 4th Ed., se sugiere realizar los ensayos que se indican en la TABLA 4.
TABLA 4. Diferenciacin de Shigella spp. y E. coli. Ensayo Mucato Acetato Cit. Christensen Indol (produccin) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Glucosa (gas) Sacarosa Salicina Movilidad Shigella -o+ -o+ +, (+), +, (+), E. coli + + o (+) +, (+), + +, (+), +, (+),+, (+), + +, (+), +, (+), +-

+ 90% o ms positivo en 1-2 das; (+) positivo tardo; - 90% o ms negativo.

Las pruebas citrato de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciacin de los miembros del gnero Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerognicos, no mviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato de Christensen es muy probable que sean E.coli. 2.2.2.- PRUEBAS BIOQUMICAS Agar Hierro Tres Azcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrgeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 13

10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formacin de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn productos alcalinos y el medio TSI permanecer rojo. La produccin de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioqumicos y la interpretacin de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volmenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121 C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. III. Procedimiento A. B. C. D. E. Con un ansa estril tomar material. Punzar el fondo en el centro. Retirar el ansa y estriar sobre la superficie del agar. Dejar la tapa floja para permitir intercambio de aire. Incubar a 37 C por 18 a 24 horas.

IV. Resultados A. B. C. D. E. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, sacarosa y/o Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp). Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.). 14 lactosa (E. coli). (Shigella spp.).

V. Control de Calidad
Bacteria Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi A Salmonella spp. Shigella spp. Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Citrobacter Klebsiella Proteus vulgaris Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Estra K K K K A A A A A A K A Puncin A Ac/g A A Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g A oAc/g Ac/g o A Ac/g o A SH2 + (*) + + +(sucio) + (sucio) -

(*) slo en la parte superior de la puncin o formacin de un anillo. A:cido; K:alcalino; c/g: cn gas

VI. Consideraciones A. Cuando se agrupan los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las reacciones del TSI y KIA pueden variar ligeramente. Algunos no fermentadores de lactosa pueden fermentar sacarosa. B. El test se debe leer entre las 18 y 24 horas. Lecturas tempranas pueden dar falsos resultados cido/cido, mientras que lecturas tardas pueden dar falsos resultados alcalino/alcalino. C. gas. D. En el TSI, la utilizacin de sacarosa puede suprimir el mecanismo enzimtico que resulta en la produccin de SH2. Por esta razn, algunos organismos pueden demostrar produccin de SH2 en KIA pero no en TSI. Una gran produccin de SH2 enmascara la reaccin de la glucosa. Sin embargo la glucosa fue fermentada aunque no se vea el cambio de color. Observar si hay produccin de

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Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilacin de la lisina a cadaverina produce una alcalinizacin del medio y un viraje al violeta del indicador prpura de bromocresol. Como la reaccin tiene lugar en medio cido, es necesaria la fermentacin previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formacin de SH2 produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de Morganella morganii, desaminan la lisina a cido -cetocarbnico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estra y fondo. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Inocular punzando el fondo y luego estriar la superficie del agar. Incubar a 37 C por 18 a 24 horas (a veces pueden ser necesarias 48 horas). IV. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formacin de SH2 se indica por la aparicin de una coloracin negra.

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V. Control de Calidad
Bacteria Salmonella sp. Proteus mirabilis Proteus vulgaris Morganella morganii Prov. rettgeri Providencia spp. Citrobacter spp. Escherichia coli Shigella spp. Klebsiella spp. Estra K R R K R R K K K K Puncin K A A A A A A A A A SH2 + + + + -

A.cido; K.alcalino; R: desaminacin de la lisina

Este medio no es un sustituto del mtodo estndar de Moeller. VI. Consideraciones Dado que decarboxilacin de la lisina ocurre nicamente a pH cido, este medio slo puede utilizarse para diferenciar cultivos que fermenten glucosa.

Prueba Del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehdos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).

