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LABORATORIO DE QUIMICA

UNIDAD ACADÉMICA: Departamento de Biología y Química

CURSO: Bioquímica y función celular
AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y SEPARACIÓN POR
PRACTICA Nº 2: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

1. OBJETIVOS
● Comprobar el carácter anfotérico de los aminoácidos y determinar mediante curvas de titulación, los
valores de pK de los grupos ionizables.
● Hallar el punto isoeléctrico de los aminoácidos.
● Separar e identificar una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina.

2. CONSULTA PREVIA
Simule una curva de titulación para un aminoácido explicando cada una de las regiones que la componen.
Consulte qué es la cromatografía de reparto.
Defina los siguientes términos: analito, fase móvil, fase estacionaria, elución, frente de elución, factor de
retención, tiempo de retención.

3. FUNDAMENTO TEÓRICO

Estructura de los aminoácidos

Los 20 aminoácidos estándar que forman las proteínas son L-aminoácido (de acuerdo a su estereoquímica, por
convención, el grupo amino se encuentra representado a la izquierda de ahí la letra L) y la ɑ aminoácidos donde
su estructura común está caracterizada por la presencia de un grupo amino, un grupo carboxilo y un hidrógeno
unidos sobre el mismo átomo de carbono, llamado carbono ɑ. A su vez, los 20 aminoácidos se diferencian por la
naturaleza del cuarto constituyente, llamado en general grupo R (Fig. 1), las propiedades de cada aminoácido
depende de la naturaleza química de cada grupo R.

Figura 1. Estructura general de los aminoácidos

Curvas de titulación para aminoácidos

Puesto que los aminoácidos poseen un grupo amino y uno carboxilo (pueden comportarse como una base o
como un ácido), deben reaccionar con ácidos y bases. Dichos compuestos se conocen como sustancias
anfotéricas. En soluciones de pH neutro los aminoácidos existen como zwitteriones (iones doblemente cargados)
en los que el grupo carboxilo está disociado y el grupo amino protonado. El zwitterion pueden actuar como ácido
(donador de protones):
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O como una base (aceptor de protones):

Los aminoácidos tienen curvas de titulación características, a partir de las cuales se pueden obtener los valores
de pK de cada uno de los grupos ionizables. El comportamiento anfótero de cada uno de los aminoácidos y sus
valores de punto isoeléctrico son una consecuencia de su estructura particular, ya que los grupos ionizables de
la cadena lateral R también contribuyen a la carga. Eso se reflejaría en la curva de titulación.

2.3 Separación por cromatografía en capa fina

La cromatografía es una de las técnicas más útiles para la separación de compuestos que presentan propiedades
químicas estrechamente relacionadas. La separación se lleva a cabo por la diferencia en la interacción entre los
componentes de una mezcla y dos fases inmiscibles: la fase estacionaria y la fase móvil. La fase estacionaria es
un medio poroso, como la sílica gel o alúmina, a través de la cual la mezcla migra bajo la influencia del movimiento
de un disolvente (fase móvil).
La cromatografía en capa fina (o thinlayerchromatography – TLC) es una técnica utilizada para separar e
identificar compuestos de interés en una mezcla. En esta técnica se utiliza una placa recubierta de una capa fina
de sílica adherida a una lámina de vidrio o aluminio, la sílica actúa como fase estacionaria y una mezcla de
solventes fase móvil (Fig 2).
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Para realizar una corrida cromatografía utilizando una técnica primero se debe sembrar la muestra a analizar en
una línea de base. Luego, la placa es puesta en una cámara cromatográfica y el solvente empezara a ascender
por capilaridad. La cámara debe estar cerrada para que este saturada con el solvente. A medida que el solvente
avanza de la mezcla se separa en sus componentes, avanzado con mayor grado aquel componente de la mezcla
que presente menor interacción con la fase estacionaria. Un criterio utilizado pata comparar los componentes
desconocidos de una mezcla y patrones conocidos es el factor de retención (Rf), el cual es un relación aritmética
entre la distancia que recorrió uno de los componentes de la mezcla y la distancia que avanzó la fase móvil.

