Inmunologa

Publicacin oficial de la Sociedad Espaola de Inmunologa

www.inmunologia.org Copyright 2008 ERGON CREACIN S.A. Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicacin puede ser reproducida, transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrnico o mecnico, incluyendo fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperacin de almacenaje de informacin, sin la autorizacin por escrito del titular del Copyright. Publicacin trimestral.

COMIT DIRECTOR
J.M. Rojo (Madrid), Director Ejecutivo, . Corb (Madrid), A. Ferreira (Santiago de Chile), M. Fresno (Madrid), M. Lpez-Botet (Barcelona), F. Lozano (Barcelona), I. Melero (Pamplona), A. Nieto (Montevideo), F. Snchez-Madrid (Madrid).

COMIT EDITORIAL
J. Alberola-Ila (Pasadena), P. Aparicio (Murcia), J. Aramburu (Barcelona), C. Ardavn (Madrid), A. Arnaiz-Villena (Madrid), J.A. Brieva (Cdiz), E. Carosella (Paris), E. Cuadrado (San Sebastin), M. de la Fuente (Madrid), M. del Val (Madrid), G. Dighiero (Paris), P. Engel (Barcelona), G. Ercilla (Barcelona), E. Fernndez-Cruz (Madrid), G. Fontn (Madrid), T. Gallart (Barcelona), F. GarcaCozar (Cdiz), F. Garrido (Granada), M.L. Gaspar (Madrid), A. Gay (Palma de Mallorca), C. Gelp (Barcelona), R.F. Gonzlez-Amaro (Mxico), . Gonzlez (Vigo), D. Jaraquemada (Barcelona), C. Lpez-Larrea (Oviedo), M. Lpez-Trascasa (Madrid), J. Madrenas (New London), A. Madrigal (Londres), R.A. Margni (Buenos Aires), E. Martnez-Naves (Madrid), N. Matamoros (Palma de Mallorca), F. Merino (Bilbao), F. Mollinedo (Salamanca), E. Osinaga (Montevideo), P. Patio (Medelln), J. Pea-Martnez (Crdoba), G. Rabinovich (Buenos Aires), J.R. Regueiro (Madrid), M. Rincn (Burlington), J.L. Rodrguez-Snchez (Barcelona), J. Sancho (Granada), M. Santamara (Crdoba), L. Santos-Argumedo (Mxico), R. Solana (Crdoba), J.L. Subiza (Madrid), M.L. Toribio (Madrid), C. Vilches (Madrid), R. Vilella (Barcelona), J. Yage (Barcelona).

ERGON CREACIN S.A. Arboleda 1, 28221 Majadahonda (Madrid) Publicacin autorizada por el Ministerio de Sanidad como Soporte Vlido: Ref. N 288 ISSN: 0213-9626 Depsito legal: M-53681-2002

SECRETARA EDITORIAL
Maria Luisa del Pozo, Departamento de Inmunologa, Centro de Investigaciones Biolgicas, CSIC, Ramiro de Maeztu, 9, E-28040 Madrid, Espaa. Tel: +34 91 837 3112; Fax: +34 91 536 0432; E-mail: marisa.pc@cib.csic.es

Arboleda 1, 28221 Majadahonda (Madrid) Telf: 91 636 29 30 Fax: 91 636 29 31 e-mail: ergon@ergon.es
TARIFAS DE SUSCRIPCIONES Miembro SEI: Gratuitos Mdicos: 42,07 euros MIR y Estudiantes: 30,05 euros Organismos y empresas: 66,11 euros Ejemplar suelto atrasado: 17 euros Precio extranjero: 200 $ Incluida en las base de datos EMBASE, ndice Mdico Espaol e IBECS.

SECRETARA DE REDACCIN
Maria Rosa Sarrias i Forns

Inmunologa
Publicacin oficial de la Sociedad Espaola de Inmunologa
www.inmunologia.org

SUMARIO
PROGRAMA CIENTFICO . . . . . . . . . . . . . . . . 6 COMUNICACIONES ORALES . . . . . . . . . . . 15 Sesin 1: Autoinmunidad - I . . . . . . . . . . . . . . . 15

Vol. 27, Supl. 1, Mayo 2008

Sesin 7: Inmunologia tumoral - II . . . . . . . . . 37 Moderadores: Federico Garrido, Luis lvarez Vallina Sesin 8: Inmunidad e infeccin . . . . . . . . . . . 40

Moderadores: Joana Ferrer, Julia Sequ Moderadores: Francisco Lozano, Margarita Bofill Sesin 2: Inmunogentica . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Sesin 9: Clulas dendrticas . . . . . . . . . . . . . . 43 Moderadores: Estela Paz Artal, Jordi Yage Moderadores: ngel Corb, Francisco Borrs Sesin 3: Inmunologa y trasplante . . . . . . . . . 21 Sesin 10: Clulas T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Moderadores: Joan Mil, Alfredo Minguela Moderadores: Manel Juan, M Luisa Toribio Sesin 4: Inmunologa tumoral - I . . . . . . . . . 25 Moderadores: Francisco Ruiz-Cabello, Ignacio Melero Sesin 5: Inmunodeficiencias: alergia y complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Moderadores: Margarita Lpez-Trascasa, Nria Matamoros Sesin 6: Clulas B y NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Moderadores: frica Gonzlez, Miguel Lpez-Botet Sesin 2: Inmunogentica . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Moderadores: Estela Paz Artal, Jordi Yage Sesin 11: Autoinmunidad - II . . . . . . . . . . . . . 48 Moderadores: Carmen Gelp, M Rosa Juli

POSTERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Sesin 1: Autoinmunidad - I . . . . . . . . . . . . . . . 55 Moderadores: Joana Ferrer, Jlia Sequ

Inmunologa
Publicacin oficial de la Sociedad Espaola de Inmunologa
www.inmunologia.org

SUMARIO
Sesin 3: Inmunologa y trasplante . . . . . . . . . 66 Moderadores: Joan Mil, Alfredo Minguela Sesin 4: Inmunologa tumoral - I . . . . . . . . . 72 Moderadores: Francisco Ruiz-Cabello, Ignacio Melero Sesin 5: Inmunodeficiencias: alergia y complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Moderadores: Nria Matamoros, Margarita Lpez-Trascasa Sesin 6: Clulas B y NK . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Moderadores: frica Gonzlez, Miguel Lpez-Botet Sesin 7: Inmunologa tumoral - II . . . . . . . . . 90 Moderadores: Luis lvarez Vallina, Federico Garrido

Vol. 27, Supl. 1, Mayo 2008

Sesin 8: Inmunidad e infeccin . . . . . . . . . . . 96 Moderadores: Francisco Lozano, Margarita Bofill Sesin 9: Clulas dendrticas . . . . . . . . . . . . . 104 Moderadores: ngel Corb, Francisco Borrs Sesin 10: Clulas T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Moderadores: Manel Juan, M Luisa Toribio Sesin 11: Autoinmunidad - II . . . . . . . . . . . . 114 Moderadores: M Rosa Juli, Carmen Gelp

ndice de Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

Inmunologa
Publicacin oficial de la Sociedad Espaola de Inmunologa
www.inmunologia.org

PROGRAMA CIENTFICO
MIRCOLES, 21 DE MAYO 10.00-14.00 ENTREGA DE DOCUMENTACIN COLOCACIN DE PSTERS (Sala Termas) 1. Autoinmunidad I 2. Inmunogentica REUNIN DE LA JUNTA DIRECTIVA TALLER DE INMUNOQUMICA (Sala Ramn Llull) Coordinadores: Cndido Jurez, Hospital Sant Pau (Barcelona). Juan Jos Rodrguez Molina, Hospital G. Universitario Gregorio Maran (Madrid). Julia Sequi Navarro, Hospital Carlos III (Madrid). Luisa M Villar, Hospital Ramn y Cajal (Madrid) TALLER DE AUTOINMUNIDAD (Sala Luis de Molina A) Coordinadores: Rita lvarez, Hospital Universitario La Paz (Madrid). Marcos Lpez Hoyos, Hospital Universitario Marqus de Valdecilla (Santander) SIMPOSIUM DIASORIN: ENFERMEDAD CELACA (Sala Magna) Inmunopatogenia de la enfermedad celaca Eduardo Arranz, Universidad de Valladolid, Presidente de la Sociedad Espaola de Enfermedad Celaca. La deteccin de la enfermedad celaca, una labor multidisciplinar Carme Farr, Hospital Sant Joan de Deu (Barcelona) CONFERENCIA INAUGURAL (Sala Magna) Complexity and complementarity of cellular and humoral innate immunity Alberto Mantovani. Instituto Clinico Humanitas (Miln) BIENVENIDA E INAUGURACIN OFICIAL (Sala Magna) Cctel de bienvenida JUEVES, 22 DE MAYO 08.30-10.00 COLOCACIN DE PSTERS (Sala Termas) 1. Autoinmunidad I 2. Inmunogentica

13.00-14.00 15.00-16.15

16.15-17.30

17.30-19.00

19.00-20.00

20.00

PROGRAMA CIENTFICO
09.00-11.00 SIMPOSIUM PLENARIO: INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (Sala Magna) Patrocinador: BAXTER Emilio Gmez de la Concha. Hospital Clnico San Carlos (Madrid) Common Variable Immunodeficiency-genetic dissection of a complex disorder Ulric Salzer. University Hospital Friburgo Sndromes de hiper-IgM Mari Cruz Garca. Hospital Universitario la Paz (Madrid) Mecanismos etiopatognicos de un nuevo grupo de inmunodeficiencias primarias. Enfermedades autoinflamatorias sistmicas Jordi Yage. Hospital Clnico (Barcelona) Up to date: REDIP: Registro Espaol de inmunodeficiencias primarias Natalia Martnez Pomar. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca) CAF Y VISITA A PSTERS 1. Autoinmunidad I 2. Inmunogentica COMUNICACIONES ORALES 1. AUTOINMUNIDAD I (Sala Luis de Molina A) Moderadores: Joana Ferrer (Palma de Mallorca). Julia Sequi (Madrid) COMUNICACIONES ORALES 2. INMUNOGENTICA (Sala Ramon Llull) Moderadores: Estela Paz Artal (Madrid). Jordi Yage (Barcelona) TALLER HLA (Sala Luis de Molina B) Coordinadores: M Rosario De Pablo y Carlos Vilches, Hospital Puerta de Hierro (Madrid). Jos Luis Vicario, Centro Regional de Transfusiones (Madrid) SIMPOSIUM BECTON DICKINSON (Sala Magna) ALGO MS EN HIV? Actualizacin en los aspectos patognicos de la infeccin por HIV Rosa Garca Delgado, Servicio de Inmunologa. Fundacin Jimnez Daz (Madrid) Vacunas teraputicas en HIV. Perspectivas actuales y futuras Montse Plana. Grupo de Investigacin de Enfermedades Infecciosas. Hospital Clnic/ IDIBAPS (Barcelona) INMUNIDAD Y ADHESIN Dianas y Terapias anti-adhesin en enfermedades autoinmunes y neurodegenerativas Francisco Snchez Madrid, Servicio de Inmunologa. Hospital La Princesa (Madrid) 13.30-15.00 15.00-16.30 ALMUERZO DE TRABAJO SIMPOSIUM PLENARIO CONJUNTO: INMUNIDAD INNATA (1 PARTE) (Sala Magna) Societ Italiana Immunologia, Immunologia Clinica e Allergologia y Sociedad Espaola de Inmunologa. Moderadores: Miguel Lpez-Botet, IMIM-Hospital del Mar (Barcelona). Francisco Lozano, Hospital Clnic (Barcelona) Epithelial cell-dendritic cell cross-talk in bacterial handling Mara Rescigno. Department of Experimental Oncology. European Institute of Oncology (Milan) Gene expression profiling on human macrophages: identification of LSECtin as a novel pathogen-attachement factor in alternatively activated macrophages Angel Corb. Centro de Investigaciones Biolgicas. CSIC (Madrid) Advances in neutrophil-derived cytokines Marco Cassatella, Department of Pathology. University of Verona (Italy) CAF Y VISITA A PSTERS

