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determinacion de plantas

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-43mediante separación electroforética en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Esta sencillez explica el gran éxito que ha tenido la RAPD-PCR en la identificación varietal en todo tipo de especies. Existe una bibliografía amplísima sobre este tema. Sin embargo, esta técnica presenta una serie de inconvenientes que han llevado a un relativo abandono de la misma frente a técnicas más potentes tales como los microsatélites. El principal problema que presenta la RAPD-PCR es el de su débil reproducibilidad entre diferentes laboratorios. Esta baja reproducibilidad es inherente a la técnica, dado que su fundamento se basa precisamente en la baja especifidad de la hibridación, lo que es la causa de la aparición de bandas poco reproducibles. El problema se puede minimizar en los experimentos realizados en un mismo laboratorio, trabajando en condiciones lo más estandarizadas posible. Sin embargo, entre diferentes laboratorios, las diferencias de reactivos, termocicladores, operación, etc., hacen dificil comparar los resultados. Esto es un grave problema cuando se trata de realizar una identificación varietal, que debe ser válida con independencia de las condiciones experimentales. A pesar de ello, la RAPD-PCR resulta útil cuando se quiere estudiar la diversidad genética de una colección y tener una estimación de la relación genética entre diferente variedades.

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También es muy útil para la elaboración de mapas genéticos, dado que se pueden obtener numerosos marcadores polimórficos en cada experimento. En contra de la técnica está el hecho de que estos marcadores son dominantes como los RAPD, no pudiendo identificarse los loci a los que pertenecen las bandas.

Conclusión
De la exposición anterior, puede deducirse que las tres técnicas básicas disponibles actualmente para la identificación molecular son más o menos adecuadas según la finalidad concreta que se persiga en cada caso. A efectos de obtener una identificación con validez comercial o jurídica, sin duda la técnica a elegir son los microsatélites. Es la técnica más reproducible, la que ofrece mayor facilidad de documentación y la que tiene una mejor interpretación genética. De aquí el gran predominio que va consiguiendo, sobre todo en el campo de la vid. Para aquellos experimentos en los que se necesite una mayor capacidad de resolución, tales como en la selección clonal, la técnica a elegir son indudablemente los AFLPs, aunque presentan el inconveniente de una elevada complejidad experimental. Por último, cuando se desee un estudio sencillo y rápido de las relaciones genéticas de una colección de germoplasma salvaje o de origen desconocido, la RAPDPCR resulta de gran utilidad. En cualquier caso, la obtención y comercialización de material vegetal se verán sin duda beneficiadas por la disponibilidad de estas técnicas.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): La técnica AFLP es la más reciente
y la más resolutiva de las que se aplican a identificación varietal. Se basa también en la PCR, pero con una variante. El ADN de la planta que se estudia es previamente digerido por la acción de dos enzimas de restricción. Esto produce miles de cortos fragmentos de ADN. Posteriormente, los extremos de estos fragmentos son ligados a unas secuencias de nucleótidos denominadas Aadaptadores@. A continuación, se realiza una PCR en la que se utilizan cebadores que hibridan con los adaptadores y uno o dos nucleótidos extras, que imponen una selección y reducen el número de fragmentos que se van a amplificar a unos cientos. El resultado de la amplificación se somete a electroforesis y detección radioactiva, visualizándose cientos de bandas polimórficas (Figura 6). Los AFLPs no se han utilizado mucho en identificación varietal, debido a su elevada complejidad experimental y al hecho de que se han desarrollado en fechas recientes. Sin embargo, presentan una importante característica y es que su poder resolutivo en la separación de genotipos es el más alto en comparación con el resto de las técnicas. En experimentos realizados en vid ha sido posible separar clones dentro de variedades, lo que lo convierte en una herramienta muy útil para la selección clonal.

Figura 6.-Resultados de un experimento de AFLPs. Fragmento de una autoradiografía donde se aprecian las bandas amplificadas para una serie de variedades de vid.

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30/10/2011