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UREA (Cintica)

Nmeros de catlogo: 275-06 275-11 275-13 275-14 Presentaciones: 10 x 6.5 mL 20 x 20 mL 12 x 50 mL 1 x 200 mL

USO Para la determinacin cuantitativa in vitro de urea en suero. PRECAUCION Evitar la ingestin y el contacto con la piel y los ojos. Almacenar a 2-8C. REACTIVOS Reactivo de Urea: solucin que contiene (despus de reconstituida) 0.37 mmol/L de NADH, amortiguador (pH 7.6 a 25C), 4 mmol/L de 2-oxoglutarato, 2.2 mmol/L de adenosina-5-difosfato, >1300 U/L de glutamato deshidrogenasa, >20,000 U/L de ureasa, un estabilizador y un conservador. Estndar de Urea: solucin que contiene 10 mmol/L (28 mg/dL) de urea y un conservador. ANTECEDENTES La determinacin de nitrgeno ureico se ha llevado a cabo tradicionalmente ya sea por la condensacin con diacetil monoxima o por la conversin de la urea a amonio por la accin de la ureasa. Fearon (1) fue el primero en proponer el mtodo de la diacetil monoxima en 1939. Este mtodo colorimtrico tiene limitaciones como una especificidad deficiente e inestabilidad de la coloracin. Marshall (2) introdujo la utilizacin de ureasa en las determinaciones de urea midiendo el amonio liberado a travs de una titulacin con cido. El amonio producido por la accin de la ureasa tambin ha sido medido a travs de las tcnicas de Nesslerizacin (3, 4) y por la reaccin de Berthelot (5). Estos mtodos colorimtricos carecen de especificidad, requieren de largos perodos de incubacin y de temperaturas altas. Talke y Schubert (6) describieron el primer procedimiento totalmente enzimtico para la determinacin de urea. En dicho procedimiento, la reaccin de la ureasa se acopla a la aminacin concurrente del cido 2-oxoglutrico y la oxidacin del NADH por la glutamato deshidrogenasa. PRINCIPIO Ureasa Urea + H2O 2NH3 + CO2 Ecuacin I

En el procedimiento de Talke y Schubert, la urea es hidrolizada primeramente por la ureasa para producir amonio y bixido de carbono como se indica en la Ecuacin I. GLDH NH3 + 2-oxoglutarato + NADH + H+ L-glutamato + NAD+ + H2O Ecuacin II En el segundo paso del proceso, el amonio producido en la primera reaccin reacciona con el 2-oxoglutarato y con el NADH en presencia de glutamato deshidrogenasa (GLDH) para producir glutamato y NAD+. La oxidacin del NADH causa una disminucin en la absorbancia a 340 nm que es proporcional a la concentracin de urea en la muestra.
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PREPARACION DEL REACTIVO Para preparar el reactivo, agregue agua desionizada de acuerdo al volumen sealado en la etiqueta del vial. Deje reposar cinco minutos para su reconstitucin y proceda a mezclar suavemente. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO Los reactivos incluidos en el equipo son estables hasta la fecha de caducidad especificada en las etiquetas a 2 a 8/C. El reactivo reconstituido se mantiene estable por 7 das a 2 a 8C o por 8 horas a 18 a 26C. DETERIORO DEL REACTIVO Las soluciones de los reactivos deben ser claras. La turbidez indicara deterioro. La lectura de la absorbancia inicial del reactivo contra la de agua desionizada a 340 nm debiera ser 1.5 o mayor para considerarse conveniente para su uso. INSTRUMENTOS Puede usarse cualquier analizador con control de temperatura de 0.5C que sea capaz de leer la absorbancia con exactitud, con una sensibilidad de 0.001 de absorbancia a 340 nm. El ancho de banda deber ser de 10 nm o menos, la desviacin de la luz de 0.5% o menos y la exactitud de longitud de onda dentro de 2 nm. RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA La muestra de eleccin debe ser suero fresco, claro y no hemolizado. El suero deber separarse rpidamente del cogulo. Se sabe que el fluoruro es un inhibidor de ureasa, por lo que debern evitarse los anticoagulantes que contengan fluoruro. INTERFERENCIAS La ureasa es especfica para la urea. Sin embargo, la contaminacin con amonio afectar seriamente los resultados obtenidos al utilizar este sistema. No deben efectuarse estas pruebas cerca de donde se realicen uroanlisis en un laboratorio o en el cual se utilicen productos para limpieza que contengan amoniaco. Consulte a Young, D.S. (7) para encontrar un resumen sobre la influencia de drogas en pruebas de laboratorio clnico. PROCEDIMIENTO Materiales Proporcionados Se incluyen los reactivos necesarios para la determinacin de urea. Se incluye el estndar de urea solo en los equipos con catlogo No. 275-11 y 275-13. Materiales Requeridos 1. Un instrumento que rena los requisitos mencionados en la seccin de Instrumentos. 2. Cubetas de 1 cm o una celda de flujo que transmita luz a 340 nm. 3. Tubos de ensayo del tamao adecuado. 4. Pipetas del tamao adecuado. 5. Agua desionizada. 6. Un cronmetro adecuado. 7. Un bao de agua adecuado. Condiciones Genricas Longitud de onda ...................................... 340 nm Temperatura ............................................. 30C Paso de luz ............................................... 1 cm Tipo de reaccin ....................................... Cintica Tiempo de reaccin .................................. 2 minutos, 30 segundos Volumen de la muestra ............................. 10 L Volumen de reactivo ................................. 1 mL Volumen total ............................................ 1.01 mL Relacin muestra/reactivo ........................ 1/100 Analizador Automatizado 340 nm 37C Cintica 125 segundos 3 L 300 L 303 L 1/100
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Procedimiento 1. Ajuste la lectura de la absorbancia a 340 nm en el espectrofotmetro a 0.000 utilizando agua desionizada como blanco. 2. En una cubeta, deje que 1.0 mL de reactivo alcance los 30C. 3. Agregue 10 L de estndar o de muestra. 4. Mezcle bien y lea la absorbancia a intervalos de 15 segundos o utilice un sistema de registro. Siga observando la reaccin por dos minutos y medio. CALIBRACION Se incluye un estndar de urea con los equipos catlogo No. 275-11 y 275-13, el cual deber utilizarse de acuerdo a las instrucciones dadas para calibrar el procedimiento. No se incluye el estndar con los catlogos No. 275-06 o 275-14. Sin embargo, deber utilizarse un estndar de acuerdo a las instrucciones dadas para calibrar el procedimiento. CONTROL DE CALIDAD Se debe analizar un suero control con nivel normal y anormal con cada serie de muestras y los resultados debern caer dentro de 2 desviaciones estndar del valor establecido. CALCULO Y RESULTADOS Resultados La concentracin de urea se expresa en mmol/L (mg/dL BUN). Clculo A/min Urea mmol/L (mg/dL) = x concentracin del estndar A/mins A/min = cambio por minuto en la absorbancia de la muestra desconocida A/mins = cambio por minuto en la absorbancia del estndar Ejemplo 0.060 Glucosa mmol/L (mg/dL) = x 10 mmol/L 0.100 = 6 mmol/L (16.8 mg/dL) 0.060 = cambio por minuto en la absorbancia de la muestra desconocida 0.100 = cambio por minuto en la absorbancia del estndar 10 mmol/L (28 mg/dL) = concentracin del estndar Limitaciones Una muestra con una concentracin de urea que exceda el lmite de linealidad deber diluirse con solucin salina a 0.9% y deber reanalizarse incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. Muestras muy ictricas, hemolticas o lipmicas requieren que se utilice un blanco de muestra, el cual puede prepararse de la siguiente manera: 10 L de muestra y 1 mL de agua desionizada. VALORES ESPERADOS (8) 2.9-9.3 mmol/L (8-26 mg/dL) Se sugieren estos valores como referencia. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales para el rea donde est localizado.