11.00-12.00

12.00-13.30

16.30-17.00

PROGRAMA CIENTFICO
17.00 -19.00 SIMPOSIUM PLENARIO CONJUNTO: INMUNIDAD INNATA (2 PARTE) (Sala Magna) Societ Italiana Immunologia, Immunologia clinica e Allergologia y Sociedad Espaola de Inmunologa NK cells at the interface between innate and adaptative immunity Alessandro Moretta, Molecular Immunology Laboratories. University of Genova (Italy) Negative regulation of macrophage activation Lisardo Bosc. Instituto de Investigaciones Biomdicas Alberto Sols (Madrid) Matricellular protein SPARC at the interface of macrophage-tumor cell interaction Mario Colombo. Fondazione IRCCS. Istituto Nazionale Tumori (Italy) ACTIVIDAD LDICO-CULTURAL Visita guiada a la Catedral de Palma de Mallorca. VIERNES, 23 DE MAYO 08.30-10.00 COLOCACIN DE PSTERS (Sala Termas) 3. Inmunologa y trasplante 4. Inmunologa tumoral I 5. Inmunodeficiencias, alergia y complemento 6. Clulas B y NK 7. Inmunologa tumoral II VOTACIONES SEI SIMPOSIUM PLENARIO: HOMENAJE AL PROFESOR JEAN DAUSSET (Sala Magna) Moderadora: Roco lvarez. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) Jean Dausset. Un visionario del siglo XX Edgardo Carosella, Hospital Saint Louis (Paris) La serologa HLA como fundamento del trasplante Guadalupe Ercilla. Hospital Clnic (Barcelona) Papel de los sistemas menores de histocompatibilidad en los trasplantes de rganos slidos Antonio Nez. Hospital Virgen del Roco (Sevilla) De la supresin de la respuesta alognica in vitro al estudio del proceso de tolerancia en trasplantes Roco Alvarez. Hospital Virgen de la Arrixaca (Murcia) Functional characterization of killer cell Ig-like receptors expressed by normal and malignant human CD4+ T lymphocytes Armand Bensussan. Directeur de Dpartement. INSERM U841. Facult de Mdecine de Crteil. Prsident de la Socit Franaise dImmunologie (Pars) SIMPOSIUM IZASA (Sala Luis de Molina A) La tecnologa de los tetrmeros de CMH: herramientas para el estudio de la respuesta T especfica Flix A. Montero-Julian. Directeur du Departement Analyse Cellulaire. Beckman Coulter Immunotech (Marseille) Flow Cytometric Analysis of Signal Transduction Pathways T. Vincent Shankey. Advanced Technology Center. Beckman Coulter, Inc. (Miami) Clulas Madre Hematopoyticas: algo ms que hematopoyesis Jos Carlos Segovia Sanz. Jefe de la Unidad de Diferenciacin y Citometra. Divisin de Hematopoyesis. CIEMAT (Madrid)

19.00

12.00-13.30 15.00-17.00 09.00-11.00

09.00-10.30

PROGRAMA CIENTFICO
11.00-12.00 CAF Y VISITA PSTERS (Sala Termas) 3. Inmunologa y trasplante 4. Inmunologa tumoral I 5. Inmunodeficiencias, alergia y complemento SIMPOSIUM ANLISIS Y GENTICA (Sala Ramon Llull) Designers antigens as diagnostic targets for autoantibody determination W. Schlumberguer. Member of Board of Directors. Division Immunobiochemical Diagnostics. Euroimmun (Lbeck) COMUNICACIONES ORALES 3. INMUNOLOGA Y TRASPLANTE (Sala Luis de Molina B) Moderadores: Joan Mil (Palma de Mallorca). A. Minguela (Murcia) COMUNICACIONES ORALES 4. INMUNOLOGA TUMORAL I (Sala Ramon Llull) Moderadores: I. Melero (Navarra). Francisco Ruiz-Cabello (Granada) COMUNICACIONES ORALES 5. INMUNODEFICIENCIAS, ALERGIA Y COMPLEMENTO (Sala Luis de Molina A) Moderadores: Margarita Lpez Trascasa (Madrid). Nria Matamoros (Palma de Mallorca) MESA REDONDA: PROTOCOLOS CLNICOS EN AUTOINMUNIDAD Consenso europeo. Experiencias espaolas (Sala Magna) Moderadora: Mara Rosa Juli (Palma de Mallorca) Comits de enfermedades autoinmunes en los hospitales: una utopa que puede ser realidad Lucio Pallars, Servicio Medicina Interna. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca) Grupo de trabajo en autoinmunidad: Propuestas y posibilidades Aresio Plaza. Servicio Inmunologa. Hospital Puerta de Hierro (Madrid) Protocolos clnicos en autoinmunidad: nuestra experiencia M Rosa Juli. Servicio Inmunologa. Hospital Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca) 13.30- 15.00 15.00-16.30 ALMUERZO DE TRABAJO COMUNICACIONES ORALES 6. CLULAS B Y NK (Sala Luis de Molina B) Moderadores: frica Gonzlez (Vigo), Miguel Lpez-Botet (Barcelona) COMUNICACIONES ORALES 7. INMUNOLOGA TUMORAL II (Sala Ramon Llull) Moderadores: Luis lvarez-Vallina (Madrid), Federico Garrido (Granada) SIMPOSIUM MENARINI: INMUNOLOGA OCULAR (Sala Magna) Moderadores: Jos M Garca Ruiz de Morales (Len). Autoimmunity in the eye: pathogenic and regulatory T cells Rachel Caspi. Laboratory Immunology. NEI. NIH (Bethesda) Protocolos clnicos en uveitis Jos Luis Olea. Servicio Oftalmologa. Hospital. Universitario Son Dureta (Palma de Mallorca) Uveitis autoinmune: avances en el diagnstico e inmunoterapia Jos M Garca Ruiz de Morales. Servicio Inmunologa Hospital de Len / Laboratory Immunology. NEI. NIH (Bethesda) TALLER DE CITOMETRA (Sala Luis de Molina A) Coordinadores: Natalia Maruri, Hospital de Cruces (Bilbao). Francisco Ruiz-Cabello (Granada) 16.30-17.00 17.00-18.30 21.00 CAF Y VISITA A PSTERS ASAMBLEA DE LA SEI (Sala Magna) CENA DE CLAUSURA Autobuses hoteles

11.15-12.00

12.00-13.30

PROGRAMA CIENTFICO
SBADO, 24 DE MAYO 08.30-10.00 COLOCACIN DE PSTERS (Sala Termas) 8. Inmunidad e infeccin 9. Clulas dendrticas 10. Clulas T 11. Autoinmunidad II COMUNICACIONES ORALES 8. INMUNIDAD E INFECCIN (Sala Luis de Molina A) Moderadores: Margarita Bofill (Barcelona). Francisco Lozano (Barcelona) COMUNICACIONES ORALES 9. CLULAS DENDRTICAS (Sala Ramon Llull) Moderadores: Francisco Borrs (Barcelona). Angel Corb (Madrid) COMUNICACIONES ORALES 10. CLULAS T (Sala Luis de Molina B) Moderadores: Manel Juan (Barcelona). M Luisa Toribio (Madrid) COMUNICACIONES ORALES 11. AUTOINMUNIDAD II (Sala Magna) Moderadores: Carmen Gelp (Barcelona). M Rosa Juli (Palma de Mallorca) MESA REDONDA: PRESENTE Y FUTURO DE LA INMUNOLOGA (Sala Magna) Moderadores: Eduardo Fernndez-Cruz. Presidente de la Comisin Nacional de Inmunologa. Miguel Lpez-Botet. Presidente de la Sociedad Espaola de Inmunologa Inmunologa en los Hospitales: situacin actual y nuevos modelos Margarita Lpez-Trascasa. Vocal de la Junta Directiva de la Sociedad Espaola de Inmunologa Formacin Especializada: Mapa de Unidades docentes y Plan de futuro Mara Jos Herrero. Representante de la Sociedad Espaola de Inmunologa en la Comisin Nacional de Inmunologa La Troncalidad en las Especialidades de Laboratorio Adolfo Campos. Vicepresidente de la Comisin Nacional de Inmunologa CAF Y VISITA A POSTERS (Sala Termas) 8. Inmunidad e infeccin 9. Clulas dendrticas 10. Clulas T 11. Autoinmunidad II CONFERENCIA DE CLAUSURA (Sala Magna) State of the art: class switch recombination and DNA repair activity Q. Pan-Hammarstrom. Karolinska Institute (Estocolmo) PRESENTACIN DE LOS PRXIMOS CONGRESOS (Sala Magna) CCTEL DE DESPEDIDA

09.00-10.30

10.30-11.45

11.45-12.15

12.15-13.15

13.15

Comunicaciones Orales
Inmunologa Vol. 27 / Supl. 1/ Mayo 2008: 15-53

SESIN 1: AUTOINMUNIDAD - I Moderadores: Dra. Joana Ferrer (Palma de Mallorca), Julia Sequ (Madrid) TLRs EN EL SISTEMA INMUNE INTESTINAL. De Andrs A, Marn N, Mirete S, Camarero C, Roy G. Hospital Ramn y Cajal de Madrid. En la enteropata celaca (EC) tiene lugar una respuesta inmune innata a nivel del epitelio intestinal, cuyo estmulo y mecanismos patognicos son prcticamente desconocidos. Dentro de los receptores del sistema inmune innato intestinal, se hallan los PRRs (pattern recognition receptors), amplios sensores de componentes microbianos filogenticamente conservados. Actualmente se especula que una disfuncin de los toll-like receptors (TLRs) reconoce a los pptidos del gluten como no propios/txicos, generando una respuesta inflamatoria inicial innata. Ningn estudio ha examinado el papel de los TLRs y de sus ligandos especficos en el fenotipo de la EC. Objetivo. Analizar la expresin de los TLRs, tanto en el epitelio como en las distintas subpoblaciones de linfocitos intraepiteliales (LIEs), en mucosa intestinal control, para conocer los niveles de expresin normales, o en celacos, con objeto de definir un estado inicial en la patogenia de la enfermedad celaca. Metodologa. Se han analizado un total de 34 biopsias de duodeno: 14 celacos activos y 19 controles. Expresin y cuantificacin por citometra de flujo, de los TLR2 y TLR4 en superficie y de los TLR3 y TLR9 intracelulares, en los distintos subtipos celulares. Resultados
Celacos activos (n = 14) LIEs Media ES TLR2 TLR4 TLR3 TLR9 13 1.5 34.5 5.1 66 9.1 61.4 6.1 Epitelio Media ES 1.5 0.5 22 3.9 51.8 6.1 48.4 5.5 No celacos (n = 19) LIEs Media ES 11.3 2.3 29.5 2.5 56.7 8 45.6 7.1 Epitelio Media ES 1.5 0.5 16.8 2.7 70.2 3.4 48.3 4.0

nes histolgicas en la mucosa intestinal, principalmente atrofia vellositaria y aumento de linfocitos intraepiteliales (LIEs). Objetivo. Estudio del perfil de LIEs en pacientes con sospecha clnica de EC en nuestro medio. Mtodos. De 97 biopsias remitidas de junio del 2006 a febrero del 2008 para el estudio del linfograma por citometria, seleccionamos 70 con datos valorables, para realizar una revisin prospectiva de las historias clnicas de los sujetos (40 mujeres, 25 hombres). Resultados. EC activa: 66%, EC. Silente: 6%, EC potencial: 15%, EC latente: 1% . EC activa
Clnica Distensin abdominal Diarrea Retraso del crecimiento Anemia Hipertransaminemia Trombocitosis Biopsia Atrofia total Atrofia subtotal Atrofia parcial Cambios mnimos Marcadores serolgicos y genticos (HLA-II) Ac antigliadina + Ac antitransglutaminasa + DQ2 DQ8 Linfograma 1.LIEs totales 10% 2.LIEs 10% 3.LIEs CD3- 10% 1+2+3 LIEs en pacientes 3 aos LIE totales LIE LIE CD3LIEs en pacientes > 3 aos LIE totales LIE LIE CD3Frecuencia 78% 72% 59% 54% 50% 46% Frecuencia 9% 67% 20% 2% Frecuencia 79% 88% 90% 7% Porcentaje de pacientes 92% 89% 60% 54% Xm DE % 27 14% 29 15% 13 8% Xm DE % 22 13% 29 19% 10 5%

Conclusiones: No parece que una diferencia en la expresin de los sensores TLRs analizados est implicada en el inicio de una respuesta inflamatoria innata en el compartimento epitelial del intestino.

PERFIL DE LINFOCITOS INTRAEPITELIALES EN EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA. Snchez M, Gutierrez EI, Toca M, Gonzalo Ocejo-Vinyals J, Leyva-Cobin F, Lpez-Hoyos M. Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario Marqus de Valdecilla, Servicio Cntabro de Salud. Santander. Introduccin. La enfermedad celiaca (EC) es una enteropata crnica mediada por el sistema inmunitario caracterizada por alteracio-

EC silente. Hipertransaminemia 75%. Marcadores serolgicos Ac antigliadina +: 33% Ac antitransglutaminasa + 75%. Linfograma, 1+2+3: 100%. EC latente y potencial. 1+2+3: 20%. Conclusiones. En la poblacin estudiada el perfil: LIEs totales 10% - LIEs LIE 10% -LIEs CD3- 10% constituye un marcador til tanto para el diagnostico de la EC activa como silente. En este ltimo caso, podra ser el mejor marcador de esta forma de presentacin.

15

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

Para la EC latente y potencial, el infiltrado linfocitario suele ser < 10% pero los LIEs se mantienen elevados y los LIE CD3- disminuidos.

