Tema 5: CRECIMIENTO EN MEDIOS DE CULTIVO

En el laboratorio, los microorganismos se cultivan bajo condiciones nutricionales óptimas en ambientes ricos
en nutrientes, los organismos proliferan. → Si la población crece se considera un aumento demográfico.
Crecimiento: incremento progresivo de la densidad celular de una población microbiana como consecuencia
de divisiones celulares sucesivas.
DIVISIÓN CELULAR EN PROCARIOTAS: FISIÓN BINARIA (BIPARTICIÓN)
La célula madre se estrangula en el centro, formando dos células hijas más pequeñas. Intervienen:
 Proteínas citoplasmáticas (FtsZ)
o Filamentos Termosensibles, similares a la tubulina eucariota, migran al centro de la célula y
forman un anillo o plano de división, el divisoma
 Autolisinas: enzimas que salen al exterior y digieren parcialmente la pared celular en localizaciones
definidas por la posición del divisoma.
 Pared celular: crece hacia el interior celular formando un tabique central o septo que estrangula el
citoplasma siguiendo el plano definido por el divisoma.
 Mesosoma: fija el cromosma y su copia y los desplazan a polos opuestos.
Proceso:
1. Replicación del cromosoma (unido al mesosoma) y de los plásmidos, una vez que la célula ya
alcanzó su talla habitual
2. Migración de cromosomas a polos opuestos la célula se alarga (desde el centro): los mesosomas se
distancian arrastrando cada cromosoma a un extremo
3. Estrangulamiento del citoplasma por crecimiento de la pared hacia el interior (septo) siguiendo un
plano de división (divisoma).
4. Separación de las ´células hijas cuando se completa el septo. Las células hijas pueden permanecer
juntas o separarse.

Septo transverso: la pared crece según el plano determinado por el divisoma.

FtsZ: es una proteína de división celular relacionada con la tubulina (homólogo estructural). Se ensambla
como un anillo y define el plano de división. Requiere GTP para su polimerización.
La división celular determina la agrupación del as células bacterianas. A consecuencia de la orientación del
plano de división celular. Puede ser:
 Escherichia coli

Formación de FstZ en E. coli. En E. coli, la selección del sitio de división por FtsZ depende de dos sistemas
reguladores negativos: Min y oclusión nucleoide (ON). Proceso:
1. El sistema Min (MinCDE) evita la formación de anillos FtsZ en los polos celulares.
2. La oclusión del nucleoide mediada por SlmA bloquea el ensamblaje del anillo FtsZ sobre el
cromosoma bacteriano mediante su unión al ADN y FtsZ.
El sistema Min
En E.coli se logra dinámicamente con las oscilaciones de polo a polo del sistema Min:
1. MinC se une a FtsZ e inhibe la formación del anillo.
2. Min D es una ATPasa que se une a MinC y el complejo MinCD se asocia con la membrana
plasmática.
3. MinE estimula la actividad de ATPasa de MinD desamblando el complejo MinCD que migra al polo
opuesto.
Los ciclos de oscilación de MinCDE originan un gradiente de proteína de MinC que, como promedio es
mínimo en la mitad de la célula y máximo en los polos. El sistema MinCDE de E. coli se identificó por
primera vez mediante mutaciones de su locus genético minB que condujeron a la formación de células
anucleadas en miniatura o minicélulas.
La oscilación de las proteínas Min no es necesaria para todos los sistemas de división celular bacteriana.
Bacillus subtilis tiene concentraciones estáticas de MinC y MinD en los polos celulares. Proteína DivIVA se
ensambla preferentemente en los polos donde secuestra el complejo MinCDJ.
Oclusión del nucleoide
SlmA: Se une como un dímero a una secuencia de ADN específica (SBS; secuencias de unión a SlmA) y
bloquea la formación del anillo FtsZ en las regiones celulares ocupadas por el nucleoide
El sistema Min y la oclusión nucleoide (NO) inhiben la formación del anillo Z en sitios inadecuados. Las
proteínas Min (azul) se concentran en los polos celulares, mientras que el nucleoide (rojo) ocupa la región
central de la célula. Las últimas etapas de la segregación cromosómica dan como resultado un alivio de la
oclusión nucleoide debido a la eliminación de SlmA del centro de la célula, lo que permite la formación del
anillo Z en este sitio.
Cuando las células se dividen, la población crece. El seguimiento de crecimiento de una población se realiza
midiendo la densidad celular a intervalos periódicos de tiempo.
Curva de crecimiento: refleja la cinética de crecimiento de la población y sus fases: Latencia, Exponencial,
Estacionaria y Declive.

Crecimiento exponencial: el número de células se duplica a intervalos constantes de tiempo.