2.4 Separación cromatografía de aminoácidos

La interacción de los aminoácidos con la fase estacionaria, como la sílica, varía en función del grupo –R. Por
ejemplo, un aminoácido que interactúa fuertemente con la sílica, luego de efectuar la corrida cromatografía,
recorrerá una pequeña distancia con respecto al punto de siembra de la muestra, mientras que el presente menor
interacción se moverá más. A su vez mediante el uso de patrones es posible identificar los componentes de una
mezcla. Puesto que los aminoácidos son compuestos no coloreados, la ninhidrinaes empleada para detectarlos.

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos y/o montajes Materiales Reactivos

Plancha de agitación Vasos de precipitados de 100 mL (2) HCl 0,2 N (valorado)

Potenciómetro Vaso de precipitado de 250 mL (1) NaOH 0,2 N (valorado)
Horno de Soluciones de aminoácidos en agua 0,1
convección Pipeta graduada de 25 mL M (ej.: glicina y glutamato)
forzada
Pera de succión (1) Sílica gel- 60

Soluciones de aminoácidos en agua al

Bureta graduada de 25 mL (1)
Pinza para bureta (1)
Soporte universal (1)
2% (ej.: Triptófano, glicina, tirosina)
Mezcla de solventes: n-butanil, ácido
acético y agua (relación 12:3:5)
Reactivo de ninhindrina: disolver 0,2 g en
100 mL de acetona (preparar solución fresca)

Agitador magnético (1)

Frasco lavador (1)

Probeta graduada de 25 mL (1)

Cámara cromatográfica (1)

Placas cromatografía (2)

Capilares (3)
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5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA

5.1 Titulación de un aminoácido

5.1.1 Aspectos generales a considerar

En esta práctica se realizará la práctica la titulación de dos aminoácidos, para ello se comparará un aminoácido
neutro con uno ácido o vaso. Para obtener la curva completa de valoración es necesario utilizar un ácido titulante
(HCl 0.2 M) y una base (NaOH 0.2 M). A partir de la curva de titulación se determinarán los valores pK de cada
uno de los grupos ionizables, así como las zonas tampón, punto isoeléctrico y la posible importancia fisiológica
de estos equilibrios.

Teniendo en cuenta que los pK de los grupos funcionales de los aminoácidos se encuentran localizados en
distintos rangos de pH, es necesario realizar una titulación que abarque prácticamente todo el rango pH (ácido y
básico) para cada aminoácido. Así, se emplea una solución de HCl 0.2 M para los grupos ɑ- carboxilo, y una
solución de NaOH 0.2 M para los grupos ɑ- amino. Bajo este esquema, hay que realizar dos valoraciones por
cada solución de aminoácido, una con ácido y otra con base.

Otra posibilidad es ajustar el pH de solución inicial a valores muy ácidos o muy básicos, y titular con un solo
agente; el problema de esta segunda aproximación radica en la dilución de la muestra tras sucesivas adiciones
de ácido o base fuerte. Dado lo anterior en esta práctica se realizará la primera opción.

5.1.2 Protocolo de trabajo

1. Calibre el potenciómetro según las instrucciones del equipo.

2. En un vaso de precipitados de 100 mL coloque 50 mL de la solución del aminoácido (0,1 M) y empiece la
agitación, lea el pH inicial y regístrelo.
3. Usando una bureta agregue HCl 0,2 M, adicionando cada vez 1 mL y determine el pH después de cada
adicción. Continúe agregando ácido hasta pH 1,5 aproximadamente. Registre los valores de pH y de ácido
adicionado (mL).
4. Lave el electrodo con agua destilada y titule de la misma manera otros 50 mL de la solución del mismo
aminoácido agregando esta vez hidróxido de sodio 0,2 M, hasta pH 12,5.

Tabulación de los datos experimentales. En una tabla debe registrar los siguientes datos: volumen de ácido o
base adicionado y el pH medido después de cada adición.

Representaciones gráficas. En una gráfica, se debe incluir el V ácido/base adicionado vs. pH para cada
valoración realizada. En el eje de abscisas se representa la cantidad de agente titulante añadido (puede
representado en términos de su volumen, equivalentes o moles) y en el eje de ordenadas, el pH obtenido. Los
puntos se pueden unir con una línea. Luego de realizada cada curva de cada titulación para el mismo aminoácido
debe de entregar una única curva de titulación para cada aminoácido.