PAPEL DEL GEN PXR EN ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. Mrquez Ortiz AM1, Martnez Doncel A1, Mendoza JL2, Taxonera C2, Fernndez-Arquero M1, Daz-Rubio M2, Gmez de la Concha E1, Urcelay E1. 1Servicio de Inmunologa Clnica, Hospital Clnico San Carlos. 2Servicio de Gastroenterologa, Hospital Clnico San Carlos. Recientemente, se ha descrito una asociacin del gen del receptor de pregnano (PXR/NR1I2) con la susceptibilidad a padecer enfermedad inflamatoria intestinal (EII). PXR es un receptor nuclear que regula genes involucrados en procesos de detoxificacin, entre ellos MDR1. Nuestro objetivo es investigar el impacto de este locus en la predisposicin a padecer EII en poblacin espaola. Para el estudio caso-control se utilizaron 365 enfermos de CU, 331 pacientes de EC y 550 controles. Se analizaron mediante sondas TaqMan tres polimorfismos en el gen PXR as como los seis haplotipos conformados por ellos. Incluimos el marcador -25385C/T (rs3814055) por ser el ms fuertemente correlacionado con la enfermedad en el estudio inicial y otros dos polimorfismos (rs6784598 y rs2276707) con el fin de cubrir toda la variabilidad. Al comparar las frecuencias genotpicas y allicas entre enfermos y controles no encontramos diferencias significativas. Sin embargo, al estratificar los enfermos de colitis por extensin observamos que el alelo -25385T era ms frecuente en pacientes con la forma extensa que en los pacientes con colitis izquierda (p=0.049), y que en los controles (p=0.009). Este efecto se debe principalmente al haplotipo de riesgo TCC significativamente aumentado en colitis extensa con respecto a colitis izquierda [p=0.032; odds ratio (95% IC)=1.51 (1.02-2.24)] y controles [p=0.001; odds ratio (95% IC)= 1.66 (1.20-2.30)]. Posteriormente, analizamos la posible interaccin entre los genes PXR y MDR1 encontrando que un polimorfismo del gen MDR1 (rs3789243), localizado en el intrn 3 y previamente asociado a colitis ulcerosa, presentaba una distribucin genotpica significativamente diferente al comparar portadores y no portadores del alelo de riesgo -25385T (p=0.005). Nuestro estudio confirma la asociacin del gen PXR con la enfermedad inflamatoria intestinal, concretamente con colitis extensa, y encontramos evidencias de interaccin entre este gen y MDR1.

en la regin 5'UTR y tres variantes en los codones 52, 54 y 57 (exn 1) conocidas como alelos D, B y C, respectivamente, mediante PCR-SSO inversa (Innogenetics). A todos los pacientes se les realiz adems determinacin de acs anti-S cerevisiae (ASCA) mediante tcnica de ELISA (Aeskulisa) El anlisis estadstico se realiz mediante los programas SPSS (v.11.0) y EpiInfo (v.6.0); se analizaron tanto los SNPs como los haplotipos comunes en los que stos se organizan. Resultados. Las caractersticas clnicas estudiadas fueron sexo, tabaquismo, edad al dco, localizacin, patrn evolutivo, manifestaciones extradigestivas, necesidad de ciruga, tratamiento con inmunosupresores y presencia de ASCA. En el anlisis por SNPs se ha observado una mayor tendencia a desarrollar un patrn fistulizante (B3 de clasif. de Viena) en los pacientes portadores del alelo 550L (p=0.027; OR=4.97, IC95% 1.02-47.31). Asimismo, dicho alelo se asocia con una mayor necesidad de ciruga (p=0.009; OR=9.97, IC95% 1.38-432). En el anlisis por haplotipos encontramos que en portadores del haplotipo secretor HYPA la enfermedad se limita al colon (L2 de clasif. de Viena) con menor frecuencia (p=0.02; OR=0.31, IC95% 0.08-0.99). Conclusin. El polimorfismo en el gen MBL2 puede influenciar la forma de presentacin de la EC.

GENES IL12B E IL23R: ANLISIS DE SUSCEPTIBILIDAD E INTERACCIN EN ARTRITIS REUMATOIDE. Varad Lpez J1, Perdigones N1, Fernndes-Arquero M1, Jover JA2, Gmez de la Concha E1, MartnezDoncel A1, Fernndez Gutirrez B2, Urcelay E1. 1Inmunologa Clnica Hospital Clnico San Carlos. 2Reumatologa Hospital Clnico San Carlos. La artritis reumatoide (AR) es una patologa de gentica compleja que afecta aproximadamente al 1% de la poblacin. Se ha postulado que existen genes comunes a distintas enfermedades autoinmunes. Recientemente se han descrito polimorfismos de un solo nucletido (SNP) en los genes IL12B e IL23R asociados a la enfermedad de Crohn. La IL23 es un heterodmero compuesto por las cadenas p19 y p40, codificadas por IL23 e IL12B respectivamente; su receptor es tambin un heterodmero compuesto por los productos de dos genes diferentes IL23R e IL12RB. Nuestro objetivo es dilucidar si dichos polimorfismos de IL12B e IL23R estn asociados al desarrollo de AR, tanto de forma individual como combinada. Analizamos 550 pacientes de AR y 546 individuos control. Todos ellos se genotiparon para 4 SNPs con sondas TaqMan. Dos SNPs estn localizados en el gen IL2B (rs688765 y rs3212227) y los otros dos en el gen IL23R (rs7517847 y rs11209026). Las frecuencias genotpicas y allicas de los cuatro SNPs se compararon por el test de c2 o el test exacto de Fisher. La Odds ratio (OR) y los valores de p se calcularon con el paquete estadstico Epi Info v. 6.02. Los alelos minoritarios de los dos polimorfismos de IL23R son ms frecuentes en AR que en controles (rs7517847, p=0.019; rs11209026, p= 0.026), contrariamente a los descrito en Crohn. Por el contrario no encontramos ninguna asociacin de los dos polimorfismos IL12B con AR. Tambin observamos una interaccin entre los marcadores rs7517847 (IL23R) y el rs3212227 (IL12B) [GG/CC vs (TT+TG)/(AA+AC) p=0.004]. Esto se ve reflejado en que un 13% de los enfermos rs7517847-GG son a su vez rs312227-CC siendo la frecuencia de este ltimo genotipo en controles del 5%, lo que supone un incremento del 8% (p=0.006). Nuestros datos sugieren que los alelos minoritarios de los polimorfismos estudiados en IL23R (rs7517847 y rs11209026) incrementan

ANLISIS DEL POLIMORFISMO DEL GEN MBL2 EN ENFERMEDAD DE CROHN. Rodrguez Gutirrez JF1, Rodrguez Bayona B1, Piero A2, Rodrguez C1, Correro F2, Brieva JA1, Nieto A1. 1Hospital Puerta del Mar. 2Servicio de Digestivo, Hospital Puerta del Mar. Introduccin. Genes de la inmunidad innata intervienen en la susceptibilidad y forma de presentacin de la enfermedad de Crohn (EC). La lectina de unin a manosa (MBL) codificada por el gen MBL2 es un importante componente de la inmunidad innata que se une a un amplio rango de microorganismos y activa complemento por la va de las lectinas. Los niveles sricos de MBL y su actividad funcional estn parcialmente regulados por variaciones genticas, las cuales se han asociado a otros procesos relacionados como la enf. de Behet. Objetivo. Analizar la posible influencia del polimorfismo en la regin 5 del gen MBL2 en la forma de presentacin de EC. Pacientes y Mtodos. Se han determinado en 120 pacientes los siguientes SNPs: -550 H/L y -221 Y/X en la regin promotora; +4 P/Q

16

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

la susceptibilidad a AR. Tambin apuntan a la existencia de una interaccin entre los genes IL12B e IL23R.

INTERACCIONES GENTICAS: MIF COMO FACTOR DE SUSCEPTIBILIDAD EN ENFERMOS DE ARTRTITIS REUMATOIDE. Perdigones Borderas MN1, Varade J1, Nez C1, Fernndez-Gutirrez B2, Jover JA2, Urcelay E1, Martnez A1. 1Unidad de Inmunologa Clnica, Hospital Clnico San Carlos, Madrid. 2Departamento de Reumatologa, Hospital Clnico San Carlos, Madrid. La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crnica e inflamatoria de etiologa desconocida que afecta al 1% de la poblacin mundial. El carcter polignico de esta inmunopata ha suscitado en el ltimo ao varios estudios de asociacin genmica (GWA, genome wide association). Mientras, investigaciones en otros mbitos como son las interacciones intergnicas o gentico-ambientales se encuentran an en sus comienzos. En este trabajo analizamos polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) potencialmente implicados en enfermedades inflamatorias, en busca de interacciones genticas involucradas en la susceptibilidad a AR. Se genotiparon 45 SNPs correspondientes a 17 regiones cromosmicas en 528 pacientes con AR y 518 controles sanos espaoles. Para detectar interacciones genticas evaluamos el desequilibrio de ligamiento (LD) entre loci no ligados con el programa Haploview. Se observaron tres interacciones estadsticamente significativas (p MIF se perfila como un potente factor de susceptibilidad en un determinado grupo de enfermos de AR. Este hecho implica que el efecto de proteccin o susceptibilidad de una mutacin depende del contexto o background gentico de cada individuo.

sentaban una distribucin de frecuencias del alelo minoritario que oscilaba entre el 14 y el 49% en controles. Varios SNPs resultaron asociados en una o ambas patologas. Se detect un haplotipo asociado con ambas patologas con frecuencias del 24.7% en RA, 28.2% en SLE y 18.4% en controles (OR 1.45, 95%CI 1.15-1.83 para RA y OR 1.74, 95% CI 1.38-2.20 para SLE). La regin de asociacin se localiza en las primeras 33 Kb rastreadas y se detect un SNP marcador que slo se encuentra en el haplotipo de riesgo. Conclusin. El presente estudio confirma asociacin entre la regin 3' UTR del gen CTLA y la susceptibilidad a padecer RA y SLE.

MAPEO DEL GEN TIM1 EN ARTRITIS REUMATOIDE Y LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO. Abad C1, Torres B1, Garca-Lozano JR1, Escalera A1, Fernndez O1, Snchez E2, Orozco G2, Nez-Roldn A1, Martn J2, Gonzlez-Escribano MF1. 1Servicio de Inmunologa. HU Virgen del Roco. Sevilla. 2Instituto de Parasitologa y Biomedicina "Lpez-Neyra". Granada. Introduccin. La respuesta inmunolgica mediada por clulas T est regulada por una serie de molculas coestimuladoras y coinhibidoras que intervienen en la sinapsis inmunolgica. TIM1 es una molcula coestimuladora que influencia la diferenciacin de las clulas T y la activacin dependiente de TCR y puede estar involucrada en diferentes fases del desarrollo de las enfermedades autoinmunes. Objetivo. Mapear el gen TIM1 para determinar la existencia de posibles regiones de susceptibilidad en artritis reumatoide (RA) y lupus eritematoso sistmico (SLE). Material y mtodos. Se incluyeron 289 pacientes con RA y 398 con SLE que cumplan los criterios de la ACR para ambas enfermedades. El grupo control inclua 371 donantes voluntarios de mdula sea. Se genotiparon 6 SNPs que abarcaban una regin de 22.000 bp. El genotipado se realiz utilizando sondas Taqman. La comparacin de la distribucin de frecuencias genotpicas y allicas se realiz mediante ?2. Resultados. Los 6 SNPs incluidos resultaron polimrficos con una distribucin de frecuencias del alelo minoritario que oscilaba entre el 2 y el 37% en controles. Se detect un SNP (A/T) asociado a ambas patologas, si bien, el sentido de la asociacin sera contrario en RA y SLE. En RA la asociacin se ajustara a un modelo recesivo, en el que los homocigotos AA fueron mas frecuentes en RA (14.9%) que en SLE (5.6%) y controles (9.2%, p=0.02, OR=1.73 95%CI 1.05-2.82); mientras que en SLE se encontr elevada la frecuencia del alelo T (73%) comparado con RA (67%) y controles (68%, p=0.03, OR=1.27, 95%CI 1.01-1.59). Conclusin. El presente estudio sugiere asociacin entre el gen TIM1 y la susceptibilidad a padecer RA y SLE.