Si se representa gráficamente el número en función del tiempo, se obtiene una curva con una pendiente que
aumenta de manera constante. Cuando se representa el número de ´células en escala logarítmica (log10) en
función del tiempo (gráfica semilogarítmica), obtenemos una línea recta. Esta línea refleja el hecho de que
las células crecen exponencialmente y la población se duplica a intervalos constantes.
Expresión matemática de la cinética de crecimiento microbiano Nt = N0 x 2^n

Factores que determinan la cinética de crecimiento

 Nutrientes
 Condiciones ambientales: pH, presión, densidad inicial…
 Cepa: cada ceepa tiene su propia cinética de crecimiento reproducible bajo las mismas condiciones
de cultivo.
Fermentadores de laboratorio: para estudios de fisiología microbiana, de enzimas, interacciones entre
poblaciones en cultivo mixto (ecología microbiana).
Grandes reactores: producción a escala industrial de biomasa, enzimas, metabolitos, disolventes,
pigmentos, fármacos, hormonas…
TERMINOLOGÍA
Caldo nutritivo: sustrato líquido estéril con nutrientes necesarios para propagar microorganismos. Fuente
de carbono, nitrógeno, sales minerales y factores de crecimiento (vitaminas,etc).
Sembra: transferir un inóculo de una muestra a un caldo nutritivo.
Incubar: mantener un caldo recién sembrado a una Tª determinada, el tiempo necesario para que proliferen
los microorganismos del inóculo.
Cultivo: población microbiana obtenida al incubar un caldo nutritivo previamente sembrado.
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES PARA EL CULTIVO: MEDIOS DEFINIDOS Y
COMPLEJOS
Medios defendidos: se preparan añadiendo cantidades precisas de productos orgánicos o inorgánicos puros
a agua destilada, se conoce la composición exacta. La composición y concentración de los componentes
depende del organismo que se va a cultivar.
Medios complejos: sus componentes son hidrolizados de productos orgánicos animales o vegetales, como
caseína (proteína láctea) carne (extracto de carne), sangre, soja, extracto de levadura. Se desconoce su
composición nutricional exacta.
ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN
Son imprescindibles en estudios microbiológicos. Las propiedades y actividades de las cepas microbianas se
estudian en cultivo puro. Aire, manos, superficies y objetos son posibles fuentes de contaminación ya que
contienen microorganismos. Su acceso al ambiente del trabajo (muestras, cultivos…) conduciría a resultados
falsos y conclusiones incoherentes.
Esterilización: efecto resultante de aplicar procesos o tratamientos capaces de de eliminar el 100% de
microorganismos vivos de cualquier material, solución o medio de cultivo.
Asepsia: conjunto de técnicas que minimizan los riesgos de contaminación de muestras, materiales o cultivos
con microorganismos ajenos a ellos.

Para esterilizar utensilios, medios nutritivos, soluciones, …

Para todos los microoroganismos existe una temperatura máxima por encima de la cuál mueren. A
temperaturas muy altas las biomoléculas pierden su estructura y función en un proceso denominado
desnaturalización. Cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos,
donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo
funcionamiento, y sus propiedades físico-químicas-estructurales.
El calor húmedo tiene mayor poder de penetración que el calor seco y
produce una reducción de la viabilidad celular más rápida a una T
determinada. Desnaturalización irreversible de las proteínas de la clara de
huevo y pérdida de solubilidad, causadas por la alta temperatura.
Autoclave: recipiente hermético programable que genera vapor a 121ºC y
lo mantiene a 1,1 atm de presión durante 15-20 min. Se esterilizan los
medios de cultivo y material de vidrio y plástico.
Los medios y disoluciones sensibles al calor, se esterilizan por filtración amicróbica.
Filtro de aire particulado de alta eficancia o HEPA: eliminan de la corriente de aire partículas de 0.3μm
(cabinas de bioseguridad con flujo de aire).
Filtros de membrana (0.22-0.45 μm): compuestos por polímeros de acetato de celulosa, nitrato de celulosa
o polisulfona.
Esterilización con gases: las placas de Petri, tubos y otros recipientes plásticos se esterilizan en fábrica con
gases de óxido de etileno. Muerte celular por modificación irreversible de componentes celulares.
Esterilización con radiaciones U.V. germicida. Para estancias y espacio de trabajo. Poco poder de
penetración.
La "Técnica aséptica" tiene un doble objetivo:
 Evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos
 Evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o
del propio operador
MEDIDAS DE ASEPSIA
1. Cabina de flujo laminar: permite manipular en asepsia en su interior circula un flujo vertical de aire
estéril. La superficie y laterales internos se esterilizan durante la noche con una lámpara germicida
de luz U.V.
2. Mechero de gas: la llama calienta el aire que circunda el mechero en una columna de 20 cm de radio.
El aire caliente asciende, impidiendo que las partículas del aire (con microorganismos) caigan por
gravedad sobre el material de trabajo.
 Manipular muestras y cultivos con instrumentos y útiles estériles
 Trabajar en interior de cabinas de Flujo Laminar, o a menos de 20 cm del mechero de gas
 Trabajar sobre superficies desinfectadas o esterilizadas con UV
 Disponer tapas de tubos o placas de forma que no tomen contacto con la mesa de trabajo
 Placas siempre en posición invertida: los microorganismos del aire que entre en ellas caerán por
gravedad sobre sus tapas y no sobre el agar
Las tapas de tubos y placas no se dejan sobre la mesa donde se pueden contaminar.
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO, CUANTIFICACIÓN
Para estudiar las distintas poblaciones que contiene una muestra ambiental es necesario separarlas
físicamente entre sí (aislarlas). Al sembrar la muestra en un sustrato nutritivo sólido, las bacterias que
contiene quedarán diseminadas sobre el agar.
Al incubar la placa de Petri a la Tª adecuada, cada célula viva formará una COLONIA (estructura
macroscópica de células genéticamente iguales). Las diferencias morfológicas entre colonias permiten
establecer la diversidad microbiana de la muestra bajo estudio:
 Cada morfotipo es una población diferente
 Para obtener cada población en cultivo puro se cultiva cada colonia separadamente, en su propia
placa

