UNIVERSIDAD NACIONAL DE

MAR DEL PLATA

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Biología

Tesis para optar al título de Doctor en Ciencias, área Biología

“Cambios bioquímicos post-mortem en músculo

de diferentes especies pesqueras. Determinación
de la vida útil de las mismas en frío”

Autor: Agueda Elena Massa

Dirección: Dr. Marcos Crupkin

Co-dirección: Dra. M. Elida Paredi

Lugar de Trabajo: INTI - Mar del Plata.

Mar del Plata, 2006

 CAMBIOS BIOQUÍMICOS POST-MORTEM EN MÚSCULO DE
DIFERENTES ESPECIES PESQUERAS. DETERMINACIÓN DE
LA VIDA ÚTIL DE LAS MISMAS EN FRÍO

Lic. Agueda Elena Massa

Directores:

Dra Maria Elida Paredi Dr. Marcos Crupkin

Co-directora Director

Lugar de Trabajo:

INTI – Mar del Plata –Instituto Nacional de Tecnología Industrial

Departamento de Biología
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad Nacional de Mar del Plata

Abril, 2006
Quiero expresar mi profundo agradecimiento

Ç A mis Directores de Tesis, Dr. Marcos Crupkin y Dra. M. Elida Paredi por haberme
dado la posibilidad de realizar este trabajo, por su generosidad al brindarme la
oportunidad de recurrir a su capacidad y experiencia científica en un marco de
confianza y afecto;

Ç A el Lic. Diego Palacios por su permanente ayuda y acertados aportes durante el

desarrollo de este trabajo;

Ç A las autoridades del INTI-MAR DEL PLATA por permitirme realizar el presente
trabajo;

Ç A las empresas Centauro S.A. y Coomarpes Coop. Ltda. y al INIDEP por colaborar
en la obtención de las muestras;

Ç A mis compañeras de laboratorio, Dra. Mariana Pagano y Lic. Lorena Mignino, por
su presencia incondicional y amistad;

Ç A mis compañeros del Instituto por su continuo y afectuoso aliento;

Ç A la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC),

al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y al Instituto
de Investigación de Tecnología Industrial (INTI) por haberme otorgado las becas que
me permitieron realizar esta tesis;

Ç A todos mis amigos: “los viejos”, los que conocí y me acompañaron en esta carrera
y a todos aquellos que encontré gracias a la realización del presente trabajo por su
paciencia y apoyo constante;

Ç y......, por último, a todos aquellos que hicieron posible la realización del presente
trabajo, a mi familia y especialmente

.....a mis Padres.

 Resumen

Resumen

Se investigaron los cambios bioquímicos post-mortem y se determinó la vida

útil comercial de tres especies pesqueras, muy valoradas por el sector industrial

pesquero de nuestro país, durante el almacenamiento en frío: lenguado (Paralichthys

patagonicus), corvina rubia (Micropogonias furnieri) y la vieira patagónica

(Zygochlamis patagónica). Los cambios bioquímicos relacionados con el ATP y sus

productos de degradación, la actividad de las principales enzimas involucradas en el

catabolismo del ATP y el pH fueron investigados. En base a los contenidos de los

compuestos relacionados con la degradación del ATP se establecieron distintos

índices químicos para evaluar la frescura y/o la calidad de estos productos. Por otro

lado, se monitorearon los niveles de aminas biógenas y se evaluó la utilidad de las

mismas como índice de deterioro. Los cambios en las propiedades texturales, el

crecimiento de los microorganismos y la evolución de los grupos deteriorantes más

significativos también fueron determinados. Asimismo se desarrollaron esquemas

sensoriales específicos para cada una de las especies evaluadas.

Lenguado (P. patagonicus)

En P. patagonicus almacenado en hielo por 12 días no se detectó la presencia

de ATP ni ADP. El contenido inicial de AMP decreció rápidamente a cero. El IMP

disminuyó un 60% durante los 2 primeros días de almacenamiento y luego descendió

gradualmente. La HxR estuvo presente en pequeñas cantidades durante todo el

almacenamiento. La Hx se incrementó hasta el séptimo día y posteriormente

permaneció sin grandes cambios El pH se mantuvo próximo a 6,6 durante la mayor

parte del almacenamiento, aumentando a 7 al finalizar el mismo. En extracto muscular

i
 Resumen

de lenguado se observó una alta actividad de la AMP-deaminasa, y no se detectó

actividad de adenosina deaminasa, sugiriendo que la degradación de ATP ocurre vía

IMP. La actividad de la nucleósido fosforilasa aumentó significativamente luego del

segundo día de almacenamiento, lo cual indicaría un papel primordial de los

microorganismos en el deterioro. El valor K mostró un incremento lineal con el tiempo

de almacenamiento. En cambio, las aminas biógenas presentaron un perfil muy

irregular. Los niveles de histamina no superaron los límites establecidos por las

normas fijadas por los organismos internacionales. La firmeza del pescado entero

decreció significativamente los dos primeros días de almacenamiento y luego

disminuyó gradualmente hasta el séptimo día en la región caudal y se mantuvo sin

cambios en la región central. La dureza, cohesividad y elasticidad del filete mostraron

un comportamiento similar al de la firmeza. Los recuentos microbianos de todos los

grupos estudiados se incrementaron durante el almacenamiento, siendo la flora

proteolítica el grupo deteriorante predominante. Bajo las condiciones experimentales

de este estudio, Shewanella putrefacies y Pseudomonas fluorescens fueron

identificadas como los microorganismos deteriorantes específicos dominantes. El

esquema sensorial QIM desarrollado para P. Patagonicus resultó adecuado para

evaluar la frescura. El QI presentó una alta correlación con el tiempo de

almacenamiento, lo que sugiere su posible utilización como un sistema de valoración

objetivo de la calidad. De acuerdo a los distintos índices de frescura evaluados P.

Patagonicus almacenado en hielo podría considerarse como aceptable para el

consumo hasta el séptimo día.

Corvina rubia (M. furnieri)

Los cambios bioquímicos post-mortem y la determinación de la vida útil

comercial de la corvina rubia fue determinada durante el almacenamiento en hielo por

ii
 Resumen

12 días. Los perfiles de degradación de nucleótidos en ejemplares en pre y posdesove

difirieron solamente en el contenido de HxR. A tiempo 0 de almacenamiento no se

detectó la presencia de nucleótidos de adenina (ATP, ADP, AMP). La concentración

de IMP fue baja durante todo el periodo de almacenamiento. La HxR fue el metabolito

predominante. Este se incrementó alrededor de un 100% durante los dos primeros

días de almacenamiento en corvina rubia de ambos estadios biológicos,

posteriormente los niveles de HxR de los ejemplares en predesove aumentaron

significativamente hasta el quinto día de almacenamiento y luego descendieron

levemente, mientras que los individuos en posdesove mantuvieron los valores

alcanzados al segundo día sin grandes variaciones hasta finalizar el experimento. El

contenido de Hx resultó adecuado para monitorear los cambios de frescura en corvina

almacenada, ya que presentó una relación lineal con una alta correlación con el

tiempo de guarda. En extracto muscular de corvina rubia se observó una alta actividad

de la AMP-deaminasa, y no se detectó actividad de adenosina deaminasa, lo cual

sugiere que la degradación de ATP ocurre vía IMP. La actividad de la nucleósido

fosforilasa aumentó a lo largo del almacenamiento. El valor K’ alcanzó valores

máximos a los primeros días de almacenamiento y posteriormente permaneció

constante, por lo que no puede ser considerado como un índice de calidad confiable

para esta especie. Bajo las condiciones experimentales de este estudio, el valor H

(definido como la relación entre el contenido de Hx y la suma de todos los nucleótidos

presentes en los extractos musculares) presentó una alta correlación con el tiempo de

almacenamiento y resultó adecuado para monitorear la calidad de M. furnieri. La

putrescina fue la única amina biógena que aumentó durante el almacenamiento en la

corvina rubia, sin embargo podría ser prematuro proponerla como un índice del grado

de frescura. La firmeza del pescado entero y la dureza del filete decrecieron a lo largo

del almacenamiento. La cohesividad y la elasticidad del filete no presentaron cambios

iii
 Resumen

significativos. Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se

incrementaron durante el almacenamiento, las bacterias psicrótrofas predominaron

durante la refrigeración, siendo la flora productora de H2S y las bacterias proteolíticas

los grupos deteriorantes más importantes. Los valores establecidos por ICMSF como

límites máximos recomendados para pescado fresco refrigerado se alcanzaron luego

del quinto día de almacenamiento. El esquema sensorial (QIM) desarrollado para la

corvina rubia almacenada en hielo resultó adecuado para evaluar la vida útil El QI

presentó una relación lineal con el tiempo de almacenamiento, lo cual sugiere que

dicho índice podría utilizarse como un sistema de valoración objetivo de la calidad de

la corvina. Los miembros del panel sensorial consideraron inaceptables a la corvina

luego del quinto día de almacenamiento. De acuerdo a los distintos índices de

frescura evaluados la corvina rubia almacenado en hielo podría considerarse como

aceptable para el consumo hasta el quinto día.

Vieira patagónica (Z. patagónica)

Los cambios bioquímicos post-mortem y la determinación de la vida útil comercial

de músculos aductores de viera patagónica almacenados a 2-4ºC fueron

determinados por 9 días. Inmediatamente después de la muerte, la concentración de

ATP aumentó alcanzando un valor máximo (5,6 ± 0,2 µmoles/g) a las 2 hs post-

mortem. Posteriormente, la concentración de ATP descendió bruscamente hasta las

primeras 48 hs y luego lentamente hasta el final del almacenamiento. Los niveles de

ADP descendieron un 50% los dos primeros días postmortem, y posteriormente

permanecieron sin mayores cambios, mientras que el AMP mostró una lenta

acumulación los primeros dos días de almacenamiento. Pequeñas cantidades de IMP

iv
 Resumen

fueron observadas a todos los tiempos. Contrariamente adenosina no fue detectada.

La concentración de HxR aumentó significativamente con el tiempo de

almacenamiento. El contenido de Hx se incrementó rápidamente hasta el cuarto día

de almacenamiento, luego permaneció constante hasta el día 7, incrementándose

nuevamente hasta los 9 días. La baja actividad de AMP-deaminasa en comparación

con la de adenosina deaminasa sugiere que la degradación de AMP a HxR podría

proceder en la viera patagónica tanto por reacciones de desaminación del AMP

formando IMP, como por reacciones de desfosforilación formando Ade. El pH decreció

significativamente durante los dos primeros días de almacenamiento y al finalizar el

mismo aumentó posiblemente por la actividad microbiana. El valor K, la acumulación

de Hx y Hx/AMP resultaron índices adecuado para monitorear los cambios de frescura

de Z. patagónica, ya que presentaron una alta correlación con el tiempo de guarda. La

carga energética de adenilato (CEA) y la relación 260/250 resultaron índices eficaces

para monitorear la condición biológica de los ejemplares. Las aminas biógenas no

resultaron adecuadas para determinar el grado de frescura en la vieira patagónica.

Bajo las condiciones experimentales ensayadas no se detectó la presencia de

histamina. La gran variación observada en la firmeza y en la dureza las primeras 24

hs de almacenamiento, podría asociarse con el comienzo del rigor mortis, ya que en

este período también tiene lugar la mayor disminución de ATP y del pH. La

cohesividad y la elasticidad no presentaron cambios significativos. Los recuentos

microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron durante el

almacenamiento de Z. patagónica a 2-4 ºC. El crecimiento de los microorganismos

psicrótrofos fue superior al desarrollo de la flora mesófilas. Las bacterias productoras

de H2S crecieron significativamente durante el almacenamiento, presentando un claro

predominio Shewanella spp. Las bacterias fluorescentes fueron caracterizadas como

Pseudomonas fluorescens. Los valores establecidos por ICMSF como límites

v
 Resumen

máximos recomendados para productos pesqueros frescos refrigerados, se

alcanzaron a los nueve días de almacenamiento. Los principales cambios sensoriales

en los callos se observaron en el color, olor y la apariencia. Los atributos de frescura

permanecieron durante los dos primeros días de almacenamiento, posteriormente y

hasta el quinto día a 2-4 ºC los ejemplares se mantuvieron aceptables y luego

presentaron un estado avanzado de deterioro. Estos resultados presentaron una gran

correlación con los criterios de aceptabilidad establecidos por los índices químicos

mencionados, pero no se relacionaron con los límites de aceptabilidad

microbiológicos. De acuerdo a los resultados descriptos, el músculo aductor de Z.

patagónica permanecería fresco hasta el segundo día de almacenamiento a 2-4°C y

alcanzaría el límite de rechazo luego del quinto día (inaceptable para el consumo).

vi
 Indice

Indice General

Resumen....................................................................................................................... i
Índice General............................................................................................................. vii
Abreviaturas Utilizadas................................................................................................ xi

1. INTRODUCCION
1.1. LA INDUSTRIA PESQUERA 2
ARGENTINA..........................................................................
1.1.1. Lenguado patagónico (Paralichthys patagonicus)................................................................ 4
1.1.2. Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)................................................................................ 5
1.1.3. Vieira Patagónica (Zygochlamys patagónica)...................................................................... 7
1.2. CALIDAD Y DETERIORO DE LOS PRODUCTOS PESQUEROS..................................... 8
1.2.1. Cambios autolíticos............................................................................................................. 9
1.2.1.1. Cambios post-mortem relacionados con el metabolismo energético.................... 9
1.2.1.2. Consecuencia del agotamiento de ATP................................................................ 14
1.2.1.3. Cambios autolíticos y catabolismo del ATP.......................................................... 15
1.2.1.4. Cambios relacionados con la fracción lipídica....................................................... 18
1.2.1.5. Cambios autolíticos que involucran enzimas proteolíticas.................................... 19
1.2.1.6. Formación de aminas biógenas............................................................................ 23
1.2.2. Cambios Microbiológicos...................................................................................................... 26
1.3. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL PESCADO........................... 28
1.3.1. Métodos Químicos. ............................................................................................................. 29
1.3.1.1. Métodos basados en la degradación del ATP. ........................................................ 30
1.3.1.2. Métodos relacionados con cambios en la fracción nitrogenada básica................... 32
1.3.1.3. Métodos relacionados con los cambios en la fracción lipídica................................. 35
1.3.2. Métodos físicos.................................................................................................................... 36
1.3.2.1. Determinación del pH muscular.............................................................................. 36
1.3.2.2. Determinación de las propiedades de textura......................................................... 37
1.3.2.3. Resistencia eléctrica de la carne del pescado........................................................ 40
1.3.3. Métodos microbiológicos.................................................................................................... 41
1.3.4. Métodos sensoriales. ......................................................................................................... 42
1.4. OBJETIVOS............................................................................................................................... 45
1.4.1. Objetivo General................................................................................................................ 46
1.4.2. Objetivos Particulares........................................................................................................ 46

2. MATERIALES Y METODOS
2.1. MUESTRAS Y MUESTREO.................................................................................................... 49
2.1.1. Lenguado patagónico......................................................................................................... 49

vii
 Indice

2.1.2. Corvina rubia....................................................................................................................... 50

2.1.2.1. Determinación del estadio gonadal de la corvina rubia....................................... 50
2.1.3. Vieira patagónica................................................................................................................. 50
2.2. METODOLOGÍA ANALÍTICA.................................................................................................... 51
2.2.1. Determinación de nucleótidos.............................................................................................. 51
2.2.1.1 Preparación de las muestras y extracción............................................................... 51
2.2.1.2. Procedimiento y condiciones cromatográficas....................................................... 52
2.2.2. Actividad de las enzimas involucradas en el catabolismo del ATP..................................... 53
2.2.2.1. Preparación del extracto enzimático..................................................................... 53
2.2.2.2. Determinación de la actividad de la AMP-deaminasa............................................ 53
2.2.2.3. Determinación de la actividad de la Adenosina deaminasa................................... 54
2.2.2.4. Determinación de la actividad de la Nucleósido fosforilasa................................... 54
2.2.3. Índices químicos para evaluar la frescura........................................................................... 55
2.2.4. Relación 260/250................................................................................................................ 56
2.2.5. Determinación de aminas biógenas.................................................................................... 56
2.2.5.1. Extracción de las muestras.................................................................................... 56
2.2.5.2. Preparación de los patrones................................................................................... 57
2.2.5.3. Derivatización de las muestras y patrones............................................................. 57
2.2.5.4. Procedimiento y condiciones cromatográficas....................................................... 58
2.2.6. Determinación del pH.......................................................................................................... 59
2.2.7. Medidas de textura ............................................................................................................. 59
2.2.7.1. Determinación de textura en el lenguado patagónico y en corvina rubia............... 59
2.2.7.2. Análisis del perfil de textura (TPA) realizado en filete crudo.................................. 61
2.2.7.3. Determinación de textura en la vieira patagónica.................................................. 62
2.2.8. Análisis microbiológicos...................................................................................................... 63
2.2.8.1. Preparación de la muestra..................................................................................... 63
2.2.8.2. Medios de cultivos.................................................................................................. 63
2.2.8.3. Identificación de microorganismos. ....................................................................... 65
2.2.9. Análisis Sensorial................................................................................................................ 66
2.3. ANÁLISIS ESTADISTICOS.......................................................................................................... 67

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. CAMBIOS POSTMORTEM EN LENGUADO (P. Patagonicus) DURANTE EL
ALMACENAMIENTO EN HIELO. .................................................................................. 70
3.1.1 Cambios en el contenido de los nucleótidos........................................................................ 70
3.1.2. Cambios en el valor de pH.................................................................................................. 76
3.1.3. Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo
del ATP (AMP-deaminasa, adenosina deaminasa y nucleósido fosforilasa)....................... 78

viii
 Indice

3.1.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura.................................................................. 80

3.1.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas................................................................... 82
3.1.6. Cambios en la características texturales............................................................................. 89
3.1.6.1 Determinación de textura en pescado entero........................................................ 90
3.1.6.2. Determinación de las propiedades texturales de filete crudo (Análisis de perfil
de textura, TPA). ............................................................................................................... 91
3.1.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y el deterioro.................................... 95
3.1.8. Cambios en las características sensoriales........................................................................ 98
3.1.9. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados.......................... 102
3.1.10. Conclusiones parciales...................................................................................................... 104

3.2. CAMBIOS POSTMORTEM EN CORV INA RUBIA (M. Furnieri) DURANTE EL

ALMACENAMIENTO EN HIELO. .................................................................................. 107
3.2.1. Cambios en el contenido de los nucleótidos...................................................................... 107
3.2.2. Cambios en el valor de pH................................................................................................. 111
3.2.3.Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el catabolismo 112
del ATP (AMP-deaminasa, adenosina deaminasa y nucleósido fosforilasa) ....................
3.2.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura................................................................. 114
3.2.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas................................................................... 116
3.2.6. Cambios en la características texturales............................................................................ 118
3.2.6.1. Determinación de textura en pescado entero...................................................... 118
3.2.6.2. Determinación de las propiedades texturales de filete crudo (Análisis de perfil
de textura, TPA). ................................................................................................. 120
3.2.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y el deterioro................................... 123
3.2.8. Cambios en las características sensoriales....................................................................... 125
3.2.9. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados......................... 129
3.2.10. Conclusiones parciales.................................................................................................... 131

3.3. CAMBIOS EN EL MUSCULOS ADUCTORES DE VIEIRA PATAGÓNICA

ALMACENADOS A 2-4 ºC
3.3.1. Cambios en el contenido de los nucleótidos..................................................................... 134
3.3.2. Cambios en el valor de pH................................................................................................. 137
3.3.3. Determinación de la actividad de las principales enzimas involucradas en el
catabolismo del ATP (AMP-deaminasa, y adenosina)....................................................... 139
3.3.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura................................................................ 141
3.3.5. Relación 260/250.............................................................................................................. 145
3.3.6. Cambios en el contenido de aminas biógenas.................................................................. 147
3.3.7. Cambios en la características texturales........................................................................... 150
3.3.8. Cambio en la microflora durante el almacenamiento........................................................ 155

ix
 Indice

3.3.9. Cambios en las características sensoriales...................................................................... 158

3.3.10. Análisis de relación entre los distintos índices de frescura determinados....................... 159
3.3.11. Conclusiones parciales.................................................................................................... 162

4. CONCLUSIONES GENERALES .............................................................................................. 166

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS......................................................................... 168

6. PUBLICACIONES REALIZADAS ........................................................................... 217

x
 Abreviaturas

Abreviaturas Utilizadas

µm Micrómetro(s)
µmoles Micromoles
Ade Adenosina
ADP Adenosina-5-difosfato
AMP Adenosina-5-monofosfato
ATP Adenosina-5-trifosfato
CEA Carga energética de adenilato
cm Centímetro(s)
DMA Dimetilamina
g Gramo(s)
HPLC Cromatografía líquida de alta presión
h Hora(s)
Hx Hipoxantina
HxR Inosina
IAB Índice de aminas biógenas
IMP Inosina-5-monofosfato
K2HPO4 di-potasio hidrogenofosfato
KClO4 Perclorato de potasio
KgF Kilogramo(s) fuerza
KH2PO4 Mono-potasio hidrogenofosfato
KOH Hidróxido de potasio
l Litro(s)
m Metro(s)
M Molar
mg Miligramo(s)
min Minuto(s)
ml Mililitro(s)
mm Milímetro(s)
mM Milimolar
n Numero de observaciones
NaCl Cloruro de Sodio
NaOH Hidróxido de Sodio

xi
 Abreviaturas

N-BVT Nitrógeno básico volátil total

nm Nanómetro
ºC Grado(s) Celsius
OED Organismos específicos del deterioro
OTMA Oxido de trimetilamina
QI Índice de calidad
QIM Método del índice de calidad (Quality Index Method)
TBA-SR Sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico
TMA Trimetilamina
TPA Análisis del Perfil de Textura
UFC Unidades formadoras de colonias
UV Ultravioleta
xg Unidad de fuerza centrifuga relativa

xii
1. INTRODUCCION
 1. Introducción

1.1. La Industria Pesquera Argentina

La plataforma continental Argentina tiene una superficie de aproximadamente

un millón de kilómetros cuadrados. Las aguas que bañan dicha plataforma se originan

en dos corrientes: la "Corriente Fría de Malvinas" que transporta aguas subantárticas a

través del talud continental con dirección sur-norte, entre los 55°S y los 39°-36°S y la

"Corriente del Brasil", que transporta aguas subtropicales hasta los 36°-38°S, con

dirección norte-sur (Guerrero y Piola, 1997). Estas dos corrientes le confieren al

Atlántico Sur las características de un ecosistema templado-frío, que sostiene una gran

diversidad biológica, con altas biomasas en muchas de sus especies (Guerrero y Piola,

1997; Cousseau y col., 2004).

A nivel internacional la Argentina se encuentra entre los principales productores

mundiales de pescado. Las estadísticas nacionales de desembarques en los últimos 15

años indican una tendencia creciente hasta 1997, año en el que se alcanza el valor más

alto de captura, con 1.300.000 toneladas. A partir de ese momento se produce una

importante caída hasta el año 2000 y posteriormente las capturas se estabilizan, con un

promedio de 865.000 toneladas en el período 2000-2004 (FAO, 2005). En el último año

las capturas alcanzaron las 765.472 toneladas (SAGPyA, 2005), el 55,56% de este

volumen se desembarcó en la Provincia de Buenos Aires, principalmente en el puerto

de la ciudad de Mar del Plata.

2
 1. Introducción

En la región costera bonaerense, que se extiende desde la línea de costa hasta la

isobata de 50 m y desde el “Chuy” (Uruguay) al norte (34 °LS) hasta el límite sur de la

Provincia de Buenos Aires (41°LS), se desarrolla una pesquería multiespecífica

conformada por diversos recursos de gran valor comercial como: corvina rubia

(Micropogonias furnieri), pescadilla común o de red (Cynoscion guatucupa), lenguados

(Paralichthys patagonicus, P. orbignyanus, Xystreuris rasiles), rayas costeras (Familia

Rajidae), gatuzo (Mustelus schmitti), besugo (Parus pagrus), palometa (Parona

signata), pez palo (Percophis brasilianus), pez ángel (Squatina spp.), brótola

(Urophysis brasiliensis), mero (Acanthistius brasilianus), salmón (Pseudopercis

semifasciata), pescadilla real (Macrodon ancylodon), pargo (Umbrina canosai), entre

las más importantes (Prenski y Sanchez, 1988, Lasta y col., 1999; Fernández Araóz y

col., 2004). Históricamente, los desembarques del conjunto de éstas especies

alcanzaban las 80.000 toneladas por año. Entre 1993 y 1997 se observó un marcado

incremento de las capturas debido a la apertura de mercados asiáticos dirigido

principalmente a la corvina rubia (Carozza y col., 2004) y a un aumento en el esfuerzo

pesquero evidenciado por el gran número de barcos que ingresaron a ésta pesquería

(Carozza y col., 2001, 2004). A partir de 1998 las capturas disminuyeron alcanzando

nuevamente los niveles históricos (Fernandez Araóz y col., 2004). En el año 2004, el

desembarque del conjunto costero fue de 81.435,5 toneladas, siendo las principales

especies desembarcadas: corvina rubia, pescadilla de red, lenguados, rayas costera, pez

palo, gatuzos y otros tiburones (Fernandez Araóz y col., 2005). Dentro de estas

especies, la corvina rubia y los lenguados han despertado gran interés en el sector

pesquero industrial debido a la alta calidad de sus carnes (Cousseau y Perrotta, 1998) y

a la gran demanda de los mercados nacionales e internacionales.

3
 1. Introducción

En los últimos años, otra especie que ha despertado gran atención debido a su

gran valor comercial es la de la vieira patagónica (Zygochlamis patagónica) (Lasta y

Bremec, 1998). Los desembarques (en callos) de esta especie se incrementaron de 836

toneladas en 1989 a 6.151 toneladas en el año 2004 (FAO, 2005; SAGPyA, 2005).

Datos de exportaciones del año 2001 indican la venta de 5.274 toneladas de callos en

28 millones de dólares (Redes, 2002).

La creciente demanda de los productos pesqueros para consumo humano y la

crítica situación presente de algunas pesquerías tradicionales, hace necesario

incrementar la información referente a recursos alternativos presentes en nuestras

costas. Como se ha mencionado, el lenguado, la corvina rubia, y la vieira patagónica

son especies muy valoradas en el sector industrial pesquero de nuestro país. Para

alcanzar la sustentabilidad de estos recursos pesqueros no solo se requiere un plan de

manejo adecuado y especifico para cada especie sino también incorporar tecnología

adecuada de captura y procesamiento que permita formular y racionalizar estrategias

efectivas para mantener la calidad de estos productos y prolongar su vida útil

comercial.

1.1.1. Lenguado (Paralichthys patagonicus)

El lenguado Paralichthys patagonicus es una especie asociada al fondo que

pertenece a la familia Paralichthyidae (Figura 1.1). Esta especies habita desde Cabo

Frío, Brasil (22° S) hasta los 43° S en Argentina, en profundidades que llegan alrededor

de los 120 metros. Es capturado por la flota costera de la provincia de Buenos Aires,

por buques de rada o ría, costera y de altura que utilizan como arte de pesca redes de

4
 1. Introducción

arrastre de fondo (Cousseau y Perrotta, 1998). Los desembarques en el 2004 alcanzaron

las 2.957,6 toneladas (Fernandez Araóz y col., 2005). Si bien este valor engloba las tres

especies de lenguado (Paralichthys patagonicus; P orbignyanus y Xystgreuris rasile)

presentes en nuestras costas, P. patagonicus es aparentemente la más abundante

(Cousseu y col., 2004).

Figura 1.1. Lenguado (Paralichthys patagonicus)

El lenguado patagónico alcanza un tamaño promedio en las hembras de 48 cm y

62 cm machos, longitud total (Cousseau y Perrotta, 1998; Cosseau y col., 2004). El

período reproductivo se extiende entre los meses de septiembre y febrero, con la

máxima intensidad en noviembre (Macchi y Díaz de Astarloa, 1996). Esta especie es

comercializada en el mercado interno como filete fresco y se exporta

fundamentalmente como filete congelado interfoliado.

1.1.2 Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)

La Corvina Rubia (Micropogonias furnieri) es una especie demersal,

perteneciente a la familia Sciaenidae (Figura 1.2). Está presente en la costa este

americana desde Veracruz (20° 20´ N, México) hasta El Rincón, en Argentina (42° S) y

5
 1. Introducción

esporádicamente en la costa Norte del Golfo San Matías (41° 10´ S) (Isaac, 1988). En

Argentina, la corvina rubia es capturada con el conjunto de especies demersales

costeras, con redes de arrastre de fondo por la flota de ría o rada y costera, con la

modalidad “a la pareja” (dos buques arrastrando una misma red). La captura total

desembarcada en el 2004 alcanzó 10.289,7 toneladas (Fernandez Araóz y col., 2005)

En las costas bonaerense las talla más frecuentes en los desembarques comerciales

oscilan entre 30 y 50 cm (longitud total), siendo la talla máxima observada de 74 cm

(Carozza y col., 2004).

Figura 1.2. Corvina Rubia (Micropogonias furnieri)

La corvina rubia es una especie eurihalina, que se adapta a ambientes muy

diferentes en cuanto a la salinidad y temperatura (Guerrero y col., 1997). Se reproduce

en una amplia franja costera, desde la primavera hasta el inicio del verano (octubre-

diciembre) (Acha y col., 1999). Se la comercializa entera, congelada en el mercado

externo y fresca en el interno. Los productos obtenidos son: enteros y filetes,

congelados enteros en bloques, tronco, eviscerados, filetes interfoliados. Los

principales destinos de exportación son los países asiáticos (Carozza y col., 2004).

6
 1. Introducción

1.1.3. Vieira Patagónica (Zygochlamys patagónica)

La vieira patagónica (Zygochlamys patagónica) es un molusco bivalvo (Figura

1.3), que se distribuye geográficamente desde Tierra del Fuego hasta los 35°S, se lo

encuentra a profundidades de entre 40 y 200 m (Lasta y Zampatti, 1981; Waloszek y

Waloszek, 1986) Las concentraciones más importantes, denominadas bancos, se

localizan entre 39° 30’ S y 42° 30’ S entre profundidades de 80 y 120 metros (Lasta y

Bremec, 1998). Para su captura se utiliza una red de arrastre de fondo (tipo tangonera),

denominada “rastra”.

Figura 1.3. Vieira patagónica (Zygochlamys patagónica)

La vieira patagónica es una especie dioica con dos pulsos de reproducción, en

primavera y a fines del verano (Waloszek y Waloszek, 1986; Orensanz y col., 1991). La

talla mínima de captura establecida por las autoridades pesqueras es de 55 mm de alto

total. Dicha talla se alcanza entre los tres a cinco años, dependiendo la misma de la

latitud (Lasta y Bremec, 1999). Las principales formas de comercialización son los

músculos aductores aislados (callos) frescos y/o congelados (Lasta y Bremec, 1999).

Estos productos marinos se consumen, en general, como pescado crudo (en forma de

7
 1. Introducción

sushi y sashimi), además se han desarrollado tecnologías que permiten la producción de

hamburguesas a partir de los callos.