MAPEO DE LA REGIN 3 ' UTR DEL GEN CTLA4 EN ARTRITIS REUMATOIDE Y LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO. Escalera A1, Torres B1, Garca-Lozano JR1, Abad C1, Fernndez O1, Orozco G2, Snchez E2, Nez-Roldn A1, Martn J2, Gonzlez-Escribano MF1. 1Servicio de Inmunologa. HU Virgen del Roco. Sevilla. 2Instituto de Parasitologa y Biomedicina "Lopez Neyra". Granada. Introduccin. La respuesta inmunolgica mediada por clulas T est regulada por una serie de molculas coestimuladoras y coinhibidoras que intervienen en la sinapsis inmunolgica. Entre los coinhibidores de la respuesta T se encuentra la molcula de CTLA4. El gen CTLA4 es un candidato para determinar la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y aunque no se ha determinado completamente la regin del gen responsable de la asociacin, estudios anteriores de nuestro grupo y otros la han situado en la regin 3' UTR del mismo. Objetivo. Acotar la regin de susceptibilidad encontrada en la regin 3' UTR del gen CTLA4 en artritis reumatoide (RA) y lupus eritematoso sistmico (SLE). Material y mtodos. Se incluyeron 455 pacientes con RA y 459 con SLE que cumplan los criterios de la ACR para ambas enfermedades. El grupo control inclua 463 donantes voluntarios de mdula sea. Se genotiparon 12 SNPs localizados en la regin 3' UTR del gen CTLA4 que abarcaban una regin de 86.367 bp. El genotipado se realiz utilizando sondas Taqman. Para el clculo de haplotipos se utiliz el programa Haploview. La comparacin de la distribucin de frecuencias genotpicas, allicas y haplotpicas se realiz mediante ?2. Resultados. Se analizaron 11 de los 12 SNPs incluidos en un principio, ya que uno de ellos result no polimrfico. Estos 11 SNPs pre-

ASOCIACIN ENTRE EL HLA Y LOS NIVELES DE ANTICUERPOS ANTI PPTIDOS CITRULINADOS CCLICOS Y DE FACTOR REUMATOIDE EN PACIENTES CON ARTRITIS DE RECIENTE COMIENZO. Cabezn Snchez A1, Ramiro Latienda S1, Cobo Ibez T1, Orozco G2, Balsa Criado A1, San Jos Valiente B1, Martn Ibez J2, Lpez-Nevot MA3, Pascual-Salcedo Pascual D1. 1Hospital Universitario La Paz de Madrid. 2Hospital Virgen de las Nieves de Granada. 3Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez Neyra, CSIC, Granada. Introduccin. La produccin de anticuerpos anti pptidos citrulinados (ac anti-CCP) se asocia con la presencia de los alelos HLA DRB1

17

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

con el eptopo compartido (EC) y con la artritis reumatoide (AR). El HLA DR3 se asocia con la AR seronegativa para Factor Reumatoide (FR) y los alelos HLA DRB1 que codifican la secuencia DERAA protegen del desarrollo de AR. Pacientes y Mtodos. En pacientes de una consulta de artritis de reciente comienzo se estudi la presencia de alelos HLA DRB1 con el EC, el HLA DR3 y alelos que codifican la secuencia DERAA. En el suero de estos pacientes se cuantificaron los ac anti-CCP y FR. Las comparaciones estadsticas se realizaron mediante los test de Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney con la correccin de Bonferroni. Resultados. De los 322 pacientes incluidos en el estudio, un 71,4% fueron diagnosticados de AR y un 28,6% de otras artropatas. El FR y los ac anti-CCP fueron positivos respectivamente en el 72,6% y 62,3% de los pacientes con AR y en el 9,2% y 3,5% de pacientes con otras artropatas. Se encontraron diferencias en el ttulo de ac anti-CCP y de FR segn el nmero de alelos con el EC, obteniendo los niveles ms bajos en los pacientes que no tenan ningn alelo con el EC (p No observamos diferencias en la produccin de ac anti-CCP y FR segn el alelo HLA DRB1 con el EC aunque s se encontr un efecto de inhibicin de la produccin de ac anti CCP de los alelos que codifican la secuencia DERAA o del HLA DR3, sobre el efecto producido por el EC (p Conclusin. La presencia del EC est asociada con la produccin de ac anti-CCP y con la magnitud de esta produccin. Observamos un efecto inhibitorio de la produccin de ac anti-CCP cuando el alelo HLA DR3 o los alelos que codifican la secuencia DERAA estn presentes junto a otro alelo con el EC.

Results. Treated and untreated non active RA patients showed a significant decrease in the percentage of classical CD14+highCD16monocytes respect to healthy controls without relationship with disease activity. On the other hand we found a significant increase in the inflammatory CD14+lowCD16+ monocytes in active RA patients treated with anti-TNFa agents with respect to healthy controls and untreated and treated with methotrexate RA patients. We did not find differences in non active disease RA patients. Inflammatory monocytes showed a significant decrease in the expression of CX3CR1 (Fractalkine) in non active untreated patients compared with healthy controls. The Treatment with anti-TNFa agents normalized this altered fractalkine expression. Conclusions: There is an altered distribution of the different monocytic cell subsets in peripheral blood of RA patients that is characterized by a decrease in the classical monocytes and an increase of inflammatory monocytes, as well as changes in their migratory properties. This phenomenon is related with the disease activity and the patient treatment.

POLIMORFISMOS DE Fc RIIA (CD32A) Y Fc RIII A (CD16A) EN LA RESPUESTA A LA TERAPIA CON INFLIXIMAB EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. Surez B 1, Caete JD2, Hernndez MV, Rego I3, Sanmart R2, Pinto JA3, Blanco FJ3, Lozano F1. 1Servicio de Inmunologa, Hospital Clnico de Barcelona. IDIBAPS, Facultad de Medicina, Univ. de Barcelona. 2Servicio de Reumatologa, Hospital Clnico de Barcelona. IDIBAPS, Facultad de Medicina, Univ. de Barcelona. 3Servicio de Reumatologa, Hospital Juan Canalejo. A Corua. El polimorfismo de los receptores of Fc gamma (Fc R) influye en su afinidad por las inmunoglobulinas (Ig) y ello puede afectar la eficacia de las terapias basadas en Ig. En el presente trabajo analizamos la relacin entre polimorfismos funcionales de los genes Fc R IIA (CD32A) y IIIA (CD16A) y la respuesta a la terapia con infliximab (antiTNF ) en pacientes con artritis reumatoide (RA). Para ello se analizaron 91 pacientes (89% mujeres; 76.7% Factor Reumatoide positivo). Los pacientes fueron evaluados a las semanas 0, 6 y 30 usando los criterios de respuesta ACR y EULAR. El genotipado de los polimorfismos de CD16A (F158V) y CD32A (R131H) se realiz por PCR-SSP y secuenciacin, respectivamente. Se aplicaron los test Chi-square and Fisher's exact test para mostrar diferencias en las variables analizadas. Los individuos homo y heterocigotos para las variantes de alta afinidad de los dos Fc R analizados se agruparon en una sola categora para realizar comparaciones ms robustas con los individuos homocigotos para alelos de baja afinidad. Se encontraron diferencias estadsticamente significativas a las 6 semanas en el ACR50 en funcin del genotipo CD16A (baja afinidad o F/F: 24.1%; alta afinidad o F/V-V/V:2.2%; p =0.003) y a las 30 semanas en el ACR20 en funcin del genotipo CD32A (baja afinidad o RR: 60 %; alta afinidad o R/H-H/H: 33.3%;p= 0.035). La reduccin de los niveles de protena C reactiva durante la terapia fue siempre mayor en los portadores de variantes de baja afinidad (CD16A-F/F; CD32A-R/R). En conclusin, la respuesta al tratamiento anti-TNF (infliximab) en pacientes con RA est influenciada por los genotipos tanto de CD16A como de CD32A y este efecto se observa a diferentes tiempos del seguimiento (6 y 30 semanas, respectivamente) reflejando la naturaleza dinmica de la interacin Fc R versus Ig.

EFFECTS OF DISEASE MODIFYING DRUGS IN THE DISTRIBUTION AND MIGRATORY PROPERTIES OF PERIPHERAL BLOOD MONOCYTES IN RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS. Chara L1, Chevarra J1, Daz D1, Snchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Prieto A1, Turrin A2, Len MJ2, lvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA, Departamento de Medicina, Universidad de Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Espaa. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune, Hospital Universidario Prncipe de Asturias, Alcal de Henares, Madrid, Espaa. Background. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic inflammatory disease characterized by a massive synovial infiltration of lymphocytes and macrophages. Functionally altered blood monocytes are associated with joint inflammation and higher disease activity. Disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) have been shown to reduce disease activity with excellent clinical results. OBJECTIVES: To determine the effect of traditional DMARDS and anti-TNFa agents in the distribution of the different peripheral blood monocytes from RA patients compared with healthy controls, and to relate that subset distribution with their migratory properties and disease activity. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 46 rheumatoid arthritis patients and 15 healthy controls were purified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies to label CD14, CD16, CD62L and CX3CR1 antigens. The DAS28 score was calculated in each patient in order to determine the disease activity (active disease was considered when DAS28> 3.2). Comparisons between patients and healthy controls were carried out using the Student`s T test and considered significant when p<0.05.

18

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

SESIN 2: INMUNOGENTICA Moderadores: Dra. Estela Paz Artal (Madrid), Dr. Jordi Yage (Barcelona) IDENTIFICACIN Y SECUENCIACIN COMPLETA DE 17 NUEVOS ALELOS HLA DE CLASE. Balas Prez A1, Snchez-Gordo F2, Snchez-Garca F3, Bustamante L1, Garca-Snchez F1, Vicario JL1. 1Centro de Transfusin de Madrid. 2Centro de Transfusin de Mlaga. 3Hospital Doctor Negrin. Gran Canaria. Diecisiete nuevos alelos HLA clase I fueron detectados y posteriormente completamente caracterizados mediante secuenciacin: A*020115, *0281, *0289, *9224, *0326, *0339, *2631, *68020103, *6836, B*0829, *3579, *4077, *9523, Cw*0220, *030203, *0736, *0742. La deteccin de nuevas variantes allicas se realiz en el tipaje de intermedia resolucin mediante PCR-SSO y tecnologa Luminex debido a patrones anmalos de hibridacin as como en el tipaje mediante secuenciacin de los exones 2/3/4. Las muestras portadoras de los nuevos alelos fueron unidades de cordn umbilical, pacientes y donantes no emparentados. La deteccin de nuevos polimorfismo en los exones 2/3/4 se confirmo posteriormente mediante clonaje y secuenciacin de las regiones codificantes restantes. La tabla compara las nuevas secuencias con las secuencias de los alelos ms homlogos, as como la tnia de los individuos portadores y el haplotipo que contiene a los nuevos alelos. Los residuos en negrita corresponden con nuevos residuos polimrficos.
Nuevo alelo A*020115 A*0281 A*0289 A*9224 A*0326 Alelo ms homlogo A*02010101 A*9224 A*02010101 A*0281 A*03010101 Cambios de codn 245GCG>GCC 265GGT>GTT 192CAC>CAA 265GTT>GGT 268AAG>GAG 102GAG>TAC 62CGG>CCG Delecin ocho nucleotidos en el intron 2 76GTG>GAG 77GAG>AAG 79GGG>CGG 80ACC>ATC 81CTG>GCG 82CGC>CTC 83GGC>CGC 82CGC>CAC 211GCG>GAG 116TAC>TTC 131AGC>CGC 147TTG>TGG 167TGG>TCG 152GAG>GTG 169CGC>CAC 271ACC>ACT 17CGC>CAC 113TAT>TTT Cambios aminoacid. Gly>Val His>Gln Val>Gly Lys>Glu Asp>Tyr Arg>Pro Raza Cau.Espaol Cauc.Aleman Cauc.Espaol Cauc.Espaol Cauc.Espaol Haplotipo/Tipaje HLA I

El alelo A*68020103 presenta variabilidad intrnica debido a una delecin de ocho nucletidos en el inicio del intron 2. Esta variacin no afecta, sin embargo, a su expresin en superficie.

ESTUDIO DE ALGUNOS ALELOS HLA EN ENFERMOS DE ALZHEIMER. Leon Moya V1, Cacho Gutierrez J2, Chong Espino Y2. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Serv. Neurologia. Hospital Universitario de Salamanca. Introduccin. Los alelos HLA relacionados con la susceptibilidad resistencia a ciertas enfermedades, hacen que su presencia module la presentacin antignica, inhibiendo activando la respuesta inmune frente a exo auto antgenos. Hemos aplicado el anlisis individualizado de los alelo HLA A3, B7, DR2 y DR4, mediante PCR, habiendo selecionado estos alelos por su relacin con ciertas enfermedades autoinmunes. Material y Mtodos. 62 pacientes de Alzheimer,EA, de acuerdo con los criterios de NINCDS-ADRDA, y 84 sujetos sanos como grupo control, GC, fueron estudiados. El ADN fue extrado mediante el kit DNA Direct II (Dynal), fundamentado en una resina con ncleo metlico que permite separar el complejo ADN-resina mediante un imn. Los primers para el estudio del gen HLA A3 : For 5 AgC gAC gCC gCg AgC CA 3, Rev 5 CAC TCC Acg CAC gTg CCA 3 ; para HLA B7: For 5` ggA gTA TTg ggA CCg gAA C 3`, Rev 5 TAC Cag CgC gCT CCA gCT 3; para DR2 : For 5 TCC TgT ggC AgC CTA AgA g 3, Rev 5 CgC TgC ACT gTg AAg CTC TC 3 y DR4: For 5gTT TCT Tgg AgC Agg TTA AAC A 3, Rev 5 CgC TgC ACT gTg AAG CTC TC 3. Las condiciones de PCR fueron: 95, 5 min, 1 ciclo; 95 30 seg, 53 30 s, 72 30s 34 ciclos, y 72 10 min. Los amplicones fueron visualizados en electroforesis de agarosa al 2% Resultados. La frecuencia gnica de alelo HLA A3 fue 21,3 EA ( 13,6% en GC), el alelo HLA B7 se un 18,3 EA ( 12,5 % en GC) el alelo DR 2 17,6 %EA (15,5 % en el GC), El DR4 32,4% EA ( 15,6% GC). Las diferencian estatisticas entre las frecuencias gnicas , Chi Cuadrado, entre enfermos y controles fueron significativas , p> 0.001, en todos los alelos. Poniendose de manifiesto la posbilidad de emplearl como marcadoes genicos los alelos HLA estudiados en enfermos de Alzheimer.