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II. Materiales A. Caldo triptofano Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 20.0 g 5.0 g 1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentracin del 1%. El medio se esteriliza a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10C para su conservacin. B. Reactivo de Erlich p-dimetilaminobenzaldehido alcohol etlico, 95% cido clorhidrco, concentrado 1.0 g 95.0 ml 20.0 ml

Se disuelve el aldehdo en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el cido. El reactivo de color amarillo es estable por un ao. Identificar el reactivo con una etiqueta y guardar refrigerado en botellas color caramelo. III. Procedimiento A. B. C. D. E. F. Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene Incubar a 37 C por 18 a 24 horas. Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo. Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

triptofano.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

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V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fcil obtencin y que su conservacin en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli +; Enterobacter aerogenes -; Klebsiella pneumoniae VI. Consideraciones A. El pH ptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La

disminucin del pH provoca una reduccin en la produccin de indol y una reaccin falsamente negativa o dbilmente positiva. B. C. Los cultivos a los cuales se les efecta la prueba del indol deben ser incubados No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada aerbicamente. El descenso en la tensin de oxgeno disminuye la produccin de indol. acidez producida por la fermentacin del azcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la produccin de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

Prueba de la -Galactosidasa I. Principio La fermentacin de la lactosa requiere dos enzimas; mientras que la permeasa facilita la penetracin de la molcula de lactosa dentro de la clula bacteriana, la -galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas; sin embargo hay bacterias que tienen -galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil--D-galactsido (ONPG) es un compuesto incoloro

estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de -galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupa de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es til en la identificacin de fermentadores de lactosa.

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II.Materiales A. Solucin de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37 C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtracin. La solucin es estable por 6 meses. Rotular la solucin y guardar refrigerada (4 a 8 C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0) Disolver 6,9 g de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solucin de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4 C. III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensin espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solucin salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observacin de un cambio de color. B. C. Agregar un disco o dos gotas de solucin de ONPG. Incubar la mezcla a 37 C y examinar cambio de color hasta 24 horas.

IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli + Salmonella (-) VI. Consideraciones A. TSI. B. C. La solucin de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo. A veces se puede favorecer la liberacin de la enzima agregando una gota de tolueno, Se puede partir de estras de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de

se deja reposar unos minutos a 37 C y se agrega luego el ONPG. 20

Test de Utilizacin de Azcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con produccin de cido o cido y gas. El patrn de utilizacin de azcares ayuda en la diferenciacin e identificacin de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azcares se agregan a un medio basal estril. La produccin de cido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La eleccin del medio y del indicador depende del camino metablico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH. II. Materiales A. Medio base Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Azul de bromotimol Indicador de Andrade Agua destilada 10.0 g 1.0 g 5.0 g 10.0 ml 5.0 ml 1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121 C por 15 minutos y enfriar en bao de agua a 50 C. Fraccionar el medio base en alcuotas y agregar los azcares esterilizados por filtracin en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azcares. Dispensar en volmenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estriles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenar con el medio y luego se agrega el azcar estrilmente despus de enfriar a 50 C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 g de fucsina cida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando

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frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castao. Si no se produce una decoloracin suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). C. Solucin de azul de bromotimol Mezclar 47.5 ml de agua destilada con 2.5 ml de NaOH 0,1N y luego agregar 0.1 g de indicador. III. Procedimiento A. B. Con un ansa estril tomar material de un cultivo en medio slido. Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono.

Para una batera de 8 a 10 azcares, es suficiente un nico inculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectar los resultados. Para una batera grande (15 a 20) de azcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. C. Incubar a 37 C y examinar da por da por 4 a 5 das. Para algunos microorganismos

puede ser necesario una incubacin ms prolongada (7 das), registrando los resultados da por da. D. En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 das.