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CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Estas caractersticas de rendimiento se obtuvieron en los laboratorios de DCL usando procedimientos automticos, a menos que se indique lo contrario. Estudio de Recuperacin Se aadi urea a tres grupos de muestras de suero humano para incrementar la concentracin de urea en 8.8, 18.5 y 20.4 mmol/L. La recuperacin de la urea agregada promedi 101%. Rango Lineal El procedimiento genrico es linealidad hasta 30 mmol/L (84 mg/dL). Al utilizar procedimientos automticos, la linealidad depender de la proporcin muestra/reactivo utilizada. Estudios de Precisin La precisin de un da a aotro se estableci analizando dos sueros control diariamente durante 20 das
Urea Suero 1 Suero 2 Media mmol/L 5.4 18.4 Desviacin Estndar mmol/L 0.16 0.32 Coeficiente de Variacin % 3.0 1.8

La precisin dentro de la corrida se estableci muestreando 2 grupos de suero humano 54 veces cada uno.
Urea Suero 1 Suero 2 Media mmol/L 5.4 18.1 Desviacin Estndar mmol/L 0.15 0.43 Coeficiente de Variacin % 2.8 2.4

Exactitud Se hizo una comparacin entre este mtodo para urea y otro mtodo para urea usando 89 muestras. El coeficiente de correlacin fue de 0.995. El anlisis de regresin lineal dio la siguiente ecuacin: Este mtodo = 1.01 (mtodo de referencia) - 0.45 mmol/L REFERENCIAS 1. Fearon, W.R., The Carbanido Diacetyl Reaction: A Test for Citrullin, Biochem. J. 33, 902 (1939). 2. Marshall, E.K., Jr., J. Biol. Chem. 151, 487 (1913). 3. Gentzkow, C.J., J. Biol. Chem. 143, 531 (1942). 4. Karr, W.B., J. Lab. Clin. Med. 9, 329 (1924). 5. Fawcett, J.K., and Scott, J.E., J. Clin. Pathol. 13, 156 (1960). 6. Talke, H., Schubert, G.E., Enzymatishche Harnstoffbestimmung in BLUT and Serum in Optishcen Test NACH Warburg, Klin. Wchnschr 43, 174 (1965). 7. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC Press, Washington, Third Edition (1990). 8. Henry, R.J., (Edito r), Clinical Chemistr y Principles and Technics, 2nd Ed. (1 974) Harper and Row, New York. IN27511-5 Agosto 28, 1997

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