CUANTIFICACIÓN DE LA DENSIDAD CELULAR VIABLE Y UFCs totales.

Siembra de placa por extensión
Se necesita etanol, asa de vidrio y una placa de agar PCA, boca abajo, detrás del mechero.
1. Tomar 100μL de muestra con la micropipeta (el tapón nunca sobre la mesa).
2. Abrir la placa: la tapa queda detrás del mechero, boca arriba).
3. Dispensar la alícuota sobre la placa.
4. Flamear el asa de vidrio.
5. Enfriar el asa en la tapa de la placa.
6. Extender la alícuota en círculos hasta que se absorba completamente, protegiendo la placa con la tapa.
Las células de la alícuota quedarán homogéneamente distribuidas en el agar después de incubar en la estufa,
cada célula formará una colonia.
Cálculo de la densidad celular viable.

CRECIMIENTO EN MEDIOS NUTRITIVOS

Crecimiento: incremento progresivo de la densidad celular del caldo, debido a divisiones celulares sucesivas
(el caldo nutritivo se enturbia progresivamente).
Densidad celular: número de células/mL de una muestra o de un cultivo.
Se puede seguir la evolución del crecimiento microbiano midiendo periódicamente la densidad óptica del
cultivo en un espectrofotómetro.
D.O: medida indirecta de la densidad celular o turbidez del caldo.
Las células dispersan la luz, y un método rápido y práctico de estimación de la masa celular es la medición
de la turbidez mediante un espectrofotómetro.
 Sirve para monitorizar el crecimiento de un cultivo (células totales: vivas/muertas (.
 No vale para cuantificar células viables.
Cultivo discontinuo
En sistema cerrado (matraz) no se renueva el medio nutritivo.
Las condiciones Nutricionales/Ambientales NO son constantes: varían por efecto del metabolismo
microbiano.
1. Se siembra un caldo estéril con un inóculo microbiano y se incuba en una estufa.
2. Cada 2-4 h se mide su densidad de población viable.
3. La gráfica que se obtiene al representar los datos sigue siempre un mismo patrón.
Curva de crecimiento
 Fase de latencia
o No hay división celular.
o Hay actividad metabólica, síntesis de las enzimas necesarias para degradar la fuente de
carbono del medio de cultivo.
 Fase exponencial
o El 100% de las células están en plena división. La población crece exponencialmente.
o Hay actividad metabólica: síntesis de componentes celulares para las células hijas.
o Se van agotando nutrientes y se van acumulando residuos tóxicos derivados del metabolismo
celular.
 Fase estacionaria
o Los tóxicos acumulados detienen la división celular. Algunas células aún se dividen. Otras
mueren. Hay actividad metabólica de mantenimiento de funciones celulares y para degradar
tóxicos.
 Fase de declive o muerte celular: muerte celular progresiva. No hay división celular ni actividad
metabólica.
(VER FOTOS PÁGINA 4)
Cultivo continuo
En sistema abierto (fermentador) el medio se renueva periódicamente. No hay curva de crecimiento.
Componentes y funciones del quimiostato
Sondas para medir condiciones previamente programadas conectadas a dispositivos para corregir estos
valores cuando es necesario:
 Válvulas que controlan la velocidad de entrada de medio fresco y eliminación del usado y células
viejas
Objetivo: mantener valores óptimos de actividad metabólica y tasa de crecimiento (propios de una fase
exponencial). Sin incremento de la densidad celular durante días o semanas.
Se dice que el sistema está en equilibrio cuando:
 Volumen del medio es constante.
 Densidad celular constante.
 Estado metabólico constante.
EXPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
La ecuación permite conocer la densidad que va alcanzando, en función del tiempo, una población en
crecimiento exponencial.
n = nº de generaciones.
Tasa de crecimiento (K) = K = n/t. Es la velocidad a la que se duplica una población (gen/h).
Tiempo de generación (g) = g=t/n. Es el tiempo que transcurre entre dos divisiones celulares sucesivas.
Número de generaciones (n)
log 𝑁𝑡 − log 𝑁0
𝑛=
log 2