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificacin del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa +

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VI. Consideraciones A. B. C. D. Inocular un medio basal sin azcar para cada microorganismo. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. Como cualquier indicio de gas, an una burbuja pequea, es evidencia de produccin La campanita de Durham se agrega nicamente al medio con glucosa porque si el

de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. microorganismo produce gas con glucosa producir gas con los otros azcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azcares, pero hay que tener en cuenta que todas las enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definicin, entonces slo se pone campanita al medio con glucosa.

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa
I. Principio La decarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminocidos que se ensayan en la identificacin de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilacin de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por accin de una dehidrolasa. El test se debe acompaar con un tubo control que contiene el medio base sin aminocido. Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).

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II. Materiales El medio base ms comnmente utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio est disponible comercialmente. Las concentraciones de aminocidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma D, porque los microorganismos son activos slo frente a la forma L. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminocidos a 3 porciones del medio. El pH se debe ajustar despus de agregar el aminocido y antes de esterilizar a 6 6,2. Fraccionar en volmenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121 C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos y guardar en heladera. III. Procedimiento A. B. C. D. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril. Incubar a 37C Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da.

IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento. Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). V. Control de calidad
Bacteria Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Salmonella Typhimurium Klebsiella spp. Arginina + + Lisina + + + Ornitina + + + + -

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VI. Consideraciones A. B. C. D. Inocular siempre un tubo control. Debe haber desarrollo para que el resultado sea vlido. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisceo puede

interpretar la reaccin. indicar reduccin del indicador ms que formacin de productos alcalinos. Se debe agregar ms indicador antes de interpretar el resultado E. F. G. H. Si la reaccin es difcil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer slo a las 24 horas. Un pequeo precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. Luego de 24 horas cualquier traza de color prpura indica un resultado positivo. interpretar los resultados.

Prueba del Acetato I. Principio El medio permite determinar la capacidad de las bacterias de utilizar acetato como nica fuente de carbono y de energa. Sirve para diferenciar E. coli de Shigella. II. Materiales El medio es igual al agar citrato de Simmons, con la diferencia que lleva 0.25 gr de acetato de sodio en lugar de citrato. Disolver en agua destilada, dispensar en volmenes de 3 ml y autoclavar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en forma de estra y guardar en heladera. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa estril e inocular el agar por puncin. B. Incubar a 37 C durante 7 das, registrando los resultados da por da. IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del medio al azul. Ensayo negativo: no hay cambio de color.

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V. Control de Calidad E. coli + Shigella VI. Consideraciones No hay.

Prueba del Mucato I.Principio Se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar el cido mcico. Es til para diferenciar Escherichia coli de Shigella. II. Materiales Bactopeptona Acido mcico Azul de bromotimol 1/500 NaOH 4N 1.0 g 1.0 g 1.8 ml 1.2 ml

Pesar el cido mcico y disolver en 80 ml de agua destilada Colocar el recipiente sobre un agitador magntico y agregar 1.2 ml de NaOH 4N aproximadamente (para 100 ml de solucin se debe agregar 2.0-2.5 ml de NaOH 4N gota a gota), hasta virar el color amarillo de la solucin al azul-verdoso; este color debe persistir durante 5 minutos de agitacin. El agregado del lcali es para transformar el cido mcico poco soluble en la sal soluble, mucato de sodio. A continuacin agregar 1.0 g de bactopeptona, 1.8 ml de azul de bromotimol. y 15.0 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 por medio de NaOH 0.1N o HCl 0.1N, si se ha pasado el pH. Esterilizar por filtracin y fraccionar en forma estril en volmenes de 3 ml por tubo. Guardar en heladera. III. Procedimiento Tomar material con un ansa estril e inocular un tubo con mucato. Incubar a 37 C durante 48 horas, realizando lecturas a las 24 horas.

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IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso. Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso. V. Control de Calidad Cepas mucato (+): E. coli, Salmonella Paratyphi B Cepas mucato (-): Proteus vulgaris, Shigella sp., Salmonella Paratyphi A VI. Consideraciones No hay.