1.2. CALIDAD Y DETERIORO DE LOS PRODUCTOS PESQUEROS

Los productos pesqueros son considerados alimentos muy perecederos debido a

su composición química y al pH poco ácido de su carne. La pérdida de la frescura de

estos alimentos ocurre por la acción de enzimas endógenas presentes en las vísceras y

en los músculos (“autolisis”) y/o por el desarrollo de microorganismos deteriorantes

(Uchiyama y Ehira, 1974; Pedrosa-Menabrito y Regenstein, 1988; Haard, 1992). La

flora contaminante se asienta básicamente en la piel, las branquias y el intestino y se

extiende a otros tejidos donde existen sustancias nutritivas adecuadas y un pH

relativamente elevado que favorece el desarrollo de dichos microorganismos (Huss,

1995). La degradación bacteriana de componentes solubles de bajo peso molecular

produce metabolitos volátiles (trimetilaminas, amoníaco, etc.) responsables del olor y

sabor desagradables, que conducen al rechazo sensorial del pescado (Huss, 1995;

Ababouch y col., 1996; Elotmani y col., 2004). Por otro lado, la acción de proteasas

endógenas y/o bacterianas provoca cambios en las propiedades texturales que afectan la

calidad de estos productos (Haard, 1992; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual, 2000).

La velocidad de los procesos de descomposición que ocurren en el pescado

depende de factores intrínsecos de las especies tales como la edad, el tamaño, la

composición química de los tejidos, el estado nutricional y las condiciones fisiológicas

de los ejemplares. Asimismo depende de la composición cualitativa y cuantitativa de la

microflora inicial asociada al ambiente de procedencia. Factores extrínsecos como las

8
 1. Introducción

condiciones de captura y los métodos de conservación son también determinantes

(Murray y Shewan, 1979; El-Marrakchi y col., 1992; Gennari y col., 1999).

El método más utilizado para conservar los productos pesqueros, desde su

captura hasta la llegada al consumidor es la aplicación del frío. En función de la

temperatura empleada se puede clasificar al pescado en: refrigerado, congelado y

ultracongelado (Madrid y col., 1999). El pescado refrigerado es el que desde su captura

esta conservado en hielo. Habitualmente, este se distribuye cubriendo todo el pescado,

en una proporción que varia entre 1:1 y 1:4, respecto al pescado, con lo que se garantiza

temperaturas entre 1 ºC y 6 ºC. Dichas condiciones no detienen los procesos autolíticos

y microbiológicos implicados en el deterioro, pero producen una fuerte inhibición de

los mismos (Madrid, y col., 1999; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual, 2000).

1.2.1. Cambios autolíticos

1.2.1.1. Cambios post-mortem relacionados con el

metabolismo energético

El músculo es un tejido altamente especializado y su funcionamiento representa

un ejemplo clásico de la conversión de energía química en energía mecánica en los

sistemas vivos. Este tejido necesita una gran cantidad de energía para poner en marcha

el aparato contráctil. Esta energía es suministrada por el adenosina trifosfato (ATP),

que es un compuesto altamente energético. En general, el contenido total de ATP en el

músculo no es suficiente para una contracción larga y sostenida; por lo que este

compuesto debe ser resintetizado a partir de varias fuentes de energía. La primera

fuente de energía son los compuestos fosfágenos, tales como la fosfocreatina (en el

9
 1. Introducción

músculo de los vertebrados) o la fosfoarginina (en algunos invertebrados marinos)

(Beis y Newsholme, 1975; Pörtner, 1993; Ellington, 2001). Estos compuestos contienen

un enlace fosfato de alta energía que se transfieren rápidamente al adenosin difosfato

(ADP), reconstituyendo al ATP

Creatina + ATP Creatina Fosfato + ADP

En general, el contenido de compuestos fosfágenos es reducido. Distintos

estudios indican que la cantidad de creatina en el músculo de pescado varia

dependiendo de la especie y del tipo de músculo (Beis y Newsholme, 1975; Ikeda,

1980). La merluza, el congrio chileno y la corvina presentan cantidades relativamente

bajas de creatina (valores que promedian los 250 mg/100g de tejido), mientras que los

escómbridos (atún, bonito, caballa, etc.) presentan valores más altos, alrededor de 500

mg/100 g de músculo (Contreras-Guzmán, 2002). Estos valores concuerdan con el

concepto de que las especies veloces tienen niveles altos de creatina. Por otro lado, se

estableció una relación entre el contenido de creatina y la función muscular. Los

músculos oscuros (adaptados para actividades continuas y prolongadas) contienen un

promedio de 316 ± 19,1 mg/100g de creatina mientras que los músculos blancos

(adaptados a contracciones musculares rápidas y explosivas) presentan 420 ± 38,2

mg/100g, (Beis y Newsholme, 1975; Kawashima y Yamanaka, 1992; Contreras-

Guzmán, 2002). Como se ha mencionado, en los invertebrados y crustáceos marinos la

función fosfatógeno es realizada principalmente por la arginina, hallándose cantidades

que promedian los 300 mg/100 g. de tejido (Kawashima y Yamanaka, 1995).

10
 1. Introducción

La fuente energética principal para mantener el nivel fisiológico de ATP en el

tejido muscular es la degradación del glucógeno almacenado. Dicha degradación ocurre

a través de la ruta del ciclo del ácido cítrico y el transporte de electrones mitocondrial

(respiración aerobia) y proporciona una gran cantidad de moléculas de ATP por

molécula de sustrato utilizado (Figura 1.4). Cuando el músculo esta sometido a un

estrés intenso y la cantidad de oxígeno disponible no es suficiente para mantener la

función mitocondrial, la glúcolisis anaerobia es la que predomina. Durante la misma, se

produce una degradación incompleta de los sustratos y la acumulación de lactato

siguiendo la ruta de Embden Meyehoff (Tarr, 1966). Gran parte del lactato formado

atraviesa la membrana del músculo y vía sanguínea llega al hígado donde es utilizado

para la resíntesis de glucosa. La glucosa resintetizada vuelve nuevamente al músculo

para finalmente formar glucógeno (Tarr, 1966). Otra fuente de energía es la que

proviene de otros sustratos (grasas y aminoácidos) y es utilizada para mantener

contracciones prolongadas.

Tras la captura y muerte del pescado, la interrupción de la circulación sanguínea

priva al músculo del aporte de oxígeno y de toda una serie de nutrientes celulares. El

sistema mitocondrial deja de funcionar en todas las células y el ATP se agota

gradualmente por la acción de diversas ATPasas, algunas propias de las proteínas

contráctiles y otras de los sistemas de membrana. Como se ha descripto, una pequeña

cantidad de ATP es resintetizado temporalmente por la conversión de la fosfocreatina

en creatina y la trasferencia del fosfato al ADP (Nazir y Magar, 1963, Beis y

Newsholme, 1975; Iwamoto y col., 1987). Posteriormente tiene lugar la glucólisis

anaerobia, acumulándose lactato como producto final, con la concomitante disminución

11
 1. Introducción

del pH muscular (Love, 1980; Kramer y Peter, 1981; Haard, 1992; Izquierdo-Pulido y

col., 1992; Huss, 1995). Resulta interesante notar que en los invertebrados marinos, la

octopina y ácido láctico son los productos finales del metabolismo anaeróbico muscular

(Hiltz y Dyer, 1971; Kawashima y Yamanaka, 1995), todos los cambios descriptos

precedentemente se resumen en la Figura 1.4 (extraída de Huss, 1995). El grado de

acumulación post-mortem de estos metabolitos depende de las temperaturas de

almacenamiento (Hiltz y Dyer, 1973; Kawashima y Yamanaka, 1995).

Figura 1.4. Descomposición aeróbica y anaeróbica del

glucógeno en el músculo de peces e invertebrados marinos (Huss,

1995)

Distintos estudios indican que el contenido de glucógeno, la velocidad de

degradación y consecuentemente el pH final del músculo varia según la especie, el tipo

de músculo, el estado nutricional del pez, la condición gonadal y el grado de

12
 1. Introducción

agotamiento al momento de la muerte (Huss, 1995; De Vido de Mattio y col., 1992,

2001; Ocaño-Higuera, 2003).

Un factor clave que limita la magnitud de la degradación del glucógeno

muscular es el pH, cuando este es demasiado bajo, son inhibidas ciertas enzimas

críticas y la glucólisis se detiene (Newbold y Scopes, 1967; Hiltz y Dyer, 1970). Ikeda

(1980) determinó una mayor acumulación de glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato en

camarón y ostión almacenados en hielo, mientras que en bonito observó un incremento

de fructosa-di-fosfato. Por otro lado, se observó un aumento de ácido láctico en

camarón y bonito mientras que en ostión el compuesto acumulado fue el ácido pirúvico

(Ikeda, 1980). Estos resultados sugieren que, en moluscos, algunas enzimas glucolíticas

intermediarias faltan o están desactivadas debido a el pH ácido o a las bajas

temperaturas de almacenamiento (Shibata, 1977). Ikeda, (1980) observó también que la

deshidrogenasa láctica se inhibe a pH 5,4 - 5,5. Con respecto a la temperatura de

almacenamiento, estudios realizados en camarón (Penaeus japonicus) mostraron una

acumulación de 50 mg de ácido láctico/ 100 g de músculo luego de almacenarlo por un

día a 5 ºC, por 7 días a 0 ºC y por 9 días a -1 ºC (Matsumoto y Yamanaka, 1990).

Cabe destacar que el descenso del pH que acompaña la glucólisis del músculo

de las especies pesqueras post-mortem tiene un efecto determinante en la calidad, ya

que afecta a las propiedades físicas de la carne (Tomlinson y Geiger, 1962; Love, 1988;

Izquierdo-Pulido y col., 1992; Færgemand y col., 1995; Ólafsdottir y col., 1997). A

medida que el pH disminuye, se reduce la carga neta de la superficie de las proteínas

musculares, causando su desnaturalización parcial y disminuyendo su capacidad de

13
 1. Introducción

retener agua. La pérdida de agua tiene un efecto perjudicial en la textura del músculo.

Distintos autores demostraron que existe una relación inversamente proporcional entre

la dureza del músculo y el pH (Love, 1975; Izquierdo-Pulido y col., 1992).

1.2.1.2. Consecuencia del agotamiento de ATP

La consecuencia del agotamiento del ATP en las células es la detención de las

reacciones biosintéticas y la pérdida de la capacidad para mantener la integridad

celular. En las fibras musculares, cuando la concentración de ATP cae por debajo de un

determinado valor critico (en general valores < 1,0 µmoles/g de músculo) se produce un

fenómeno singular, denominado rigor-mortis o rigidez cadavérica. Este fenómeno se

caracteriza por la pérdida de la extensibilidad y la flexibilidad muscular, debido a la

unión irreversible de los filamentos de actina y miosina (Iwamoto y col., 1987; Watabe,

y col., 1989; 1991). El estado de rigidez en el pescado se mantiene durante uno o más

días y luego se resuelve por la acción de enzimas proteolíticas que degradan ciertos

componentes del tejido muscular (Bremner y Hallet, 1985; Koohmaraie, 1994;

Kolodziejska y Sikorski, 1995; Kubota y col., 2001; Ladrat y col., 2003).

El tiempo entre el inicio y la resolución del rigor-mortis dependen de diversos

factores, tales como la especie, la talla, las condiciones fisiológicas antes del sacrificio,

la forma de sacrificio, la manipulación y la temperatura de almacenamiento. Se han

publicado numerosos estudios sobre el efecto de cada uno de estos factores en la

evolución del rigor de las especies marinas (Johnston y Moon, 1980; Botta y col., 1987;

Iwamoto, y col., 1987; Watabe, y col., 1989). En pescado exhausto, como las especies

capturadas por arrastre, la fase de rigor pasa rápidamente. En especies pequeñas,

14
 1. Introducción

veloces y fatigadas sucede lo mismo (Huss, 1995). El efecto de la temperatura sobre el

rigor no es uniforme. Generalmente se acepta que el comienzo y la duración del rigor-

mortis en pescado resultan más rápidos a mayor temperatura, pero se ha observado en

ciertas especies tropicales un efecto opuesto (Curran y col., 1986; Parry y col., 1987).

En estas especies el inicio del rigor es más rápido a 0 °C que a 10 °C. Este

comportamiento se atribuye al hecho de que a bajas temperaturas parece haber una

cierta incapacidad del retículo sarcoplasmático para reabsorber el calcio, acelerando la

contracción (Pöulter y col., 1982; Iwamoto y col., 1987; 1991).

El conocimiento de las etapas del rigor-mortis es de importancia cuando el

pescado es fileteado antes o procesado. Durante el rigor el cuerpo del pescado está

completamente rígido, el rendimiento del fileteado resulta muy bajo y una

manipulación tosca puede causar el desgarramiento de los filetes. Si los filetes son

removidos antes del rigor, el músculo puede contraerse libremente y se encogerá al

comenzar el rigor. Si el pescado es cocido antes del rigor, la textura será muy suave y

pastosa. Por el contrario, la textura es dura cuando el pescado es cocido durante el

rigor. Posterior al rigor la carne se torna firme, exhudativa y elástica (Tomlinson y col.,

1965, Huss, 1995).

1.2.1.3. Cambios autolíticos y catabolismo del ATP

Otra secuencia importante de la pérdida de ATP en el músculo post-mortem es

su degradación. El ATP es convertido, por reacciones de desfosforilación, primero en

adenosina difosfato (ADP) y posteriormente en adenosina monofosfato (AMP). El

AMP es a su vez desaminado a inosina monofosfato (IMP) y este se degrada a inosina

15
 1. Introducción

(HxR) e hipoxantina (Hx) (Saito y col., 1959; Kassemsarn y col., 1963 Ehira y

Uchiyama, 1986) (Figura 1.5). En general, esta degradación procede de la misma forma

en la mayoría de las especies marinas, sin embargo, en invertebrados marinos la vía

degradativa de los nucleótidos no ha sido claramente establecida. Diversos estudios

proponen para estos organismos un mecanismo alternativo, que considera una

secuencia de desfosforilaciones hasta adenosina (Ade), la que posteriormente se

degrada a HxR e Hx y en algunos casos puede formarse xantina y ácido urico (Saito y

col., 1958; Arai, 1960; Hiltz y Dyer, 1970; Sakaguchi y col., 1990) (Figura 1.5).

Figura 1.5. Secuencia de la degradación post-mortem del ATP en

el músculo esquelético de pescado e invertebrados marinos.

16
 1. Introducción

En general, después de la muerte de pez, las moléculas de ATP se hidrolizan

rápidamente hasta IMP por la acción de enzimas endógenas (Tarr, 1966; Surette y col.,

1988; Okuma y col., 1992). La posterior degradación del IMP a HxR e Hx es más lenta

y participan tanto enzimas autolíticas como microbianas (Surette y col., 1988; Ryder y

col., 1993; Ólafsdóttir y col., 1997). Distintos estudios han determinado que la

velocidad de estas reacciones enzimáticas varía ampliamente entre especies (Ryder,

1985; Sakaguchi y col., 1990), con el tipo de músculo (Obatake y col., 1988), con la

condición biológica de los ejemplares (sexo, estadio gonadal, etc.) (De Vido de Mattio

y col., 1992, 2001; Sagedhal y col., 1997) y con el tipo de almacenamiento (Surette y

col., 1988).

Los contenidos de los metabolitos de degradación de ATP durante el

almacenamiento en hielo de los distintos productos pesqueros, han sido ampliamente

utilizados como indicadores biológicos del grado de frescura (Saito y col., 1959; Ehira y

Uchiyama, 1973; Yokoyama y col., 1994). Se ha demostrado que el IMP es el principal

responsable del aroma y del sabor del pescado fresco; incluso en Japón es usado como

un agente saborizante (Kuninaka y col., 1964). Por el contrario, la Hx imparte un sabor

amargo típico del pescado en deterioro (Hughes y Jones, 1966). Saito y col., (1959)

fueron los primeros en desarrollar un índice para el análisis de la calidad del pescado

basados en las concentraciones de todos los productos de degradación de ATP, dicho

índice es conocido como el valor K. Otros índices no tan difundidos son el valor H,

basado en la formación de Hx (Loung y col., 1991) y el índice G que da mayor

importancia a la formación de HxR (Burns y Ke, 1985).

17
 1. Introducción

1.2.1.4. Cambios relacionados con la fracción lipídica

El contenido graso de los pescados y mariscos es muy variable, depende de la

especie, de la edad, del estado nutricional y del desarrollo gonadal, entre otros factores

(Love, 1975; Hazel, 1979; Brown, 1986, Contreras-Guzman 2002). Las características

tecnológicas de las especies pesqueras se ven afectadas principalmente por el contenido

de lípidos (Huss, 1995) y por tal razón resulta sumamente útil clasificar las especies

según el porcentaje de grasa en: magras (menor al 2,5%), semi-grasas (entre 2,5 y

9,5%), y grasas cuando contienen un porcentaje mayor al 9,5% (Jacquot, 1961, Murray

y Burt, 1969, Contreras-Guzmán 2002). En la mayoría de las especies pesqueras los

depósitos grasos consisten principalmente en triglicéridos compuestos de ácidos grasos

de cadena larga (14-22 átomos de carbono) con un alto grado de instauración, tales

como el ácido linoleico (LA 18:2 ω6), ácido linolénico (LLA18:3 ω3) ácido

araquidónico (AA, 20:4 ω6) ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 ω3) y ácido

decosahexaenoico (DHA, 22:6 ω3) (Stansby y Hall, 1967; Haard, 1992; Huss, 1995).

Las modificaciones más importantes que tienen lugar en la fracción lipídica,

durante el almacenamiento post-mortem de las especies pesqueras están relacionadas

con procesos de hidrólisis y con reacciones de oxidación (Deng, 1978; Shewfelt, 1981;

Ladikos y Lougovois, 1990). Ambas reacciones son de gran importancia para la vida

útil de estos productos, ya que dan como resultado distintas sustancias, las cuales

algunas tienen sabores y olores desagradables (rancio) y otras pueden contribuir a

cambios en la textura (Haard, 1992; Huss, 1995). Los ácidos grasos poliinsaturados

presente en los lípidos del pescado son oxidados mediante un mecanismo autocatalítico

18
 1. Introducción

dando hidroperóxidos, compuestos inodoros e insípidos (Ladikos y Lougovois, 1990).

Estos hidroperóxidos continúan degradándose formándose aldehídos, cetonas,

alcoholes, pequeños ácidos carboxílicos y alcanos que originan un extenso espectro de

olores y en algunos casos decoloración (Fuijii y col., 1989). Estas reacciones

autocatalíticas pueden ser iniciadas y aceleradas por calor, luz (especialmente luz UV)

y diversas sustancias orgánicas e inorgánicas (tales como Cu y Fe). Los hidroperóxidos

también pueden ser formados enzimáticamente, por lipoxigenasas presentes en

diferentes tejidos del pescado en cantidades variables (German y Kinsella, 1985;

German y col., 1991).

Por otra parte, durante el almacenamiento, aparece una cantidad considerable de

ácidos grasos libres. Los triglicéridos presentes en los depósitos de grasas son

escindidos principalmente por lipasas del tracto digestivo o lipasas excretadas por

ciertos microorganismos, mientras que las lipasas musculares desempeñan un papel

menor (Liston, 1965; Deng, 1978; Shewfelt 1981).

1.2.1.5. Cambios autolíticos que involucran enzimas

proteolíticas

El proceso de ablandamiento en el músculo, llamado resolución del rigor-mortis

es extremadamente importante y ha sido ampliamente estudiado en carnes rojas pero

aún no ha sido claramente establecido en pescado (Ladrat y col., 2003). La causa

principal de dicho proceso es la pérdida de la regulación biológica de las proteasas que

funcionan en el recambio de las proteínas del músculo en el animal vivo. Durante el

almacenamiento post-mortem, dichas proteasas hidrolizan ciertas proteínas del músculo

19
 1. Introducción

debilitando la estructura miofibrilar y promoviendo el ablandamiento (Asghar y Bhatti,

1987; Yamashita y Konnagaya, 1992; Koohmaraie, 1994, Jiang, 2000; Ladrat y col.,

2003).

Las proteasas son enzimas que están distribuidas en diferentes tejidos del

pescado, siendo principalmente abundantes y variadas en el aparato digestivo y en el

músculo esquelético. Las enzimas proteolíticas del aparato digestivo causan grandes

defectos en la calidad, particularmente cuando el pescado se alimenta abundantemente

antes de la captura (Haard, 1992). Las enzimas de los apéndices pilóricos e intestino

presentan actividad máxima entre pH 7,0 y 9,0; mientras que las enzimas del estomago

y del hígado son activas a pH ácidos (Haard y col., 1979; Nip y col., 1985).

Diversas proteasas se han aislado del músculo de pescado. La actividad de las

mismas depende de la integridad de la célula, de la cantidad de enzima nativa, de la

presencia de inhibidores, activadores y cofactores adecuados y del pH de la disolución

(Ladrat y col., 2003). Se han establecido dos grandes líneas degradativas intracelulares:

una de origen lisosomal (catepsinas) y otra de origen citosolica calcio-dependiente

(calpaínas). Otras proteasas, tales como las metaloproteinasas presentan un importante

papel en el ablandamiento de la matriz extracelular muscular, específicamente sobre

proteínas del tejido conectivo (Bremner y Hallett, 1985;. Sato y col., 1991; Kubota y

col., 2001, Ladrat y col. 2003). La contribución de cada sistema proteolítico descripto

no es clara, pero se ha sugerido que actúan sinergicamente en el tiernizado post-mortem

del pescado.

20
 1. Introducción

Como se ha mencionado, las catepsinas son enzimas lisosomales que se

encuentran en casi todos los tejidos animales (Goll y col., 1989, 1992). Estas muestran

actividad optima a pH ácidos (Etherington, 1984). En el tejido vivo, las catepsinas son

responsables de la degradación proteica en áreas de tejido dañado. Se han aislado

alrededor de 13 catepsinas (Kolodziejska y Sikorski, 1995), entre ellas la B, D y L han

sido observadas en tejido muscular de pescado (Jiang y col., 1996; Aoki y Ueno, 1997;

Ogata y col., 1998). Después de la muerte, la disminución del pH debilita la membrana

lisosomal, liberando las captesinas a los fluidos celulares. En relación a sus efectos

sobre la degradación del tejido muscular, estudios realizados in vitro demostraron una

gran susceptibilidad de varias proteínas miofibrilares. La cadena pesada de miosina, α-

actinina, desmina, actina, troponina T, y tropomiosina son degradadas por las

catepsinas B, D y L (Makinodan e Ikeda, 1969; Doke y col., 1980; Reedi y col., 1992;

Aoki y Ueno, 1997; Aranishi y col., 1998; Ogata y col., 1998; Ladrat y col., 2003). Por

otra parte, se ha demostrado que estas enzimas presentan la capacidad de degradar

proteínas de alto peso molecular (titina, proteína C y proteína M), lo que sugiere que su

principal acción podría estar dirigida al filamento grueso (Zeece y col., 1986; Zeece y

Katoh, 1989).

El segundo grupo de proteasas musculares mencionados, son las proteasas

neutras activadas por calcio, denominadas calpaínas (µ-calpaína que requieren para su

actividad 50-70 µM de Ca2+ y m-calpaína que requieren 1-5 mM Ca2+). Muchas de

estas enzimas han sido aisladas y caracterizadas de músculos de especies marinas

como: carpa, langosta americana y vieiras (Toyohara y col., 1983; Taneda y col., 1983;

Mykles y Skinner, 1986; Maeda y col., 1992a,b). Distintos estudios señalan que las

21
 1. Introducción

calpaínas juegan un rol principal en la proteólisis post-mortem durante los primeros

días de almacenamiento (Muramoto y col., 1989; Goll y col., 1992; Haard, 1992), en

particular, se ha sugerido que degradan las proteínas de la línea Z (Astier y col., 1991;

Papa y col., 1996, 1997; Ladrat y col., 2003).

Otras enzimas importantes en los cambios texturales que ocurren en el pescado

durante el almacenamiento son las colagenasas (Huss, 1995) La carne de los peces

teleósteos está dividida en bloques de células musculares separadas en miotomas,

mediante tejido conectivo denominado miocomata. Cada célula muscular o fibra está

rodeada por tejido conectivo que se une a la miocomata al final de la célula mediante

finas fibrillas de colágeno. Durante el almacenamiento refrigerado, estas fibrillas se

deterioran (Bremner y Hallett, 1985). Sato y col. (1991) demostraron en trucha

refrigerada una solubilización del colágeno tipo V de los miotomos, debido a la

actividad de colagenasas autolíticas.

Los péptidos de bajo peso molecular y los aminoácidos libres producidos por las

enzimas proteolíticas descriptas no sólo disminuyen la aceptación comercial del

pescado, sino también se ha demostrado que acelera el crecimiento de bacterias

deteriorantes, ya que proporciona un medio de crecimiento propicio para su desarrollo

(Aksnes y Brekken, 1988). La mayoría de estas bacterias presentan la capacidad de

descarboxilar aminoácidos libres, produciéndose una gran variedad de aminas biógenas

que disminuyen significativamente el valor nutritivo y comercial de estos productos.

22
 1. Introducción

1.2.1.6. Formación de Aminas Biógenas

Las aminas biógenas son compuestos orgánicos nitrogenados de carácter básico,

presentes en animales, plantas y microorganismos como consecuencia de distintos

procesos metabólicos (Brink y col., 1990; Halász y col., 1994). Mariné-Font y col.

(1995) clasificaron a las aminas biógenas encontradas en los alimentos, en base a su

estructura química: aminas aromáticas: (histamina, β-feniletilamina, tiramina,

triptamina); diaminas alifáticas: putrescina y cadaverina; y poliaminas alifáticas:

agmatina, espermina y espermidina (Figura 1.6).

En función de su origen las aminas pueden dividirse en dos grupos: biogénas y

naturales (Bardócz, 1995). Las aminas biógenas se forman por la descarboxilación

microbiana de los aminoácidos precursores. Estas incluyen: tiramina β-feniletilamina,

histamina y triptamina, que resultan de la descarboxilación de la tirosina, fenilalanina,

histidina y triptófano respectivamente. Las aminas naturales (de origen fisiológico), que

se forman como consecuencia de distintos procesos metabólicos celulares normales de

los seres vivos. Dentro de este grupo se incluyen putrescina, cadaverina, espermina,

espermidina y agmatina. Algunas de estas aminas, como la putrescina, la cadaverina y

la agmatina, también se pueden formar como consecuencia de la actividad

descarboxiladora de los microorganismos (Bardócz, 1995; Bardócz, 1999).

23
 1. Introducción

Figura 1.6. Estructura química de las aminas biógenas

Las aminas biógenas se pueden encontrar en una amplia gama de alimentos, tanto

de origen animal como vegetal, en especial en aquellos alimentos proteicos o con un

cierto contenido de aminoácidos libres, que se encuentra expuesto a condiciones que

permiten el desarrollo y la actividad microbiana (Eitenmiller y De Souza, 1984). En

pescado fresco los contenidos de aminas biógenas son muy bajos; sin embargo, a

medida que avanza su deterioro, aumenta debido a la descarboxilación de los

aminoácidos precursores por acción de enzimas bacterianas (Halász y col., 1994). Para

que se formen las aminas biógenas, además de microorganismos, es necesaria la

disponibilidad de sustratos (aminoácidos libres y péptidos) y la presencia del cofactor

24
 1. Introducción

piridoxal 5’-fosfato. Asimismo, son necesarias condiciones de pH y actividad de agua

óptimas para la expresión de la actividad microbiana responsable de la descarboxilación

de los aminoácidos precursores (Behling y Taylor, 1982; Brink y col., 1990).

El interés del estudio de las aminas biógenas en los productos pesqueros radica

tanto en las posibles implicancias toxicológicas de estos compuestos para la salud

humana, como en su significado higiénico-sanitario durante las etapas del procesado o

almacenamiento (Mariné-Font y col., 1995). La intoxicación por aminas biógenas,

denominada habitualmente “intoxicación histamínica” se trata del trastorno asociado a

la ingesta de alimentos que contienen niveles anormales de aminas biógenas,

especialmente de histamina y tiramina (Taylor, 1986). Históricamente esta afección ha

sido denominada “intoxicación por escómbridos” debido a la frecuente asociación de la

misma con el consumo de pescado deteriorado de las familias Scomberesocidae y

Scombridae, que incluyen a los atunes y las caballas (Taylor y Bush, 1988; Yeannes y

Casales, 1995; Maher y col., 2000). Sin embargo, también se han dado casos de este

tipo de trastorno por el consumo de otras especies pesqueras, e incluso de otros

alimentos como quesos, vinos y productos cárnicos (Mariné-Font y col., 1995; Lehane

y Olley, 1999, 2000). Los síntomas más frecuentes de esta intoxicación son: trastornos

gastrointestinales (náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal y digestión pesada),

neurológicos (cefalea), circulatorios (hipotensión y palpitaciones) y cutáneos (erupción,

rubor, prurito, ardor, urticaria, edemas e inflamación local) (Stratton y col., 1991).

Desde una perspectiva legal, la FDA (Food and Drug Administration) propuso en 1995

como nivel máximo permitido de histamina un valor medio de 50 mg/kg en productos

de la pesca (FDA, 1995). La Unión Europea, por su parte, establece para los pescados

25
 1. Introducción

de las familias de los escómbridos y clupeidos, un límite más elevado, un valor

promedio máximo de 100 mg/kg (CEE/493/91).

1.2.2. Cambios Microbiológicos

Es de aceptación generalizada que la alteración del pescado de mar tiene como

causa principal el crecimiento bacteriano (Liston, 1980; Gram y Huss, 1996). El

músculo de peces vivos y sanos normalmente no presenta microorganismos. Las

bacterias del pescado fresco se encuentran localizadas en la superficie externa (piel y

branquias) y en las vísceras (Shewan, 1977; Ababouch y col., 1996). La flora

predominante refleja el medio ambiente que circunda el pez vivo y su alimentación

(Shewan, 1977). En pescados procedentes de aguas templadas predominan las bacterias

Gram-negativas psicrótrofas, mientras que en especies de aguas tropicales se observa

un alto predominio de flora mesófila Gram-positiva (Shewan, 1977; Huss, 1995)

El crecimiento bacteriano depende de distintos factores tales como la especie, la

edad, el tamaño del ejemplar, la alimentación, el estado fisiológico y las composiciones

cualitativas y cuantitativas de la microflora inicial. Asimismo, depende del arte de

pesca, de la manipulación y de las temperaturas de almacenamiento (Murray y Shewan

1979; El-Marrakchi y col., 1992; Abgrall, 1994; Gennari y col., 1999). El método de

captura es con frecuencia el factor que más influye en el número y en el tipo de

bacterias presentes en el pescado. Ejemplares obtenidos por arrastre presentan

usualmente una carga bacteriana mayor que los capturados con línea (Ward y Baj,

1988).

26
 1. Introducción

Durante el almacenamiento del pescado, las bacterias de la superficie, branquias

y del intestino se desarrollan e invaden la masa muscular, llegando a alcanzar valores

de 108 –109 unidades formadoras de colonias por gramo de carne (UFC/g) cuando el

deterioro es evidente (Gram, 1989; Ababouch y col., 1996).

La flora contaminante habitual del pescado refrigerado está representada por

distintos géneros de bacilos psicrótrofos Gram-negativos, no esporógenos:

Achromobacter spp., Pseudomonas spp., Flavobacterium spp., Shewanella spp.,

Cytophaga spp. En distintas circunstancias se aislaron otros grupos como Vibrio spp.,

Clostridium spp., Micrococcus spp., Alteromonas spp., Moraxella spp., enterobacterias,

microorganismos coliformes (Eschearichia spp., Proteus spp. Serratia spp.

Enterobacter spp. Citrobacter spp.), Bacillus spp. y Listeria spp. También se han

encontrado bacterias ácido-lácticas, mohos y levaduras (Shewan, 1961, Horsley, 1977;

Shewan, 1977; Gram y col., 1987; Huss, 1995; Pascual-Anderson y Calderón-Pascual,

2000). Pero no todos los géneros presentes en el pescado son responsables de los olores

y sabores anormales asociados con el deterioro. Estos varían en función de las

condiciones de almacenamiento y la composición del producto (Huss, 1995). Los

microorganismos específicos del deterioro (OED) son en su mayoría organismos que

presentan la capacidad de producir H2S y reducir oxido de trimetilamina (OTMA).