Cálculos y resultados que debe incluir el informe:

● Valores de los pK de los grupos ionizables.
● Regiones de capacidad buffer.
● Punto isoeléctrico (pl)
● Esquema de las formas ionizables del aminoácido en cada rango de pH.
● Carga eléctrica del aminoácido en cada rango del pH y solubilidad del mismo
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5.2 Separación cromatografía de aminoácidos

5.2.1 Preparación de la cromatografía

1. Adicione la mezcla de solventes en una cámara para cromatografía y ciérrela (adicione un volumen
suficiente para que la altura del líquido sea alrededor de 0,5 cm)

2. la cámara debe estar sin perturbaciones por aproximadamente 20 min, esto permite saturar la atmósfera
dentro de la cámara con el solvente

3. tome la placa (siempre teniendo cuidado de no tocar la sílica, sujetando la placa por los lados). CON UN
LÁPIZ (no debe utilizar esfero) trace cuidadosamente una línea recta a través de lo ancho de la placa
aproximadamente 1,5 cm del borde inferior. Esta línea se denominará línea de base.

4. Usando capilares diferentes para cada muestra de aminoácidos, coloque diminutas gotas (siembra) sobre
la línea base, para ello toque suave y perpendicularmente la placa con la punta del capilar.

5. Permita secar la siembra.

6. Siembre el segundo aminoácido sobre la línea de la base de la placa, procurando dejar por lo menos un
espacio aproximando de 1,0 cm entre muestra y muestra y alrededor de no menos de 0,5 cm antes de
los bordes de la placa.

7. Repita los anteriores pasos para la siembra del aminoácido desconocido.

8. Escriba una marca en la placa que le permita identificar el orden de siembra y registre dicho orden
directamente en el cuaderno.

9. Las muestras a sembrar son:

a. Un aminoácido polar.
b. Un aminoácido con polaridad intermedia.
c. Un aminoácido apolar.
d. Una mezcla de aminoácidos desconocida.

5.2.2. Desarrollo de la cromatografía

1. Ponga la placa en la cámara e inclina contra la pared interna del frasco (la línea base con las muestras
sembradas debe de estar por encima del solvente).

2. Cierre la cámara. No perturbe el sistema mientras asciende el solvente.

3. Retire la placa y observe que el líquido esté cerca del borde superior (alrededor de 1 cm del final de la
placa).

4. Marque rápidamente con un lápiz la línea final que alcanzó el líquido después del ascenso.
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5. Dejar de secar la placa a temperatura ambiente. DE QUIMICA

6. Atomice la placa con la solución de ninhidrina.

7. Caliente la placa en el horno a 105°C por cada 5 min (la ninhidrina reaccionara con los aminoácidos
sembrados volviéndolos como manchas de color purpura).

5.2.3 Cálculo del factor de retención (Rf) y expresión de los resultados

Las retenciones de la fase estacionaria para las diferentes sustancias se determinan calculando el factor
retención, Rf. Es importante establecer un criterio unificado para medir la distancia desde el punto de siembra
hasta la mancha coloreada. Lo mas usual es considerar la distancia de la línea base hasta el centro de la mancha
de color de la sustancia que ha migrado (distancia A). El Rf se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:

6. RESULTADOS
Se entregará un informe con los respectivos resultados.
¿Cuál es la utilidad del punto isoeléctrico en la separación de aminoácidos?

7. FUENTES BIBLIOGRÁFICAS
● López Rico, María Elizabeth. Guía de laboratorio de Bioquímica para la carrera de química. Bogotá.
Universidad Nacional de Colombia, 2005.
● http://ocw.usal.es/ciencias-biosanitarias/bioquimica-ph-equilibrios-acido-2013-
base/contenidos/4.%20Curvas20%titulacion%20de%20aminoacidos.pdf , Última fecha de acceso:
05/08/13
● http://www.uco.es/dptos./bioquímicabiomol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20DE%20CAPA
%2 0FINA%20DE%20AAs.pdf