Citrato de Christensen I. Principio Este medio pone en evidencia la utilizacin del citrato en presencia de nitrgeno orgnico (monoclorhidrato de cistena). Es igual al de citrato de Simmons con la nica diferencia que la fuente de nitrgeno es orgnica. Es til en la diferenciacin entre Escherichia coli y Shigella. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Se disuelve el polvo con agua destilada, se caliente suavemente y se fracciona en volmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Se esteriliza a 121 C durante 15 minutos y se enfra en pico de flauta. El medio se guarda en heladera. III. Procedimiento Se repite todo exactamente igual que lo indicado para el citrato de Simmons, pero las lecturas se realizan durante 7 das, registrando los resultados da por da. IV. Resultados Ensayo positivo: color rojo rosado en el pico de flauta. Ensayo negativo: no se observa cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli +

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Shigella VI. Consideraciones No hay. 2.3.- SEROTIPIFICACIN DE SHIGELLA spp. El uso de mtodos de serotipificacin con propsitos de vigilancia epidemiolgica se basa en el hecho que los microorganismos muestran variaciones en su composicin antignica. Los microorganismos producen una variedad de antgenos: componentes estructurales de la clula (constituyentes de la pared celular, cpsulas, flagelos, fimbrias); productos de secrecin de las clulas (toxinas, enzimas extracelulares) o antgenos contenidos en el interior de las clulas. Qumicamente, los antgenos usados con este propsito pueden ser protenas, carbohidratos, o mezclas de ambos componentes. Debido a la caracterstica del gnero Shigella de ser inmviles, solamente se ponen en evidencia los antgenos (denominados somticos) compuestos por cadenas polisacardicas del lipopolisacrido (LPS) de la membrana externa, integrante de la pared celular. Cuando un antisuero especfico se mezcla con una suspensin de un cultivo puro de Shigella se observa una reaccin de aglutinacin. Luego del aislamiento e identificacin, se realiza la aglutinacin en lmina: los anticuerpos en el suero aglutinarn con la bacteria cuando los antgenos correspondientes estn presentes.

Materiales y equipamiento Ansas descartables Lminas de vidrio

Reactivos Solucin salina 2% Antisueros polivalentes y monovalentes de Shigella para la serotipificacin de

miembros del gnero Shigella. Se necesita el siguiente conjunto de antisueros: a) Tres antisueros de Shigella dysenteriae.

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- A(I -) que aglutina los serotipos indol negativos (1,3,4,5,6,9 y 10) - A(I +) que aglutina los serotipos indol positivos (2,7 y 8) - Un antisuero monovalente anti Sh. dysenteriae 1. b) Antisueros polivalentes de Shigella flexneri para aglutinar los 6 serogrupos y antisueros monovalentes para diferenciar los serotipos dentro de cada serogrupo.. c) Un antisuero de Shigella sonnei. d) Dos antisueros de Shigella boydii - C(I-) para aglutinar serotipos indol negativo (1,2,3,4,6,8,10,12 y 14). - C(I+) para aglutinar serotipos indol positivo (5,7,9,11,13 y 15). La nomenclatura de los antisueros mencionados corresponde a los nombres dados por el Instituto Nacional de Produccin de Biolgicos - ANLIS Carlos G. Malbrn, Argentina.
Procedimiento Comentarios

Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lmina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de solucin salina 2% (control de autoaglutinacin). Mezclar cuidadosamente, con un palillo sobre una lmina de vidrio, un ansa del cultivo en TSA y una gota de antisuero polivalente. Mover la lmina suavemente por 2 minutos.

Si no hay aglutinacin el cultivo no est rugoso y se procede al segundo paso. La seleccin de los antisueros polivalentes se debe hacer en base a la historia de la regin o pas y a las pruebas bioqumicas diferenciales indicadoras de especie Una suspensin homognea indica una reaccin negativa. Una aglutinacin indica una reaccin positiva. Cuando un cultivo que presenta caractersticas bioqumicas de Shigella aglutina pobremente o no aglutina, se puede estar en presencia de un aislamiento capsulado. Estos cultivos se deben calentar en un bao de agua a 100C por 15 a 30 minutos y luego se repite el ensayo de aglutinacin.