Dichos metabolitos se forman debido a la utilización de moléculas relativamente

pequeñas e hidrosolubles (mucopolisacáridos, aminoácidos libres, péptidos, OTMA y

otros compuestos, como nutrientes durante las etapas activas del crecimiento bacteriano

(Shewan y col. 1960; Shewan, 1977; Huss, 1995 Ababouch y col., 1996).

27
 1. Introducción

Los principales microorganismos deteriorantes identificados en el pescado

almacenado en hielo son: Shewanella putrefaciens que produce H2S, N-TMA e

hipoxantina (Gram y col., 1987); Pseudomonas spp. que producen compuestos volátiles

como aldehídos, cetonas, ésteres y sulfuros no-H2S (Gram y col., 1990);

Photobacterium phosphoreum que forma N-TMA e hipoxantina (Dalgaard y col.,

1997). Además, otras bacterias identificadas como deteriorantes son Vibrio spp.,

Alteromonas spp. y Aeromonas spp (Shewan, 1977; Gram y col., 1987; Huss, 1995).

1.3. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL PESCADO

En industria pesquera, el término "calidad” puede tener distintas acepciones.

Frecuentemente, esta palabra se relaciona con especies costosas o con el tamaño de la

pieza, con la ausencia de agentes nocivos tales como parásitos, compuestos químicos y

organismos patógenos, o es usada como sinónimo de frescura y apariencia, refiriéndose

al grado de deterioro que ha sufrido el pescado por la acción de enzimas autolíticas

endógenas y/o por el desarrollo de una flora de contaminación variada (Huss, 1995)

Se han propuesto numerosos métodos de evaluación de la frescura y calidad del

pescado: químicos, físicos, microbiológicos y sensoriales. Ningún método aislado suele

ser suficiente para evaluar la calidad de los productos marinos, por lo que

frecuentemente se aconseja realizar al menos dos pruebas, una para determinar la

pérdida de frescura y otra para detectar el deterioro microbiano (Morales y col., 1996).

28
 1. Introducción

1.3.1. Métodos Químicos

El interés de los métodos químicos en la evaluación de la calidad de los

productos pesqueros, está relacionado con la capacidad para establecer estándares

cuantitativos. En general, estos métodos aportan resultados más objetivos, fiables y

seguros, pero requieren en muchos casos de personal experimentado e instrumentación

que, a veces, tiene un costo elevado. La mayoría de los métodos químicos utilizados en

la evaluación de la calidad del pescado implican el análisis de una sola sustancia o de

diferentes sustancias que pertenecen a la misma familia (Huss, 1995). Para el análisis

de los parámetros relacionados con el deterioro o la pérdida de frescura, existen

técnicas de tipo general que son aplicables a la mayoría de las especies de pesqueras.

Dichas técnicas se pueden clasificar en:

Ç Métodos basados en la medida de la degradación del ATP

Ç Métodos relacionados con cambios en la fracción nitrogenada básica

Ç Métodos relacionados con cambios en la fracción lipídica

También se han propuesto métodos con aplicación específica a determinados

grupos o especies pesqueras. Así, la determinación del amoníaco evalúa el grado de

deterioro de peces elasmobranquios, en los que se forman grandes cantidades de esta

substancia debido a la descomposición bacteriana de urea (Huss, 1995). En el caso de

crustáceos, la determinación del indol, producto de degradación del triptófano, se usa

como alternativa al examen organoléptico, ya que se acepta que su formación es debida

a una acción bacteriana (Chang y col., 1983).

29
 1. Introducción

1.3.1.1. Métodos basados en la degradación del ATP

Dentro de los cambios bioquímicos post-mortem que ocurren en el pescado, la

degradación de ATP ha sido ampliamente estudiada con el propósito de monitorear la

frescura y la vida útil de estos productos. Si bien, el catabolismo del ATP procede de la

misma manera en la mayoría de las especies marinas (Figura 1.5), la velocidad de las

distintas reacciones intermediarias de transformación de un catabolito a otro, varía

considerablemente por factores tales como: la especie, el método de captura, la

manipulación a bordo, la temperatura de almacenamiento y condiciones físicas del

pescado, entre otros (Ryder, 1985; Surette y col., 1988; Sakaguchi y col., 1990; De

Vido de Mattio y col., 1992, 2001; Sagedhal y col., 1997). En los últimos años,

distintas investigaciones coincidieron en que el IMP y otros 5´nucleotidos funcionan

como fuertes mejoradores del sabor, la HxR es más o menos insípida y la Hx imparte

un sabor agrio o amargo al pescado. En este contexto, se ha propuesto a la acumulación

de HxR e Hx como una medida de la perdida de calidad dada su alta correlación con

paneles de evaluación sensorial en muchas especies marinas.

Varios índices han sido sugeridos para determinar el grado de deterioro a partir

de los catabolitos del ATP. El valor K, descripto por Saito y col., (1959), definido como

el cociente entre las concentraciones de HxR e Hx y la suma de las concentraciones de

ATP y de todos sus compuestos de degradación (expresado como porcentaje),

constituye un indicador ampliamente utilizado en este tipo de estudios. Los valores

obtenidos tras la aplicación del índice K permiten clasificar a algunas especies

comerciales en:

30
 1. Introducción

- K < 20 %: pescados muy frescos, apto incluso para su consumo crudo.

- 20 < K <40 %: pescados que se puede considerar frescos, pero que debe cocerse

antes de ser consumido.

- K > 40 %: pescados no frescos, no apto para el consumo humano.

Karube y col. (1984) propusieron utilizar el valor K’. Dicho índice no tiene en

cuenta las concentraciones de ATP, ADP o AMP, ya que el ATP se degrada

rápidamente a IMP después de la muerte. En algunas especies el valor K y/o K’ no

reflejan de forma adecuada los cambios de frescura ya que aumentan en forma muy

rápida y luego se mantienen más o menos constantes. Esto se debe a una rápida

acumulación de HxR e Hx. Para estas especies se utiliza el valor H que se basa en la

concentración de Hx (Loung y col., 1991). En invertebrados marinos, Ohashi y col.

(1991), determinaron que la relación entre el contenido de Hx y AMP es un buen

indicador de frescura. Por otro lado, la carga energética de adenilato o valor CEA, que

es un índice propuesto por Atkinson (1968) como un parámetro del control metabólico,

se ha utilizado como un índice de frescura en distintos moluscos marinos (Yokoyama y

col., 1994).

La concentración de Hx en extractos desproteinizados puede determinarse por:

mediciones fotométricas, después de la reacción con un indicador de la oxidación-

reducción, generalmente el 2,6 diclorofenol-indofenol (Burt y col., 1968); o después de

su conversión en ácido urico por tratamiento con xantina oxidasa (Jones y col., 1964).

Más recientemente se han adaptado métodos basados en cromatografía líquida de alta

performance (HPLC). Este último método separa todos los componentes del

31
 1. Introducción

catabolismo de ATP y permiten su cuantificación (Murray y Thomson, 1983, Ryder

1985). Además se han desarrollado algunos instrumentos rápidos que utilizan sensores

enzimáticos basados en electrodos de oxígeno y en enzimas inmovilizadas (Watanabe y

col., 1983; Karube y col., 1984; Gill, 1990; Loung y col., 1992).

1.3.1.2. Métodos relacionados con cambios en la fracción

nitrogenada básica

Nitrógeno Básico Volátil Total (N-BVT). Como se ha mencionado previamente, la

actividad bacteriana es principalmente responsable de la formación de una serie de

compuestos nitrogenados básicos como el amoníaco, la trimetilamina (TMA), la

dimetilamina (DMA), monometilamina y propilaminas (Reay y Shewan, 1949;

Hollingworth y col., 1990; Huidobro y Tejada, 1990). Estas sustancias son conocidas

en su conjunto como Nitrógeno Básico Volátil Total (N-BVT). El componente

mayoritario de la fracción del N-BVT es la TMA. En pescado fresco la TMA, se

encuentra en cantidades muy pequeñas y se va acumulando durante el deterioro como

resultado de la reducción bacteriana del óxido de trimetilamina (OTMA). El OTMA

esta presente en el tejido vivo de muchas especies de peces marinos, dicho compuesto

desempeña un papel sustancial en los procesos de osmoregulación (Stenberg y col.,

1984). La formación de TMA, a lo largo del deterioro, presenta gran variabilidad entre

distintas especies marinas, principalmente por las diferencias en el contenido inicial de

OTMA que presentan en su músculo (Rodríguez y col., 1997). Asimismo el contenido

de TMA depende del crecimiento de la flora deteriorante, y del modo de captura,

conservación y almacenamiento.

32
 1. Introducción

La determinación de N-BVT como índice de descomposición del pescado, ha

sido ampliamente usada ya que presenta una elevada correlación con el grado sensorial

de aceptación del mismo (Connell, 1995; Contreras-Guzmán 2002). Por otro lado,

algunos autores han establecido buenas correlaciones entre los niveles de N-TMA y el

recuento total de microorganismos (Wong y Gill, 1987; Wong y col., 1988; Pastoriza y

col., 1996) por lo que propusieron a la determinación del N-TMA como método

objetivo para evaluar la calidad higiénico-sanitaria del pescado de aguas saladas (Dyer,

1959; Castell y col., 1973). En general, el límite de aceptabilidad para el consumo

humano se encuentra, para la mayoría de las especies, entre 10-15 mg N-TMA/100 g de

músculo en pescado almacenado aeróbicamente (Connell, 1995). Este limite de

aceptabilidad es solo aplicable al pescado conservado en hielo, ya que durante el

almacenamiento a elevadas temperaturas se forman cantidades mayores de TMA

(Ababouch y col., 1996; Baixas-Nogueras y col., 2001).

Existen muchos métodos y adaptaciones de los mismos para la estimación del

N-TMA. Entre ellos se pueden mencionar los de microdifusión, colorimétricos, por

electrodos específicos, enzimáticos, cromatográficos y por inyección de flujo.

Aminas biógenas. Como ya hemos mencionado, las aminas biógenas son bases

orgánicas de bajo peso molecular, presentes en animales, plantas y microorganismos

como consecuencia de diversos procesos metabólicos. En pescado se acepta que el

origen de contenidos elevados de aminas biógenas es fruto de la actividad aminoácido

descarboxilasa que presentan algunos microorganismos y es por ello que su

determinación se ha usado como un índice de calidad higiénico-sanitario del pescado

33
 1. Introducción

(Brink y col., 1990; Halász y col., 1994). Mietz y Karmas (1977, 1978) propusieron un

índice de calidad química basado en las aminas biógenas, indicadoras de la pérdida de

la calidad en el atún enlatado, donde:

[ histamina + cadaverina + putrescina]

IAB = .
[1 + espermina + espermidina]

Límites: 0 ≤ IAB ≤ 0,1 mg/100 g para productos fresco,

0,1 ≤ IAB ≤ 1 mg/100 g para productos en estado inicial de deterioro

IAB >1 mg/100 g para productos en descomposición avanzada.

Esta relación se basa en el hecho que las concentraciones de histamina,

cadaverina y putrescina son cuantitativamente importantes durante el almacenamiento

mientras que los niveles de la poliaminas fisiológicas (espermindina y espermina) se

mantienen constantes o incluso disminuyen a lo largo del deterioro. Otros autores

señalan que el uso de una sola amina es más adecuado para esta función indicadora,

mientras que otros proponen la suma de dos o tres aminas distintas (principalmente las

diaminas y la histamina). Yamanaka y col. (1987) propusieron a la formación de

agmatina como índice de frescura en calamar común. El principal interés en la

determinación de las aminas biógenas se centra en la necesidad de controlar el

contenido de algunas de ellas (como la histamina) ya que se han descrito problemas

toxicológicos relacionados con el consumo de pescado con contenidos elevados de

estas substancias (Mariné-Font y col., 1995; Lehane y Olley, 2000).

34
 1. Introducción

Algunos de los métodos para el análisis de aminas biógenas incluyen

cromatografía líquida de alta presión (Mietz y Karmas, 1977), cromatografía de gas

(Staruszkiewicz y Bond, 1981), espectrofluorometría (Vidal-Carou y col., 1990) y un

método enzimático rápido recientemente desarrollado para histamina, usando un lector

de microplaca (Etienne y Bregeon, 1992)

1.3.1.3. Métodos relacionados con los cambios en la

fracción lipídica.

Como ya se ha mencionado, la gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados

presentes en los lípidos de las especies pesqueras las hace altamente susceptibles a

reacciones de oxidación. En las mismas, mediante reacciones en cadena por radicales

libres se forman hidroperóxidos, que posteriormente son oxidados a aldehídos, cetonas

y otros compuestos, que tienen olor y sabor desagradable. Existen distintos métodos

para medir ambas etapas de la oxidación de lípidos. El valor de peroxido da una medida

de la primera etapa de esta reacción (Stine y col., 1954), mientras que la segunda puede

ser monitoreada cuantificando el valor de las sustancias reactivas al ácido tíobarbitúrico

(SR-TBA) (Ke y Woyewoda, 1979). Estos métodos muestran resultados contradictorios

en cuanto a la correlación con la evaluación sensorial (Hoyland y Taylor 1991; Raharjo

y col., 1993; Boyd y col., 1993). En la mayoría de los casos, el pescado es considerado

no apto para el consumo humano (proliferación bacteriana muy avanzada) antes de que

las modificaciones de la fracción lipídica sean evidentes. Por el contrario, resultan

índices útiles para la evaluación del pescado congelado ya que la congelación inhibe el

35
 1. Introducción

crecimiento microbiano, pero no evita totalmente ni las modificaciones químicas, ni las

debidas a enzimas endógenas.

1.3.2. Métodos físicos

Los métodos físicos son generalmente no destructivos, sencillos y de fácil

aplicación, por lo que resultan muy útiles en los análisis de rutina y pueden utilizarse

fuera del laboratorio. Sin embargo, la información que ofrecen es a menudo limitada y

por ese motivo se usan únicamente como complemento de otro tipo de técnica de

evaluación (Veciana-Nogués, 1999). Existen numerosos métodos físicos para la

determinación de la calidad del pescado. A continuación se describen brevemente dos

de los más utilizados.

1.3.2.1. Determinación del pH muscular.

En muchas especies de pescado el pH inicial del músculo post-mortem es

cercano a 7. Posteriormente desciende a valores de 6,5 o inferiores, por la acumulación

de ácido láctico. Estos valores se mantiene durante algunos días y luego aumentan

debido a la formación de compuestos básicos (principalmente amonio y aminas) que se

generan por la actividad de los microorganismos deteriorantes (Flick y col., 1991;

Connell, 1995; Huss, 1995). La determinación de pH se puede realizar directamente

con un pHmetro sobre una masa homogénea de carne de pescado triturada y en caso de

no lograr la homogeneidad o de tratarse de una muestra excesivamente seca se

recomienda hacer una dilución con agua destilada. Resulta difícil relacionar un

determinado valor de pH con el grado de frescura, ya que el pH final que se alcanza en

36
 1. Introducción

el músculo después de la muerte del pez depende de las reservas glucógeno en ese

momento, algo que es muy variable y que depende, entre otros factores, del estado

nutricional del pescado y del tipo de captura empleada. Ruíz–Capillas y Moral (2001)

proponen, a pesar de encontrar un aumento significativo del pH durante el deterioro del

pescado, que se utilice este parámetro más como una guía de calidad que como un

índice propiamente dicho.

1.3.2.2. Determinación de las propiedades de textura

La textura es uno de los factores más importantes a considerar en la calidad del

pescado (Botta, 1991). Los posibles mecanismos que pueden explicar los procesos de

alteración relacionados con los cambios en la textura durante el almacenamiento post-

mortem son: la degradación enzimática de algunos componentes de las miofibrillas y

del tejido conectivo y la separación de las uniones intercelulares que permiten que se

mantenga una estructura organizada y estable entre los componentes musculares

(Bremner y Hallett, 1985; Bremner, 1992; Cheret y col., 2005).

La integridad muscular del pescado se debe principalmente a la función que

tienen las proteínas estructurales presentes (colágeno, titina, nebulina, entre otras)

(Verrez-Bagnis y col., 1999). Así, pequeñas modificaciones de estas proteínas pueden

producir cambios importantes en la textura del pescado. El colágeno juega un papel

muy importante en la integridad de la carne, sin embargo, la cantidad de colágeno en el

pescado (teleósteos 3% y seláceos 10%) es inferior que en la carne (17%), y además se

solubiliza con mayor facilidad. Otros factores que afectan las propiedades de textura

son: la especie, la edad, el tamaño del pescado, el estado nutricional y el tipo de

37
 1. Introducción

músculo (Dunajski 1979; Johnston y Moon, 1980; Ingolfsdottir, y col., 1998; Hyldig y

Nielsen, 2001). Asimismo, son sumamente importantes factores post-mortem como: la

manipulación a bordo, el procedimiento utilizado para el sacrificio, (Sigholt y col.,

1997; Færgemand y col., 1995) y el perfil de temperatura durante el almacenamiento

(Færgemand y col., 1995; Sato y col., 1991) .

En la industria pesquera, la textura es comúnmente evaluada de manera

subjetiva, por una prueba descripta por Jellinek, (1985). Esta consiste en presionar con

el dedo índice la piel (o el filete) del pescado, determinándose la firmeza en función de

la dureza y del tiempo que queda la impresión en la muestra. Mediciones objetivas de

las características de textura pueden realizarse mediante el uso de un texturómetro

(Botta, 1991; Sigurgisladottir y col., 1997; Veland y Torrissen, 1999). Muchos de estos

ensayos son versiones modificadas de los métodos usados en carnes. Las principales

técnicas se basan en principios reológicos: fuerza de corte, punción y compresión.

Diversas investigaciones han usado la fuerza de corte con el método Warner

Bratzler o con la celda de Kramer para evaluar la textura (Careche y col., 1998;

Montero y Borderias 1989; 1990). Si bien estos métodos son muy sensibles presentan la

desventaja de ser destructivos (Sigurgisladottir y col., 1999; Hyldig y Nielsen, 2001).

Los ensayos de punción son usados principalmente en el análisis de geles,

desmenuzados y filetes. Distintos estudios coinciden en que este método presenta una

alta correlación con la evaluación sensorial de firmeza (Ando y col., 1991;

Sigurgisladottir y col., 1999). Los ensayos de compresión pueden incluir una o dos

compresiones. Una compresión es necesaria para determinar la dureza (o la firmeza) y

38
 1. Introducción

la fracturabilidad de las muestras; mientras que mediante la realización de dos ciclos de

compresión consecutivos se puede realizar un Análisis de Perfil de Textura (TPA). A

partir del gráfico de fuerza vs tiempo obtenido del TPA se pueden calcular distintos

parámetros como la cohesividad, elasticidad, adhesividad, gomosidad y masticabilidad

del alimento (Figura 1.7; Tabla 1.1).

Figura 1.7. Curva típica del análisis de perfil de textura (TPA)

En un test de TPA, la cohesividad se define como la relación entre las áreas de

las fuerzas positivas bajo la curva de la 2ª y la 1ª compresión. La elasticidad se define

como la altura que el alimento recupera durante el tiempo transcurrido entre el final de

la 1ª compresión y el comienzo de la 2ª. La adhesividad se calcula determinando el

área de la fuerza negativa de la 1ª mordida. Otras dos características reológicas que

39
 1. Introducción

derivan de los parámetros medidos son la gomosidad (dureza x cohesividad) y la

masticabilidad (gomosidad x elasticidad) (Bourne, 1978).

Tabla 1.1 Descripción de los parámetros mecánicos obtenidos

mediante el test del análisis de perfil de textura (TPA)

Parámetros Variable
Descripción
mecánicos (unidades)

Fuerza requerida para comprimir un alimento entre los molares.

Dureza Altura máxima del primer pico (primer ciclo de compresión = Fuerza
primera mordida)

La fuerza a la que los materiales se fracturan (Los alimentos

Fracturabilidad Fuerza
frágiles nunca son adhesivos)

Cohesividad La fuerza que los enlaces internos hacen sobre el alimento Relación

Propiedad de un material por la que recupera su forma y

Elasticidad dimensiones originales parcial o totalmente al cesar la acción del Relación
esfuerzo aplicado.

Adhesividad El trabajo requerido para retirar el alimento de la superficie Trabajo

La energía requerida para masticar un alimento sólido hasta que

Masticabilidad Trabajo
esta lista para ser ingerido

La energía requerida para desintegrar un alimento semisólido de

Gomosidad Fuerza
modo que esta listo para ser ingerido

1.3.2.3. Resistencia eléctrica de la carne del pescado.

Las medidas de la resistencia eléctrica de la carne del pescado se basa en el hecho de

que las propiedades eléctricas de la piel y tejido muscular del pescado cambian después

de su muerte. Estos cambios se traducen en una disminución gradual de la resistencia al

paso de la corriente eléctrica, atribuible al deterioro de las membranas celulares

(Ólafsdóttir y col., 2004). Hennings (1965) desarrolló el Intelectron Fish Tester que mide

40
 1. Introducción

la impedancia a dos frecuencias distintas entre electrones de grafito aplicado en una

región específica del pescado. Jason y Richards (1975) desarrollaron un aparato que

mide los cambios en las propiedades dieléctricas, capacitancia y resistencia. Burt y col.,

(1976) determinaron que ambos aparatos muestran una buena correlación con las

puntuaciones del aspecto general, recomendando que cada especie en particular debe

calibrarse en términos del grado de alteración o de la vida útil.

1.3.3. Métodos microbiológicos

La finalidad de los métodos microbiológicos es ofrecer información sobre la

calidad higiénica durante la manipulación, elaboración o almacenamiento del producto

y sobre la posible presencia de microorganismos patógenos para la salud humana

(Huss, 1995; Morales y col., 1996).

La actividad de los microorganismos es el principal factor que limita la

durabilidad del pescado fresco. Para el análisis microbiológico rutinario del pescado se

utilizan habitualmente dos tipos de métodos: los que hacen un recuento del número

total de microorganismos presentes en el pescado y los que se basan en el recuento de

un grupo concreto. Así, la legislación Europea propone como límites máximos para que

el pescado sea apto para el consumo humano, valores de 106 UFC/g de bacterias

psicrófilas o 103 UFC/g de enterobacterias (MSC, 1991). En los últimos años está

adquiriendo importancia el uso de técnicas para el análisis de organismos específicos

del deterioro (OED). Entre estos microorganismos, se destaca Shewanella putrefaciens,

bacteria que produce H2S en pescados refrigerados en condiciones aerobias y

41
 1. Introducción

Photobacterium phosphoreum, en pescado conservado en atmósferas modificadas

(Connell, 1995; Ólafsdóttir y col., 1997).

El principal inconveniente de los métodos microbiológicos tradicionales es que

normalmente requieren entre 24 hs y 3 días para la obtención de resultados, hecho que

limita su utilización. Es por ello, que se han propuesto métodos rápidos, basados

generalmente en medidas indirectas de tipo fisicoquímico que permiten ahorrar tiempo

en la obtención de resultados. Estos métodos rápidos incluyen los basados en técnicas

de impedimetría, microcalorimetría, turbidimetría, radiometría, epifluorescencia directa

sobre filtro, bioluminiscencia, el ensayo de la actividad aminopeptidásica ligada a la

pared celular y diversos métodos inmunológicos y genéticos (González y col., 1994a,b).

Sin embargo, ninguno de ellos ha tenido aún una aceptación general en la

determinación de la frescura del pescado, unos por ser excesivamente costosos, otros

por requerir personal especializado y, en otros casos, por no haberse demostrado su

eficacia.

1.3.4. Métodos sensoriales

La evaluación sensorial se puede definir como una disciplina científica que

analiza las características del alimento a través de los sentidos (vista, olfato, gusto, tacto

y audición). Estos métodos son ampliamente utilizados en las inspecciones diarias de

puertos y mercados; y son en los que se apoyan los consumidores para determinar la

frescura, calidad e idoneidad de los diferentes productos pesqueros. Los métodos

sensoriales no requieren de equipos ni materiales especiales, son rápidos y permiten la

valoración simultánea de más de un parámetro en diferentes muestras de pescado. Sin

42
 1. Introducción

embargo, presentan la desventaja de que el resultado está sometido a las impresiones

subjetivas del panel de catadores (Huss, 1995). Por otra parte, se debe tener en cuenta

que las calidades deseadas, en muchos casos, depende de las preferencias regionales,

actitudes del consumidor y métodos de preservación y consumo (Haard, 1992).

Numerosos esquemas han sido desarrollados para el análisis sensorial de

distintas especies de pescado. El método más usado para la evaluación de la calidad en

la industria pesquera es el esquema UE (CEE/2406/76-96). Este se basa en la

apariencia, el aroma y la textura del ejemplar, y clasifica al pescado en tres niveles de

calidad: E (extra), A y B; donde E corresponde a la mayor calidad y por debajo del

nivel B el producto se considera no apto para el consumo humano. El esquema UE es

comúnmente aceptado en los países de la Unión Europea para la evaluación sensorial,

sin embargo, existen algunas discrepancias dado que el esquema no toma en

consideración las diferencias entre especies, ya que sólo utiliza parámetros generales

(Huss, 1995). Actualmente una alternativa a el esquema UE, es el Método del Indice de

la Calidad o Quality index Method, QIM (Botta, 1995; Huidobro y col., 2001).

El QIM es un procedimiento sistemático que permite evaluar en forma rápida y

precisa la calidad de los productos pesqueros. Este método que tiene en cuenta todas las

características de los métodos sensoriales tradicionales, se basa en la observación

directa de atributos externos significativos del pescado tales como: ojos, piel, agallas y

olor. Sobre los cambios que ocurren tales atributos, el QIM otorga un puntaje de

demerito (en general de 0 al 3) que va adicionando puntos en contra de la calidad

(Jonsdottir, 1992). Las puntuaciones registradas en cada atributo se suman para dar una

43
 1. Introducción

puntuación sensorial total, denominado índice de la calidad (QI). Este asigna una

puntuación sensorial de cero al pescado muy fresco; y va aumentando a medida que el

deterioro del pescado avanza. La principal ventaja que presenta este método es

posibilidad de predecir la vida útil comercial del pescado en hielo, ya que existe una

correlación lineal entre el QI y el tiempo de almacenamiento (Alasalvar y col., 2002;

Lougovois y col., 2003). Otra ventaja sumamente importante es que el QIM se

desarrolla específicamente para cada especie pesquera, describiendo en forma precisa

los cambios experimentados durante el almacenamiento, presentando frecuentemente

fotografías de referencias (Botta, 1995). Actualmente se han desarrollado esquemas

QIM para bacalao (Larsen y col., 1992), arenque (Jonsdottir, 1992), salmón

(Sveinsdottir y col., 2002), merluza (Baixas-Nogueras y col., 2003) y boquerón

Engraulis encrasicholus (Pons-Sánchez-Cascado, y col., 2006), entre otros.

Debido a la importancia que está adquiriendo el desarrollo de métodos QIM

dentro del análisis sensorial, distintos institutos de investigación europeos (Instituto

Holandés de Investigación Pesquera, Laboratorio Islandés de Pesquerías, y el

Departamento de Investigación de Productos del Mar Danés de Investigación Pesquera)

han establecido una alianza estratégica denominada QIM-Eurofish (www.qim-

eurofish.com), con el objeto de desarrollar y promover la aplicación de estos esquema

para evaluar la calidad de los productos marinos. Europa no esta sola en esta iniciativa,

de hecho, el QIM se basa en estudios realizados originalmente en la Unidad de

Investigación de Alimentos de Tasmania de Australia.

44
 1. Introducción

1.4. OBJETIVOS

Como se ha mencionado precedentemente, los productos pesqueros son

considerados alimentos muy perecederos. Bajo condiciones normales de

almacenamiento, la calidad de estos productos se ve reducida en una primera etapa, por

enzimas propias del músculo del pescado ("autólisis") y posteriormente por la actividad

de los microorganismos. En esta última etapa se producen los efectos más pronunciados

del deterioro, caracterizado por cambios en el aspecto, la textura y por la aparición de

olores y sabores anormales, así como por la acumulación de compuestos orgánicos y

microorganismos que pueden representar un riesgo toxicológico (Davis, 1999).

Con el objetivo de establecer la vida útil comercial de los recursos pesqueros, se

han realizados distintos estudios sistemáticos sobre las alteraciones post-mortem que se

producen en varias especies de pescados y moluscos durante el almacenamiento (Ryder

y col., 1984; Fatima y Qadri, 1985; Surette, y col., 1988; Yokoyama y col., 1994;

Mazorra-Manzano, y col., 2000; Sveinsdottir y col., 2002). Si bien las distintas especies

presentan una secuencia similar de deterioro, se deben estudiar los cambios que ocurren

en cada una de las mismas, ya que la velocidad de descomposición post-mortem

depende fundamentalmente de las diferencias en la composición de los tejidos del

pescado, del tamaño del ejemplar, del estadio del ciclo reproductivo, y de los métodos

de captura y de manipulación (Shewan, 1977; Abgrall, 1994).

La creciente demanda de los productos pesqueros para el consumo humano y la

crítica situación de algunas pesquerías tradicionales de nuestro país hace necesario la

búsqueda de recursos pesqueros alternativos. Por esa razón en esta tesis se estudiaron

45
 1. Introducción

tres especies que fueron seleccionada en virtud de su productividad, nivel de captura,

calidad de la carne y por el interés comercial tanto a nivel nacional como internacional.

1.4.1. Objetivo General

El objetivo general de esta tesis fue determinar los cambios bioquímicos post-

mortem en músculo de especies pesqueras y determinar la vida útil de las mismas

almacenadas en frío mediante análisis químicos, físicos, microbiológicos y sensoriales

1.4.2. Objetivo Particulares

X Investigar los cambios bioquímicos post-mortem relacionados con el ATP y sus

productos de degradación, la actividad de las principales enzimas involucradas en el

catabolismo del ATP y el pH.

X Establecer en base a los contenidos de los compuestos relacionados con la

degradación del ATP, distintos índices químicos de evaluación de calidad.

X Monitorear los niveles de aminas biógenas en las distintas especies en estudio y

evaluar la utilidad de éstas como índice de deterioro.

X Monitorear los cambios en textura en pescado entero y filete, y en el músculo

aductor de vieira.

X Estudiar el perfil microbiológico y la evolución de los grupos deteriorantes más

significativos.

46
 1. Introducción

X Desarrollar un Quality Index Method (QIM) específico para P. patagonicus y M.

furnieri fresco y una tabla de análisis sensorial de músculo aductor de Z patagónica

durante el almacenamiento en frío.

X Analizar posibles correlaciones entre los distintos parámetros estudiados a fin de

encontrar índices adecuados para monitorear cambios en la calidad.

47
2. MATERIALES
y
METODOS
 2. Materiales y Métodos

2.1. MUESTRAS Y MUESTREO

Se estudiaron tres especies pesqueras presentes en el litoral marítimo argentino:

Ü Lenguado (Paralichthys patagonicus),

Ü Corvina rubia (Micropogonias furnieri),

Ü Vieira patagónica (Zygochlamys patagónica).