A*0339 A*03010101 A*2631 A*260101 A*68020103 A*68020101

A*020115-B*5002-Cw*060201 A*0281-B*440201-Cw*050101 A*0289-B*3701-Cw*0602 A*9224,*23 ; B*40,*56 A*0326,*24020101;B*3701, B*400201; Cw*04010101,*06020101 Cauc.Espaol A*0339-Cw*070101-B*080101 Cauc.Espaol A*2631-B*440201-Cw*050101 Cauc.Espaol A*01,*68020103;B*530101,*5601 Cw*010201,*04010101 Ecuatoriano A*02,*6836; B*40,*51; Cw*06,*15

A*6836

A*680101

Val>Glu Asp>Asn Gly>Arg Leu>Ala Arg>Leu Gly>Arg Arg>His Ala>Gly Tyr>Phe Arg>Ser W>Leu Ser>Trp Glu>Val Arg>His Arg>His Tyr>Phe

B*0829 B*3579 B*4077

B*080101 B*3543 B*401401

Desconocida A*01,A*-;B*0820,*1402 Ecuatoriano A*24020101-B*3579-Cw*010201 Cauc.Espaol A*01,*02; B*08,*4077

B*9523 Cw*0220 Cw*030203 Cw*0736 Cw*0742

B*1591 B*1503 Cw*020202 Cw*030201 Cw*070101 Cw*070201

Cauc.Espaol No definido Cauc. Espaol Desconocida Cauc.Espaol Cau. Hungaro A*3301-B*440301-Cw*0220 A*020104-B*5801-Cw*030203 A*020101-B*180101-Cw*0736 B*070201-Cw*0742

EL ORIGEN DE LOS HABITANTES DE LAS ISLAS ALEUTIANAS (ESTRECHO DE BERING) SEGN LOS GENES HLA. Moscoso J1, Vicario JL2, Crawford M3, Serrano-Vela JI1, Reguera R1, Ferri A1, AbdEl-Fatah-Khalil S4, Millan P1, Arnaiz-Villena A1. 1Dept. Inmunologa, Universidad Complutense, Centro de Transfusin de la Comunidad de Madrid, Madrid. 2Dept. Inmunologa, Centro de Transfusin de la Comunidad de Madrid, Madrid. 3Dept. Anthropology, University of Kansas, Lawrence, USA. 4Dept. Hematologa, Centro de Transfusin de la Comunidad de Madrid, Madrid. Los Aleutianos son una poblacin que vive en las Islas Aleutianas situadas entre las actuales Alaska y Rusia, en la zona Sur del Estrecho de Bering. Su lengua no pertenece a ninguna familia conocida, incluidas las lenguas Amerindias, Na-Dene (Atabascos), Eskimales o Siberianas. Se han identificado los alelos de los genes HLA-A, -B, -C y -DRB1 mediante tcnicas estndar de alta resolucin en 58 individuos Aleutianos no emparentados.

Se definieron dos nuevas variantes caracterizadas por mutaciones no productivas, A*020115 y Cw*030203. Asimismo se han definido dos variantes de A*02, *0281 y *9224 que presentan un eptopo Bw4 equivalente al presente en alelos A*25 y A*32. De forma similar, se ha caracterizado y detectado en dos muestras procedentes de donantes ecuatorianos un nuevo alelo, A*6836, que presenta el eptopo Bw4 presente en alelos A*23 y A*24.

19

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

Los resultados se compararon con poblaciones de todo el mundo, que incluan Amerindios, Eskimos, NaDene (Atabascos), Europeos, Asiticos, Africanos y Australianos; en total, se analizaron 12.298 cromosomas. No se encontraron los alelos HLA caractersticos de Amerindios. Los clculos realizados usando distancias genticas, dendrogramas Neighbour-Joining, anlisis de correspondencia y haplotipos HLA extendidos muestran que genticamente, los Aleutianos estn estrechamente relacionados con los actuales Europeos Finlandeses y Lapones, que emigraron hacia el Oeste desde los montes Altai de Siberia hasta los lugares que actualmente ocupan en Escandinavia. Se discute la hiptesis de que los Aleutianos representen una migracin hacia el Este de las poblaciones originarias de los montes Altai Siberianos.

DIVERSIDAD ALELICA DEl gen MICA Y HAPLOTIPOS mica/hlab EN UNA POBLACIN DE LA REGION DE MURCIA. Lucas D, Campillo JA, Lpez M, Salgado G, Botella C, Lpez-Hernndez R, Sanchs MJ, Alemany JM, Minguela A, lvarez-Lpez MR, Muro M. Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia, CIBERehd, Spain. MICA esta localizado a 46 kb centromrico a HLA-B. Su estructura genmica es similar a los genes HLA de clase I, aunque no se asocia a 2-microglobulina. Los exones 2, 3 y 4 del gen codifican los 3 dominios extracelulares (1, 2 y 3, respectivamente), y el exn 5 codifica el dominio transmembrana. MICA es muy polimrfico y se han descrito hasta ahora 63 alelos. El significado funcional de estos polimorfismos no se conoce an, aunque cambios en la secuencia aminoacdica de MICA influencian la afinidad de la interaccin con NKG2D, su ligando en la clulas NK, T y T CD8. As, la presencia de metionina o valina en el codn 129 del dominio 2 confiere fuerte o dbil afinidad, respectivamente. Nuestro propsito fue establecer la diversidad allica de MICA y su ligamiento a HLA-B (gen HLA prximo) en nuestra poblacin. DNA fue extrado con el extractor Maxwell16 (Promega, WI). Genotipaje de MICA y HLA-B se realizo por PCR-SSO y PCR-SSP alelo especfica. Las frecuencias gnicas y haplotpicas se analizaron mediante el programa Arlequin (Universidad de Ginebra). El alelo MICA*008 fue el ms frecuente (25.3%), seguido por MICA*002 (15.6%), MICA*004 (14.9%), MICA*001 (7.8%), MICA*009 y MICA*016 (7.2%), y MICA*010 (4.6%). Los alelos menos representados fueron MICA*005, MICA*007, MICA*017, MICA*023, MICA*030, MICA*033, MICA*046, MICA*050 y MICA*052. En el anlisis de haplotipos, el ms frecuentemente observado es MICA*008-B*07 (9.4%), seguido de MICA*004-B*44 y MICA*001-B*18 (8.1%), MICA*002-B*35 (6.7%), MICA*008-B*44 y MICA*004-B*49 (4.7%) y, MICA*008-B*08 y MICA*002-B*38 (4.1%). Combinaciones no vistas ocasionalmente y no reportadas en poblacin espaola serian MICA*010-B*1501, MICA*015-B*45, MICA*008-B*13 y MICA*008B*4001. En conclusin, la diversidad allica de nuestra poblacin es similar a otras poblaciones ibricas, aunque encontramos una serie de alelos poco frecuentes, as como determinadas asociaciones haplotpicas no descritas en otras poblaciones de la Pennsula Ibrica.

LA IgD DE EUBLEPHARIS MACULARIUS. UN GEN GENERA MLTIPLES ANTICUERPOS. Magadn Momp S1, Snchez Espinel C2, Gambn-Deza F2. 1Hospital Meixoeiro. 2Instituto Superior de Sade do Alto Ave. Al igual que la IgM, la IgD se expresa en la membrana de los linfocitos B maduros como receptor para el antgeno. La ausencia de IgD en aves y su descripcin en peces seos contribuy a la confusin relativa a sus orgenes evolutivos. Recientes estudios han establecido la presencia de IgD en el anfibio Xenopus tropicalis, siendo esencial el estudio gentico en reptiles para conocer mejor el proceso evolutivo de la IgD en vertebrados. En trabajos realizados por nuestro grupo describimos en el reptil Eublepharis macularius (Gecko leopardo) el gen para la IgD. Est constitudo por 11 dominios Ig y un dominio TM. En el presente estudio describimos diferentes ARNs mensajeros generados a partir del gen de la IgD, indicando la presencia de varias formas secretadas y de membrana. El gran nmero de dominios Ig y la diversidad de ARNs mensajeros sugiere una actividad funcional de la IgD relevante. Metodologa. Se obtuvo ARNm a partir de sangre perifrica, bazo y tracto digestivo. Se realizaron RT-PCR con primers especficos para diferentes dominios variables (V) y constantes (C) de inmunoglobulina y TM. Los amplificados obtenidos fueron clonados utilizando el vector pGEM-T y/o secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron analizadas utilizando el software DNAstar. Resultados. El anlisis de las secuencias de ADNc obtenidas mediante RT-PCR y/o posterior clonacin, indican la expresin de mltiples ARNm generados, a travs de splacing, a partir del gen de la IgD. A su vez, los resultados indican la produccin de ARNm que codifica para dos formas de IgD secretada. Ambas presentan tallo secretor en el dominio CH11, el cual tiene un menor nmero de aminocidos que el descrito en la IgM e IgA , y no presenta cistenas, sugiriendo que no polimeriza en formas mltiples. Con respecto a la forma transmembrana, hemos descrito al menos 4 formas de ARN mensajero, siendo los dominios CH4, CH9 y CH11, los que realizan splicing con el exn TM. Conclusiones. Un nico gen de anticuerpo IgD puede generar numerosos anticuerpos con capacidades funcionales diferentes, lo que debe conferir ventajas evolutivas que condicionan la permanencia de la IgD en los reptiles. Estos mismos resultados podran obtenerse en otras especies, como peces y anfibios, en los que se encuentran Igs con un gran nmero de dominios, como la IgW e IgY.

EFECTO DE LOS RECEPTORES KIR EN LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO COMBINADO EN PACIENTES CON HEPATITIS CRNICA C. Vidal-Castieira JR1, Lpez-Vzquez A1, Daz-Pea R1, Pruneda L1, Alonso-rias R1, Prez R2, Rodrigo L2, Lpez-Larrea C1. 1Servicio de Inmunologa, Unidad de Histocompatibilidad y Transplantes, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo. 2Servicio de Digestivo, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo. Los receptores KIR (killer immunoglobulin-like receptors) estn relacionados con la activacin e inhibicin de las clulas NK, y pueden jugar un papel muy importante en la respuesta innata frente a infecciones virales, tales como el HCV. El propsito de este estudio era investigar la posible implicacin de los receptores KIR en la respuesta al tratamiento con interferon pegilado (Peg-IFN--2b) y ribavirina. Para ello se seleccion un grupo de 186 pacientes diagnosticados de infeccin por HCV crnica. Todos los pacientes recibieron tratamiento combinado a lo largo de 6-12 meses y fueron clasificados en

20

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

funcin de su respuesta al finalizar el periodo de seguimiento posttratamiento: 77 fueron no respondedores (NR) y 109 alcanzaron una respuesta viral sostenida (RVS). Todos fueron tipados para HLA-B, HLA-Cw y KIR mediante PCR-SSOr por la tecnologa Luminex. Se observ que la presencia KIR2DL3 estaba significativamente incrementada en pacientes RVS (61.93% vs. 45.46%, p= 0.001). Adems este receptor en homocigosis tambin se encontraba aumentado en este grupo (p=0.05). Por otro lado, la frecuencia de KIR2DL2 era mayor en pacientes NR (54.54% vs. 38.07%, p=0.001, OR= 1.95). Este receptor en homocigosis tambin se encontraba significativamente aumentado en NR (p=0.005, OR=2.52). Tambin se analizaron las distintas interacciones de estos receptores con sus ligandos HLA. Se observ que el genotipo KIR2DL2/KIR2DL2-HLA-C1C2 estaba aumentado en el grupo NR (p=0.007, OR=3.15) frente al genotipo KIR2DL3/KIR2DL3-HLAC1C1 que se encontraba aumentado en el grupo RVS (p= 0.028). Como conclusin hemos observado que la mayora de los pacientes con el genotipo KIR2DL3/KIR2DL3-HLA-C1C1 responden adecuadamente al tratamiento antiviral. Este genotipo buen respondedor parece facilitar la consecucin de una respuesta viral sostenida. En cambio, la mayora de los pacientes con el genotipo KIR2DL2/KIR2DL2-HLA-C1C2 no responden adecuadamente al tratamiento y no pueden eliminar el RNA viral.

REGULACIN EPIGENETICA DEL MHC EN LINEAS EMBRIONARIAS HUMANAS. Lopez-Larrea C, Bravo-Mendoza C, SuarezAlvarez B. Hospital Central de Asturias. Las clulas embrionarias humanas (hESC) son capaces de diferenciarse a la mayoria de tipos celulares y cultivarse durante largos periodos de tiempo. Estas caracteristicas las hacen ser una fuente importante de clulas capaces de ser utilizadas para el futuro del trasplante y la medicina regenerativa. Uno de los problemas principales es el reconocimiento alognico del injerto y la activacin del sistema inmune conduciendo al rechazo del rgano transplantado. Las hESC expresan niveles muy bajos de MHC-I, pudiendo incrementarse pero nnca alcanzando los niveles detectados en una clulas somticas. No existe expresin de MHC-II y HLA-G. Los mecanismos epigeneticos (metilacin del ADN y modificacin de histonas) son claves en la regulacin de genes en eucariotas, implicando la activacin o silenciamientos de los mismos. Las hESC presentan patrones de metilacin y acetilacin nicos que afectan a la regulacin de genes implicados en su pluripotencialidad y diferenciacin. Todos esto nos ha llevado a estudiar la expresin de MHC en la lnea de hESC Shef-1 (Sheffield, UK) en diversos estadios, as como las molculas implicadas en la maquinaria de procesamiento antignico, factores de transcripcin y los mecanismos epigeneticos que podrian regular su expresin. Hemos observado una deficiencia en los niveles de expresin del MHC-I en hESC como consecuencia de la disminucin de expresin en los genes implicados en la maquinaria de procesamiento antignico (Tapasina, TAP y Erp57), adems de la ausencia de expresin de HLA-DR y de los factores de transcripcin CIITA y RFX-5. Mediante tcnicas de secuenciacin de bisulfito, detectamos hypermetilacin en los genes HLA-DR, CIITA, LMP7 y HLA-G. Adicionalmente, y mediante ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina (ChIP) se observ que modificaciones especificas en las histonas H3 y H4 participan tambien en la regulacin de estos genes. Tratamiento de las hESC con inhibidores de deacetilasas de histonas (HDACs), slo o en combinacin con agentes desmetilantes del ADN, inducen la reexpresin en superficie de las molculas MHC. En conclusin, determinamos que la expresin del MHC-I y II en lineas embrionarias humanas puede estar regulada mediante mecanismos epigenticos.