La aglutinacin positiva con los antisueros polivalentes contina con la aglutinacin con algunos de los antisueros monovalentes correspondientes, para determinar el serotipo del cultivo.

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Comentarios Situaciones atpicas que se pueden presentar: a) 100 C. b) TSI alcalino/cido con gas, SIM (---), acetato de sodio negativo, ureasa negativa: a TSI alcalino/cido sin gas, SIM (-v-), acetato de sodio negativo, ureasa negativa y

aglutinacin con el antisuero especfico pobre o negativa: estos cultivos se deben calentar a

estos cultivos se les debe probar aglutinacin porque algunos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh. flexneri y Sh. boydii fermentan glucosa con produccin de gas.

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FLUJOGRAMA PARA SEROTIPIFICACIN DE SHIGELLA spp.

Cultivo con propiedades bioqumicas de Shigella

Aglutinacin con solucin salina 2%

Negativo

Positivo

Cepa rugosa Aglutinacin con OShB

Positivo Negativo

Sh. flexneri (probar serotipos 1a 6)

Aglutinacin con OShD

Positivo Negativo

Sh. sonnei

Aglutinacin con OShC

Positivo Negativo

Sh. boydii (probar serotipos indol + y -)

Aglutinacin con OShA

Positivo Negativo

Sh. dysenteriae (probar serotipos indol + y -, y serotipo 1)

Calentar y repetir el procedimiento

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Referencias

Bopp, Ch., Brenner, F., Wells, J., Strockbine N. 1999. Escherichia, Salmonella, Shigella,. In Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. (Ed.). Cap. 28, pp. 459-474. Ewing, W. 1986. Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae. 4th edition. Elsevier Science Publishers. Le Minor, L., Richard, C. 1993. Mthodes de Laboratoire pour lIdentification des Entrobactries. Institut Pasteur.

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CAPTULO III PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

Los laboratorios de microbiologa son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy rpido, no seguir prcticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo. Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el conjunto de mtodos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la proteccin de los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente. Define las condiciones de contencin provistas por el uso de equipos de seguridad. Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en funcin de su patogenicidad, forma y facilidad de transmisin, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento. Los microorganismos con los cuales se trabajar Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin pero se dispone de medidas de tratamiento y de prevencin y el riesgo de propagacin es limitado. 1.- NIVEL DE LABORATORIO El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En este nivel el personal debe contar con una capacitacin especfica para el manejo de los agentes patgenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio est restringido cuando se estn desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el smbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos cortopunzantes y se utilizan elementos de proteccin (ambos, delantales, guantes, mscaras faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los productos qumicos empleados en la desinfeccin.

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El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas de decontaminacin del material. En los laboratorios est prohibido comer, beber, fumar, manipular de lentes de contacto, maquillarse. 2.- ELEMENTOS DE PROTECCION a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el lavado. b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y no se deben usar fuera del laboratorio. c) Proteccin Facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algn procedimiento genere gotas o aerosoles La proteccin facial esta dada por anteojos, mscaras faciales, barbijos. d) Gabinete de seguridad biolgica, cuando existe la posibilidad de generacin de gotas o aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el medio ambiente. El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al rea de trabajo, y tambin sale al ambiente a travs de otro filtro, (Fig. 1). Es obligatorio que los gabinetes se evalen y certifiquen en el momento de la instalacin en el laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por ao a partir de ese momento.