2.1.1. Lenguado

Los ejemplares de Paralichthys patagonicus utilizados fueron capturados en

distintas estaciones de pesca en el Sudoeste del océano Atlántico (36º - 43 ºS), con

redes de arrastre de fondo, por barcos comerciales de altura o costeros y por buques de

investigación del INIDEP, desde el comienzo del 2001 hasta fines del 2002. Los

individuos con tallas entre 35-45 cm de longitud total (talla comercial) fueron

seleccionados y transportados rápidamente (en hielo) al laboratorio, donde se

acondicionaron en cajas plásticas perforadas, intercalando alternadamente capas de

hielo granizado y pescado (en relación 0,5:1). Las cajas plásticas fueron almacenadas

dentro de una cámara fría a 0 - 4 ºC y la eliminación del agua de fusión y la adición del

hielo se realizó cada 24 hs.

Se realizaron dos experimentos. En cada uno de ellos, 3 pescados fueron

separados a 0, 2, 6, 9 y 12 días de almacenamiento y usados para los análisis químico,

físicos, microbiológicos y sensoriales. Cada muestra fue procesada por triplicado.

49
 2. Materiales y Métodos

2.1.2. Corvina rubia

Los ejemplares de Micropogonias furnieri fueron capturados por buques

comerciales costeros que ofrecían garantía de un pescado capturado recientemente (4 -

6 hs.) en la costa de la provincia de Buenos Aires. El tamaño de los ejemplares

seleccionado fue entre 40-50 cm longitud total (talla comercial). La forma de

acondicionamiento, almacenamiento, toma de muestra, número de experimentos,

ejemplares por muestreo analizados y repeticiones por muestra en la corvina rubia

fueron similares a lo descripto precedentemente para el lenguado.

2.1.2.1. Determinación del estadio gonadal de la corvina

rubia

La determinación del estadio gonadal de la corvina rubia se realizó en hembras

maduras por análisis macroscópico de las gónadas y por análisis histológico del tejido

(Macchi, 1992).

2.1.3. Vieira patagónica

Las muestras de Zygochlamys patagónica fueron recolectadas del banco

Reclutas (39º24´S-55º56´W) del océano Atlántico por buques de investigación

pertenecientes al Instituto Nacional y Desarrollo de Investigación Pesquero (INIDEP).

Las mismas fueron trasladadas vivas hasta el laboratorio, en recipientes plásticos con

agua de mar filtrada y aireación constante. Posteriormente se seleccionaron ejemplares

maduros de 55-56 mm de altura total de valva (talla comercial).

50
 2. Materiales y Métodos

Inmediatamente después de remover las valvas, los músculos aductores (callos)

fueron disecados y cuidadosamente liberados de todo resto de hepatopáncreas.

Posteriormente, los músculos aislados fueron almacenados individualmente a 2 - 4 ºC

en cámara refrigerada por 9 días. En experimentos destinados al análisis microbiológico

el almacenamiento se prolongó por 12 días. Se tomaron muestras a tiempo 0 y a

diferentes tiempos de almacenamiento. A cada tiempo se analizaron entre seis y nueve

muestras. Cada muestra estuvo constituida por uno o dos músculos. Los análisis fueron

realizados por triplicado.

2.2. METODOLOGÍA ANALÍTICA

2.2.1. Determinación de nucleótidos

La determinación de los nucleótidos se realizó mediante el método de

cromatografía líquida de alta presión (HPLC) propuesto por Ryder (1985).

2.2.1.1 Preparación de las muestras y extracción

La extracción de los nucleótidos fue realizada homogeneizando 20 g de músculo

de pescado, previamente cortados en pequeños trozos, en un homogeneizador Omni-

mixer (SORVALL, Dupont Co., Newtown, CT. U.S.A.) con 50 ml de ácido perclórico

frío al 7% durante 3 min. Posteriormente los homogenatos fueron centrifugados durante

10 min. a 10.000 xg a 2- 4 ºC (Sorvall RC 26 Plus, Sorvall Products LP, Newtown, CT

U.S.A.). Una alícuota de 25 ml de los sobrenadantes fue inmediatamente neutralizada

con KOH al 30% (pH 6,5-6,8) y luego de 30 min. de reposo los cristales de KClO4

formados fueron removidos por filtración a través de papel de filtro Whatman 1. El

51
 2. Materiales y Métodos

filtrado fue diluido a 50 ml y este volumen fue completado con agua destilada calidad

HPLC. Los extractos fueron almacenados a -30 ºC hasta el momento de su análisis.

Antes de ser inyectados en el cromatógrafo los extractos fueron pasados a través de

filtros (ISO-Disc TM filter N-4-2, Nylon Supelco) de 4mm x 0.25 µm.

2.2.1.2. Procedimiento y condiciones cromatográficas

El sistema de HPLC usado en este estudio estuvo compuesto por una bomba

2350-ISCO (Pro-Tean LC INERT), un detector UV/VIS V4-ISCO y un programador de

gradiente 2360 ISCO (Pro-Tean LC INERT). El sistema analítico y de cálculo se

controló utilizando el software CHEM-RESERARCH 150. La separación

cromatográfica se realizó utilizando una columna de fase reversa (Waters Spherisorb

ODS-2,5 µm, 250 mm x 4,6 mm Supelco INC) termostatizada a 30ºC. La fase móvil

empleada fue un sistema binario. Solvente A: en 0.04 M K2HPO4 + 0.06 M KH2PO4 pH

6.5; Solvente B: Metanol (calidad HPLC). El gradiente de elución fue programado de la

siguiente manera: elución isocrática 100%A, 0-12 min.; gradiente lineal 100%A a

85%A/15%B, 12-15 min.; elución isocrática 85%A/15%B, 15-27 min.; gradiente lineal

de 85%A/15%B a 100%A, 27-30 min. Flujo 1 ml/min. El estudio fue monitoreado por

absorción al UV a 254 nm.

La determinación del ATP y de sus productos de degradación en las muestras se

realizó por comparación con los tiempos de retención de las correspondientes

soluciones patrones: Adenosina-5-trifosfato (ATP), Adenosina-5-difosfato (ADP),

Adenosina-5-monofosfato (AMP), Inosina-5-monofosfato (IMP), Adenosina (Ade),

Inosina (HxR) y Hypoxanthine (Hx) (Sigma el St. Louis, MO). El cálculo del

52
 2. Materiales y Métodos

contenido de los nucleótidos se realizó mediante la cuantificación por patrón externo a

partir de una recta de calibrado preparada con una serie de soluciones patrón de

concentraciones comprendidas entre 0,1 mg/l y 0.5 mg/l de cada uno de los nucleótidos.

La concentración final de cada nucleótido fue expresada en µmoles/g de tejido húmedo.

2.2.2. Actividad de las enzimas involucradas en el

catabolismo del ATP

2.2.2.1. Preparación del extracto enzimático

Los extractos enzimáticos fueron obtenidos de acuerdo a lo descripto por Stone

(1970), 5 g. de tejido muscular fueron homogeneizados con 35 ml de succinato de

potasio 0,1 M (pH 6,5) en un homogeneizador Omni-mixer (SORVALL). Los

homogenatos fueron agitados, usando un agitador magnético, en un baño a 0-4 ºC

durante 1 hora y posteriormente centrifugados durante 30 min. a 15.000 xg. Los

sobrenadantes fueron filtrados e inmediatamente congelados a –30 ºC para su posterior

análisis. Las determinaciones de las actividades enzimáticas fueron realizadas según el

método de Kalckar (1947) con algunas modificaciones.

2.2.2.2. Determinación de la actividad de la AMP-deaminasa

Una alícuota de 0,10 ml del extracto enzimático se preincubó en 2,8 ml de

buffer succinato de potasio 0,1 M (pH 6.5) por 5 min. a 25 ºC. La reacción enzimática

se inició con la adición 0,1 ml de AMP 2,6 mM determinándose durante un periodo de

10 min. el descenso en los valores de absorbancia a 265 nm con un espectrofotómetro

53
 2. Materiales y Métodos

(Metrolab 1700 UV/Vis). Los resultados fueron expresados en µmoles de sustrato

desaminado por minuto por gramo de tejido húmedo. El cálculo se realizó

multiplicando la pendiente inicial de la curva de absorbancia vs tiempo por el volumen

total de reacción (en litros) y dividiendo por 8.860 M-1cm-1, que es la diferencia entre la

absortividad molar del AMP (sustrato) y el IMP (producto) a 265 nm (Smiley y col.,

1967) por los gramos de tejido húmedo (µmoles/g min).

2.2.2.3 Determinación de la actividad de la Adenosina

deaminasa

Una alícuota de 0,1 ml del extracto enzimático se preincubó en 2,8 ml de buffer

fosfato 0,05 M (pH 7,4) por 5 min. a 25 ºC. La reacción enzimática se inició

inmediatamente después de la adición 0,1 ml de adenosina 2 mM determinándose el

descenso en la absorbancia a 265 nm durante un período de 10 min. Los resultados

fueron expresados en µmoles/g min, empleando el valor de 7.900 M-1 cm-1 como la

diferencia la absortividad molar entre la adenosina y la inosina (Hoagland and Fisher

1967).

2.2.2.4. Determinación de la actividad de la Nucleósido

fosforilasa

Una alícuota de 0,1 ml del extracto enzimático se preincubó en 2,8 ml de buffer

fosfato 0,05 M (pH 7,4) por 5 min. a 25 ºC. La reacción enzimática se inició

inmediatamente después de la adición 0,1 ml de inosina (50 mM) determinándose el

54
 2. Materiales y Métodos

incremento en la absorbancia a 293 nm durante un período de 10 min. Los resultados

fueron expresados en µmoles/g min., basados en el cambio de absortividad molar entre

la inosina y el ácido úrico de 12.500 M-1 cm-1 (Kalckar, 1947).

2.2.3. Índices químicos para evaluar la frescura

El valor K fue determinado según Saito, y col. (1959) mediante la siguiente

ecuación:

[HxR]+ [Hx]
K (%) = x 100
[ATP]+ [ADP]+ [AMP]+ [IMP] + [HxR]+ [Hx]

El valor K´ es un índice propuesto por Karube y col. (1984) con la siguiente

fórmula:

[HxR]+ [Hx]
K´ (%) = x 100
[IMP] + [HxR]+ [Hx]

El valor H es un índice utilizado por Loung y col. (1991)

[Hx]
H (%) = x 100
[IMP] + [HxR] + [Hx]

La carga energética de adenilato o valor CEA. se calculó según Atkinson (1968)

([ATP]+½[ADP]
CEA(%) = x 100
[ATP]+[ADP]+[AMP])

55
 2. Materiales y Métodos

También se calculó la relación Hx/AMP, como índice de frescura, a partir del

contenido de AMP y Hx. En todas estas ecuaciones las concentraciones fueron

expresadas en µmoles de nucleótidos por gramo de tejido húmedo (µmoles/g).

2.2.4. Relación 260/250

Se determinó en extractos perclóricos de tejido muscular, como la relación

de absorbancia a 260 nm y 250 nm (Korhonen y col., 1990). Los extractos fueron

obtenidos homogeneizando 2 g de músculo en un homogeneizador Omni-mixer

(SORVALL) con 50 ml de ácido perclórico 20% durante 3 min. Posteriormente los

homogenatos fueron filtrados a través de papel del filtro (Whatman 1). El filtrado se

diluyó con 3 volúmenes de agua destilada e inmediatamente se determinó la

absorbancia en un espectrofotómetro (Metrolab 1700) a 250 y 260 nm.

2.2.5. Determinación de Aminas Biógenas

La determinación y cuantificación de aminas biógenas fue realizada por

cromatografía líquida de alta presión (HPLC) según el procedimiento descripto por Yen

y Hsieh (1991).

2.2.5.1. Extracción de las muestras

La extracción de las poliaminas fue realizada homogeneizando 5 g de muestra

con 25 ml de ácido perclórico 3% durante 3 min. en un Omni-mixer (SORVALL).. Los

homogenatos fueron centrifugados durante 10 min. a 10.000 xg ( 0-4 ºC). Luego los

sobrenadantes se filtraron a través un papel de filtro Watman 1. El filtrado se diluyó a

56
 2. Materiales y Métodos

50 ml con agua destilada calidad HPLC. Los extractos fueron almacenados a -30 ºC

hasta su análisis.

2.2.5.2. Preparación de los patrones

Se disolvieron por separado en 10 ml de agua ultrapura: 122,8 mg de

diclorhidrato de tiptamina, 130.1 mg de diclorhidrato de 2 feniletilamina, 165,7 mg de

diclorhidrato de histamina, 171,4 mg de diclorhidrato de cadaverina, 182,9 mg de

diclorhidrato de putrescina, 172,0 mg de tetraclorhidrato de espermidina, 175,3 mg de

trihidroclorato de espermina, 126,7 mg de diclorhidrato de tiramina, y 175,4 mg sulfato

de agmatina. La concentración final de cada amina (como base libre) fue de 10 mg/ml.

2.2.5.3. Derivatización de las muestras y patrones

La derivatización de las muestras y de los patrones fue realizada con cloruro de

benzoílo. Dos mililitros de cada extracto fueron alcalinizados con 1ml de NaOH 2M.

Posteriormente se añadieron 10 µl de cloruro de benzoílo e inmediatamente se agitaron

durante 30 segundos y se dejaron reaccionar durante 20 min a temperatura ambiente. Se

adicionaron 2 ml de NaCl (solución saturada) y posteriormente se realizó la extracción

con 4 ml de dietileter. Se dejó en reposo durante 30 min a -30ºC y posteriormente se

transfirió la fase etérea a un tubo y se evaporó en corriente de N2. El residuo se

resuspendió en 500 µl de metanol. El extracto final se filtró a través de un filtro (ISO-

Disc TM filter N-4-2, Nylon Supelco) de 4mm x 0.25 µm. y se inyectó 10 µl en el

sistema cromatográfico.

57
 2. Materiales y Métodos

2.2.5.4. Procedimiento y condiciones cromatográficas.

La separación cromatográfica fue realizada en una columna de fase reversa C-

18 Lichrosper 5 µm (2,5 x30 cm) termostatizada a 30ºC. La fase móvil empleada fue un

sistema binario. Solvente A: metanol, Solvente B: agua destilada (calidad HPLC). El

gradiente de elución fue programado de la siguiente manera: elución isocrática

55%A/45%B, 0-5 min. a 1,1 ml/min; gradiente lineal de 55%A/45%B a 88%A/12%B,

5-7 min. a 1,1 ml/min; elución isocrática 88%A/12%B, 7-11 min. a 1,3 ml/min;

gradiente lineal de 88%A/12%B a 55%A/45%B, 11-15 min. a 1,1 ml/min.; elución

isocrática 55%A/45%B, 15-20 min. a 1,1 ml/min.

El cálculo del contenido de aminas biógenas en la muestra se realizó mediante la

cuantificación por patrón externo a partir de una recta de calibrado preparada con una

serie de soluciones patrones de concentraciones comprendidas entre 0,1 mg/l y 20 mg/l

de cada una de las aminas biógenas. La concentración final de cada amina de la muestra

analizada se expresó en mg/100 g de músculo (peso húmedo).

El índice químico de calidad basado en el contenido de aminas biógenas en

pescados se calculó mediante la siguiente ecuación propuesta por Mietz y Karmas

(1977).

[histamina + cadaverina + putrescina]

IAB = .
[1 + espermina + espermidina]

58
 2. Materiales y Métodos

2.2.6. Determinación del pH

Dos gramos de músculos fueron homogeneizados en cinco volúmenes de agua

destilada en un homogeneizador Sorvall, y posteriormente los valores de pH fueron

determinados utilizando un pH-metro (Hanna-Instrument modelo HI 9321- Hanna

Instrument Italia Srl. Sarmeola di Rubano PD, Italy).

2.2.7. Medidas de textura

Un texturómetro INSTRON Modelo 4442 (INSTRON Corporation, USA) fue

utilizado para medir los cambios en las propiedades de textura durante el

almacenamiento en frío de ejemplares enteros y filetes de lenguado patagónico y de

corvina rubia, y del músculo aductor de vieira patagónica.

2.2.7.1. Determinación de textura en el lenguado

patagónico y en corvina rubia.

Para determinar los cambios en firmeza que tienen lugar en el pescado entero

durante el almacenamiento en hielo se realizaron ensayos de punción. Estos intentaron

simular la presión que podría ejercer con el dedo una persona que lleva a cabo un

análisis sensorial. En cada ejemplar se efectuaron dos determinaciones, en el lenguado

la firmeza fue evaluada en la región ocular central y caudal, evitando la línea lateral e

intentando encuadrar al ejemplar paralelo a la superficie de contacto del sensor (Figura

2.1); mientras que en la corvina rubia las determinaciones fueron realizadas en la región

dorsal central y caudal (Figura 2.2). En ambas especies, la compresión se realizó con un

sensor cilíndrico de acrílico de 12 mm de diámetro, a una velocidad de 50 mm/min. La

59
 2. Materiales y Métodos

firmeza fue determinada como la fuerza requerida para comprimir el pescado a una

profundidad de 4 mm, según lo propuesto por Ginés y col. (2002).

Figura 2.1. Diagrama de la localización de las medidas de

firmeza realizadas en el lenguado.

Figura 2.2. Diagrama de la localización de las medidas de

firmeza efectuadas en la corvina rubia

60
 2. Materiales y Métodos

2.2.7.3. Análisis del perfil de textura (TPA) realizado en

filete crudo

El TPA se realizó según el método propuesto por Bourne (1978). La zona

central del filete fue sometido a dos ciclos sucesivos de compresión hasta el 30 % de la

altura original, con un sensor cilíndrico de 12 mm de diámetro y a una velocidad de 20

mm/min., con una espera de 30 seg. entre los ciclos de compresión (Figura 2.3). De la

curva de fuerza vs. tiempo resultante, se determinaron los siguientes parámetros:

dureza que corresponde a la altura máxima del primer pico de compresión (KgF), la

cohesividad que se define como la relación entre las áreas del segundo ciclo de

compresión y la primera (adimensional < 1) y la elasticidad que se calcula como la

diferencia entre la altura máxima de la primera y la segunda compresión (adimensional

> 1) (Figura 1.7 y Tabla 1.1-Capitulo1)

Figura 2.3. Diagrama de la localización del análisis de TPA

realizadas en filetes de lenguado y corvina rubia.

61
 2. Materiales y Métodos

2.2.7.2. Determinación de textura en la vieira patagónica

Para determinar los cambios de textura que tienen lugar en el músculo aductor

de vieira patagónica durante el almacenamiento en frío, se realizaron ensayos de

compresión paralelos al eje de las fibras musculares. La firmeza se determinó

sometiendo a los callos a un porcentaje de compresión del 80%, respecto a la altura

original del músculo (ensayo destructivo), utilizando un sensor cilíndrico de acero

inoxidable de 5 mm de diámetro y a una velocidad de 20 mm/seg (Figura 2.4).

Figura 2.4. Dispositivo utilizado para evaluar la textura de la

vieira patagónica.

El TPA se efectuó mediante una doble compresión de las muestras al 30 % de su

altura inicial Dichas compresiones también fueron realizadas longitudinalmente a las

fibras musculares con un sensor cilíndrico 5 mm de diámetro, a una velocidad de 20

mm/seg y con un tiempo de espera de 30 seg entre compresión y compresión. De la

curva de fuerza-tiempo resultante se determinó: la dureza, cohesividad y elasticidad.

62
 2. Materiales y Métodos

2.2.8. Análisis Microbiológicos

2.2.8.1. Preparación de la muestra

Se realizó una enumeración diferencial de la flora bacteriana superficial del

músculo. Para cada punto de muestreo, 25 g de músculo procedentes de 3 a 6

ejemplares diferentes, fueron transferidos asépticamente a bolsas con filtros (Seward

6141/str, Londres, Inglaterra), y homogeneizados con 225 ml de agua de peptona

(peptona 1 g; NaCl 8.5 g; agua destilada 1000 ml; pH 7.0) en un Stomacher®400

Circulator (Seward Medical, Londres, Inglaterra) (Gram, 1992). Posteriormente se

realizaron diluciones decimales progresivas del homogenato inicial con diluyente estéril

y se sembraron por duplicado en los distintos medios de cultivos.

2.2.8.2. Medios de cultivos

La cuantificación de la flora aeróbica total fue realizada por un método estándar

(FDA, 1998).

Agar para conteo en placa (APC) (Bio-Rad laboratories 64475, Marnes-la-Coquette,

Francia): Triptona 5 g; extracto de levadura 2,5 g; glucosa 1 g; agar-agar 12 g; en 1000

ml de agua destilada; pH 7,0. Se utilizó para el recuento de la flora aerobia total a

distintas temperaturas de incubación (a 35 ºC para el recuento de las bacterias

mesófilas y a 22 ºC para el recuento de las bacterias psicrótrofas).

Agar leche descremada (SKM): peptona de caseína 5 g, extracto de levadura 2,5 g;

glucosa 1 g; solución de leche descremada 100 ml; en 1000 ml de agua destilada; pH

63
 2. Materiales y Métodos

7,0 a 25ºC. Se utilizó para el cultivo y diferenciación de bacterias con actividad

proteolíticas (Atlas, 1993). Estas bacterias dan colonias que aparecen rodeadas de una

zona clara.

Agar peptona hierro (PIA): Agar 15 g; peptona 15 g; proteosa peptona 5 g;

glicerolfosfato de sodio 1 g; citrato amonio férrico 0,5 g; en 1000 ml de agua destilada;

pH 6,7 a 25 ºC. Se utilizó para el cultivo y diferenciación de microorganismos

productores de H2S. Dicho organismos forman colonias de color negro debido a la

precipitación de FeS (Atlas, 1993).

Agar F Modificado (Merck Microbiology, Darmstad Alemania): peptona de caseína 10

g; peptona de carne 10 g; sulfato de magnesio 1,5 g; fosfato tripotásico-3-hidrato 1,8 g;

agar-agar 12 g; glicerina 10 ml, 1000 ml de agua destilada; pH 7,2. Se utilizó para el

cultivo y diferenciación de microorganismos productores de pigmentos

fluorescentes. Las colonias productoras de estos pigmentos fueron detectadas y

contadas bajo luz ultravioleta (lampara UV 366 nm).

Agar violeta rojo y bilis-glucosa (VRBG): Peptona carne 7 g; extracto de levadura 3

g; cloruro de sodio 5 g; glucosa 10 g; mezcla de sales biliares 1,5 g; rojo neutro 0,03 g;

violeta cristal 0.002 g; agar-agar 15 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8. Se utilizó para el

cultivo y diferenciación de enterobacterias totales. Este medio se utilizó sin esterilizar

en autoclave.

Agar violeta rojo y bilis-lactosa (VRBL): Peptona carne 7 g; extracto de levadura 3

g; cloruro de sodio 5 g; lactosa 10 g; mezcla de sales biliares 1,5 g; rojo neutro 0,03 g;

64
 2. Materiales y Métodos

violeta cristal 0,002 g; agar-agar 15 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8. Se utilizó para el

cultivo y diferenciación de coliformes totales. Este medio se utilizó sin esterilizar en

autoclave.

Todos los medios de cultivos utilizados se esterilizaron en autoclave a 121 ºC

durante 15 min. Para la siembra en profundidad en placa de petri, los agares se dejaron

enfriar a 45ºC en baño termostatizado. El APC, SKM, y el agar F se sembraron en

superficie con espátula de vidrio estéril. El agar PIA se sembró en profundidad. y una

vez solidificado se agregó una capa gruesa (overlay) del mismo medio. El APC también

fue sembrado en profundidad. Las placas sembradas se incubaron a 22 ºC durante un

tiempo total de cuatro días, realizándose conteos preliminares a las 48 hs de incubación.

Para el recuento de microorganismos mesófilos se incubaron a 35 ºC durante 48 horas.

Para el recuento de enterobacterias y coliformes totales se incubaron las placas

correspondientes a 35 ºC durante 24 horas.

2.2.8.3. Identificación de microorganismos.

Para la identificación de las bacterias productoras de H2S y de los

microorganismos productores de pigmentos fluorescentes en lenguado y vieira

patagónica, se utilizó un micrométodo estandarizado API 20 NE (BioMérieux, Francia)

que combina 8 test convencionales y 12 test de asimilación para la identificación de

bacilos Gram negativos, no exigentes y no enterobacterias. El perfil obtenido se ingresó

a un programa de cálculo e identificación APILAB-Plus (BioMérieux), el cual provee

la caracterización del microorganismo estudiado, basado en dos índice: Porcentaje de

Identificación (Id) y Indice de Tipificación (t)

65
 2. Materiales y Métodos

2.2.9. Análisis Sensorial

El análisis sensorial fue realizado por panelistas entrenados pertenecientes al

INTI – Mar del Plata (Área Bioquímica). Para el análisis sensorial de las especies en

estudio, se llevaron a cabo dos tipos de sesiones: Sesiones preliminares donde se

discutieron las tablas sensoriales disponibles, el porqué de sus modificaciones y la

necesidad de elaborar un esquemas sensorial específico para cada una de las especies en

estudio, y sesiones de aplicación donde se pusieron en práctica los nuevos esquemas

elaborados.

Para el análisis sensorial del lenguado patagónico y de la corvina rubia

almacenado entero en hielo, se elaboró un esquema Quality Index Method o método del

índice de calidad (QIM) especialmente diseñado para las especies citadas. Los

parámetros analizados con dicho esquema fueron: la apariencia general, los ojos, las

branquias, el abdomen y la carne. La evaluación sensorial en vieira patagónica fue

realizada en los músculos aductores aislados y almacenados a 2–4 ºC por distintos

tiempos de almacenamiento. Los descriptores utilizados (olor, color, textura y aspecto

general) fueron seleccionados según el criterio de Brenmer y Statham (1983). Las

tablas de evaluación sensorial, se presentan en los capítulos de resultados

correspondientes, ya que constituyen un aporte importante para los mismos.

66
 2. Materiales y Métodos

2.3. ANÁLISIS ESTADISTICOS

Las medias y las desviaciones estándares fueron calculadas usando Microsoft

Excel Windows 95–Versión 7 (Microsoft Corp. Redmond, Wash. USA). Los

coeficientes de correlación y análisis de componentes principales fueron realizados

sobre los resultados obtenidos usando (Statistica/MAC.1994). Statistica para Macintos.

Statsoft Inc: Tulsa, OK.

67
3. RESULTADOS
y
DISCUSIÓN
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

3.1 CAMBIOS POSTMORTEM EN LENGUADO (P. patagonicus)

DURANTE EL ALMACENAMIENTO EN HIELO.

3.1.1 Cambios en el contenido de los nucleótidos

Dentro de los cambios bioquímicos postmortem que ocurren en los músculos de

los organismos marinos, la desfosforilación y la desaminación de ATP ha sido

ampliamente estudiada con el propósito de monitorear la frescura y la vida útil de estos

productos. Paralelamente con estas investigaciones, se han desarrollado y perfeccionado

distintos métodos para determinar y cuantificar el ATP y sus productos de degradación.

Estos incluyen procedimientos enzimáticos (Jahns y col.,1976; Ehira y col., 1986;

Karube y col., 1984), ensayos ópticos (Khan y Frey, 1971) y cromatográficos (Ryder,

1985; Iwamoto y col., 1987). Actualmente, la técnica más utilizada es la cromatografía

líquida de alta performance o HPLC (Iwamoto y col., 1987; El-Okki y col., 1988;

Ryder, 1985; Matsumoto y Yamanaka, 1990; Price y col., 1991; Cappeln y col., 1999).

Dicha técnica ha sido utilizada tanto con columnas de intercambio iónico como con

columnas de fase reversa (Hu y col., 1991). En la presente tesis, la separación

cromatográfica fue realizada utilizando una columna de fase reversa según el método

descripto por Ryder (1985). Como se muestra en la Figura 3.1.1, los estándares de ATP

y de sus catabolitos fueron efectivamente separados mediante un gradiente de elusión

(metanol:agua) en 30 min. La curva de calibración obtenida fue lineal en el rango de

trabajo, de 0 a 1,00 nmoles (Tabla 3.1.1), comprobándose además una gran precisión de

los resultados, con coeficientes de variación menores al 5%.

70
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Figura 3.1.1 Cromatograma correspondiente a los patrones de ATP

(adenosin trifosfato), ADP (adenosin difosfato), AMP (adenosin
monofosfato), IMP (inosina monofosfato), HxR (inosina), Hx
(hipoxantina), Xt (xantina), Ade (adenosina) y Ad (adenina).

Los nucleótidos presentes en las muestras fueron identificados comparando los

tiempos de retención y las características de los picos, con estándares comerciales. En la

Figura 3.1.2 A se puede observar un perfil cromatográfico obtenido del extracto

perclórico del músculo de lenguado al inicio del estudio (tiempo 0), donde IMP

constituyó el nucleótidos predominante, detectándose además pequeñas cantidades de

AMP e Hx. En cambio, en el cromatograma perteneciente ejemplares almacenados por

9 días en hielo (Figura 3.1.2 B) se puede observar que los nucleótidos predominantes

son HxR e Hx.

71
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Tabla 3.1.1. Resultados del análisis de regresión de las curvas

de calibración de patrones de nucleótidos.

Coeficiente de
Patrones a b
Regresión
ATP 0,98 10,69 0,85

ADP 0,96 4,51 0,10

AMP 0,97 20,92 3,01

IMP 0,97 23,35 3,70

HxR 0,97 37,41 3,37

Hx 0,98 22,58 4,10

Xt 0,97 8,87 2,34

Ade 0,97 22,62 4,40

Ad 0,99 26,67 0,14

(Ajuste lineal: Concentración (nmoles) = a x respuesta (mm) + b)

Figura 3.1.2. Cromatogramas de los nucleótidos presentes en

músculo de lenguado. A: tiempo 0; B: a 9 días de almacenamiento
en hielo

72
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

En la Figura 3.1.3 se muestran los cambios que ocurren en las concentraciones

de los nucleótidos de adenina y en sus compuestos de degradación durante el

almacenamiento del lenguado patagónico en hielo. A tiempo 0 de almacenamineto el

contenido total de los mismos fue de 12,3 µmoles/g de músculo (peso húmedo).

Valores similares fueron encontrados en pez sierra, Scomberomorus sierra (Pacheco

Aguilar y col., 2002). La concentración inicial de ATP y de sus compuestos de

degradación depende de distintos factores tales como: la especie, el tipo de músculo, el

estado nutricional del pez, y al método de captura (Huss, 1995). Valores iniciales de 9,3

µmoles/g fueron descriptos en seriola (Seriola quinqueradiata) (Murata y Sakaguchi

1986) y en bonito negro (Mazorra-Manzano y col. 2000), mientras que en calamar

gigante (Dosidicus gigas) los valores fueron menores (Pacheco Aguilar y col., 2002).

En el presente estudio no se detecto la presencia de ATP ni de ADP. El AMP

presentó una concentración inicial de 2,3 ± 0,4 µmoles/g. Después de 2 días este valor

descendió significativamente (P < 0,05) a valores cercanos a cero, indicando que la

hidrólisis de ATP a IMP en el lenguado ocurriría durante los dos primeros días de

almacenamiento en hielo. Esto podría deberse, al menos en parte, al método de captura

utilizado (redes de arrastre de fondo) y al tiempo necesario para que los ejemplares de

lenguados en hielo arriben al laboratorio. Se ha informado que la conversión de ATP a

IMP se debe, en gran parte de las especies marinas estudiadas, se completa dentro del

primer día post-captura y se atribuye exclusivamente a la acción de enzimas autolíticas

(Jones 1965; Hiltz y col., 1971; Ólafsdóttir y col., 1997)

73
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

12
AMP IMP HxR Hx
Concentración ( moles/g) 10

0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.3. Cambios en el contenido de adenosína monofosfato

(AMP), inosina monofosfato (IMP), inosina (HxR) e hipoxantina
(Hx) en músculo de lenguado almacenado en hielo. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

A tiempo cero, el IMP fue el nucleótido predominante con una concentración

10,5 ± 0,2 µmoles/g. La misma descendió alrededor de un 60% durante los dos

primeros días de almacenamiento en hielo y luego disminuyó gradualmente hasta un

valor de 1,7 ± 0,5 µmoles/g a los 12 días de almacenamiento. Resultados similares

fueron descriptos para otras especies. Ryder (1984), informó en jurel Trachurus

novaezelandiae un descenso en los valores de IMP de 10,3 µmoles/g a 1,10 µmoles/g

luego de 23 días de almacenamiento en hielo, mientras que en atún (Thunus alalunga)

almacenado en hielo fue informado un descenso progresivo de 10,6 µmoles/g a 4,5

µmoles/g luego de 15 días (Price y col., 1991). Diversos autores han sugerido que el

74
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

contenido de IMP es un buen indicador de frescura, ya que es el principal responsable

del deseable aroma y sabor a pescado fresco (Woyewoda y col., 1986, Huss, 1995).