ANLISIS DEL POLIMORFISMO ALLICO DE KIR3DL1 Y SU ASOCIACIN CON ESPONDILITIS ANQUILOSANTE EN LA POBLACIN ESPAOLA. Daz Pea R, Blanco Gelaz MA, Vidal Castieira JR, Lpez Vzquez A, Surez lvarez B, Lpez Larrea C. Hospital Universitario Central de Asturias. Los diferentes loci de receptores KIRs (Killer cell immunoglobulin-like receptors) y antgenos leucocitarios humanos (HLA) son altamente polimrficos, y algunas molculas HLA de clase I se unen a estos receptores KIRs. En el presente estudio se ha realizado un anlisis del polimorfismo allico del loci KIR3DL1 y se ha examinado si la combinacin de los diferentes subtipos junto con genotipos HLA-B27 est asociado con susceptibilidad a desarrollar espondilitis anquilosante (EA). Para llevar a cabo el estudio, fue seleccionada una poblacin espaola HLA-B27 positiva (56 pacientes con EA y 55 controles sanos). Nuestros resultados mostraron que la diferente distribucin de KIR3DL1 en la poblacin espaola se debe principalmente al descenso de los subtipos KIR3DL1*001 y KIR3DL1*004 en pacientes EA (15.6% vs. 4.5%, p<0.05 y 31.8% vs. 15.2%, pc<0.05; respectivamente). Puesto que existen indicios que sugieren que la fuerza de la seal inhibitoria generada por el reconocimiento de HLA-B Bw4 por KIR3DL1 tambin vara dependiendo del alelo presente, tambin se analiz si el ligando natural de KIR3DL1 podra estar involucrado en la susceptibilidad a desarrollar EA junto con algn subtipo o algn grupo de subtipos, clasificados stos en alelos con alta expresin en membrana, con baja expresin y con ausencia de expresin (KIR3DL1*004). Por una par te, se observ que no existan pacientes EA que tuviesen formas homocigticas 3DL1/3DL1 que se expresen en membrana junto con Bw4I80, mientras que su presencia en controles era significativamente mayor (pc<0.005). Adems, tambin se observ un aumento significativo de la frecuencia de KIR3DL1*004 junto con Bw4I80 en pacientes EA (pc<0.05). De esta manera, la susceptibilidad a desarrollar EA podra estar determinada por un balance de activacin e inhibicin compuesto de genotipos KIR-HLA, en el que la interaccin 3DL1-Bw4I80 parece ser decisiva.

SESIN 3: INMUNOLOGA Y TRASPLANTE Moderadores: Dr. Joan Mil (Palma de Mallorca), Dr. Alfredo Minguela (Murcia) FRECUENCIAS ALLICAS Y HAPLOTPICAS HLA EN PACIENTES ESPAOLES EN BSQUEDA DE DONANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS. IMPLICACIONES EN LA OBTENCIN DE DONANTE HLA COMPATIBLE 12/12. Balas Prez A, Garca-Snchez F, Bustamante L. Centro de Transfusin de Madrid. El trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas de donante no emparentado (DNE) es la mejor opcin cuando no existe un donante familiar HLA idntico. Los resultados para este tipo de trasplante han demostrado ser mejores cuando existe identidad a nivel allico para los genes HLA-A, -B, -C, -DRB1 y DQB1.

21

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

A pesar de la expansin de los registros de donantes, la identidad a nivel allico sigue siendo un obstculo debido a la gran diversidad de alelos y haplotipos HLA. Pacientes con variantes HLA comunes sobre haplotipos conservados presentaran mas ventaja a la hora de encontrar donantes con compatibilidad 12/12 (HLA-A, -B, -C, -DRB1DRB3/4/5, -DQB1), que aquellos con alelos raros o haplotipos infrecuentes. En stos ltimos, aproximaciones alternativas han demostrado ser mejores que el mantenimiento del paciente en bsqueda durante un periodo de tiempo prolongado. Los registros de donantes no emparentado estn compuestos por donantes tipados para HLA-A, -B, -DRB1 a resolucin baja/media. Es imprescindible por tanto el conocimientos de las frecuencias de cada una de las poblaciones con el fin de evaluar en cada caso la estrategia de bsqueda a seguir. En el presente estudio incluimos 253 pacientes espaoles caucasoides en bsqueda de DNE entre los aos 1992-2008 de los que se tienen datos de segregacin familiar con el fin de conocer la distribucin haplotpica de clase I o clase I y II. Todos ellos fueron tipados para los genes HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5, y DQB1 mediante secuenciacin. A partir de este grupo de pacientes se obtuvieron 506 haplotipos HLA de clase I y 436 incluyendo tambin los genes HLA de clase II. Para este grupo de pacientes se recibi, y tipo al mismo nivel de resolucin, un total de 493 DNE. De los 253 pacientes en bsqueda, 172 recibieron al menos un donante, obtenindose en 81 casos al menos un donante compatible 12/12. El anlisis de frecuencias allicas de clase I demostr la presencia en poblacin espaola de 33, 57 y 31 alelos para los genes HLAA, -B y C, lo cual representa un 5,5%, 5,8% y 9,1% de las variantes descritas para estos tres genes respectivamente. Asimismo, entre 6-8 alelos representan para los tres genes de clase I, entre un 55% y un 75% del total de alelos encontrados. Esta limitada variabilidad contrasta sin embargo con los datos obtenidos de frecuencias allicas, ya que aparecen un total de 245 haplotipos de clase I distintos, de los cuales 169 (69%) aparecen una sola vez. Diecisis haplotipos de clase I presentan una frecuencia superior al 1%. Cuando se analizan haplotipos completos, nicamente son 11 los que presentan una frecuencia superior al 1%. El anlisis de las asociaciones haplotpicas HLA-B-C demostr la distribucin atpica que presenta el antgeno B*510101 pudindose encontrar asociado hasta con 10 diferentes alelos HLA-C. La comparacin de las poblaciones de pacientes que recibieron al menos un donante compatible 12/12 y aquellos para los que no se obtuvo ningn donante completamente idntico demostr que: 1. Se encuentra una diferencia significativa en la frecuencia de haplotipos con frecuencia superior al 1% (p<0,0001). 2. Existe una diferencia significativa en la frecuencia del alelo B*510101 entre ambas poblaciones (p= 0,004). 3. Existe una diferencia significativa en la frecuencia de alelos HLA con una frecuencia inferior al 1% entre ambas poblaciones (p<0,0001). 4. Se encuentra una mayor frecuencia de asociaciones haplotpicas infrecuentes B-C y DRB1-DQB1 en la poblacin de pacientes sin donante HLA idntico. Por lo tanto, considerando todos estos factores asociados al paciente, junto con los datos obtenidos de la bsqueda en el Bone Marrow Dornor Worldwide, es posible realizar una prediccin sobre la posibilidad de obtener un DNE HLA 12/12 idntico.

PIG CHONDROCYTES TRIGGER A XENOGENEIC CELLULAR IMMUNE RESPONSE. Sommaggio R, Mez R, Costa C. Institut d'Investigaci Biomdica de Bellvitge (IDIBELL). Xenotransplantation may be a solution to the shortage of human cells, tissues and organs for transplantation. In particular, transplantation of porcine chondrocytes may benefit patients who suffer articular, nasal or other cartilage defects. Cartilage is an avascular tissue with very low regenerative capacity that is subjected to a not well understood process of xenograft rejection. In this work, we sought to elucidate the molecular bases of cell-mediated rejection of xenogeneic cartilage. To this end, we isolated pig costal chondrocytes (PCC) and conducted a series of functional studies that included treatment with human inflammatory cytokines and xenogeneic cell-based assays. First, we determined by flow cytometry the cell surface expression of SLAI, SLA-II, VCAM-1, ICAM-1, E-selectin, CD86 and CD40 in resting conditions or after treatment with 10 ng/ml TNF-alpha, IL-1-alphafnfnor IL-1-beta for 24 hours. Some molecules were not expressed (SLAII, E-selectin), or barely detected (CD40), at any of the conditions assayed. On the contrary, TNF-alpha and to a lesser extent IL-1-alpha led to a marked upregulation of SLA-I, VCAM-1 and ICAM-1 on PCC. CD86, constitutively expressed at moderate levels, was only slightly elevated by these cytokines. We next studied the interaction of the human monoblastic cell line U937 with untreated or cytokine-activated porcine chondrocytes in an adhesion assay testing various effector:target ratios. U937 demonstrated significant adherence to the PCC in resting and cytokine-stimulated conditions. VCAM-1 played a role in this process, as demonstrated with a specific blocking antibody. Finally, coculture of PCC with Jurkat for various days led also to an increase in IL-2 secretion. In summary, porcine chondrocytes respond to human inflammatory cytokines and trigger a xenogeneic cellular immune response.

AFFINITY STUDIES OF PORCINE TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR 2 TO ELUCIDATE ITS ROLE IN XENOGRAFT REJECTION. Bosch L, Uribe-Herranz M, Costa C. Institut dInvestigaci Biomdica de Bellvitge (IDIBELL) Clinical xenotransplantation is precluded by a strong immune response in which innate immunity plays a role. In particular, tumor necrosis factor (TNF) produced by NK cells and macrophages contributes to xenograft rejection by promoting endothelial cell activation and recruitment of inflammatory cells. To elucidate its molecular mechanism, we previously cloned the cDNA of porcine TNFReceptor 2 (pTNFR2) and obtained two isoforms. The longest one comprised the 4 TNFR cysteine-rich domains conserved between species, whereas the short variant lacked the sequence corresponding to exon 4 and one of the cysteine-rich repeats. We have now assessed their affinity for TNF. We produced two recombinant proteins containing the extracellular domain of each pTNFR2 variant fused to GST at the carboxyterminal end and examined their ability to bind pig and human TNF-alpha (pTNF and hTNF) by surface plasmon resonance. In one set of experiments, the GST-fusion proteins were immobilized directly on a CM5 chip and the pig and human TNF were injected at multiple concentrations. It generated very robust results and calculated a comparable KD for pTNFR2 binding to either pTNF or hTNF (2,5E-9 and 2,4E-9 M, respectively) with a 1:1 binding fit. The dissociation was slightly faster for hTNF. In this experiment,

22

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

we also obtained the KD for hTNFR2 binding hTNF (4,2E-9 M) and pTNF (9,9E-9 M) for comparison. In a second series, we orientated the receptor with an anti-GST antibody bound to the chip and obtained one-order-of-magnitude higher affinities overall but with lower reproducibility. In this setting, the pTNFR2 variant lacking exon 4 showed no binding to hTNF and very little to pTNF. In conclusion, pTNFR2 binds hTNF with high affinity, whereas the shorter isoform does not. We continue to work on further elucidating the potential biological function of these variants, which may participate in the process of xenograft rejection.

INFLUENCIA DEL GENOTIPO MBL2 (MANNOSE BINDING LECTIN) DE DONANTE Y RECEPTOR EN LA EVOLUCIN DEL TRASPLANTE HEPTICO. Pascal M1, Cervera C2, Suarez B1, Balderramo D3, Prieto J3, Fuster F3, Moreno A2, Navasa M3, Lozano F1. 1Servicio Inmunologa. 2Servicio Enfermedades Infecciosas. 3Servicio Hepatologa. Hospital Clinic i Provincial de Barcelona. Introduccin. MBL es una colectina srica de produccin heptica que se fija a la superficie de mltiples patgenos contribuyendo a su eliminacin por opsonofagocitosis y/o lisis mediada por complemento. Sus niveles plasmticos estn determinados por polimorfismos del promotor/exn 1 del gen MBL2. El objetivo del trabajo fue evaluar los genotipos MBL2 de donante y receptor de un injerto heptico y su influencia en las infecciones y evolucin del trasplante. Mtodos. Se determinaron por secuenciacin los genotipos de MBL2 de donante y receptor correspondientes a trasplantes hepticos realizados en nuestra institucin entre 2003 y 2007. Los genotipos se dividieron en silvestre (A/A) y variante (A/O; O/O). Se analizaron variables pre y peri trasplante, incidencia de infecciones, rechazo y supervivencia post-trasplante con objeto de identificar variables relacionadas con el desarrollo de infecciones y supervivencia. Resultados. Se analizaron 96 parejas donante-receptor de trasplante heptico. La frecuencia de genotipo variante fue del 38% en donantes y 48% en receptores. No existieron diferencias significativas entre las caractersticas del trasplante en funcin del genotipo del donante o del receptor. La tasa de incidencia total de infecciones fue similar en los receptores de un donante con genotipo salvaje o variante (p= 0.835). Los receptores de un injerto heptico de genotipo variante presentaron una mayor tasa de mortalidad por infeccin. No se observaron diferencias en cuanto a tasa de infecciones o evolucin en funcin del genotipo del receptor. En el anlisis multivariado, genotipo variante del donante (HR 2.83, IC95% 1.00-7.95), puntuacin MELD (HR 1.13, IC95% 1.05-1.22) e infeccin bacteriana post-trasplante (HR 11.0, IC95% 2.8-43.0) fueron factores independientes predictivos de mortalidad. Conclusin. El genotipo MBL2 variante del donante se asocia de forma independiente con una peor evolucin del trasplante, fundamentalmente por una mayor severidad de las infecciones.