FIGURA 1 34

Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para perturbar lo menos posible la circulacin del aire dentro del gabinete. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO 1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de trabajo. 2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio, plstico, pipetas, esptulas, que est en contacto con las supensiones bacterianas. 3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratar en autoclave. No efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio. 4. Descartar los residuos plsticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a la perforacin, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos recipientes NO SE DEBEN LLENAR COMPLETAMENTE. 5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plsticas de color rojo, para su posterior eliminacin. 6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad para su posterior descontaminacin en autoclave. 7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solucin de hipoclorito de sodio al 10%. 8. Notificar a las personas responsables del rea o instructores de trabajos prcticos cuando se produzcan derrames, quienes tomarn las medidas adecuadas segn el caso. 9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa plstica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad vidrios rotos. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas. 2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene. 3. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin no se arriesgue y evacue el laboratorio. 4. No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. 5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.

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6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA Se deben tener disponibles los nmeros telefnicos correspondientes. 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS El acondicionamiento seguro de muestras para diagnstico bacteriolgico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envo. Los materiales para diagnstico se deben enviar en el sistema de triple envase de acuerdo a las recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2) El sistema consiste de: a) Recipiente primario, a prueba de prdidas, con cierre hermtico (tubo pequeo o vial), en el cual se coloca la muestra. b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el recipiente primario. c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como dao fsico o agua. El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente, para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una prdida durante el transporte. Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de informacin que identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor del recipiente secundario.

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FIGURA 2 REFERENCIAS Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH, 2001. www.cdc.gov. Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/.

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CAPTULO IV - MEDIOS DE CULTIVO

Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inculos pequeos. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la produccin de cido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitacin de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. El medio contiene: peptona, sales biliares, rojo neutro, cristal violeta, sales y lactosa. Interpretacin Salmonella, Shigella: incoloras, medio amarillo Escherichia: rojas, halo turbio Enterobacter, Klebsiella: grandes, rosadas a rojo, mucosas Proteus: incoloras Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patgenas intestinales Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciacin de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompaante lac (-)/lac(+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinacin de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan ms rpido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias Gram (+) est inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno).

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Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. El medio contiene: peptona, sales biliares, tiosulfato, carbonato de calcio, lactosa y sacarosa. Interpretacin Salmonella, Shigella: transparentes, mbar rosado Escherichia: violceas con brillo metlico y centro negro azulado Enterobacter, Klebsiella: colonias grandes, mucosas sin brillo metlico y centro oscuro. Bacterias lac (+): negras o centro oscuro, halo transparente. Bacterias lac (+) o sac (-): incoloras. Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve tambin para Yersinia enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentracin de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompaante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formacin de sulfuro de hierro. La degradacin de la lactosa a cido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. El medio contiene: extracto de carne, peptona, lactosa, citrato de hierro amoniacal, tiosulfato, verde brillante, rojo neutro. Interpretacin Salmonella: incoloras, transparentes, centro negro Shigella: incoloras, transparentes, medio amarillo Proteus: transparentes, centro rojo, medio amarillo Escherichia coli: rosadas a rojo, medio rojo Enterobacter aerogenes: rosadas a crema, opacas, mucosas Bacterias lac +: rojizas, mucoides, centro negro Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella. La degradacin de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al

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amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la produccin de sulfhdrico. La decarboxilacin de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo prpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciacin de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentacin de xilosa, decarboxilacin de lisina y produccin de sulfhdrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella de los fermentadores de xilosa no patgenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis + reviertan la condicin alcalina de los microorganismos consumidores rpidos de xilosa/lisina. La produccin de sulfhdrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones cidas la precipitacin negra se inhibe. El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtracin. Interpretacin E. coli, Enterobacter: amarilla, opacas, c/precipitado Aeromonas: amarilla, opacas, c/precipitado Klebsiella: amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado Citrobacter: amarilla, opacas, centro negro Serrati, Hafnia: amarilla, opacas P. vulgaris, P. mirabilis: amarilla, translcidas, centro negro Salmonella: igual color del medio, centro negro Shigella, Providencia: igual color del medio, translcidas Salmonella Typhi: amarilla, ligeramente opacas

Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluidas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompaante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac + tienen una diferencia

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cromtica con las colonias lac -; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloracin negra a las colonias sulfhdrico+. Las sales biliares inhiben a la flora acompaante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. El medio contiene: peptona, extracto de levadura, sacarosa, lactosa, salicina, tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, sales biliares, azul de bromotimol, fucsina. Interpretacin Shigella, Providencia: verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus: verde-azuladas, c/s centro negro Pseudomonas: verde-azuladas, planas, borde irregular Coliformes: salmn, halo de precipitacin

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CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS

Aislamiento de Shigella de heces Morfologa en agar selectivo
Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color Morfologa en MacConkey Resultados Comentarios

Morfologa en EMB

Morfologa en SS

Morfologa en XLD

Morfologa en Hektoen

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PLANILLA DE RESULTADOS Aislamiento de Shigella de heces Pruebas Bioqumicas

Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ Color TSI profundidad TSI estra TSI gas TSI H2S LIA profundidad LIA estra Arginine dihidrolasa Lisine decarboxilasa Ornithine decarboxilasa Mucate (fermentacin) Acetate (utilizacin) Cit. Christensen Indole (reaccin) Sucrose (fermentacin) Manitol (fermentacin) Xylose (fermentacin) Dulcita (fermentacin) -galactosidasa Resultados Comentarios

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PLANILLA DE RESULTADOS Aislamiento de Shigella de heces Serotipificacin

Fecha:____________________ Nombre:__________________ Muestra:__________________ A) Antisueros polivalentes OSh A OSh B OSh C OSh D

B) Antisueros de serotipos Antisueros polivalentes OSh A OSh B OSh C OSh D Antisueros de serotipos

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Subgrupo/Serotipo Sh. dysenteriae 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sh. flexneri 1 2 3 4 4 5 6 Sh. boydii 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Sh. sonnei

Man. + + + + + + + + + + + + + + + + + + "-/+" + +

% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 95 99 98 99 0 99 99 100 100 100 99 100 100 100 95 94 100 100 100 29 90 99

Dul. "+/(+)" d d "-/(+)" "(+)/+" + "-/(+)" "-/(+)" -

% 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 1 1 75 28 0 100 0 0 0 100 34 14 0 0 0 1

Xil. "+/(+)" + d "+/(+)" d (+) + + + d "+/(+)" "(+)/+" -

% 0 0 0 0 0 0 0 96 0 100 0 0 0 0 71 0 4 97 0 86 0 94 100 98 94 0 84 100 0 0 100 0 1

Ram. + "(+)/+" d d "-/+" d "+/(+)"

% 0 98 0 0 0 0 90 0 0 0

Raf. d d

% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 89 77 88 82 3 72 84

Glic. "+/(+)" "(+)/+" "(+)/+" "(+)/+" "+/(+)" "-/(+)" "+/(+)" "+/(+)" d "(+)/+ "+/(+)" "+/(+)" "+/(+)" d "(+)/+" "(+)/+" "(+)/+" "(+)/-" "(+)/+" "(+)/+" "-/+" "(+)/-" "+/(+)" "(+)/+" d

% 100 98 100 100 100 38 0 100 100 0 0 0 0 0 0 0 98 96 100 91 100 61 100 98 100 82 100 100 14 63 100 64 46

Indol + + + "-/+" "-/+" "+/-" "+/-" + + + + + + + + -

% 0 100 0 0 0 0 100 100 0 0 35 44 88 55 98 95 0 0 0 0 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0

Orn. Decarb. + +

% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 99

12 23 48 5 6 0 0 0 0 0 0 0 0 80 0 0 0 0 0 0 98

d d d d

6 "+/(+)" 100

Tabla 3.2. Reacciones Bioqumicas de Serotipos de Shigella spp.

+ 90% o >; - 90% o >; +/- >> +; -/+ >>-; d diferentes reacciones

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