Un bajo contenido de HxR (0,1 µmol/g) fue observado durante todo el periodo

de almacenamiento. Contrariamente los niveles de Hx se incrementaron

progresivamente hasta el quinto día de almacenamiento. Entre el quinto y el séptimo

día se observó un incremento significativo (P < 0,05), alcanzando un valor máximo de

4,4 ± 0,9 µmoles/g. Posteriormente los niveles de Hx permanecieron sin mayores

cambios. Como se puede observar en la Figura 3.1.3, hay una falta de correspondencia

entre la disminución de los niveles de IMP y los niveles de HxR, que podría

relacionarse con una mayor velocidad de conversión de HxR a Hx que de IMP a HxR

(Greene y col., 1990). Esto resulta sumamente importante en términos de calidad, ya

que la IMP es una sustancia resaltadora del sabor, mientras que la Hx imparte un sabor

amargo, típico del pescado deteriorado (Hughes y Jones, 1966). La formación de Hx en

tejido muscular del pescado post-mortem refleja la fase inicial del deterioro autolítico y

de las alteraciones microbiológicas (Woyewoda y col. 1986). Algunos especies

pesqueras como el salmón (Kim 1986); medregal del Japon, Seriola quinqueradiata

(Murata y Sakaguchi 1986); pargo colorado, Lutjanus sebaes (Williams y col., 1991) y

varias especies tropicales (Bremner y col., 1988; Williams y col., 1991) acumulan HxR.

Mientras que otras especies tales como el carpas (Uchiyama y Ehira 1974), lenguados

(Kassemsarn y col., 1963), abadejo Atlántico (Dingle y Hines 1971), pez sierra

(Williams y col., 1991) y otros acumulan Hx. En función a la variabilidad de

metabolización de HxR a Hx. que presentan las distintas especies pesqueras Ehira y

Uchiyama (1986) clasificaron algunas especies pesqueras en los siguientes grupos:

75
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

- Especies formadoras de inosina (HxR), las que presentan una relación de

HxR/Hx > 5/1: la mayoría de los escombridos, jurel, atún, pez espada, salmon y

varias especies tropicales.

- Especies formadoras de hipoxantina (Hx), las que presentan una relación de

HxR/Hx < 1/5: bonito, peces planos, calamar y otros.

- Especies de tipo intermedias, las que presentan una relación de HxR/Hx entre 5/1

y 1/5: salmón, congrio, corvina común, congrio, calamar y otros

Ehira y Uchiyama, (1986) determinaron que la concentración de Hx presenta

una alta correlación con la perdida de frescura en especies formadoras de Hx, una

moderada relación en especies de tipo intermedia y una muy baja correlación en

especies formadoras de HxR. De acuerdo a lo descripto previamente, los resultados

obtenidos en este estudio indicarían que P. patagonicus es una especie formadora de

Hx. Un alto coeficiente de correlación (r = 0,96) fue obtenido entre la concentración de

Hx y el tiempo de almacenamiento, lo cual indicaría que la Hx podría ser un buen

indicador de frescura para esta especie. Resultados similares informados en otras

especies pesqueras (Jacober y Rand, 1982, Burns y Kee, 1985; Zhang y Lee, 1997).

3.1.2. Cambios en el valor de pH.

Inmediatamente después de la muerte, el músculo de pescado tiene un pH

próximo a la neutralidad (Huss 1995), que puede variar (entre 6,0 y 7,0) por distintos

factores, tales como la especie, el estado nutricional del pez y del estrés sufrido al

momento de la captura. Estos dos últimos aspectos son fundamentales ya que afectan

76
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

los niveles de glucógeno muscular y consecuentemente la acumulación de ácido láctico

que provoca la disminución del pH (Moral, 1987; Church, 1998, Ruíz-Capillas y col.,

2002). El comportamiento del pH en P. Patagonicus se muestra en la Figura 3.1.4.

Inicialmente el pH fue de 6.6 ± 0,08. Este valor permaneció relativamente constante

hasta el sexto día de almacenamiento y posteriormente aumentó significativamente

hasta un pH de 7,0 ± 0,05 a los 9 días. Este incremento puede atribuirse a los distintos

procesos autolíticos y microbiológicos que producen la formación de compuestos

básicos que neutralizan el ácido láctico formado modificando los valores de pH

(Hebard, y col., 1982, Fatima y Qadri, 1985; Ruíz-Capilla y Moral., 2001).

8.0

7.5

7.0
pH

6.5

6.0

5.5

5.0
0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.4. Cambios en el valor de pH de P. patagonicus

almacenados en hielo. Cada punto representa el valor de la
media ± desvío estándar (n=6).

77
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

En este estudio, no se encontraron cambios significativos del pH durante gran

parte del periodo de almacenamiento, por lo que no seria adecuada la utilización de

este parámetro para monitorear cambios de calidad de P. Patagonicus en hielo. Esto

coincide con lo informado en otras especies pesqueras (Ryder y col., 1984; Sakaguchi y

col., 1990; Ruíz-Capilla y Moral, 2001).

3.1.3 Determinación de la actividad de las principales

enzimas involucradas en el catabolismo del ATP (AMP-
deaminasa, adenosina deaminasa y nucleósido fosforilasa)

Como se ha mencionado, la alteración del pescado es el resultado de la acción

combinada de procesos autolíticos (derivados de la actividad enzimática tisular) y de la

actividad metabólica microbiana. Surette y col., (1990) sugirió que la nucleósido

fosforilasa y otras enzimas involucradas en el catabolismo del ATP pueden ser usadas

en análisis rápidos de calidad de distintos productos marinos. Como se observa en la

Figura 3.1.5, la actividad de la AMP-deaminasa muscular aumento, alrededor de un

100%, entre el segundo y el quinto día de almacenamiento en hielo. Esta actividad

enzimática permaneció sin cambios entre el quinto y el séptimo día y posteriormente

descendió. Bajo las condiciones ensayadas, no se detectó actividad de adenosina

deaminasa. Tampoco se detectó adenosina en los extractos musculares (Figura 3.1.3).

Estos resultados indican que la degradación de AMP a HxR en P. patagonicus procede

vía IMP (Figura 1.5- Capitulo 1).

78
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

AMP - deaminasa ( moles / g min.) 1.0 0.025

Nucleosido fosforilasa ( moles /g min)

0.8 0.020

0.6 0.015

0.4 0.010

0.2 0.005

0.0 0.000
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.5. Cambios en la actividad de AMP-deaminasa y

nucleósido fosforilasa muscular de lenguado patagónico durante
el almacenamiento en hielo. Cada punto representa el valor de
la media ± desvío estándar (n=6).

La actividad de la nucleósido fosforilasa en el lenguado fresco fue baja (0.08

µmoles/g min), incrementándose alrededor de un 300% hasta el quinto día de

almacenamiento y posteriormente se mantuvo constante (Figura 3.1.5). Este gran

incremento en la actividad de la nucleósido fosforilasa podría explicar la drástica caída

en los niveles de IMP durante los primeros días de almacenamientos. Surette y col.

(1988) estudiaron la degradación de ATP en bacalao del Atlántico estéril y no estéril,

refrigerado encontrando que la velocidad de formación y descomposición de IMP en

ambos tratamientos, era la misma, y propusieron que la degradación de ATP hasta HxR

se debe fundamentalmente a la acción de enzimas autolíticas. Asimismo observaron

79
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

que la conversión de HxR a Hx se aceleraba en 2 días en muestras no estériles,

sugiriendo que la nucleósida fosforilasa de origen bacteriano desempeña un papel

primordial en la producción de Hx en bacalao refrigerado. Un perfil similar de

degradación de ATP y de sus compuestos relacionados, fue observado en este estudio.

De acuerdo a esto, en P. Patagonicus almacenado en hielo, puede ser postulado que la

degradación post-mortem de ATP hasta HxR ocurre por procesos autolíticos con una

posterior conversión de HxR a Hx podría acelerarse, al menos en parte, por la actividad

metabólica de microorganismos deteriorantes.

3.1.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura

Como se ha mencionado, la determinación del contenido de ATP y sus

productos de degradación presenta una doble ventaja. Por un lado permite evaluar la

pérdida de frescura previa a la proliferación bacteriana (Kassemsarn y col., 1963;

Surette y col., 1988; Huss, 1995); y por otro lado, la Hx que es un metabolito

termoestable puede proporcionar información acerca del pescado fresco, refrigerado y

en conserva (Jacober y Rand 1982; Burns y Kee 1985; Zhang y Lee 1997). Saito y col.

(1959) pusieron a punto una técnica para la determinación cuantitativa de los derivados

del ATP y definieron el valor K como un índice de calidad para los productos

pesqueros. Este índice fue ampliamente aceptado dado que presenta una alta

correlación lineal con el tiempo de almacenamiento a 0 °C en la mayoría de las especies

pesqueras (Price y col., 1991; Willians y col., 1991; Randell y col., 1997; Pacheco

Aguilar y col., 2000). Ehira y Uchiyama (1986) propusieron los siguientes límites para

productos pesqueros, en general: K < 20 % para productos muy frescos, 20%< K

<40% para productos moderadamente fresco, y K > 40 % para pescado no fresco, no

80
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

apto para el consumo humano. Como se observa en la Figura 3.1.6, el valor K mostró

un incremento lineal con el tiempo de almacenamiento, desde un valor inicial de 0%

hasta un valor de 72% a los 12 días de almacenamiento en hielo. El modelo de

regresión lineal para el valor K en P. Patagonicus bajo las condiciones ensayadas fue:

% K = 6,58 x + 3,94 R2 = 0,92 P < 0.05 (con x= días en hielo)

100

80
Valor K (%)

60

40

20

0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.6. Cambios en el valor K en músculo de lenguado

patagónico almacenado en hielo. Cada punto representa el valor
de la media ± desvío estándar (n=6).

De acuerdo a los límites propuestos por Ehira y Uchiyama (1986), P.

patagonicus almacenado en hielo podría considerarse como muy fresco hasta el

segundo día de almacenamiento, moderadamente fresco hasta el séptimo día y de baja

calidad posteriormente.

81
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Como se mencionó anteriormente, la concentración de Hx podría ser utilizada

como un indicador de la pérdida de frescura en el lenguado. Se han propuestos valores

límites de aceptación de Hx para algunas especies marinas, por ejemplo: 2 µmol/g en la

corvina brasileña, 2 - 3 µmol/g en bacalao; 2 - 2,5 µmol/g en arenques, 1 - 1,2 µmol/g

en caballa (Barile y col., 1985) y de 0,5 µmol/g en sardina (Contreras-Guzmán, 2002).

Bajo las condiciones experimentales analizadas, P. patagonicus presentó un valor

máximo de Hx de 3,46 µmoles/g al séptimo día de almacenamiento. Este valor podría

considerarse como límite de aceptación de Hx, ya que coincide con el límite establecido

por el valor K.

3.1.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas

Son numerosas las investigaciones en las que se determina la formación de

aminas biógenas a lo largo del almacenamiento de los organismos marinos con el fin de

determinar índices químicos de calidad o para evaluar el estado higiénico sanitario de

estos productos. Un aspecto importante de las aminas biógenas es su baja volatilidad,

por lo que permanecen en los productos aunque hayan sido sometidos a tratamientos

térmicos y/o deshidratación, lo que es utilizado para determinar la calidad inicial de la

materia prima utilizada. Por otro lado, el interés en la determinación de las poliaminas

se centra en la necesidad de controlar el contenido de algunas de ellas (como la

histamina) ya que se han descripto problemas toxicológicos relacionados con el

consumo de pescado con contenidos elevados de estas sustancias (Mariné-Font y col.,

1995; Lehane y Olley, 2000). El uso de las aminas biógenas como indicadoras del

deterioro ha sido sumamente discutido ya que la producción de aminas depende de

múltiples factores tales como: la flora microbiana, la composición de aminoácidos

82
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

libres, y la temperatura de almacenamiento, entre otros. Sin embargo, desde un punto

de vista práctico, la relativa sencillez y la rapidez con la que se pueden analizar las

aminas biógenas, son aspectos a favor del uso de estas sustancias como índices

objetivos de la frescura.

Distintos métodos han sido desarrollados para determinar y cuantificar las aminas

biógenas presente en los alimentos, estos métodos incluyen procedimientos enzimáticos

(Etienne y Bregeon, 1992), ensayos ópticos por espectrofluorometría (Vidal-Carou y

col., 1990) y diversos métodos cromatográficos (Mietz y Karmas, 1977; Staruszkiewicz

y Bond, 1981; Yen y Hsieh, 1991). Actualmente, los procedimientos más aplicados al

análisis de las aminas biógenas son los ensayos cromatográficos, especialmente por

HPLC. Este método, además de presentar una mayor precisión, exactitud y

especificidad permiten analizar simultáneamente varias aminas. Distintos estudios

indican que la cuantificación de las aminas biógenas debe ser realizados como una

función de diferentes parámetros metodológicos. Dichos parámetros involucran tanto la

determinación de las condiciones óptimas de extracción y derivatización, como la

determinación de la relación ideal entre la matriz y la fase móvil utilizada (Valle y col.,

1996).

En la presente tesis, la determinación y cuantificación de las aminas biógenas se

realizó por HPLC utilizando el método propuesto por Yen y Hsieh (1991). Dicho

método fue seleccionado por contar en nuestro laboratorio con un equipo

cromatográfico con detector UV/VIS. La derivatización fue realizada con cloruro de

benzoílo. Este reactivo ha sido ampliamente utilizado ya que produce compuestos

relativamente estables (Yen y Hsieh, 1991; Hwang y col., 1997). Hwang y col., (1997)

83
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

determinaron que las condiciones de derivatización afectan la cuantificación de las

poliaminas. Dichos autores describieron las condiciones óptimas de la reacción de

derivatización con cloruro de benzoílo, las que incluyen un medio alcalino (pH entre 8

y 10) y una temperatura de 30 ºC durante 40 min. En este estudio, la separación

cromatográfica de los nueve patrones de aminas biógenas se realizó bajo las

condiciones propuestas por Hwang y col., (1997). Como se observa en la Figura 3.1.7,

las poliaminas fueron efectivamente separadas con una muy buena resolución de los

estándares comerciales.

Figura 3.1.7. Cromatograma correspondiente a los derivatizados

benzoilados de los patrones de las aminas biógenas.

84
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Se realizó una curva de calibración, inyectando tres concentraciones diferentes de

los patrones derivatizados. Los coeficientes de regresión lineal que se encontraron para

todos los patrones fueron superiores a 0,95 (Tabla 3.1.2), lo cual indica una evidente

linealidad entre las concentraciones (en el rango de trabajo) de las aminas y la respuesta

del detector. Asimismo se determinó una muy buena reproducibilidad en los distintos

ensayos.

Tabla 3.1.2. Resultados del análisis de regresión de las curvas

de calibración de patrones de aminas biógenas

Patrones Coeficiente de A b
regresión
Putrescina 0.990 63,380 0,232

Cadaverina 0.993 78,436 0,215

Triptamina 0.981 16,913 0,030

2-feniletilamina 0.994 37,604 0,065

Espermina 0.974 118,667 0,055

Espermidina 0.982 46,948 0,261

Histamina 0.956 56,194 0,114

Tiramina 0.999 106,985 0,031

Agmatina 0.989 9,677 0,576

Ajuste lineal: Concentración (mg/100ml de solución) = a x respuesta + b

La evolución de las aminas biógenas durante el almacenamiento de P.

patagonicus en hielo se muestra en la Tabla 3.1.3. Los contenido de aminas biógenas en

pescado fresco (tiempo 0) fueron muy bajos. Espermidina, espermina y triptamina

fueron las únicas poliaminas presentes en estas muestras. El contenido de espermidina

se incrementó durante los dos primeros días de almacenamiento, alcanzando un valor

85
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

de 0,94 mg/100g de músculo, y posteriormente mostró un descenso significativo,

mientras que el contenido de espermina no mostró cambios significativos. Los perfiles

encontrados para ambas aminas fueron similares a lo descripto en otras especies

marinas (Fernandez-Salguero y Mackie, 1987; Ababouch y col., 1991; Veciana-Nogues

y col., 1996; Veciana-Nogues y col., 1997). Esta ampliamente aceptado que los niveles

de espermidina y espermina permanecen sin mayores cambios o disminuyen durante el

almacenamiento, debido a que pueden ser utilizadas por microorganismos como fuente

de nitrógeno (Bardocz, 1995), o pueden sufrir reacciones de desaminación (Halász y

col., 1994). La presencia de las aminas mencionadas en pescado fresco ha sido

relacionada con su función fisiológica, ya que "in vivo" juegan un importante rol en el

crecimiento celular (Ababouch y col., 1991; Bardocz, 1995). A lo largo del

almacenamiento del lenguado, los niveles de triptamina se incrementaron desde un

valor inicial de 3,39 mg/100 g hasta 6,91 mg/100 g. Putrescina y tiramina solo fueron

detectadas al finalizar el periodo de almacenamiento (1,56 y 1,72 mg/100g,

respectivamente). Resultados similares fueron descriptos en atún y en merluza

almacenados en hielo (Veciana-Nogués y col. 1997; Ruíz Capillas y Moral, 2001).

Las aminas biogenas cadaverina, agmatina y β-fenilalanina no se detectaron a lo

largo del periodo analizado. La histamina se detectó a partir del sexto día de

almacenamiento, alcanzando un nivel de 3,60 mg/100g de músculo (36 ppm) y

posteriormente permanecieron sin mayores cambios.

86
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Tabla 3.1.3. Evolución de las aminas biógenas (mg/100 g de

músculo, peso húmedo) y del índice de aminas biógenas (IAB) en
tejido muscular de P. Patagonicus almacenado en hielo

Fresco 2 días 6 días 9 días

Putrescina ND ND ND 1,56 ± 0,63

Triptamina 3,39 ±1,23 5,63 ± 2,00 6,56 ± 1,23 6,91 ± 2,37

Esperminidina 0,06 ±0,02 0,94 ± 0,54 0,16 ± 0,10 0,11 ± 0,08

Espermina 2,51 ± 0,53 2,88 ± 0,61 1,79 ± 1,10 2,04 ± 0,62

Histamina ND ND 3.60 ± 1,83 3,01 ± 0,68

Tiramina ND ND ND 1,72 ± 0,53

IAB 1.22 0.95

ND: No detectado

La FDA (Food and Drug Administration) propuso en 1995 como nivel máximo

de histamina un valor medio de 5 mg/100 g en atún y otros tipos de

pescadosrelacionados con brotes de intoxicación histamínica (FDA, 1995). Mientras

que la Unión Europea (UE) y el Codex Alimentarius (Diario Oficial de las

Comunidades Europeas, 1991) reglamenta, para los pescados de las familias de los

escómbridos y clupeidos, un límite máximo más elevado (10 mg/ 100g de pescado).

Como se describió anteriormente (Tabla 3.1.3), los niveles de histamina observados en

este estudio no superaron los límites establecidos por los organismos internacionales.

Varios investigadores han estudiado la formación de aminas biógenas

conjuntamente con los cambios microbiológicos y organolépticos que suceden durante

los procesos de deterioro del pescado (Mietz y Karmas, 1977; Veciana-Nogués y col.,

1997; Chytiri y col., 2004). Basándose en estos estudios, Mietz y Karmas (1977) fueron

los primeros en sugerir el uso de ciertas aminas biógenas como indicadoras de la

87
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

pérdida de la calidad en el atún enlatado y en otros productos pesqueros. El índice de

aminas biogenas (IAB) fue definido como la relación entre la suma de las

concentraciones de histamina, cadaverina y putrescina (aminas que alcanzan niveles

importantes cuando avanza el deterioro) y la suma de poliaminas fisiológicas, cuyos

contenidos se mantienen constantes o incluso disminuyen a lo largo del

almacenamiento y se han establecido los siguientes límites: 0 ≤ IAB ≤ 0,1 mg/100 g

para productos pesqueros fresco, 0,1 ≤ IAB ≤ 1 mg/100 g para productos pesqueros en

estado inicial de deterioro y IAB >1 mg/ 100 g para productos pesqueros en estado de

descomposición avanzada. Durante este estudio el IAB permaneció en cero durante los

dos primeros días de almacenamiento, alcanzando al sexto día un valor de 1,22 mg/

100g y posteriormente el IAB mostró una tendencia decreciente, debido posiblemente a

la caída del contenido de histamina (Tabla 3.1.3). Según la clasificación descripta, el

lenguado patagónico presentaría un estado de descomposición inicial a partir del sexto

día de almacenamiento en hielo. Además del IAB, algunos autores proponen a partir de

la formación de poliaminas otras formas de monitorear el deterioro y de establecer

niveles a partir de los cuales se pueda considerar que el producto sea o no aceptable.

Stede y Stockemer (1986) propusieron la producción de putrescina y cadaverina para

evaluar el deterioro en gallineta, bacalao y solla. En salmónidos se propuso a la

concentración de cadeverina (Yamanaka y col., 1989), en carpa y trucha al contenido

de putrescina (Krizek y col., 2002; Chytri y col., 2004) y en escómbridos y clupeidos

al contenido de histamina (CEE/493/91, 1991). Sin embargo, el uso de estos índices es

fuertemente discutido, ya que la producción de aminas no solo depende de la presencia

de microorganismos con capacidad para descarboxilar los aminoácidos precursores,

sino que además es necesaria la existencia de condiciones favorables de disponibilidad

88
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

de sustrato y del cofactor de la reacción (piridoxal 5’-fosfato), así como de condiciones

ambientales de pH, actividad de agua y presencia de nutrientes, que favorezcan el

crecimiento bacteriano y la expresión de las enzimas responsables de la

descarboxilación de los aminoácidos precursores (Brink y col., 1990).

3.1.6. Cambios en la características texturales

La textura es uno de los factores más importantes a considerar en la calidad de los

productos pesqueros. Los cambios en la textura que ocurren en el pescado luego de la

muerte se asocian directa o indirectamente a los procesos autolíticos y microbiológicos

que tienen lugar en el tejido muscular (Ingolfsdottir 1997). Factores tales como la

especie, el estado fisiológico y nutricional del pez, el método de captura y el

procesamiento de los ejemplares afectan las características texturales (Love, 1975;

Dunajski, 1979; Botta y col., 1987; Ingolfsdottir y col., 1998).

La textura del músculo de pescado puede ser evaluada tanto por análisis

sensoriales como por métodos instrumentales. En los últimos años con la finalidad de

determinar objetivamente los cambios texturales que se producen durante el

almacenamiento se han desarrollado distintos ensayos instrumentales (destructivos y

no-destructivos). Pruebas que simulan la presión que ejerce con el dedo una persona

durante la realización de un análisis sensorial, han sido desarrollada para determinar la

firmeza en pescado entero (Ginés y col., 2002; Careche y col., 2003) y en filetes

(Borderías y col., 1983; Orban y col., 1996; Careche y col., 2003).

89
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

3.1.6.1 Determinación de textura en pescado entero.

A fin determinar instrumentalmente los cambios en la firmeza del lenguado

patagónico almacenado en hielo, se llevó a cabo un ensayo de punción. La evaluación

de la firmeza en pescado entero es dificultosa debido a la forma y a la heterogeneidad

de la estructura muscular. Sin embargo, en P. Patagonicus esta medida se llevo a cabo

sin inconvenientes ya que se trata de una especie plana. El estudio se realizó

sometiendo a los ejemplares a deformación de 4 mm en dos regiones distintas del lado

ocular del pescado: caudal y central (Figura 2.1 - Capitulo 2).

Los valores de firmeza de la región caudal fueron superiores a los obtenidos en

la región central (Figura 3.1.8). Estos resultados fueron consistentes con los de otras

investigaciones (Chamberlain y col., 1993; Andersen y col., 1997). Morkore y col.

(2002) determinaron la firmeza en cinco regiones distintas de filete de trucha y

encontraron que en la zona caudal y abdominal la firmeza era mayor que en el resto del

filete. Varias investigaciones coinciden que la porción central del mismo es la más

representativa para evaluar las características texturales (Sigurgisladorttir y col., 1999,

Einen y Thomassen 1998, Andersen y col., 1997, Botta 1991). Los mayores valores de

firmeza, en ambas regiones, se observaron al inicio del almacenamiento (Figura 3.1.8).

Al segundo día, los mismos disminuyeron significativamente (P < 0,05) para luego

mantenerse constante en la región central y mostrar una tendencia decreciente en la

región caudal.

90
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

1,0
Región Central

0,8 Región Caudal

Firmeza (KgF)
0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento

Figura 3.1.8. Cambios de la firmeza de lenguado patagónico

durante el almacenamiento en hielo. Cada punto representa el
valor de la media ± desvío estándar (n=6).

3.1.6.2. Determinación de las propiedades texturales de

filete crudo (Análisis de perfil de textura, TPA).

Las propiedades de textura del filete fueron determinadas mediante un análisis de

perfil de textura (TPA) (Bourne, 1978). Como se ha descripto en materiales y métodos,

el análisis de TPA se efectuó sobre la región central de los filetes obtenidos del lado

ocular y del lado ciego del lenguado. Los cambios en la dureza de los filetes obtenidos

a partir de ejemplares de P. Patagonicus almacenados en hielo se muestran en la Figura

3.1.9. En ambos filetes, los perfiles de dureza observados fueron prácticamente

similares. La dureza del filete perteneciente al lado ocular descendió progresivamente

desde un valor inicial de 0,26 ± 0,08 KgF (día 0) hasta 0,14 ± 0,04 KgF al noveno día

de almacenamiento y posteriormente se incrementó. Una alta correlación negativa (r= -

91
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

0,86) fue obtenida entre la firmeza de estos filetes y el tiempo de almacenamiento. El

filete del lado ciego presentó una dureza inicial de 0,20 ± 0,03 KgF. Dicho valor se

incrementó a 0,23 ± 0,05 KgF, sobre el segundo día, luego disminuyó gradualmente

hasta el día 9 de almacenamiento y posteriormente aumentó nuevamente.

0,30
Lado ocular

0,25 Lado ciego

Dureza(Kg.F.)

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.9. Cambios en la dureza de los filetes obtenidos

de P. patagonicus durante el almacenamiento en hielo. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

Diversas investigaciones indican que, luego del estado de rigor-mortis, durante el

almacenamiento en hielo el tejido muscular pierde progresivamente dureza (Azam,

1989; Montero y Borderías, 1990; Ando y col., 1991; Andersen y col., 1997). Esta

perdida es principalmente relacionada con la degradación enzimática de las proteínas

musculares (Dunajsky 1979; Ouali y Talmant, 1990; Papa y col., 1997). Se ha

observado una degradación de las fibras de colágeno del tejido conectivo pericelular, y

se ha demostrado una desorganización de la estructura de la línea Z, de los costameros

92
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

y una separación entre filamentos y bandas I (Astier y col., 1991; Bremner 1992; Ando

y col., 1992; Papa y col., 1996; Montero 1997; Papa y col., 1997; Chéret y col., 2005).

A través de estudios de microscopía electrónica de transmisión, Busconi y col. (1989)

no detectaron cambios en las estructuras de las proteínas contráctiles mayoritarias, pero

observaron una marcada degradación de nebulina.

La cohesividad es un parámetro que determina la atracción entre las moléculas o

las partículas que forman un material. Es una medida adimesional que se define como

la relación del área positiva del segundo ciclo sobre el área del primer ciclo (ver Figura

1.7, Capitulo 1). Como se puede apreciar en la Figura 3.1.10, en ambos filetes la

cohesividad decreció significativamente los dos primeros días de almacenamiento y

posteriormente permaneció constante hasta el final del mismo.

0,8 Lado ocular

Lado ciego
0,7
Cohesividad

0,6

0,5

0,4
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.10. Cambios en la cohesividad de los filetes obtenidos

de lenguado patagónico durante el almacenamiento en hielo. Cada
punto representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

93
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

La elasticidad es la propiedad que tiene un material por la cual recupera su forma y

dimensiones originales parcial o totalmente al cesar el esfuerzo aplicado. Esta

propiedad en los filetes de lenguados obtenidos del lado ciego descendió

significativamente (P < 0,05) los primeros dos días de almacenamiento y

posteriormente permaneció sin cambios significativos (Figura 3.1.11). En los filetes

obtenidos del lado ocular, la elasticidad presentó una ligera caída los primeros cuatro

días de almacenamiento y luego los valores se mantuvieron relativamente estables.

Estudios realizados por Chéret y col., (2005) mostraron en filete de robalo un descenso

significativo de distintos parámetros de textura (dureza, cohesividad, elasticidad,

masticabilidad, gomosidad) durante los primeros 7 días de almacenamiento, y

posteriormente dichos parámetros permanecieron sin cambios.

0,9
Lado ocular

0,8 Lado ciego

Elasticidad (mm)

0,7

0,6

0,5

0,4
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.11. Cambios en la elasticidad de los filetes

obtenidos de lenguado patagónico durante el almacenamiento en hielo.
Cada punto representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

94
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

3.1.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y

el deterioro.

Los cambios de la flora microbiana durante el almacenamiento del lenguado en

hielo se muestran en la Figura 3.1.12. Los mayores recuentos obtenidos

correspondieron a la flora psicrótrofa aerobia total. Este grupo creció una unidad

logarítmica en cada etapa de muestreo, desde un valor inicial de 2 x 105 UFC/g de

músculo hasta un recuento de 1 x 108 UFC/g al noveno día de almacenamiento. El

recuento de microorganismos mesófilos se mantuvo bajo en comparación con los

microorganismos psicrótrofos, aumentando desde un valor de 5 x 103 UFC/g hasta 3 x

105 UFC/g de músculo al final del muestreo. Las diferencias observadas entre los

recuentos de dichos microorganismos son las esperadas para pescados provenientes de

aguas templadas (Shewan, 1977; Huss, 1995). En relación a los recuentos iniciales de

los grupos estudiados, los organismos proteolíticos conformaron el 15% de la flora total

mientras que las bacterias productoras de H2S y las fluorescentes representaron el 1,6 y

0,5%, respectivamente. El grupo proteolítico y las bacterias productoras de H2S

mostraron un elevado crecimiento relativo entre el segundo y el sexto día (con

incrementos de dos unidades logarítmicas en sus recuentos respectivos). Esto indicaría

que el grupo proteolítico y la microflora responsables de la formación de H2S son los

microorganismos deteriorantes más importantes. Al finalizar el almacenamiento las

bacterias proteolíticas representaron el 40% del total de la flora (4 x 107 UFC/g)

mientras que los grupos restantes conformaron un valor menor de 5%. Las

enterobacterias y las bacterias coliformes se mantuvieron por debajo de 1 x 103 UFC/g

durante todo el muestreo y se consideró que su actividad no fue importante en el

deterioro (datos no mostrados).