CAMBIOS EN LA EXPRESIN DE LOS RECEPTORES ILT-3 (INMUNOGLOBULIN LIKE TRANSCIPT-3) E ILT-4 EN RECEPTORES DE TRASPLANTE RENAL SEGN LA EDAD DEL DONANTE Y RECEPTOR. Benito Almazan MJ1, Fernndez Fresnedo G2, Ruiz JC2, Benito A2, San Segundo D1, Alamillo C2, Arias M2, Lpez Hoyos M1. 1Servicio de Inmunologia. 2Servicio de Nefrologa. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. Entre los nuevos mecanismos tolerognicos con relevancia en la evolucin del trasplante de rganos se ha implicado la generacin de clulas dendrticas con fenotipo y funcin tolerognica. Este mecanismo est muy estudiado en modelos animales pero existen pocas evidencias en humanos. Adems, es posible que la edad pueda influir en la generacin y/o mantenimiento de estas clulas presentadoras de aloantgenos. Objetivo. Determinar el fenotipo de las clulas dendrticas sanguneas en receptores de trasplante renal a los 12 meses del trasplante, con especial atencin a las diferencias de edad entre receptor y donante. Mtodos. Se incluyeron 49 receptores de trasplante renal consecutivos de nuestro centro. Se analiz el nmero de clulas dendrticas inmaduras y maduras en sangre mediante tincin con anticuerpos monoclonales especficos y citometra de flujo, junto con la expresin de receptores inhibidores de la funcin de las clulas dendrticas (ILT3, ILT-4). Para el estudio se seleccionaron cuatro grupos de parejas receptor/donante segn la edad avanzada (M: >60 aos) o joven (J: Resultados. A los 6 meses del trasplante se encuentra un aumento significativo de la frecuencia de clulas dendrticas que expresan ILT-3 en el grupo DJ/RM respecto a DM/RM. No hay cambios en los receptores jvenes donde la expresin es incluso menor que en los receptores mayores. En cambio, ILT-4 aumenta en las clulas dendrticas a los 6 meses del trasplante en la combinacin DJ/RJ respecto a la DM/RJ pero no hay diferencias en los receptores mayores. Observamos adems una correlacin significativa entre el nmero absoluto de clulas dendrticas ILT-4+ y las clulas T reguladoras CD4+CD25high tanto en el momento pre-trasplante (r=0,476; p=0,004) como a los 6 meses post-trasplante (r=0,408; p=0,013) y a los 12 meses (r=0,517, p=0,041).Tambin encontramos correlacin significativa de estas clulas con la subpoblacin CD8+CD28- en el momento pre-trasplante (r=0,540; p=0,001) y a los 12 meses post-trasplante (r=0,609; p=0,012). Conclusin. El trasplante renal con un injerto joven, tanto en receptor mayor como joven, parece inducir ms clulas dendrticas con fenotipo tolerognico (definido por la expresin de ILT-3 e ILT-4) que el donante mayor. Financiacin: FIS, Fundacin Mutua Madrilea, Fundacin Marqus de Valdecilla-IFIMAV.

IDENTIFICACIN DE NUEVAS DIANAS ANTIGNICAS EN PACIENTES TRASPLANTADOS DE CORAZN Y DIAGNOSTICADOS DE ENFERMEDAD VASCULAR DEL INJERTO. Acevedo Calado MJ1, lvarez Mrquez A1, Aguilera I1, Caro Oleas JL1, Lage Gall E2, Wichmann Schlipf I1, Nuez Roldan A1. 1Servicio Inmunologa. 2Servicio de Cardiologa. Hospital Universitario Virgen del Roco. La Enfermedad Vascular del Injerto (EVI) se caracteriza por un engrosamiento progresivo de la ntima arterial. Es la causa principal de morbilidad y mortalidad despus del primer ao del trasplante. Aunque de patogenia desconocida, la EVI podra ser la manifestacin de una respuesta inmunitaria crnica, entre otras posibles causas. Objetivos. El objetivo principal de nuestro trabajo es identificar nuevas dianas antignicas, presentes en el suero de los pacientes, que puedan tener relevancia en la EVI post-trasplante cardiaco. Pacientes y Mtodos. Se seleccionaron 22 pacientes trasplantados de corazn con ms de un ao de evolucin y con EVI diagnosticada por IVUS (ecografa intravascular). Se estudi la presencia de anticuerpos anti-endoteliales en sueros previos y posteriores al trasplante mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en portas de clulas

23

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

HUVEC y la identificacin de los antgenos se realiz mediante el rastreo inmunolgico de una genoteca de expresin de arteria coronaria humana. Resultados. Dieciocho de los 22 pacientes presentaban un patrn nuclear similar, slo o en combinacin con otros patrones citoplasmticos. Se seleccion el suero de uno de estos pacientes para efectuar el rastreo y se obtuvieron 4 clones positivos que, tras ser secuenciados, correspondan a las siguientes protenas: hnRNP K, IFI16, TYMS y ZIP14. El antgeno hnRNP K es una ribonucleoprotena nuclear heterognea que est implicada en la regulacin de la expresin gnica. Su patrn nuclear, se confirm en IFI con un anticuerpo monoclonal comercial frente a sta protena y en WB de lisado de clulas HUVEC en el que da una banda de 64KDa tambin reconocida por el suero motivo del rastreo. El resto de los antgenos se encuentran bajo estudio. Conclusiones 1. Hemos descrito la presencia de anticuerpos frente a 4 nuevos antgenos en trasplantados de corazn. 2. El antgeno hnRNP K es reconocido por anticuerpos presentes en el suero de al menos 7 de estos pacientes.

protena del rgano donante y que pueden llegar a reproducir en algunos casos la enfermedad original. Es fundamental detectar y caracterizar cualquier anticuerpo aunque sea inusual en pacientes tras transplante con el fin de predecir las disfunciones y poder entender el mecanismo que las produce.

ANLISIS DE LA EVOLUCION DE LA RESPUESTA HUMORAL EN UN RECEPTOR CON DOS TRASPLANTES RENALES. Marin Crespo N, Andres Martin A, Mirete Bachiller S, Castaer Alabau JL. Hospital Ramn y Cajal. Madrid. Caso clnico. Varn de 43 aos con IRC secundaria a GMN mesangial IgA, sin sensibilizacin previa anti-HLA. Recibe un primer trasplante renal en 1996 con prueba cruzada negativa e incompatibilidades A29, A11, B57, B08, DR4, DR8. Rechazo agudo tardo y nefrectoma a los 6 aos post-trasplante. Segundo trasplante renal en marzo de 2000 con prueba cruzada negativa e incompatibilidades A31, B51, DR7. Recidiva de GMN mesangial IgA diagnosticada a los cuatro aos y diagnstico AP de nefropata crnica del injerto en 2006. Transplantectoma del segundo injerto en 2007. Objetivos. Estudio de la evolucin de las especificidades antiHLA a lo largo del tiempo y anlisis estructural de la respuesta de anticuerpos. Materiales y mtodos. Deteccin de anticuerpos anti-HLA-I, HLAII y MICA y estudio de sus especificidades mediante citometra de flujo. Anlisis de tripletes incompatibles mediante el algoritmo Matchmaker. Resultados. Tras el rechazo del primer injerto se detectan anticuerpos dirigidos frente a la incompatibilidad A1 y frente a antgenos con reactividad cruzada, esta respuesta estara dirigida frente a las regiones relacionadas con los tripletes incompatibles 9f y 90D. No se detectan anticuerpos frente a las otras incompatibilidades del injerto. Tras la nefrectoma se detectan anticuerpos frente a las incompatibilidades A29, B8 y B57 as como las especificidades comentadas anteriormente. El nuevo espectro de especificidades se correlaciona como mnimo con las regiones relacionadas con los tripletes 62RMN/66ASA, 62 qif y193av/207s/253q. Tras el rechazo del segundo injerto aparece un patrn de reactividad similar al anterior. Destaca la deteccin de reactividad frente a la incompatibilidad A31 del segundo injerto tanto en los sueros pre- como post-TX2 y que se explica por la regin que comparte con A29. No aparecen sin embargo anticuerpos frente al resto de incompatibilidades del segundo injerto. En el suero posterior a la nefrectoma no se observan variaciones con respecto a los sueros previos. Conclusiones: Tras el rechazo del primer injerto solo se detectan anticuerpos frente a la incompatibilidad A1, aunque la retirada del injerto evidencia la presencia de anticuerpos frente a todas las incompatibilidades del trasplante. El tratamiento inmunosupresor con acondicionamiento previo ha sido efectivo en la supresin de la respuesta humoral frente al segundo injerto. La presencia preTX2 de anticuerpos frente al antgeno A31 del segundo injerto plantea su implicacin en el rechazo tardo de ste, aunque los datos anatomo-patolgicos no permiten confirmarlo. Las intensidades de fluorescencia de los anticuerpos anti-A31 post-nefrectoma indicaran el secuestro de stos en el injerto. La prdida del segundo injerto, as como su posterior extirpacin no altera el patrn de anticuerpos anti-HLA.

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS INUSUALES EN PACIENTES POST-TRANSPLANTE HEPATICO. Alvarez Doforno R1, Alvarez L2, Yaez F1, Diaz MC3, Larrauri J4, Jara P3, Fontan G1. 1Servicio Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid. 2Unidad Investigacin. Hospital La Paz. Madrid. 3Servicio Hepatologa. Hospital Infantil La Paz. Madrid. 4Servicio Anatoma Patolgica. Hospital La Paz. Madrid. Introduccin. La hepatitis autoinmune de novo (HAI) tras transplante heptico es una patologa inflamatoria del hgado caracterizada por hipergammaglobulinemia, presencia de autoanticuerpos y buena respuesta a dosis crecientes de inmunosupresores. Caso 1 Paciente de 13 aos de edad en la actualidad, que a los 3 aos de vida se somete a transplante heptico por una colestasis crnica. A partir de los 3 aos y medio posttransplante sufre varios episodios de disfuncin del injerto. Caso2 Paciente de 7 aos que a los dos aos de vida se somete a transplante heptico con diagnostico previo de enfermedad de Jarabe de Arce. A los 5 aos post transplante presenta una disfuncin heptica. Objetivos. 1) Estudiar la presencia de autoanticuerpos en dos nios transplantados que presentan episodios de disfuncin heptica. 2) Identificar los antgenos reconocido 3) Determinar si los episodios de disfuncin estn relacionados con los anticuerpos. Materiales y Mtodos. Las tcnicas empleadas fueron inmunofluorescencia indirecta (IFI) sobre triple tejido de rata (hgado/rin/estmago), Inmunoblot (IMB) sobre extracto de hgado y/o protenas purificadas recombinantes. Resultados. Caso 1, Biopsia patrn histolgico con colestasis y transformacin gigantocelular. Se detecta anticuerpos anti-canalculos biliares a ttulo alto, que van dirigidos contra la protena BSEP. En ensayos in vitro de transporte de cidos biliares, se observa que estos anticuerpos son capaces de inhibir la funcionalidad del BSEP. Caso 2, Biopsia: Tejido heptico con lesiones de rechazo agudo ligero con moderada fibrosis portal. Se detecta Ac anti Mitocondriales a titulo alto tipo M2. Estos Ac reconocen al complejo deshidrogenasa de los cetocidos de cadena ramificada. Conclusiones. En algunos pacientes sometidos a transplante heptico se generan anticuerpos que pueden ser bloqueantes contra una

24

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

PERFIL DE ANTICUERPOS DONANTE ESPECFICOS EN PACIENTES TRASPLANTADOS RENALES CON RECHAZO MEDIADO POR ANTICUERPOS Y DEPSITOS DE C4d. Caro Oleas JL1, lvarez Mrquez A1, Aguilera Garca I1, Gentil MA2, Acevedo Calado MJ1, Cabello V2, Fernndez J3, Wichmann Schlipf I1, Gonzlez Escribano MF1, Nez Roldn A1. 1Servicio de Inmunologa. 2Servicio de Nefrologa. 3Servicio de Anatoma Patolgica del Hospital Universitario Virgen del Rocio Objetivos. La produccin de anticuerpos anti-HLA donante especficos post-trasplante se asocia con rechazo y fallo del injerto. Sin embargo, otros anticuerpos no HLA se asocian tambin al rechazo. Por otro lado, los anticuerpos anti-GSTT1 fueron descritos por nuestro grupo en 2001 en el suero de pacientes con trasplante heptico. Son muy especficos frente al antgeno del donante y aparecen en pacientes que carecen del gen de la GSTT1 cuando reciben un injerto de un donante positivo, dando lugar a una hepatitis inmune de novo. GSTT1 se expresa adems en rin. Por otra parte la presencia de anticuerpos frente a MICA se ha relacionado con una menor supervivencia del injerto renal. El objetivo principal de nuestro trabajo es identificar el perfil de anticuerpos donante especficos en pacientes con rechazo mediado por anticuerpos (RMA), que se pone de manifiesto por la deteccin de anticuerpos circulantes donante especficos (ADE) y el depsito de C4d en biopsias del injerto renal Pacientes y mtodos. Se seleccionaron 19 pacientes que cumplan los criterios histopatolgicos de RMA y que presentaban depsitos de C4d en biopsias renales. Se estudi la presencia, en sueros previos y posteriores al trasplante, de anticuerpos anti-HLA clase I, clase II y MICA especficos del donante mediante tecnologa Luminex. Los anticuerpos anti-GSTT1 se analizaron mediante IFI y/o ELISA. Resultados. En el momento de la biopsia, 4 pacientes (21%) tenan anticuerpos anti-HLA de clase I, tres (15.8%) anti-GSTT1, dos (10.5%) tenan anti-HLA de clase II y dos (10.5%) tenan anti-MICA; 4 pacientes tenan una combinacin de anticuerpos: HLA+MICA (n=1); HLAI + GSTT1 (n=2) y GSTT1+MICA (n=1). En 4 pacientes (21%) no se encontr ningn anticuerpo. La presencia de anti-GSTT1 se asociaba significativamente con RMA (p=0.026). Conclusin. Adems de los anticuerpos anti-HLA, los anticuerpos anti GSTT1 y MICA pueden estar implicados en el rechazo mediado por anticuerpos en el trasplante renal.