95
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

8
10

7
10

6
10
UFC/g

5
10

4
10
Bacterias Psicrótrofas Totales
3
10 Bacterias Mesófilas Totales
Bacterias Productoras de H 2S
10
2 Bacterias Proteolíticas
Bacterias fluorescentes
1
10
0 2 4 6 8 10
Tiempo de almacenamiento (días)

3.1.12. Evolución de las bacterias deteriorantes en

músculo P. patagonicus almacenado en hielo. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

Varias investigaciones sostienen que el recuento bacteriano total es el mejor índice

de calidad, por ser éste el principal factor de descomposición del pescado almacenado

en hielo (Shewan, 1977; Gram, 1992, Huss y col. , 1997). De acuerdo con estos autores,

el deterioro es evidente cuando la carga bacteriana total alcanza valores de 106 a 107

UFC/g de músculo. Estos mismos valores fueron establecidos por la Comisión

Internacional de Especificaciones Microbianas para Alimentos (ICMSF, 1978) como

límites máximos recomendados para pescado fresco refrigerado. En el caso del

lenguado patagónico almacenado en hielo estos valores se observaron luego del sexto

día de almacenamiento. No toda la flora presente en el pescado refrigerado puede ser

clasificada como deteriorantes específicos (Gram y col., 1987). Los microorganismos

96
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

proteolíticos no son considerados específicos del deterioro (OED), sin embargo, la

elevada proporción de flora proteolítica presente en el lenguado almacenado podría

sugerir que dicho grupo contribuye al deterioro, principalmente por la formación de

sustratos que posteriormente podrían ser utilizado por los OED (Levin, 1968). Los

microorganismos productores de H2S han sido usualmente considerados como

deteriorantes específicos (Scott y col., 1984). En el lenguado almacenado en hielo

fueron identificado como Shewanella putrefaciens (API 20 NE, Id: 99,5%; t: 0,55)

(Palacios, 2005). Distintos estudios indican que este microorganismo es la especie

formadora de H2S predominante en filetes refrigerados (Levin, 1968; MacDonell y

Colwell, 1985) y se considera deteriorantes específicos debido a que produce

componentes volatiles no deseables tales como (TMA, H2S, CH3SH, (CH3)2S y Hx)

(Lee, 1979: Shewan y Murray, 1979; Gill, 1992; Boskou y Debevere,1997; Hozbor y

col., 2005). De acuerdo con Shewan (1977), Gram (1992), Huss y col., (1997) cuando

el número de microorganismos productores de H2S alcanza valores de 105 UFC/g de

músculo, el deterioro es notorio. En este estudio, se alcanzó dicho valor al sexto día de

almacenamiento en hielo.

Por otro lado, las bacterias fluorescentes presentaron un fuerte incremento después

del sexto día de almacenamiento, pasando de 3 x 104 UFC/g a 3 x 106 UFC/g. Esto

sugiere la posible participación de este grupo en el deterioro del lenguado luego del

sexto día de almacenamiento. Las bacterias fluorescentes fueron identificadas como P.

fluorescens (API 20 NE Id: 86.4%; t: 0,64). Las Pseudomonas spp. tiene un importante

papel en el deterioro en alimentos refrigerados (carne de pescado, pollo, huevos,

productos lácteos, etc.) dado que presenta la capacidad para crecer a bajas temperaturas

97
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

produciendo compuestos volátiles como aldehídos, cetonas y otros compuestos que

originan olores desagradables.

3.1.8. Cambios en las características sensoriales.

Los principales cambios sensoriales que ocurren en P. Patagonicus almacenado

en hielo están relacionados con la apariencia general (Fig. 3.1.13). Los ejemplares

frescos presentaron una pigmentación brillante e iridiscente con mucus transparente

(acuoso) en su superficie. A medida que el pescado se deteriora, la piel se decolora

tornándose opaca (mate) con mucus gris amarillento. Paralelamente se evidenció un

cambio en la consistencia muscular y abdominal.

Los ojos y las branquias también presentaron cambios notorios (Figura 3.1.13). Los

ojos convexos con cornea transparente y pupila negra brillante fueron indicativos de

frescura, mientras que los ojos cóncavos con la cornea opaca y la pupila gris fueron

rasgos típicos de un avanzado estado de deterioro (Figura 3.1.13). Las branquias rojas-

rosadas brillante sin mucus con olor fresco a algas marinas fueron consideradas

características de frescura; mientras que un color marrón-amarillento con mucus espeso

y olor muy desagradables indicaron una gran alteración (Figura 3.1.13). Por otro lado,

la apariencia y el color de la carne mostraron cambios manifiestos, pasando de

presentar un aspecto nacarado y traslucido a marrón opaco en el lenguado deteriorado.

Los parámetros y atributos mencionados fueron incluidos en el esquema QIM

propuesto para el lenguado patagónico (Tabla 3.1.4).

98
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Ejemplares fresco (0 días de almacenamiento) en hielo)

Ç Piel: Brillante e iridiscente,

con mucus transparente acuoso

Ç Ojos: Convexos con cornea

transparente y pupila negra
brillante

Ç Branquias: Rojo-rosado
brillante, mucus translucido

Ejemplares con 7 días de almacenamiento en hielo

Ç Piel: Mate, algo descolorida

Ç Ojos: Cóncavos y pupila gris

Ç Branquias: Descolorida rosa

pálido, con regiones marrones

Ejemplares con 12 días de almacenamiento hielo

Ç Piel: Mate con decoloración

marcada, con mucus amarillento

Ç Ojos: Cóncavos con cornea

lechosa y pupila gris

Ç Branquias: Marrón
amarillenta con mucus abundante

Figura 3.1.13. Evolución de los principales características

externas de P. Patogonicus almacenado en hielo

99
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

El valor máximo asignado por este esquema se estableció en 32. Los cambios en

el QI del lenguado almacenado en hielo se muestran en la Figura 3.1.14. Este índice

mostró un valor inicial de 1 propio de un pescado completamente fresco y llegó a una

puntuación de 26 a los 12 días de almacenamiento debido a cambios evidentes en el

color de la piel, forma y color de los ojos y color y olor de las agallas. En P.

patagonicus almacenado en hielo, el QI aumentó linealmente ajustándose al siguiente

modelo de regresión: QI = 2,05 x + 2.98 R2 =0.96; P < 0.05 (donde x= días en

hielo). Ejemplares de lenguado con valores de QI por encima de 18 fueron

considerados inaceptables por los miembros del panel, dichos valores se alcanzaron al

séptimo día de almacenamiento.

30
QI- (Indice de calidad)

25

20

15

10

0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.1.14. Cambios en el índice de calidad (QI) de P.

patagonicus almacenado en hielo. Cada punto representa el valor
de la media ± desvío estándar (n=6).

100
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Tabla 3.1.4 Esquema de evaluación utilizado para identificar la

calidad P. Patagonicus crudo

Parámetros Características Puntuación

Brillante, iridiscente 0
Piel Brillante con pérdida de la irisación 1
Mate; algo descolorida 2
Apariencia Mate, decoloración marcada 3
general Transparente, acuoso. 0
Mucus Levemente lechoso 1
Opaco 2
Gris; amarillento; con algo de coagulación. 3
Rígido, este punto de demérito es sólo para 0
pescados en el rigor.
Rigidez Firme y elástico 1
Ligeramente blando, menos elástico 2
Consistencia Blando, flácido 3
Firme elástico 0
Pared
Abdominal Blando 1
Reventado 2
Córnea transparente, pupila negra brillante 0
Color Córnea levemente opaca, pupila negra mate 1
Cornea y pupila opaca 2
Ojos Córnea lechosa, pupila gris 3
Convexos (sobresalientes) 0
Forma Planos, 1
Ligeramente cóncavo 2
Totalmente hundidos, 3
Rojo/rosado brillante. 0
Color Rojo/rosado pálido 1
Descolorida, rosa pálido/marrón 2
Marrón, amarillento 3
Fresco, a alga marinas 0
Branquias Olor Neutro 1
Leve a pescado, ácido, algo desagradable 2
Muy desagradable, putrefacto. 3
Mucus traslúcidos 0
Mucus Mucus ligeramente opaco 1
Excesivo mucus amarillento y opaco 2
Nacarado, traslucido 0
Color del
músculo Blanco, lechoso 1
Descolorado, amarillo, marrón, opaco 2
Filetes Se quiebra en lugar de separarse de la carne 0
Adherencia a
la columna Adherida 1
vertebral Ligeramente adherida 2
No adherida 3
Blanco lustroso y brillante, muy adherente 0
Peritoneo Ligeramente opaco, intacto, adherente 1
Desgarrado, se despega fácilmente. 2
Puntuación sensorial total 0-32

101
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

3.1.9. Análisis de relación entre los distintos índices de

frescura determinados

Para determinar la relación entre el tiempo de almacenamientos y los índices

químicos, microbiológicos, sensoriales y texturales de frescura en P. patagonicus

almacenado en hielo, se realizó un análisis de Componentes Principales (ACP). Las

variables seleccionadas para tal fin fueron: la concentración de AMP, IMP y de Hx, pH,

el valor K, el índice sensorial de calidad (QI), las bacterias psicrótrofas totales y las

productoras de H2S, la textura del pescado entero (firmeza) y la dureza del filete.

Mediante el ACP se transformaron las variables citadas en otras variables

intercorrelacionadas, de media cero y varianza 1. Estas nuevas variables que pueden

escribirse como combinación lineal de las primeras se denominan componentes

principales, las cuales pueden ordenarse por la magnitud de su varianza. El porcentaje

de varianza total asociada al primer componente principal (CP1) fue del 80%

(porcentaje adecuado para explicar correctamente la variabilidad del conjunto de datos),

mientras que la segunda componente principal (CP2) explicó un 12% de la variabilidad

total del conjunto de datos.

En la Figura 3.1.15 se muestra una representación gráfica de las variables sobre el

plano formados por la 1ra. y la 2da. CP. Se puede observar que las variables, contenido

de IMP y de Hx, el valor K, el índice sensorial QI, las bacterias psicrótrofas, la firmeza

del pescado entero y la dureza del filete se correlacionaron muy bien con la 1ra CP,

contribuyendo casi exclusivamente a su conformación. La CP 2 esta asociada

principalmente a el pH y a la concentración de AMP y en menor medida al nivel de

IMP y los recuentos bacterianos. Las variables estuvieron fuertemente relacionadas

102
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

entre sí. El contenido de AMP e IMP y los parámetros texturales mostraron una

correlación inversa con las demás variables analizadas. Esto indica, que a medida que

transcurre el tiempo de almacenamiento hay una disminución del contenido de AMP e

IMP y una acumulación de Hx, un aumento en el valor K, en el índice sensorial QI y en

los recuentos bacterianos. En cuanto a las características texturales hay una

disminución de la firmeza del pescado y de la dureza del filete. La CP 1 podría ser

interpretada como “deterioro”; así las variables ubicadas en el cuadrante I serian

indicadoras de deterioro mientras las que se encuentran que en el cuadrante II serian

parámetros de frescura

Figura 3.1.15 Correlación entre los distintos índices químicos, físicos

microbiológicos y sensoriales utilizados para monitorear la frescura en
P. patagonicus

103
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

3.1.10. Conclusiones parciales

Ç P. patagonicus es una especie formadora de Hx. El contenido de Hx resultó

adecuado para monitorear los cambios de frescura durante el almacenamiento. Presentó

una relación lineal con una alta correlación con el tiempo de almacenamiento, y mostró

una muy buena correlación con los otros índices de frescura evaluados.

Ç En extracto muscular de lenguado patagónico se observó una alta actividad de la

AMP-deaminasa,, y no se detectó actividad de adenosina deaminasa, sugiriendo que la

degradación de ATP ocurre vía AMP-deaminasa. La actividad de la nucleósido

fosforilasa aumentó significativamente luego del segundo día de almacenamiento, lo

cual indicaría un papel primordial de los microorganismos en el deterioro.

Ç El pH no resultó un parámetro útil para monitorear cambios de calidad de P.

patagonicus, ya que no mostró cambios durante la mayor parte del almacenamiento.

Ç El valor K mostró un incremento lineal con el tiempo de almacenamiento. De

acuerdo a los límites propuestos por distintos autores, P. patagonicus almacenado en

hielo podría considerarse como muy fresco hasta el segundo día de almacenamiento,

aceptable hasta el séptimo día y posteriormente no apto para el consumo humano.

Ç Las aminas biógenas no son adecuadas como indicadoras del grado de frescura, ya

que durante el almacenamiento presentaron un perfil muy irregular. Los niveles de

histamina observados en este estudio no superaron los límites establecidos por las

normas fijadas por los organismos internacionales.

104
 3. Resultados y Discusión– Lenguado

Ç La firmeza del pescado entero y la dureza del filete decrecieron a lo largo del

almacenamiento. Mientras que la cohesividad y la elasticidad disminuyeron los

primeros días de almacenamiento y posteriormente no mostraron cambios

significativos.

Ç Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron

durante el almacenamiento de P. patagonicus en hielo, siendo la flora proteolítica el

grupo deteriorante predominante. Los valores establecidos por ICMSF como límites

máximos recomendados para pescado fresco refrigerado se alcanzaron luego del sexto

día de almacenamiento.

Ç El esquema sensorial (QIM) desarrollado para la evaluación de P, patagonicus

almacenado en hielo resultó adecuado para evaluar su frescura. El índice sensorial QI

presentó una relación lineal con una alta correlación con el tiempo de almacenamiento

y mostró además una buena correlación con los otros índices de frescura evaluados. Los

miembros del panel sensorial consideraron inaceptable al lenguado patagonico luego

del séptimo día de almacenamiento.

Ç De acuerdo a los índices de frescura evaluados P. Patagonicus almacenado en

hielo presentaría una vida útil comercial en hielo de 7 días.

105
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2 CAMBIOS POSTMORTEM EN CORVINA RUBIA (M. FURNIERI)

DURANTE EL ALMACENAMIENTO EN HIELO.

3.2.1. Cambios en el contenido de nucleótidos

Como se ha mencionado previamente, el catabolismo del ATP procede de la

misma manera en la mayoría de las especies pesqueras, pero la velocidad de

degradación varia considerablemente con la especie (Uchiyama y Ehira, 1974; Ryder,

1985; Bremner y col., 1988), con el tipo de músculo (Obatake y col., 1988), con las

condiciones nutricionales de los ejemplares y con el estadio gonadal (De Vido de

Mattio y col., 1992; Sagedhal y col., 1997) y con las condiciones de captura y

almacenamiento (Uchiyama y Ehira, 1974; Surette y col., 1988).

En la presente tesis, se investigó el efecto del estadío gonadal de la corvina rubia

(M. Furnieri), sobre la degradación del ATP. A tiempo 0 de almacenamiento no se

detectó la presencia de nucleótidos de adenina (ATP, ADP, AMP) por lo que se puede

inferir que la hidrólisis de ATP a IMP fue completa en los primeros dos días post-

captura, tanto en individuos de predesove como de posdesove (Figura 3.2.1) Estos

resultados son similares a los descriptos en una gran variedad de especies pesqueras

(Murata y Sakaguchi, 1986; Haard, 1992; Olasfsdottir y col., 1997). Pacheco Aguilar y

col. (2002) determinaron en distintos pescados (sardina, cochito, barrilete y sierra) una

importante degradación de nucleótidos de adenina con una concomitante acumulación

de IMP en las primeras 12 hs post-captura.

107
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

En la Figura 3.2.1 se muestran los cambios en el contenido de IMP, HxR e Hx

del músculo de corvina rubia en predesove y postdesove almacenadas en hielo. La

concentración de IMP fue baja durante todo el periodo de almacenamiento, sin

encontrarse diferencias significativas entre ambos estadios gónadales. Los contenidos

iniciales de IMP en ejemplares de pre y posdesove fueron de 0,12 ± 0,06 µmoles/g y

0,19 ± 0,03 µmoles/g, respectivamente; ambos valores mostraron una tendencia

decreciente durante los dos primeros días de almacenamiento y posteriormente se

mantuvieron sin mayores cambios.

IMP IMP
3 HxR HxR
Hx Hx
Concentración (µmoles/g)

0
0 2 5 9

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.1. Cambios en el contenido, IMP, HxR e Hx en corvinas

en pre y posdesove almacenadas en hielo. Cada punto representa el
valor de la media ± desvío estándar (n=6).

108
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Distintas investigaciones indican que el grado de descomposición del IMP

depende de la especie y de las condiciones de almacenamiento (Contreras-Guzmán

2002; Pacheco Aguilar y col., 2002). En ejemplares de sardina (Sardinella aurita),

almacenada en hielo, el IMP se degrada rápidamente (Okuma y col., 1992), mientras

que en merluza (Macruronus novaezelandiae), la degradación del IMP es muy lenta y a

los 25 días de almacenamiento, todavía representa un 39% de IMP en relación al total

de nucleótidos (Ryder y col., 1993). La diferencia observada en la velocidad de

degradacion del IMP en sardina y merluza puede ser debida a una diferencia en la

actividad de la 5´nucleotidasa. Dicha enzima presenta actividad optima a pH cercanos a

la neutralidad por lo que en pescados con músculos ácidos, tales como el pez sierra

(Scomberomorus cavalla), pez espada (Xiphias gladius) y merluza la conversión de

IMP a HxR es paulatina (Contreras-Guzman, 2002).

La HxR es el catabolito predominante en músculo de corvina de ambos estadios

gonadales. La concentración inicial de este metabólito fue de 1,12 ± 0,26 µmoles/g en

corvinas de predesove y de 1,25 ± 0,34 µmoles/g en ejemplares de postdesove. Dichos

valores se incrementaron alrededor de un 100% durante los dos primeros días de

almacenamiento. Posteriormente, la formación de HxR fue significativamente diferente

(P<0.05) en corvinas de pre y postdesove Los ejemplares en predesove presentaron un

incremento significativo hasta el quinto día de almacenamiento y luego una leve caída

hasta el final del mismo, mientras que los individuos en postdesove mantuvieron los

valores alcanzados al segundo día sin grandes variaciones hasta finalizar el

almacenamiento.

109
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Los perfiles de acumulación de Hx en M. furnieri en predesove y posdesove

fueron similares (Figura 3.2.1). Los valores iniciales de Hx fueron de 0,33 ± 0,06

µmoles/g y 0,35 ± 0,02 µmoles/g en ejemplares en pre y posdesove, respectivamente.

Estos aumentaron linealmente con el tiempo de almacenamiento, alcanzando valores de

1,58 ± 0,03 µmoles/g y 1,44 ± 0,05 µmoles/g en individuos de predesove y posdesove,

respectivamente. El modelo de regresión lineal fue para la corvina rubia en predesove

Hx = 0,12x + 0,40, r2 = 0,94 P < 0.05; y para ejemplares en posdesove fue: Hx = 0,17x

+ 0,28 r2 = 0,97, P < 0.05 (con x = días de almacenamiento en hielo). La alta

correlación entre la formación de Hx y el tiempo de almacenamiento sugiere que la Hx

podría ser un buen indicador de frescura para esta especie almacenada en hielo.

Como ya fue mencionado, en la ultima etapa de la degradación de nucleótidos

participan tanto enzimas autolíticas como enzimas de origen microbiana. Es por ello

que la metabolización de la HxR a Hx presenta gran variabilidad, entre las especies. En

función de la variabilidad, Ehira y Uchiyama (1986) clasificaron a los peces en especies

formadoras de HxR, cuando acumulan HxR debido a la baja actividad de las enzimas

que catalizan la transformación a Hx; especies formadoras de Hx; y en especies de tipo

intermedio (ver sección 3.1.1). Los resultados descriptos muestran que M. furnieri

podría ser considerada una especie de tipo intermedia, ya que presenta una gran

acumulación de HxR e Hx.

110
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.2. Cambios en el valor de pH

Como se ha mencionado, el pH post-mortem puede variar entre 6,0 y 7,0 y esa

variación depende entre otras cosas de la especie, del estado fisiológico de los

ejemplares, de la composición del músculo, de la capacidad buffer de las proteínas

musculares, etc. (Moral, 1987; Church, 1998). A lo largo del almacenamiento el pH

presentó un leve aumento desde un valor inicial de 6,28 ± 0.06 hasta un pH final de

6,48 ± 0.01 (Figura 3.2.2).

7.0

6.5
pH

6.0

5.5

5.0
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.2. Cambios en el pH muscular de la corvina rubia

almacenada en hielo. Cada punto representa el valor de la media ±
desvío estándar (n=6).

111
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Como ya se ha mencionado, este aumento se asocia a la acumulación de

metabólitos alcalinos originados durante el deterioro bacteriano (Hebard y col., 1982;

Fatima y Qadri, 1985) Es importante observar que al igual a lo descripto en distintas

especies marinas (Ryder y col., 1984; Sakaguchi, 1990), el pH no resultó un indicador

adecuado para determinar la frescura de la corvina rubia.

3.2.3. Determinación de la actividad de las principales

enzimas involucradas en el catabolismo del ATP (AMP-

deaminasa, adenosina deaminasa y nucleósido fosforilasa)

La actividad de la AMP-deaminasa en corvina rubia almacenada en hielo

mostró un incremento significativo desde un valor inicial de 0,62 µmoles/g min. hasta

un valor de 0,92 µmoles/g min. durante los dos primeros días de almacenamiento.

Posteriormente la actividad se mantuvo relativamente constante (Figura 3.2.3). Bajo las

condiciones ensayadas, no se detectó actividad de adenosina deaminasa. Estos

resultados que fueron consecuentes con lo descripto precedentemente en esta tesis para

lenguado patagónico y en otras especies de peces (Zielke y Suelter, 1971; Fijisawa y

Yoshino, 1987) indican que la degradación de AMP a HxR en corvina rubia procede

vía IMP.

La actividad de la nucleósido fosforilasa en M. furnieri fue de 0,05 µmoles/g

min. al inicio del almacenamiento; aumentó significativamente hasta el séptimo día

alcanzando una actividad de 0,014 µmoles/g min. y luego permaneció sin cambios

significativos (Figura 3.2.3). En corvina rubia la actividad de esta enzima fue inferior a

la descripta para lenguado patagonico (ver sección 3.1.3). Esto coincide con el hecho de

112
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

que M. furnieri presente a lo largo del almacenamiento a la HxR como nucleótido

predominante, mientras que en el lenguado patagónico es la Hx. Surette y col. (1988)

propusieron que la degradación de la HxR a Hx se debe a la acción de enzimas

autolíticas y de microorganismos deteriorantes (Shewanella putrefaciens,

Photobacterium phosphoreum, principalmente), siendo estas ultimas las que desempeña

un papel fundamental en la producción de Hx en pescados refrigerados.

0.025
1.0
AMP deaminasa (µmoles / g min.)

Nucleosido fosforilasa (µmoles / g min.)

0.020
0.8

0.6 0.015

0.4 0.010

0.2 0.005

0.0 0.000
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.3. Cambios en la actividad de AMP-deaminasa y de la

nucleósido fosforilasa muscular durante el almacenamiento de
la corvina rubia en hielo. Cada punto representa el valor de
la media ± desvío estándar (n=6).

113
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.4. Valor K y otros índices químicos para evaluar la

frescura

Ya se ha mencionado que el grado de degradación de los derivados

nucleotidicos es un buen indicador del tiempo de captura y de la calidad de los

productos marinos (Church, 1988; Ehira y Uchiyama, 1986; Murata y Sakaguchi,

1986). El valor K definido como la relación entre los compuestos de degradación de

ATP no-desfosforilado y el contenido total de ATP y de sus productos de degradación

ha sido usado ampliamente como una medida de frescura (Ehira y Uchiyama, 1986;

Perez-Villareal y Pozo 1990; Lin y Morrssey, 1994; Vazquez y col., 1997). En este

estudio no se comprobó la presencia de ATP, ADP ni AMP, por lo que se determinó

como índice de calidad el valor K’, propuesto por Karube y col. (1984). En la Figura

3.2.4 se observa que el valor K’ presentó valores superiores a 90% durante todo el

periodo de almacenamiento; debido a una gran acumulación inicial de HxR e Hx

(Williams y col., 1991; Loung, y col., 1992; Pacheco Aguilar y col., 2002). Estos

resultados indican que el valor K´ no puede ser considerado como un índice confiable

de frescura para la corvina rubia almacenada en hielo. Resultados similares fueron

encontrados en otras especies marinas, tales como bacalao, salmón y truchas

almacenadas en hielo y a 20ºC (Ehira y Uchiyama, 1973; Williams y col., 1991; Loung

y col., 1992). Loung y col. (1992) propusieron como índice de calidad para estas

especies, al valor H definido como:

[Hx]
H (%) = x 100
[IMP] + [HxR]+ [Hx]

114
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

100
Posdesove
100
Valor K´ (%)

Predesove
75

Valor H (%)
75

50
Predesove

50

Posdesove
25
25

0 0
0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.4. Cambios en el valor K’ y en el valor H en músculo de

corvina rubia de pre y posdesove almacenados en hielo. Cada punto
representa la media de seis determinaciones, desviación estándar
relativa < 3%

Como se observa en la Figura 3.2.4, el valor H aumento linealmente, desde un

valor inicial de 22% en ambos estadios gonadales hasta un valor final de 44,42% y

51,55% en ejemplares de predesove y posdesove, respectivamente (Figura 3.2.4). El

modelo de regresión lineal para el valor H en corvina rubia en predesove fue: H (%) =

2,59x + 20,586 r2 = 0.95; P < 0.05; y para ejemplares en posdesove fue: H (%) =

3,43x + 21,46 r2 = 0.98; P < 0.05, (con x = días de almacenamiento en hielo). Al igual

que en otras especies marinas, en M. furnieri el valor H resultó mas adecuado como

índice de calidad que el valor K’ (Loung y col., 1992; Burns y col., 1985), indicando

claramente que la utilización de los distintos índices de frescura debe verificarse y/o

adaptarse a la especie en estudio.

115
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.5. Cambios en el contenido de aminas biógenas

Como se puede apreciar en la Tabla 3.2.1, al comienzo del almacenamiento los

contenidos de espermina y espermidina presentes en el músculo de corvina rubia fueron

0,07 y 0,25 mg/100g, respectivamente. Posteriormente, los niveles de espermidina

mostraron un incremento hasta el quinto día de almacenamiento y luego no fue

detectada; mientras que la espermina permaneció constante los primeros dos días y

posteriormente no fue detectada.

Tabla 3.2.1. Cambios en el contenido de amimas biógenas durante

el almacenamiento en hielo de M. furnieri (mg/100 g de músculo)

Fresco 2 días 5 días 9 días

Putrescina 0,18 ±0,12 0,25 ±0,09 0,36 ±0,36 0.48 ±0,27

Cadaverina ND ND ND ND

Triptamina ND ND ND ND

2-feniletilamina ND ND ND ND

Espermidina 0,25 ±0,12 0.36 ±0,08 0,44 ±0,10 ND

Espermina 0,07 ±0,05 0.09 ±0,03 ND ND

Histamina ND ND ND ND

Tiramina ND ND ND 0,34 ±0,12

Agmatina ND ND ND ND
ND: No detectado

La concentración de putrescina aumentó a lo largo del almacenamiento desde un

valor inicial de 0,18 mg/100 g (tiempo 0) hasta un valor máximo de 0,48 mg/100 g al

octavo día en hielo (Tabla 3.2.1). Resultados similares fueron observados en sardinas

almacenadas a 8ºC (Ababouch y col., 1991). En este trabajo, la tiramina solo fue

116
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

detectada al final del ensayo. Bajo las condiciones experimentales de este estudio, no se

detectaron agmatina, histamina, 2-fenilalamina ni tripramina. La cadaverina se presentó

en algunos ejemplares de corvina rubia pero no siguió un perfil característico. Distintas

investigaciones describen una gran variabilidad en la cantidad y el tipo de aminas

biógenas formada a los largo del almacenamiento en ejemplares de una misma especie

(Eitenmiller y col., 1982; Ababouch y col., 1991; Gloria y col., 1999). Dichas

variaciones se asocian a numerosos factores tales como, la flora bacteriana, la

composición de aminoácidos libres, el estado fisiológico, las condiciones de captura, la

temperatura y el tiempo de almacenamiento (Cahill, 1990; Ababouch y col., 1991;

Veciana Nogues, y col 1997; Gloria y col., 1999).

En el presente estudio se evidenció una relación entre la formación de

putrescina y el tiempo de almacenamiento en hielo de la corvina rubia. Esto sugiere

que la putrescina puede ser un indicador adecuado del grado de frescura o de la calidad

higiénico-sanitaria en la corvina rubia. Resultados similares fueron encontrados en

carpa por Krízek y col., (2002), y en trucha por Chytiri y col., (2004). Sin embargo,

debido a la gran variabilidad que se observó las determinaciones de las aminas en los

distintos ejemplares y muestreos realizados, podría resultar prematuro proponer a la

putrescina como índice de frescura en corvina.

117
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.6. Cambios en las características texturales

La textura es una de las propiedades de los alimentos más apreciadas por el

consumidor (Botta, 1991; Huss, 1995; Hyldig y Nielsen, 2001). Esta propiedad es

muy importante en productos de origen marino, ya sea crudo o cocido. El músculo que

es la porción comestible del pescado contiene dos fracciones proteicas mayoritarias: las

proteínas miofibrilares y las del tejido conectivo. Variaciones en el contenido y las

propiedades de los componentes de ambas fracciones musculares afectan las

propiedades de textura. Distintos factores influyen sobre la textura, dentro de los cuales

podemos citar: la especie, la edad, el tamaño, el estado nutricional de pez, y la madurez

sexual, entre otros (Reid y Durance, 1992; Andersen y col., 1997, Hyldig y Nielsen,

2001). Por otro lado, factores postmortem como la glucólisis, el pH y el desarrollo del

rigor-mortis y la temperatura de almacenamiento y cocción también influyen sobre la

textura (Dunajski 1979, Johnston 1999; Hyldig y Nielsen, 2001).

3.2.6.1 Determinación de textura en pescado entero.

Los valores de firmeza de la región caudal fueron superiores a los obtenidos en

la región central (Figura 3.2.5). Estos resultados fueron consistentes con los resultados

descriptos en la presente tesis para P. patagonicus y en otras especies pesqueras

(Andersen y col., 1997; Chamberlain y col., 1993). Varias investigaciones coinciden

que la región central del pescado es la más representativa para evaluar las

características texturales (Sigurgisladorttir y col., 1999, Einen y Thomassen 1998,

Andersen y col., 1997, Botta 1991). Los cambios en la firmeza de la región central y

caudal de la corvina rubia entera almacenada en hielo se muestran en la Figura 3.2.5.

118
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

En ambas regiones los mayores valores de firmeza se obtuvieron al inicio del

almacenamiento. En la región central el valor inicial de 0, 65 ± 0,02 KgF descendió

significativamente (P < 0,05) el primer día de almacenamiento y posteriormente

permaneció relativamente constante hasta el quinto día, a partir del cual mostró una

nueva una tendencia decreciente de la firmeza. En la región caudal, se observó una

fuerte caída de la firmeza hasta el séptimo día de almacenamiento y posteriormente

permaneció sin cambios significativos. Estos resultados coinciden con lo observado en

P. patagonicus (ver sección 3.1.6.1) y lo descripto en Sparus auratus por Ginés y col.

(2002).

1,0 Región central

Región caudal
0,8
Firmeza (KgF)

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.5. Cambios en la firmeza de la corvina rubia

almacenada en frío. Cada punto representa el valor de la media ±
desvío estándar (n=6).

119
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.6.2. Determinación de las propiedades texturales de

filete crudo (Análisis de perfil de textura, TPA).

Las propiedades de textura del filete fueron determinadas mediante un análisis de

perfil de textura (TPA) (Bourne, 1978), según lo descripto previamente en materiales y

métodos. La dureza del filete descendió significativamente el primer día de

almacenamiento y posteriormente permaneció sin grandes cambios (Figura 3.2.6).

1,0

0,8
Dureza (kgF)

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.6. Cambios en la dureza del filete de corvina

rubia almacenada en hielo. Cada punto representa el valor de la
media ± desvío estándar (n=6).

El músculo de pescado generalmente se ablanda durante el almacenamiento en

hielo (Sato y col., 1991; Færgemand y col., 1995; Ando y col., 1991). Esta perdida ha

sido atribuida principalmente a la degradación enzimática de las proteínas del colágeno

y de las proteínas miofibrilares (Dunajsky 1979; Ando y col., 1992). Ando y col.,

(1992) asociaron la perdida de dureza en trucha arco iris almacenada en hielo a una

120
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

desintegración en las fibras de colágeno. Sato y col., (1991) observaron en esta misma

especie un aumento de la solubilidad del colágeno y demostraron que la diferencia de

dureza observada en tres especies marinas, estaban relacionadas con la densidad y el

arreglo de las fibras del tejido conectivo (Hatae y col., 1986). Sin embargo estudios más

recientes indican que la degradación de las proteínas del citoesqueleto es la principal

responsable del tiernizado del pescado (Bremner 1992; Ando 1997; Montero 1997;

Chéret y col., 2005). Otro importante evento que afectan la dureza de la carne de

pescado durante el almacenamiento es el crecimiento de microorganismos

deteriorantes. En el presente estudio se observó que los valores de dureza en la corvina

rubia durante todo el ensayo resultaron superiores a lo detectado en lenguado

patagónico.

La cohesividad del músculo en corvina rubia almacenada en hielo (Figura 3.2.7)

permaneció relativamente constante hasta el noveno día y posteriormente mostró una

tendencia decreciente. En cambio, la elasticidad (Figura 3.2.8) presentó una caída

significativa al primer día de almacenamiento y posteriormente permaneció

relativamente constante. Estos resultados fueron consistentes con los descripto

anteriormente para lenguado patagónico almacenado en hielo.

121
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

1,0

0,8
Cohesividad

0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.7. Cambios en la cohesividad del filete de corvina

rubia almacenada en hielo. Cada punto representa el valor de
la media ± desvío estándar (n=6).

1,0

0,9
Elasticidad

0,8

0,7

0,6

0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.8. Cambios en la elasticidad del filete de la

corvina rubia almacenada en hielo. Cada punto representa el
valor de la media ± desvío estándar (n=6).

122
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.7. Cambio en la microflora durante el almacenamiento y

el deterioro.

Los resultados del análisis microbiológico de la corvina rubia almacenada en hielo

se muestran en la Figura 3.2.9. El recuento de la flora aerobia psicrótrofa fue de 2,5 x

104 UFC/g al inicio de la conservación y alcanzó un valor de 1 x 108 UFC/g a los 9 días

de almacenamiento. Por otra parte, el recuento de bacterias aerobias mesófilas, que al

comienzo del ensayo presentó un valor <103 UFC/g, se incremento lentamente hasta el

séptimo día y posteriormente experimento un importante aumento hasta llegar a 9,3 x

104 UFC/g de músculo. La diferencia observada entre los recuentos de la flora

psicrótrofa y la mesófila fue similar a la que se presentaron en lenguado patagonico

(sección 3.1.7) y en otros pescados provenientes de aguas templadas (Shewan, 1977)

Durante el presente estudio, se observó que los microorganismos productores

de H2S crecieron significativamente desde un valor < 103 UFC/g hasta un recuento de

1,2 x 106 UFC/g, valor que constituyó una pequeña porción de la microflora psicrótrofa

total (<2%). Las bacterias con actividad proteolítica evidenciaron un patrón de

crecimiento muy similar a las bacterias formadoras de H2S. Por su parte,

microorganismos productores de pigmentos fluorescentes aumentaron desde recuentos

iniciales < 103 UFC/g hasta 6,0 x 105 UFC/g al termino del ensayo. En cuanto al resto

de la flora analizada las enterobacterias y los microorganismos coliformes se

mantuvieron por debajo de 1x103 UFC/g durante todo el periodo en estudio (datos no

mostrados).

123
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

8
10

7
10

6
10
UFC/g

5
10

4
10

3
10
Bacterias Psicrótrofas Totales
2
10 Bacterias Mesófilas Totales
Bacterias Productoras de H2S
1 Bacterias Proteolíticas
10
Bacterias Fluorescentes

0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.9. Evolución de las bacterias deteriorantes en músculo

corvina rubia almacenada en hielo. Cada punto representa la media de
seis determinaciones, desviación estándar relativa < 3%

Para el caso de la corvina rubia almacenada en hielo los valores límites

establecidos por ICMSF (1978) como máximos recomendados para pescado fresco

refrigerado (106-107 UFC/g), se alcanzaron al quinto día de almacenamiento. Como se

ha mencionado, las bacterias productoras H2S han sido estudiadas como un índice de

deterioro en pescado (Scott y Nealson., 1984). Shewan (1977), Gram (1992), Huss y

col., (1997) establecieron que cuando este grupo alcanza valores de 105 UFC/g de

músculo, el deterioro en el pescado almacenado es importante. En este estudio, este

valor se alcanzó entre el séptimo y el noveno día de almacenamiento en hielo. El hecho

de que no coincidan los días en que se alcanzan ambos límites podría relacionarse con

que la corvina rubia es capturada en aguas costeras que presentan, generalmente,

mayores niveles de microorganismos no deteriorantes.

124
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.8. Cambios en las características sensoriales.

Los principales cambios sensoriales que ocurren en la corvina rubia almacenada

en hielo están relacionados principalmente con la apariencia general (Fig. 3.2.10). Los

ejemplares frescos presentaron: una pigmentación brillante e iridiscente, ojos convexos

con cornea transparente y una pupila negra brillante, y branquias rojo-sangre brillante

con olor fresco algas marinas. La corvina rubia en estado avanzado de deterioro se

caracteriza por una piel opaca con mucus gris amarillento especialmente alrededor de

las agallas, ojos cóncavos con la cornea opaca y la pupila, y las branquias son de color

marrón-grisaseo con mucus espeso y un olor fuertemente desagradables (Figura 3.2.10).

La apariencia y el color de la carne mostraron cambios manifiestos, pasando de

presentar un aspecto nacarado y traslucido en ejemplares frescos, a marrón opaco en

pescado deteriorado (Figura 3.2.11). Los cambios en los atributos mencionados a lo

largo del almacenamiento fueron de fundamental importancia para desarrollar el

esquema QIM especifico para la corvina rubia (Tabla 3.2.2). El índice de calidad (QI)

máximo asignada por este esquema se estableció en 29. Los cambios en el QI de la

corvina rubia almacenada en hielo se muestran en la Figura 3.2.12. Este índice mostró

un valor inicial de 1 propio de un pescado completamente fresco y llegó a una

puntuación de 23 a los 12 días de almacenamiento en hielo, donde los ejemplares

evaluados mostraron signos indiscutibles de deterioro en todas las características

evaluadas. El QI en la corvina rubia almacenado en hielo aumentó linealmente, siendo

el modelo de regresión: QI = 1.736 x + 0.84 R2 =0.98 P < 0.05 (con x = días en

hielo). Ejemplares de M. furnieri con un QI por encima de 12 fueron considerados

inaceptables por los miembros del panel. Dicho valor se obtuvo luego del quinto día de

almacenamiento en hielo.

125
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Ejemplares fresco (0 días de almacenamiento)

Ç Piel: Brillante e iridiscente, con

mucus transparente acuoso

Ç Ojos: Convexos con cornea

transparente y pupila negra brillante

Ç Branquias: Rojo sangre

brillante, con escaso mucus

Ejemplares con 5 días de almacenamiento en hielo

Ç Piel: Pigmentación mate;

decolorada

Ç Ojos: Planos, con córnea

opaca, pupila negra mate

Ç Branquias: Rojo oscuro, mate.

Ejemplares con 9 días de almacenamiento en hielo

Ç Piel: Mate con decoloración

marcada, con mucus amarillento-
verdoso

Ç Ojos: Cóncavos. con córnea

lechosa y pupila gris

Ç Branquias: Marrón grisáceo

con mucus abundante

Figura 3.2.10. Evolución de los principales características externas

de la corvina rubia almacenada en hielo

126
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Tabla 3.2.2: Esquema de evaluación sensorial utilizado en

corvina entera y fileteada

Parámetros Características Puntuación

Brillante, iridiscente 0
Piel Pigmentación viva pero sin brillo 1
Apariencia Pigmentación mate; decolorada 2
general Transparente, acuoso. 0
Mucus Ligeramente turbio, lechoso 1
Amarillo-verdoso especialmente en la zona ventral 2
Rígido, este punto de demérito es sólo para pescados en rigor. 0
Firme y elástica (se hunde ligeramente a la presión digital
1
Rigidez suave y se recupera en forma total)
Carne poco firme y poco elástica (se hunde a la presión
2
Consistencia digital suave y sólo se recupera parcialmente)
Blando, flácido (la presión digital no desaparece) 3
Firme elástico 0
Pared
Abdominal Blando 1
Reventado 2
Córnea transparente, pupila negra brillante 0
Color Córnea opaca, pupila negra mate 1
Cornea y pupila opaca 2
Ojos Córnea lechosa, pupila gris, descolorida 3
Convexos 0
Forma Planos 1
Cóncavos 2
Rojo sangre, brillante 0
Color Rojo oscuro, mate 1
Descoloridas, rosa pálido/marrón 2
Color marrón, gris, totalmente descoloridas 3
Fresco, a alga marinas 0
Branquias Neutro 1
Olor
A pescado, rancio, ligeramente desagradable 2
Muy desagradable, putrefacto. 3
Escaso, traslúcidos 0
Mucus Espeso, opaco 1
Abundante, marrón, opaco 2
Nacarado, traslucido 0
Color del
músculo Blanco, lechoso 1
Descolorado, amarillo, marrón, opaco 2
Filetes Se quiebra en lugar de separarse de la carne 0
Adherencia a la
columna Adherida 1
vertebral Ligeramente adherida 2
No adherida 3
Blanco lustroso y brillante, muy adherido 0
Peritoneo Ligeramente opaco, intacto, adherente 1
Desgarrado, sin adherencia 2
Puntuación Sensorial Total 0 – 29

127
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Fresco: Nacarado, traslucido Deteriorado: Blanco, lechoso

Figura 3.2.11. Cambios en la apariencia del filete de la

corvina rubia almacenado en hielo

30

25

20

15

10

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.2.12. Cambios en el índice de calidad (QI)de M.

furnieri almacenada en hielo. Cada punto representa el valor de
la media ± desvío estándar (n=6).

128
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.9. Análisis de relación entre los distintos índices de

frescura determinados

Un análisis de Componentes Principales (ACP) fue realizado para determinar la

relación entre el tiempo de almacenamientos y los índices químicos físicos y

microbiológicos de frescura en M. furnieri almacenada en frío. El análisis de

componentes principales se llevo a cabo para identificar grupos de variables de

comportamiento correlacionable. Las variables seleccionadas para dicho análisis

fueron: el contenido de HxR e Hx, el valor H, el pH, los parámetros texturales (firmeza,

dureza, cohesividad y elasticidad), los recuentos de los microorganismos psicrótrofos y

de las bacterias formadoras de H2S y el índice de calidad QI. En la Figura 3.2.13, se

muestra la representación gráfica de las variables sobre el plano formados por la 1ra. y

la 2da. CP. El porcentaje de varianza total asociada con la CP1 y CP 2 fue superior al

99%. Las variables, contenido de HxR, Hx, valor H, las variables microbiológicas, el

QI y el tiempo de almacenamiento en hielo presentaron una alta correlación con la 1ra

CP. Asimismo las variables citadas estuvieron fuertemente relacionada entre sí, e

inversamente relacionadas con los parámetros físicos (pH, dureza, firmeza, cohesividad

y elasticidad). Si interpretamos la CP 1 como una medida del “deterioro” las variables

ubicadas en el cuadrante I serían indicadoras de deterioro mientras las que se

encuentran que en el cuadrante II serían parámetros de frescura

129
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Figura 3.2.13. Correlación entre los distintos índices

químicos, físicos, microbiológicos y sensoriales utilizados
para monitorear la frescura en la corvina rubia

130
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

3.2.10. Conclusiones parciales

Ç La corvina rubia es una especies de tipo intermedia, ya que presenta una gran

acumulación de HxR e Hx. Los perfiles de degradación de nucleótidos en ejemplares en

pre y posdesove difirieron solamente en el contenido de HxR.

Ç El pH no resultó un parámetro útil para monitorear cambios de calidad, ya que no

mostró cambios durante la mayor parte del almacenamiento de M. furnieri

Ç El contenido de Hx resultó adecuado para monitorear los cambios de frescura

durante el almacenamiento, ya que presentó una relación lineal con una alta correlación

con el tiempo de almacenamiento, y mostró una muy buena correlación con otros

índices de frescura evaluados.

Ç En extracto muscular de corvina rubia se observó una alta actividad de la AMP-

deaminasa, y no se detectó actividad de adenosina deaminasa .Esto sugiere que la

degradación de ATP ocurre vía AMP-deaminasa. La actividad de la nucleósido

fosforilasa aumentó a lo largo del almacenamiento, lo cual podría indicar un papel

primordial de los microorganismos en el deterioro.

Ç El valor K no resultó un indice adecuado para monitorear la calidad de M. furnieri.

El índice de Hx o valor H presentó una alta correlación con el tiempo de

almacenamiento.

131
 3. Resultados y Discusión – Corvina rubia

Ç La putrescina fue la única amina biógena que aumentó durante el almacenamiento

en la corvina rubia, sin embargo es prematuro proponer a la putrescina como un índice

del grado de frescura.

Ç La firmeza del pescado entero decreció a lo largo del almacenamiento. La dureza

y la elasticidad del filete descendieron significativamente mientras que la cohesividad

no presentó cambios significativos.

Ç Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron

durante el almacenamiento de M. furnieri en hielo. Las bacterias psicrótrofas

predominaron durante la refrigeración, siendo la flora productora de H2S y las bacterias

proteolíticas los grupos deteriorantes más importantes. Los valores establecidos por

ICMSF como límites máximos recomendados para pescado fresco refrigerado se

alcanzaron luego del quinto día de almacenamiento.

Ç El esquema sensorial (QIM) desarrollado para la evaluación de M. furnieri

almacenado en hielo resultó adecuado para evaluar su frescura. El índice sensorial QI

presentó una relación lineal con una alta correlación con el tiempo de almacenamiento

y mostró una buena correlación con los otros índices de frescura evaluados. Los

miembros del panel sensorial consideraron inaceptables a la corvina luego del quinto

día de almacenamiento.

Ç Por todos los parámetros de frescura evaluados la vida útil comercial de la corvina

rubia almacenada en hielo es de cinco días.

132
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3. CAMBIOS EN EL MUSCULOS ADUCTORES DE VIEIRA

PATAGÓNICA ALMACENADOS A 2-4 ºC

3.3.1. Cambios en el contenido de nucleótidos

Los nucleótidos presentes en extracto perclóricos del músculo aductor de vieira

patagónica almacenados a 2-4 ºC se muestran el la Figura 3.1.3. En el perfil

cromatográfico de extracto muscular obtenido de vieira inmediatamente después de la

muerte se puede observar que el ATP y el AMP constituyeron el 85% de los

nucleótidos presentes, detectándose además pequeñas cantidades de HxR (Figura 3.3.1

A). En cambio, en callos almacenados por 5 días (Figura 3.3.1 B) se puede observar

que los nucleótidos predominantes son AMP, HxR e Hx.

Figura 3.3.1. Cromatogramas de los compuestos de degradación de

ATP en músculo aductor de viera. A: Inmediatamente después de
la muerte; B: almacenados a 2-4ºC durante 5 días.

134
 3. Resultados - Vieira patagónica

En la Figura 3.3.2 se presentan los cambios en el contenido de nucleótidos del

músculo aductor de la vieira patagónica durante su almacenamiento a 2-4 ºC. A tiempo

0 de almacenamiento el contenido total de nucleótidos fue de 7,8 ± 0,9 µmoles/g de

músculo. Este valor es similar al informado para otros invertebrados marinos

(Yokoyama y col., 1994). Inmediatamente después de la muerte, la concentración de

ATP fue de 4,1 ± 0,1 µmoles/g. A las 2 hs de almacenamiento este nucleótido alcanzó

un valor máximo de 5,6 ± 0,2 µmoles/g. Este incremento ha sido atribuido a la

regeneración de ATP por la degradación de arginin-fosfato (De Vido de Mattio y col.,

1992, 2001; Wongso y col., 1998). Posteriormente la concentración de ATP descendió

bruscamente hasta las 48 hs y luego lentamente hasta el final del almacenamiento. Este

comportamiento del ATP en el músculo postmortem de la vieira patagónica fue similar

a lo descripto en el músculo aductor de vieira Aequipecten tehuelchu y en cholgas

Aulacomya ater ater durante el almacenamiento en frío (De Vido de Mattio y col.,

1992; 2001). Los niveles de ADP descendieron un 50% a los dos primeros días post-

mortem, y posteriormente permanecieron sin mayores cambios, mientras que el AMP

mostró una lenta acumulación los primeros dos días de almacenamiento. Pequeñas

cantidades de IMP fueron detectadas a todos los tiempos, y por el contrario adenosina

no fue detectada. La concentración de HxR aumentó significativamente con el tiempo

de almacenamiento (r = 0,95, P < 0,05), alcanzado un valor de 2,2 ± 0,1 µmol/g a los 9

días. El contenido de Hx se incrementó rápidamente hasta el cuarto día de

almacenamiento, luego permaneció constante hasta el día 7 incrementándose

nuevamente hasta el día 9, alcanzando una concentración de 3,2 ± 0,1 µmol/g. Este

metabolito presentó una buena correlación con el tiempo de almacenamiento (r = 0,92),

lo cual permite sugerir su utilización como índice de frescura en los callos de Z.

135
 3. Resultados - Vieira patagónica

patagónica refrigerados (2-4 °C). La utilización de Hx con esta finalidad ha sido

ampliamente aceptada en productos de origen marino, ya que este compuesto imparte

un sabor amargo, típico del pescado en deterioro (Hughes y Jones, 1966; Fletcher y

Stamtham, 1988; De Vidos de Mattio y col., 1992, 2001; Sagedhal y col., 1997,

Church, 1998).

6
ATP ADP AMP
Concentración ( moles/g)

5
IMP HxR Hx

0 2 4 6 8 10
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.2 Cambios en el contenido de nucleótidos en músculo

aductor de vieira patagónica durante el almacenamiento a 2 - 4
ºC. Cada punto representa la media de seis determinaciones,
desviación estándar relativa < 3%

En general, el contenido de ATP y de sus catabolitos durante el almacenamiento

a 2-4 ºC del músculo aductor de Z. patagónica fue similar a lo observado en distintos

invertebrados marinos, como en la ostra Crassostrea gigas (Yokoyama y col., 1992);

136
 3. Resultados - Vieira patagónica

en las almejas Meritrix lusoria (Yokoyama y col., 1994) y Nodipecten subnodosus

(Ocaño-Higuera, 2003); en la vieria Chlamys nobilis (Wongso y Yamanaka, 1996) y en

manto de calamar, Illex argentinus (Sagedhal y col., 1997).

3.3.2. Cambios en el pH

En la Figura 3.3.3 se muestran los valores de pH del músculo aductor de vieira

almacenados a 2 - 4 ºC. El pH mostró un comportamiento normal similar al de otras

especies marinas almacenadas (Fletcher y Statham, 1988; Sikorski y col., 1990,

Wongso y Yamanaka, 1998). Inicialmente el pH fue de 7,32 ± 0,13. Un descenso

significativo (0,02 unidades de pH por hora) fue observado al cabo del primer día,

seguido por otro gradual hasta el segundo día de almacenamiento. El valor mas bajo de

pH fue registrado al día 4, con un valor de 6,68 ± 0,14. Posteriormente, este se

incrementó ligeramente hasta alcanzar al noveno día un valor de 6,81 ± 0,07.

Como se ha mencionado, para mantener los niveles normales de ATP en el

músculo, los moluscos e invertebrados primeramente consumen arginin-fosfato (Hiltz y

Dyer, 1971; Kawashima y Yamanaka, 1995; Wongso y col., 1998). Una vez agotado

este compuesto se inicia la degradación de glucógeno formándose anaerobicamente

ácido láctico y octopina que producen una caída del pH. Esta caída está estrechamente

relacionada con la reserva de glucógeno presente en el callo de los ejemplares, la que a

su vez está vinculada con el estado nutricional y con las circunstancias en las cuales se

produjeron las capturas (Tomlinson y col., 1965; Moral, 1987; Izquierdo-Pulido y col.,

1992). El posterior aumento del pH puede estar asociado a la producción de

137
 3. Resultados - Vieira patagónica

compuestos básicos que acompañan al desarrollo bacteriano (Hebard y col., 1982;

Ryder y col., 1984; Simeonidou y col., 1998).

7.50

7.25

7.00
pH
6.75

6.50

6.25

6.00
0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.3. Cambios en el pH en músculo aductor de vieira

patagónica durante el almacenamiento a 2 - 4 ºC. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

Los resultados obtenidos en este estudio muestran cambios significativos en los

valores de pH durante los dos primeros días de almacenamiento. Posteriormente no se

observan grandes variaciones, por lo que el pH no sería adecuado como índice de

frescura para la vieira patagónica. Esto coincide con numerosas investigaciones

realizadas en otras especies pesqueras (Izquierdo-Pulido y col., 1992; Yamanaka, 1989;

Wongso y Yamanaka, 1998)

138
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3.3. Determinación en la actividad de las principales

enzimas involucradas en el catabolismo del ATP (AMP-

deaminasa y adenosina deaminasa)

Como se ha mencionado previamente, la mayor vía de degradación del ATP

post-mortem en músculos de pescados consiste en una progresiva desfosforilación del

ATP hasta llegar a AMP seguida de una desaminación a IMP (Tarr, 1966; Eskin y col.,

1971). Sin embargo, en invertebrados marinos la vía degradativa de los nucleótidos no

ha sido claramente establecida. Diversos autores proponen para estos organismos un

mecanismo alternativo que considera una secuencia de desfosforilaciones hasta

adenosina (Saito y col., 1958; Arai, 1961; Hiltz y Dyer, 1970; Sakaguchi y col., 1990)

(Figura 1.5, Capitulo 1). La predominancia de uno u otro mecanismo depende de la

presencia y de la actividad de AMP-desaminasa, y de adenosina desaminasa (Stone

1970; Fijisawa y Yoshino, 1987; Contreras-Guzmán, 2002). Fijisawa y Yoshino (1987)

encontraron en extractos musculares de crustáceos, gasterópodos y bivalvos una baja

actividad de la AMP-deaminasa, adenosina deaminasa y 5'nucleotidasa sugiriendo una

reducida degradación de los nucleótidos de adenina en estas especies. Por otra parte, en

almejas pertenecientes a la familia de Schizothaerus, los mismos autores observaron

alta actividad de AMP-deaminasa y baja actividad de adenosina deaminasa y

5’nucleotidasa, lo que sugiere que la degradación del ATP procede vía IMP. En

cefalópodos se observó una marcada actividad de la adenosina deaminasa, bajos niveles

de AMP-deaminasa y actividad de 5´nucleotidasa con mayor preferencia por AMP que

por IMP, lo que sugiere que la degradación del ATP ocurre vía Ade. Sin embargo, en

músculo de distintas especies de calamar la desfosforilación de AMP a IMP fue

139
 3. Resultados - Vieira patagónica

comparable a lo observado en vertebrados marinos (Fijisawa y Yoshino, 1987;

Sagedhal y col., 1997).

Adenosina-deaminasa ( moles/ g mim.)

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.4. Cambios en la actividad de adenosina deaminasa en

músculo aductor de vieira patagónica almacenado a 2-4 ºC. Cada
punto representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

Bajo las condiciones experimentales descriptas en este estudio se detectó una

muy baja actividad de la AMP-deaminasa (0,04 µmoles /g min.) en todos los tiempos

de almacenamiento (datos no mostrados), mientras que la actividad inicial de la

adenosina deaminasa fue de 0,83 ± 0,20 µmoles /g min. Dicha actividad se mantuvo

durante los primeros 5 días de almacenamiento y posteriormente descendió

bruscamente a valores inferiores a 0,30 µmoles /g min. (Figura 3.3.4).

140
 3. Resultados - Vieira patagónica

En el presente estudio, no se detectó Ade y se observó una pequeña

acumulación de IMP a todos los tiempos analizados, lo que estaría sugiriendo que la

degradación de nucleótidos procede vía IMP. Sin embargo, la baja actividad de la AMP

deaminasa en comparación con la adenosina deaminasa permitiría suponer que la

degradación de AMP a HxR en la vieira patagónica podría proceder por ambas vías.

Diversas investigaciones describen la existencia de ambos caminos degradativos en

algunas especies y sostienen que la formación IMP o Ade depende tanto de las

condiciones de almacenamiento como de las condiciones fisiológicas de los organismos

al momento de la captura (Suwetja y col., 1989; Contreras-Guzmán, 2002). Arai (1966)

demostró que la desaminación de AMP en camarón rosado predomina a 19ºC, mientras

que la desaminación de Ade prevalece a 6ºC. Por otro lado, los cambios en el pH

también afectan la actividad de estas enzimas. La AMP-deaminasa (enzima de origen

mitocondrial) presenta una actividad óptima a pH 6,6 (Stone, 1970) mientras que la

adenosina deaminasa tiene un pH de actividad optimo es de 7,5. Similares resultados

fueron observados en músculo esquelético de vertebrados (Ranieri-Raggi y Raggi,

1988). Como se ha mencionado, en el presente estudio, el pH descendió desde un valor

de 7,32 ± 0,13 hasta 6,68 ± 0,14, lo que podría sugerir una probable inhibición de la

actividad de la adenosina deaminasa durante el almacenamiento.

3.3.4. Valor K y otros índices para evaluar la frescura

En la Figura 3.3.5 se muestran distintos índices químicos de frescura, calculados

a partir de las concentraciones de ATP y de sus productos de degradación. El índice K,

que como se ha mencionado, se define como la relación entre la sumatoria (HxR + Hx)

141
 3. Resultados - Vieira patagónica

/ (ATP + ADP + AMP + IMP + HxR + Hx) x 100 (Saito y col., 1959; Ehira y

Uchiyama, 1986), ha sido ampliamente utilizado por diferentes autores para definir la

frescura de distintos productos pesqueros en forma objetiva (Iwamoto y col., 1987;

Ryder y col., 1993; Yokoyama, 1994). El valor K aumentó en forma lineal desde un

valor inicial de 1,8 hasta 69,9% al finalizar el periodo de almacenamiento (día 9).

Resultados similares fueron observados en distintos invertebrados marinos (Yokoyama

y col., 1994; Kodaira y col., 2001). Wongso y Yamanaka (1996) determinaron en el

callo de Chlamys nobilis un incremento lineal del valor K hasta el día 7 de

almacenamiento a 0 °C, alcanzando un valor de 63,0 ± 3,5%. El modelo de regresión

lineal para el valor K en Z. patagónica bajo las condiciones analizadas fue: %K= 7,3 x

+ 6,9, R2= 0,94; P < 0,05 (con x = días a 2-4 ºC).

Distintos autores describieron para productos pesqueros, en general, una

clasificación de calidad basada en el % de índice K. En esta se establece un índice K

menor al 20 % para productos muy fresco (apto para el consumo crudo "sashimi"),

entre 20 y 40% para productos moderadamente frescos, y valores superiores para

productos deteriorados, no aptos para el consumo humano (Saito y col., 1959; Ehira y

Uchiyama, 1986). En base a la clasificación de calidad establecida mediante el valor K,

los callos de vieira permanecerían como productos frescos hasta el segundo día de

almacenamiento a 2-4 ºC, como moderadamente frescos hasta el quinto día y

posteriormente no serían aptos para el consumo humano.

142
 3. Resultados - Vieira patagónica

Dado que el ATP se degrada a IMP muy rápidamente después de la muerte,

Karube y col. (1984) propusieron utilizar el valor K´ como un índice de frescura. Este

índice no tiene en cuenta la concentración de ATP, ADP o AMP. Bajo las condiciones

ensayadas en la vieira patagónica, el índice K’ alcanzó un valor de 89.9% durante los

dos primeros días de almacenamiento y posteriormente permaneció constante, por lo

que no puede ser considerado como un índice de calidad confiable (Figura 3.3.5).

Como se mencionó precedentemente, los niveles de Hx se han utilizado en

distintos estudios como un indicador de frescura (Jones y col., 1964). Flecher y Statham

4
%
CEA

100

Hx ( moles/g)
3
80

60
2
K´

40

1
20
Hx/AMP
K

0 0

0 2 4 6 8 10
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.5. Cambios en el valor K, K’, la carga energética de

adenilato (CEA), relación Hx/AMP y el contenido de Hx en músculo
aductor de vieira durante el almacenamiento a 2-4 ºC. Cada punto
representa la media de seis determinaciones, desviación estándar
relativa < 3%

143
 3. Resultados - Vieira patagónica

(1988) encontraron una alta correlación entre la producción de Hx y el flavor

indeseable. Los resultados del valor K determinaron que la aceptabilidad de la vieira

patagónica se extendería hasta el quinto día de almacenamiento. La concentración de

Hx al finalizar dicho periodo fue aproximadamente de 2 µmol/g, valor que puede ser

considerado como límite de aceptación de Hx en músculo aductor de vieira patagónica

almacenado a 2-4 ºC. Este se encuentra dentro del rango propuesto para otros

invertebrados marinos almacenados en hielo, por ejemplo, de 2 a 3 µmol/g para el

calamar (Licciardello y col., 1985) y de 2 µmol/g para el langostino Panaeus

merquierisis (Fatima y col., 1988).

La relación entre el contenido de Hx y AMP ha sido propuesta por Ohashi y

col., (1991) como un buen indicador de frescura en invertebrados marinos. En el

músculo aductor de la vieira patagónica, la relación Hx/AMP aumentó progresivamente

con el tiempo de almacenamiento (Figura 3.3.5). El modelo de regresión lineal para

este índice fue: relación Hx/AMP = 0,19 x + 0,55, R2= 0.90; P < 0,05 (con x = días a 2-

4 ºC). Estos resultados sugerirían la posible utilización de la relación Hx/AMP como un

parámetro objetivo de calidad. Yokoyama y col., (1994) encontraron un patrón similar

en calamar (Doryteuthis bleekeri) almacenado en hielo y determinaron que tanto la

relación Hx/AMP como el contenido de Hx eran los índices de frescura más confiables.

La carga energética de adenilato (CEA) es un indicador del estado fisiológico

confiable en pectínidos, y ha sido incluido como índice de frescura en algunas

investigaciones (Yokoyama y col., 1994; Ocaño Higuera, 2003). La CEA se calcula a

partir de la relación entre la sumatoria de las concentraciones de ATP, 0,5 ADP y la

sumatoria de ATP, ADP y AMP, expresado como porcentaje (ver inciso 2.2.3). Un

144
 3. Resultados - Vieira patagónica

valor cercano a 100 indica que la fracción nucleotídica esta enriquecida de ATP y ADP

y un resultado próximo a 0 la presencia mayoritaria de AMP (Maguire y col.,. 1999).

Como se observa en la Figura 3.3.5, la CEA descendió linealmente con el tiempo de

almacenamiento desde 77,8 hasta 27,3%. Valores similares de CEA fueron informados

en otras especies de moluscos bivalvos (Yokoyama y col., 1994). El modelo de

regresión lineal para este índice fue: % CEA= -4,8 x + 72,2 R2= 0.91; P < 0,05 (con x

= días a 2 - 4 ºC). Los resultados obtenidos estarían indicando una buena condición

fisiológica de los ejemplares de vieiras evaluados. Por otra parte, la gran correlación

que se presenta entre el CEA y el tiempo de almacenamiento podría sugerir el uso de

este parámetro como un indicador de la pérdida de frescura.

3.3.5. Relación 260/250

Como se ha descripto, el desarrollo del rigor-mortis se relaciona con el

agotamiento del ATP (Tomlinson y Geiger, 1962; Iwamoto y col., 1987) y con la

producción de ácido láctico con la concomitante caída del pH muscular. Khan y Frey

(1971) describieron un método espectrofotométrico simple para monitorear la

degradación de nucleótidos durante el rigor-mortis en carne de vaca y cerdo. Dicho

método se basa en que los nucleótidos de adenosina presentan una absorción máxima a

259-260 nm mientras que sus derivados IMP, HxR e Hx lo hacen a 249-250 nm. A

partir de la relación de absorbancia a 260/250 de extractos perclóricos de tejido

muscular se puede determinar las condiciones ante-morten de los ejemplares y la

velocidad de entrada al rigor (Korhonen y col., 1990), lo cual resulta de gran

importancia ya que de esto depende el desarrollo de los cambios bioquímicos

postmortem. Valores iniciales de 1,26 y 1,22 fueron informados para músculo aductor

145
 3. Resultados - Vieira patagónica

de Aequipecten tehuelchus en buena y pobre condición biológica respectivamente (De

Vido de Mattio y col., 2001). Korhonen y col., (1990) informaron valores iniciales de

1,07 y 0,97 en extracto muscular de peces no-estresados y estresados, respectivamente.

En la Figura 3.3.6 se muestran los cambios en la relación 260/250 durante el

1.2

1.1
Relación 260/250

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.6. Cambios en la relación 260/250 en músculo aductor

Z. patagónica durante el almacenamiento a 2-4 ºC. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

almacenamiento a 2-4 ºC del músculo aductor de vieira patagónica. Luego del sacrificio

el valor de la relación 260/250 fue de 1,13 ± 0,05, lo que en concordancia con los

resultados descripto para el índice CEA sugeriría una buena condición biológica de los

ejemplares. Un rápido descenso en la relación 260/250 fue observado durante las

primeras 24 hs de almacenamiento (0,0063 unidades de absorbancia por hora, R2 =

146
 3. Resultados - Vieira patagónica

0,96), luego se produjo una caída leve y posteriormente esa relación descendió

significativamente alcanzando un valor de 0,69 ± 0,06 a los 9 días. Un perfil similar fue

observado en distintos estudios realizados en carne de vaca y cerdo (Khan y Frey

1971), en extracto muscular de pescado (Korhonen y col. 1990) y de vieira Aequipecten

Tehuelchus (De Vido de Mattio y col. 2001).

3.3.6. Cambios en el contenido de aminas biógenas

En la Tabla 3.3.1 se presentan los cambios en el contenido de aminas biógenas

del músculo aductor de la vieira patagónica durante el almacenamiento a 2 - 4 ºC. Al

inicio del almacenamiento las únicas aminas presentes fueron: espermidina y

espermina, con 0,07 y 0,21mg/100 g de músculo, respectivamente. Estas aminas son

usualmente encontradas en productos marinos frescos, ya que se encuentran de forma

natural en los tejidos musculares de los animales y su formación no está directamente

vinculada a reacciones de descarboxilación aminoacídica producida durante el deterioro

(Bardócz, 1995). Posteriormente, la espermidina mostró una tendencia irregular,

mientras que los niveles de espermina disminuyeron. Está descripto que durante el

almacenamiento, los niveles de espermidina y espermina se mantienen constantes o

incluso tienden a descender (Mietz y Karmas, 1978), debido a que las poliaminas

pueden ser utilizadas por los microorganismos como fuente de nitrógeno (Bardócz,

1995) y/o reacciones de desaminación (Halász y col., 1994). La triptamina solo fue

detectada el quinto día; mientras que cadaverina, putrescina, agmatina y tiramina fueron

detectadas en el día 9 de almacenamiento. En este estudio no se detectó la presencia de

histamina ni 2-fenilalamina. El índice aminas biógenas (IAB) propuesto por Mietz y

147
 3. Resultados - Vieira patagónica

Karmas (1977) que se basa en lar relación entre las concentraciones de histamina,

cadaverina y putrescina y los niveles de la poliaminas fisiológicas (espermindina y

espermina) solo pudo calcularse para el último día de almacenamiento. El valor

obtenido fue de 1,7 mg/100g lo cual sugiere un estado de descomposición inicial.

Tabla 3.3.1. Cambios en el contenido de amimas biógenas durante

el almacenamiento a 2-4 ºC del músculo aductor de Z. patagónica
(mg/100 g de músculo).

Fresco 2 días 5 días 9 días

Putrescina ND ND ND 1,705 ± 0,76

Cadaverina ND ND ND 0,025 ± 0,01

Triptamina ND ND 1.24 ND

2-feniletilamina ND ND ND ND

Espermidina 0.079 ± 0,03 0.0766 ± 0,04 ND 0.016 ± 0,008

Espermina 0.218± 0,06 0.022 ± 0,01 0,018± 0,01 ND

Histamina ND ND ND ND

Tiramina ND ND ND 0.048 ± 0,03

Agmatina ND ND ND 0.810 ± 0,54

ND: No detectada

Los resultados descriptos concuerdan con distintas investigaciones que

describen que putrescina, cadavérina y agmatina son las aminas biógenas más

representativas de la descomposición de moluscos. Histamina esta casi siempre ausente

(Contreras-Guzmán, 2002). La relación entre los cambios en las aminas biógenas y los

procesos de deterioro en distintos moluscos ha sido ampliamente investigada. Estudios

realizados en distintos invertebrados marinos almacenados en frío muestran un

descenso en los niveles de arginina con un concomitante incremento en los de ornitina

148
 3. Resultados - Vieira patagónica

y de agmatina (Tokunaga, 1983; Yamanaka, 1989). Por otro lado, altos niveles de

citrulina fueron observados en músculo deteriorado de cangrejo, este metabolito se

asoció a la acción de enzimas bacterianas (Barman, 1969). Sin embargo, el descenso

del contenido de arginina no puede ser atribuido solamente a la formación de agmatina,

ornitina y citrulina, ya que una considerable cantidad de arginina puede ser convertido

en octopina y reaccionar con ácido pirúvico (Yamanaka y col., 1987; 1989) (Figura

3.3.7).

Figura 3.3.7. Vías eventuales de descomposición de la arginina.

Fuente: Contreras-Guzmán (2002)

En el presente estudio, no se evidenció una relación entre los cambios en el

contenido de aminas biógenas y el tiempo de almacenamiento a 2-4 °C de la vieira

patagónica . Esto indicaría que las aminas biógenas no son adecuadas para determinar

el grado de frescura o la calidad higiénico-sanitaria de estos productos.

149
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3.7. Cambios en las características texturales

Como se ha mencionado, la textura del músculo de los organismos marinos es

un importante atributo sensorial que determina la calidad o aceptación de los productos

con alto valor comercial. La textura de los productos marinos esta influenciada por

varios factores, entre ellos la especie, la edad y tamaño de los ejemplares, el contenido

de grasa, las propiedades de las proteínas del músculo. Asimismo se ve influenciada por

el manejo que se da a los ejemplares una vez que han sido capturados (Dunajski, 1979;

Botta y col. 1987; Hatae y col., 1985,1990; Ingolfsdottir y col., 1998). Los mecanismos

involucrados en el ablandamiento del músculo son tanto fisicoquímicos como

enzimáticos (Ouali y Talmant, 1990; Ando y col., 1997). En el músculo de los

organismos acuáticos varias proteinasas han sido identificadas (calpainas, catepsinas,

proteosamas y colagenasa) (Jiang, 2000). Por otro lado, un factor importante que

repercute en la pérdida de la textura durante el almacenamiento es la carga microbiana.

En la Figura 3.3.8 se muestran los resultados de la firmeza del músculo aductor

de la vieira patagónica almacenados a 2 - 4 ºC. En este estudio, la firmeza se definió

como la fuerza necesaria para alcanzar una deformación del 80% de su altura original

(ensayo destructivo), al iniciar el estudio fue de 0,089 ± 0,003 KgF. Este valor aumentó

significativamente entre las 16 y las 24 hs de almacenamiento alcanzando un valor de

0,115 ± 0,005 KgF. Posteriormente, el esfuerzo descendió alcanzando al tercer día de

almacenamiento valores cercanos a los iniciales, que se mantuvieron sin grandes

variaciones hasta el final del almacenamiento.

150
 3. Resultados - Vieira patagónica

La variación de la firmeza las primeras 48 hs de almacenamiento esta

relacionada con el desarrollo y la resolución del rigor mortis. Este se caracteriza por la

pérdida de extensibilidad y flexibilidad del músculo debido a la unión irreversible de

los filamentos de actina y miosina (Tomlinson y col., 1965; Iwamoto y col., 1987). Este

estado estrechamente relacionado con el agotamiento del ATP (Tomlinson y Geiger,

1962; Iwamoto y col., 1987, 1991) y con la producción de ácido láctico y octopina con

la concomitante caída del pH muscular. La evolución del pH, del contenido de ATP, de

la relación 260/250 y de la firmeza en músculo aductor almacenado post-mortem a 2 –

4 ºC sugiere que la mayoría de los ejemplares alcanzan el estado de rigor mortis

alrededor de las 24 hs.

0.14

0.12
Firmeza (KgF)

0.10

0.08

0.06

0.04

0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.8. Firmeza del músculo aductor de vieira

patagónica durante el almacenamiento a 2 - 4 ºC. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

151
 3. Resultados - Vieira patagónica

El TPA en músculo aductor de vieira patagónica fue realizado mediante dos

compresiones consecutivas del callo al 30% de su altura original. Posteriormente a

partir de la curva de fuerza empleada en función del tiempo se obtuvieron los siguientes

parámetros: dureza, cohesividad y elasticidad de los callos. Como se ha mencionado, la

dureza se calculó como la fuerza máxima requerida para comprimir los callos un 30%

(es decir, la fuerza máxima del primer pico de compresión). En general, los cambios en

la dureza en los callos de la vieira patagónica fueron similares a los cambios de firmeza

(Figura 3.3.8). La dureza inicial fue de 0,026± 0,008 KgF, luego se produjo un rápido

aumento en las primeras 24 hs de almacenamiento alcanzando un valor de 0,072 ±

0,004 KgF; que fue seguido de un descenso significativo hasta las 48 hs, y

posteriormente los valores se mantuvieron sin grandes variaciones (Figura 3.3.9).

0.10

0.08
Dureza (kgF)

0.06

0.04

0.02

0.00
0 2 4 6 8 10
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.9. Dureza del músculo aductor de vieira

patagónica durante el almacenamiento en frío. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

152
 3. Resultados - Vieira patagónica

La cohesividad es una medida de la atracción entre moléculas o partículas que

forman la masa de un líquido o un sólido. Veland y Torrissen (1999) definen la

cohesividad como una medida adimensional que ofrece un conocimiento relativo sobre

la fuerza del músculo que se retiene luego de la deformación sufrida por la primera

compresión. Hatae y col. (1986) y Izquierdo-Pulido y col., (1992) describen este

parámetro como medida de la perdida de la integridad del músculo. En un TPA, la

cohesividad se calcula mediante la relación entre las áreas debajo de la curva de la

segunda y la primera compresión (ver Figura 1.7, Capitulo 1). Algunos autores, tales

como Meullenet y Gross (1999) e Hyldig y Nielsen (2001) no coinciden con esta

definición y manifiestan que un alto grado de compresión fractura la muestra luego de

la primera compresión, cambiando drásticamente la estructura de la muestra para la

segunda. Estos autores concluyeron que es improbable que se pueda calcular alguna

propiedad incluyendo datos de la segunda compresión. Como se ha descripto en la

presente tesis, los análisis de TPA se realizaron comprimiendo las muestras un 30% de

su longitud original, lo cual aseguró la no-ruptura del material (Chung y Merritt, 1991).

En la vieira patagónica, la cohesividad no presentó variaciones significativas en las

primeras 24 hs de almacenamiento y posteriormente los valores permanecieron

relativamente constantes (Figura 3.3.10).

Como se observa en la Figura 3.3.11, la elasticidad en la vieira patagónica

tampoco presentó cambios significativos (P > 0,05) a lo largo del almacenamiento. Las

primeras 48 hs postmortem, la elasticidad de los callos mostró una tendencia

decreciente y luego se incrementó manteniéndose sin grandes variaciones hasta el sexto

153
 3. Resultados - Vieira patagónica

día de almacenamiento. Los valores de elasticidad luego del sexto día de

almacenamiento mostraron una nueva tendencia decreciente.

1.0

0.8
Cohesividad

0.6

0.4

0.2

0.0
0 2 4 6 8 10
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.10. Cohesividad del músculo aductor de vieira

patagónica durante el almacenamiento a 2-4 ºC. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

1.0

0.9
Elasticidad

0.8

0.7

0.6

0.5
0 2 4 6 8 10

Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.11. Elasticidad del músculo aductor de vieira

patagónica durante el almacenamiento a 2 –4 ºC. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

154
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3.8.Cambio en la microflora durante el almacenamiento

Los resultados del análisis microbiológico del músculo aductor de vieira

almacenado a 2-4 ºC se muestran en la Figura 3.3.12. Los recuentos de bacterias

psicrótrofas al inicio del almacenamiento fueron de 1,2 x 103 UFC/g de músculo. Estos

valores aumentaron significativamente, alcanzando 1,1 x 106 UFC/g a los 9 días de

almacenamiento. Las bacterias mesófilas variaron desde 1,0 x 103 UFC/g a tiempo 0 del

almacenamiento hasta recuentos cercanos 1,4 x 104 UFC/g. Como puede observarse, el

crecimiento de los microorganismos psicrótrofos fue superior a el desarrollo de la flora

mesófila (en una proporción de dos órdenes de magnitud), lo cual se asocia a la

adaptación a temperaturas bajas que presenta la flora psicrótrofa. Similares resultados

fueron descriptos en las especies precedentemente estudiadas y en distintas

investigaciones realizadas en organismos marinos almacenados en frío (Bremner y

Statham, 1983; Gennari y Tomaselli, 1988).

Como se mencionó, no todos los géneros de microorganismos presentes en el

pescado son responsables del deterioro, las bacterias productoras de ácido sulfhídrico

(H2S) constituyen la principal proporción de la microflora deteriorante en los productos

marinos frescos (Lee, 1979; Shewan y Murray, 1979; Jensen y col., 1980; Sumner y

Gorezyca, 1981; Gill, 1992; Boskou y Debevere, 1997). En la Figura 3.1.12 se observa,

que las bacterias productoras de H2S crecieron significativamente desde un valor < 103

UFC/g (menos del 10% de la flora psicrótrofa total) hasta un recuento de 5,2 105

UFC/g, valor que constituyó el 47% de la microflora total. Mediante estudios de

identificación realizados utilizando un sistema API 20 NE (bioMérieux) se encontró un

155
 3. Resultados - Vieira patagónica

claro predominio de Shewanella spp. Si bien el perfil bioquímico no fue aceptable

como Shewanella putrefacies, debido a que se obtuvieron resultados no típicos en

cuatro test de asimilación (glucosa, maltosa gluconato y citrato), los cultivos fueron

identificaron como Shewanella spp., teniendo en cuenta que podría tratarse de biotipos

o especies no incluidos en la base de datos del sistema APILAB-plus (Palacios, 2005).

Boskou y col., (1997) han reportado problemas similares para la identificación de cepas

de Shewanella spp. utilizando sistemas API 20 NE.

6
10

5
10
UFC/g

4
10

3
10
Bacterias Psicrótrofas Totales
Bacterias Mesófilas Totales
2
10 Bacterias Productoras de H2S
Bacterias Proteolíticas
Bacterias Fluorescentes
1
10
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de almacenamiento (días)

Figura 3.3.12. Evolución de las bacterias deteriorantes en músculo

aductor de vieira patagónica almacenado a 2-4 °C. Cada punto
representa el valor de la media ± desvío estándar (n=6).

Por otro lado, las bacterias proteolíticas aumentaron progresivamente desde un

recuento inicial muy bajo (<102 UFC/g) hasta valores de 6,0 104 UFC/g (5,4%). Por su

parte, las bacterias fluorescentes presentes caracterizadas como Pseudomonas

156
 3. Resultados - Vieira patagónica

fluorescens (API 20 NE, Id: 86,4%; T: 0,83) alcanzaron recuentos de 104 UFC/g a los

12 días de almacenamiento. Investigaciones realizadas por Hathaway 1997 y Gram y

Dalgaard (2002), confirman que Pseudomonas spp. y Shewanella spp. son las bacterias

psicrotolerantes, que predominan como flora de deterioro en organismos marinos

almacenado en frío. Shewanella spp. produce grandes cantidades de H2S y

trimetilamina (TMA), mientras que Pseudomonas spp. presenta la capacidad de

degradar los péptidos presentes en el pescado en deterioro y producir cetonas, ésteres,

aldehídos y amoníaco (Dalgaard y col. , 1993). En cuanto al resto de la flora analizada

las enterobacterias y los microorganismos coliformes se mantuvieron por debajo de

1x103 UFC/g durante todo el periodo en estudio (datos no mostrados).

Varios autores consideran al recuento bacteriano como el mejor índice de calidad

por ser el principal factor de descomposición (Shewan, 1977; Gram, 1992, Huss y col. ,

1997). Límites de aceptabilidad de calidad han sido determinados en diferentes

estudios, los mismos consideran que el pescado resulta sensiblemente alterado cuando

los recuentos de bacterias psicrótrofas superan 107 UFC/g de músculo y los de

microorganismos productores de H2S presentan valores mayores de 105 UFC/g. De

acuerdo a los resultados descriptos previamente, los valores límites de aceptabilidad

microbiológica establecidos por los organismos internacionales se alcanzan en Z.

patagonica a los nueve días de almacenamiento a 2-4 °C.

157
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3.9. Cambios en las características sensoriales.

En el presente estudio, se determinaron los cambios en el olor, color, textura y

apariencia del músculo aductor de la vieira patagónica durante el almacenamiento a 2 -

4 ºC. El experimento fue dividido en dos etapas, en la primera se estableció una lista

con las características y los atributos que se consideraban más importantes para evaluar

la frescura de la vieira patagónica y se confeccionó una tabla sensorial final (Tabla

3.3.2). En la segundo etapa, se determinaron los cambios significativos que ocurren en

el músculo aductor de Z. patagónica durante el almacenamiento a 2-4 ºC. Un olor nulo

o leve a algas marinas y un color típico de la especie, blanco brillante, fueron

observados durante los dos primeros días de almacenamiento (Figura 3.3.13). Estas

cualidades fueron consideradas como atributos de frescura. Posteriormente y hasta el

quinto día de almacenamiento, los músculos presentaron un olor ligeramente a pescado

y una leve tendencia al oscurecimiento. Estas características definieron

organolépticamente el estado inicial del deterioro, en este periodo los ejemplares se

mantuvieron aceptables para su consumo. Luego, los músculos presentaron un color

marrón opaco y un olor fuertemente amoniacal, muy desagradable lo que determinó el

estado avanzado de deterioro y el rechazo de los panelistas (inaceptable) (Figura

3.3.13). Estos resultados presentaron una gran correlación con los criterios de

aceptabilidad establecidos por el valor K, pero no tuvieron relación con los límites de

aceptabilidad microbiológicos.

158
 3. Resultados - Vieira patagónica

Tabla 3.3.2. Esquema de evaluación utilizado para identificar la

calidad de viera patagónica

Apariencia
Olor (x) Color (x) Textura (x) General (x)

Agradable o nulo Color típico de la especie Firme Nacarado, brillante

Color típico de la especie con De moderada Húmedo, menos
Propio no-desagradable
tendencia al oscurecimiento consistencia brillante
Fuerte y abiertamente Pigmentación típica De escasa
Opaco, seco.
desagradable desaparecida. consistencia
Descriptores

Nulo Blanco Ligeramente firme Observaciones

Algas marinas Amarillo Firme

Pescado Marrón Elástico

Amoniacal Nacarado Blando

Rancio Brillante Fláccido
H2S Opaco

Figura 3.3.13. Apariencia general de los músculos aductores de la

vieira patagónica frescos (A) y luego del quinto día a 2-4 ºC (B).

3.3.10. Análisis de relación entre los distintos índices

de frescura determinados

Un análisis de Componentes Principales (ACP) fue realizado para determinar la

relación entre el tiempo de almacenamiento y los índices químicos físicos y

microbiológicos de frescura en Z. patagónica almacenada a 2 - 4 ºC. En el presente

estudio el análisis de componentes principales se orientó a la identificación de grupos

159
 3. Resultados - Vieira patagónica

de variables de comportamiento correlacionable. Las variables seleccionadas para el

análisis de componentes principales fueron: el contenido de ATP, HxR e Hx, el valor

K, CEA y la relación 260/250, el pH, los parámetros texturales (firmeza, dureza,

cohesividad y elasticidad) y las variables microbiológicas fueron los microorganismos

psicrótrofos y las bacterias formadoras de H2S. En la Figura 3.3.14 se muestra la

representación gráfica de las variables sobre el plano formado por la 1ra. y la 2da. CP. El

porcentaje de varianza total asociada con la CP1 y CP 2 fue superior al 99%.

Asimismo se puede observar que las variables, contenido de HxR, Hx, valor K, relación

HxAMP, las variables microbiológicas y el tiempo de almacenamiento (días 2-4 ºC)

presentaron una alta correlación con la 1ra CP; y estuvieron fuertemente relacionada

entre sí, e inversamente relacionadas con el contenido de ATP, el índice CEA y la

relación 250/260. Esto indica, que a medida que transcurre el tiempo de

almacenamiento hay una disminución del contenido de ATP, del índice CEA y de la

relación 260/250 IMP y una acumulación de HxR e Hx, un aumento en el valor K, en la

relación Hx/AMP y de bacterias psicrótrofas. Si interpretamos la CP 1 como una

medida del “deterioro” las variables ubicadas en el cuadrante I serían indicadoras de

deterioro mientras las que se encuentran en el cuadrante II serían parámetros de

frescura.

160
 3. Resultados - Vieira patagónica

Figura 3.3.14. Correlación entre los distintos índices

químicos físicos microbiológicos utilizados para monitorear
la frescura en Z. patagónica.

161
 3. Resultados - Vieira patagónica

3.3.11. Conclusiones parciales

Ç Los cambios en el contenido de ATP y de sus compuestos de degradación fueron

similares a los observados en otros invertebrados marinos

Ç Los valores de pH mostraron cambios significativos durante los dos primeros días

de almacenamiento y posteriormente no se observaron grandes variaciones, por lo que

el pH no sería adecuado como índice de frescura para la vieira patagónica.

Ç En extracto muscular de la vieira patagónica se observó una pequeña acumulación

de IMP a todos los tiempos analizados. Contrariamente no se detectó Ade. La baja

actividad de la AMP-deaminasa en comparación con la adenosina deaminasa sugiere

que la degradación de AMP a HxR, en esta especie, podría proceder por ambas vías.

Ç El valor K mostró un incremento lineal con el tiempo de almacenamiento. De

acuerdo a los límites propuestos por distintos autores, Z. patagónica almacenada a 2 - 4

ºC podría considerarse como muy fresco hasta el segundo día de almacenamiento,

aceptable hasta el quinto día y no aptos para el consumo humano a partir de ese día. El

valor K’ alcanzó valores máximos a los primeros días de almacenamiento y

posteriormente permaneció constante, por lo que no puede ser considerado como un

índice de calidad confiable.

Ç La formación de Hx resultó adecuada para monitorear los cambios de frescura de Z.

patagónica, ya que presentó una alta correlación con el tiempo de guarda, y mostró una

muy buena correlación con los otros índices de frescura evaluados. La relación entre el

contenido de Hx y AMP también resultó un buen índice de frescura para vieira

162
 3. Resultados - Vieira patagónica

patagónica ya que aumentó progresivamente y presentó una alta correlación con el

tiempo de almacenamiento.

Ç El valor inicial del índice CEA (carga energética de adenilato) indica una buena

condición fisiológica de los ejemplares vieiras al iniciar los ensayos. Por otra parte, la

gran correlación que presenta el CEA y el tiempo de refrigeración podría sugerir el uso

de este parámetro como un indicador de la pérdida de frescura. Los valores de la

relación 260/250 también indicaron una buena condición biológica de los ejemplares

evaluados.

Ç Las aminas biógenas no resultaron adecuadas para determinar el grado de frescura

en la vieira patagónica.

Ç La gran variación observada en la firmeza las primeras 24 hs de almacenamiento en

la vieira patagónica fueron asociadas al progreso rigor mortis. En este mismo periodo

tiene lugar la mayor dismiunción de ATP y del pH. En el análisis de TPA la dureza

presentó un perfil similar al de la firmeza, mientras que la cohesividad y la elasticidad

no presentaron cambios significativos.

Ç Los recuentos microbianos de todos los grupos estudiados se incrementaron

durante el almacenamiento de Z. patagónica refrigerada. El crecimiento de los

microorganismos psicrótrofos fue superior al desarrollo de la flora mesófilas. Las

bacterias productoras de H2S crecieron significativamente durante el almacenamiento,

mostrando un claro predominio Shewanella spp. Los valores establecidos por ICMSF

como límites máximos recomendados para productos pesqueros frescos refrigerados, se

alcanzó en la vieira a los nueve días de almacenamiento.

163
 3. Resultados - Vieira patagónica

Ç Los principales cambios sensoriales durante el almacenamiento a 2-4 ºC se

observaron en el color, olor y la apariencia. Los músculos permanecieron frescos

durante los dos primeros días de almacenamiento, aceptables hasta el quinto día y luego

presentaron un estado avanzado de deterioro. Estos resultados presentaron una gran

correlación con los criterios de aceptabilidad establecidos por el valor K, pero no se

relacionaron con los límites de aceptabilidad microbiológicos.

Ç La vida útil de músculos aductores de Z. patagónica almacenados a 2-4°C es de

cinco días.

164
4. CONCLUSIONES
GENERALES
 Conclusiones Generales

Ç Lenguado (P. patagonicus)

Durante el almacenamiento post-mortem en hielo el ATP se degrada via IMP.

Es una especie que acumula Hx.

Los índices químicos de frescura sugeridos para esta especie son: Hx y valor K.

Mediante las determinaciones de Hx, valor K, recuentos bacterianos y del método

sensorial QIM se estableció que la vida útil comercial es de 7 días.

Ç Corvina rubia (M.furnieri)

Durante el almacenamiento post-morten en hielo el ATP se degrada vía IMP.

Es una especie que acumula HxR y Hx

Los índices químicos de frescura sugeridos para esta especie son: Hx y valor H

Mediante las determinaciones de Hx, valor H, recuentos bacterianos y QIM se

estableció que la vida útil comercial es de 5 días.

Ç Vieira patagónica (Z. patagónica)

Durante el almacenamiento post-mortem del músculo el ATP se degrada vía

IMP o Ade

Los índices químicos de frescura sugeridos para el músculo de esta especie son:

Hx, valor K, relación Hx/AMP.

Mediante las determinaciones de Hx, valor K, relación Hx/AMP, recuentos

bacterianos y el análisis sensorial se estableció que la vida útil comercial es de 5 días.

166
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6. PUBLICACIONES
REALIZADAS
 Publicaciones

Publicaciones surgidas de este trabajo de tesis

Artículos en Revistas Internacionales

¯ Autores: Massa A. E., Paredi M. E., Crupkin M.

Título: Nucleotide catabolism in cold stored adductor muscle of scallop (Zygochlamys
patagonica)
Fuente: Journal of Food Biochemistry. (ISSN 0145-8884).
Volumen: 26
Numero: 4
Páginas: 295-305.
Editorial: Editor N. F. Haard. Food and Nutrition Press, INC
Lugar: Trumbull, Connecticut 06611 USA
Fecha: 2002

¯ Autores:. Massa A. E., Paredi M. E., Crupkin M.

Título: Chemical assessment of freshness in stored adductor muscle of scallop
Fuente: Brazilian Journal of Chemical Engineering. (ISSN 0104-6632)
Volumen: 20
Numero: 02
Página: 147-152
Editorial: Milton Mori
Lugar: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Faculdade de Engenharia
Química (FEQ), Campinas - SP, Brazil
Fecha: Apr./June 2003

(Nota: Este trabajo fue seleccionado a partir de un proceedings presentado en 3er Mercosur Congress on
Process Systems Engineering. 1er Congress of Chemical Engineering. ENPROMER 2001 para ser publicado en
una edición especial del Brazilian Journal of Chemical Engineering )

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 Publicaciones

¯ Autores: Massa, A.E., Palacios, D. Paredi, M.E. y Crupkin, M.

Título: Postmortem changes in quality indices of iced stored flounder (Paralichthys
patagonicus)
Fuente: Journal of Food Biochemistry. (ISSN 0145-8884).
Volumen: 29
Numero: 5
Paginas: 570-590
Editorial: Editor N. F Haard. Food and Nutrition Press, INC
Lugar: Trumbull, Connecticut 06611 USA

Proceeding

¯ Autores: Massa A. E., Paredi M. E., Crupkin M.

Título: Chemical assessment of freshness in stored adductor muscle of scallop
Reunión: 3erMercosur Congress on Process Systems Engineering. 1er Congress of
Chemical Engineering – ENPROMER -
Lugar: Santa Fe. Argentina
Fecha de reunión: 19-20 septiembre 2001
Responsable: Facultad de Ingeniería Química (U. N. del Litoral), CERIDE (CONICET),
INTEC (U. N. del Litoral – CONICET), INGAR (CONICET)
Tipo de trabajo: Artículo completo.
Fuente: Proccedings of EMPROMER Vol. III – ISSN 1666-1621
Editorial, fecha, Lugar de edición: Centro Regional de Investigaciones y Desarrollo de
Santa Fe CONICET. Septiembre 2001. República Argentina.

¯ Autores: Massa A. E., Paredi M. E., Crupkin M.

Título: Vida útil de músculos aductores de vieira (Zygochlamys patagónica) durante el
almacenamiento en frío.
Reunión: X Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de los Alimentos y 1º
Simposio Internacional de Nuevas Tecnologías.
Lugar: Mar del Plata (Bs. As.), Argentina.
Fecha de reunión: 18 al 20 de mayo de 2005.
Responsable: Asociación Argentina de Tecnólogos Alimentarios
Editorial, fecha, Lugar de edición: en prensa

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 Publicaciones

¯ Autores: Massa, A. E., M. E. Paredi and M. Crupkin.

Título: Biochemical, microbiological and sensory assessment of freshness in ice stored
flounder (Paralichthys patagonicus).
Tipo: Artículo completo
Reunión: 2nd Mercosur Congress on Chemical Engineering - 4th Mercosur Congress
on Process Systems Engineering (ENPROMER)
Lugar: Río de Janeiro. Brasil.
Fecha: 14-18 de agosto 2005.
Tipo de trabajo: Artículo completo
Editorial, fecha, Lugar de edición: Editado en CR-rom.

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6. PUBLICACIONES
REALIZADAS