Inmunoglobulinas sricas, subclases de IgG, complemento, protena C reactiva, ANA, tipaje HLA y ac citotxicos, subpoblaciones linfocitarias, Rx trax, prueba tuberculnica y booster, hemograma, bioqumica, marcadores tumorales. Profilaxis de rechazo: Micofenolato mofetil (1-3g/24h VO) profilctico durante 1-2 aos. Esta terapia es complementaria al tratamiento habitual con ciclosporina y corticoides tpicos y prednisona oral (4-6 semanas tras el TCor). Tratamiento de rechazo: Tacrolimus (niveles 2-8 ng/ml) o Ciclosporina (niveles 125-175 ng/ml) segn perfil de efectos adversos, y prednisona a bajas dosis segn respuesta. Profilaxis antiinfecciosa: Isoniacida (si riesgo de TBC) y TMP-SMX. Resultados. Excludos: 7, en lista de espera: 2, tratados: 5. Motivos de exclusin: tumores activos (3), enfermedad sistmica descompensada (1), infeccin grave activa (1), otros (2). Estudio pre-TCor: Prueba tuberculnica o booster positivo: 4/9 pacientes; hipogammaglobulinemia: 4/14, 451-746 mg/dl; ac citotxicos positivos: 1/12. Evolucin: En 2 retrasplantes nuevos: los 2 libres de rechazo (1 en paciente con 3 injertos previos rechazados y anticuerpos anti-HLA elevados, se realiz seleccin de donante sin los Ag HLA que reconoce). En 3 TCor con rechazo: 1 injerto transparente sin vascularizacin y buena AV, 1 injerto transparente con persistencia de vascularizacin y buena AV, 1 sin mejora. Complicaciones: 2 episodios de infecciones respiratorias sin consolidacin. Conclusin. La aplicacin del protocolo descrito podra impactar positivamente en el resultado del TCor de alto riesgo.

SESIN 4: INMUNOLOGA TUMORAL - I Moderadores: Dr. Francisco Ruiz-Cabello (Granada), Dr. Ignacio Melero (Navarra) THERAPEUTIC ANTI-TUMOR EFFICACY OF ANTI-CD137 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODY IN MOUSE MODELS OF MYELOMA. Murillo O2, Dubrot J2, Arina A2, Hervs-Stubbs S2, Melero I1. 1CIMA, Clnica Universitaria. 2CIMA. Purpose. Eradication of post-treatment residual myeloma cells is needed to prevent relapses and immunostimulatory monoclonal antibodies (mAbs) such as anti-CD137, CTLA-4, CD40, etc, that enhance the immune response against malignancies represent a means of achieving this purpose. This study explores anti-CD137 mAbs for mutiple myeloma (MM) treatment in preclinical models of the disease because they safely augment tumor immunity and are in clinical trials for other cancers. Experimental design. The anti-tumor effect of anti-CD137 mAb on mouse plasmacytomas derived from HOPC and NS0 cell lines was studied and compared with that of anti-CTLA-4, anti-CD40 and antiICAM-2 mAbs. The anti-tumor effect of anti-CD137 mAb was also examined in a mouse syngeneic disseminated myeloma (5TGM1) model, which more closely resembles human MM. Depletions of specific cell populations and gene-targeted mice were used to unravel the requirements for tumor rejection. Results. Agonistic mAb against CD137 and blocking anti-CTLA4 mAb showed activity against intra-peritoneal HOPC tumors, resulting in extended survival of mice that also became immune to re-challenge. Anti-CD137 mAbs induced complete eradications of established subcutaneous NS0-derived tumors that were dependent on IFN, NK cells and CD8+ T lymphocytes. NK cells accumulated in tumor draining lymph nodes (TDLNs) and showed increased IFN- produc-

INMUNOSUPRESION SISTEMICA AMPLIADA EN TRASPLANTE CORNEAL CON ALTO RIESGO DE RECHAZO. Sarmiento E1, Balado P2, Baeza A2, Vicario JL3, Acero A2, Palka M4, Carbone J1. 1Servicio de Inmunologa. 2Servicio de Nefrologa. 3Servicio de Anatoma Patolgica del Hospital Universitario Virgen del Rocio 1Servicio de Inmunologa. Hospital Gregorio Maran. Madrid. 2Servicio de Oftalmologa. Hospital Gregorio Maran. Madrid. 3Centro de Transfusiones. CAM. 4Facultad de Medicina. UCM. Madrid. Introduccin. Sin inmunosupresin sistmica los trasplantes corneales (TCor) de alto riesgo presentan ms del 50% de rechazo en el primer ao. Objetivo. Evaluar los riesgos y utilidad de la implementacin de un protocolo individualizado de profilaxis y tratamiento de rechazo en pacientes sometidos a TCor de alto riesgo. Mtodos. Resultados preliminares del estudio de 14 pacientes. Etiologa del TCor: rechazo crnico (7; 1-3 queratoplastas previas), rechazo agudo (1), perforaciones corneales (4), otros (2). PROTOCOLO: Pre-TCor:

25

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

tion. Anti-tumor efficacy of anti-CD137 mAb was preserved in CD28deficient mice, despite the fact that CD28 signaling increases the expression of CD137 on CD8+ T cells. Importantly, anti-CD137 mAb treatment significantly decreased systemic tumor burden in the disseminated 5TGM1 model. Conclusions. Anti-CD137 mAbs immune-mediated anti-tumor activity in mouse models holds promise for myeloma treatment in humans.

IN VIVO DEPLETION OF DENDRITIC CELLS IMPAIRS BUT DOES NOT COMPLETELY ABROGATE THE ANTI-TUMOR EFFECT OF AGONISTIC ANTI-CD137 MONOCLONAL ANTIBODIES. Murillo O2, Arina A2, Azpilicueta A2, Prez-Gracia JL3, HervsStubbs S2, Melero I1. 1CIMA, Clnica Universitaria. Universidad de Navarra. 2CIMA. 3Clnica universitaria. Anti-CD137 monoclonal antibodies (mAbs) are capable of inducing tumor rejection in several murine syngeneic tumor models. This antitumour effect is thought to involve the activation of naive CD8 T cells that are specific for tumor antigens cross-presented by dendritic cell (DCs). However, whether DCs are required for the efficacy of anti-CD137 treatment has never been examined. This study investigates the involvement of DCs in the rejection of EG7-OVA tumors upon treatment with anti-CD137 agonistic mAb. This thymoma expresses chicken ovoalbumin (OVA) as a traceable antigen to which specific immune responses can be monitored in vivo and in vitro following anti-CD137 mAb treatment. The administration of anti-CD137 mAbs cause the eradication of EG7-OVA derived tumors by a CD8+ T cell-dependent mechanism that correlates with increased cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity against the immunodominat OVA epitope. Although tumor cells are detectable in the tumor draining lymph nodes (TDLNs) of EG7-OVAbearing mice, tumor antigen presentation to OVA-specific CD8+ T lymphocytes in this model depends primarily on cells derived from the host. Ex vivo analyses to determine the identity of the cell type(s) responsible for tumor antigen cross-presentation has revealed that CD11c+ cells, most likely DCs, mediate this function. Using DTR-GFP C57BL/6 bone marrow chimeric mice, which allow for sustained in vivo ablation of DCs with diphtheria toxin, we confirmed the involvement of this cell subset in tumour antigen cross-presentation and in CTL induction against EG7-OVA. However, exhaustive depletion of DCs incompletely abrogates antitumor efficacy of anti-CD137 mAb indicating that DC-mediated cross-presentation is not an absolute requirement.

geno-especficas mostraron un fenotipo efector/memoria (CD127pos, CD62Lneg). El anlisis del repertorio de TCRs demostr un uso predominante de las cadenas Vbeta4 y Vbeta6 para el reconocimiento del eptopo NY-ESO-1 (157-165). Se observ adems una potente respuesta de clulas T CD4 especficas para NY-ESO-1, que increment significativamente la respuesta CD8 as como una fuerte respuesta humoral frente a diferentes eptopos lineales de NY-ESO-1. En conclusin, la inmunizacin con el antgeno tumoral NY-ESO1 en ratones transgnicos usando vectores lentivirales estimula una respuesta celular y humoral similar a la observada en pacientes con tumores NY-ESO-1+.

INDUCCIN DE APOPTOSIS POR AGENTES DESMETILANTES EN CLULAS T LEUCMICAS. Ruiz Magaa MJ, Morales Camino JC, Ruiz Ruiz MC. 1Centro de Investigaciones Biomdicas. La hipermetilacin del ADN es un mecanismo epigentico relacionado con el desarrollo del cncer que provoca el silenciamiento de genes supresores de tumores. Al contrario de lo que ocurre con los cambios genticos, esta alteracin epigentica se puede revertir mediante agentes farmacolgicos que inducen la hipometilacin del ADN, lo que sugiere el uso de las llamadas drogas epigenticas, solas o en estrategias combinadas, en la terapia del cncer. El objetivo de este trabajo es conocer el efecto que tienen los agentes desmetilantes decitabine y zebularine, solos o en combinacin con el ligando de muerte TRAIL, sobre lneas de clulas leucmicas T y sobre clulas T no transformadas. Hemos analizado la induccin de apoptosis por ambos agentes desmetilantes, as como la posible sensibilizacin a la muerte mediada por TRAIL, tanto en clulas T leucmicas como en T normales, mediante determinacin del ciclo celular con yoduro de propidio. Tambin se han estudiado las seales implicadas en la induccin de apoptosis por decitabine y zebularine y la regulacin de genes pro- y anti-apoptticos por dichos agentes, mediante las tcnicas de Western-blot y RT-PCR. Los resultados obtenidos indican que tanto el decitabine como el zebularine inducen apoptosis dependiente de caspasas y de la activacin de la ruta mitocondrial en lneas de clulas T leucmicas. Sin embargo, no son capaces de potenciar la muerte mediada por TRAIL en este modelo tumoral. Por otro lado, se ha observado que estos agentes desmetilantes no presentan efectos sobre la viabilidad de clulas T normales lo que sugiere su baja toxicidad y por tanto su posible utilizacin en terapia anti-turmoral.

LA INMUNIZACIN CON VECTORES LENTIVIRALES EN RATONES TRANSGNICOS INDUCE RESPUESTA CELULAR Y HUMORAL FRENTE AL ANTGENO TUMORAL NY-ESO-1. Casado JF1, Janda J2, Colombetti S2, Lvy F2. 1Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura. 2Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne Branch. Los vectores lentivirales infectan clulas dendrticas permitiendo la expresin estable de un gen y el desarrollo de una repuesta inmune cuantitativa y cualitativamente superior. En este trabajo hemos analizado la respuesta inmune en ratones transgnicos HLA-A2+ inmunizados va subcutnea con vectores lentivirales que codifican para el antgeno tumoral NY-ESO-1. La inmunizacin subcutnea con lentivectores dispar una respuesta de clulas T CD8+ especficas para diferentes eptopos. Esta respuesta fue mayor y ms duradera que la obtenida mediante inmunizacin con pptidos. Las clulas T CD8+ ant-

CORRELACIN ENTRE LA EXPRESIN DE HLA DE CLASE I Y LA PROGRESIN/REGRESIN DE LAS METSTASIS DE MELANOMA EN DOS PACIENTES SOMETIDOS A INMUNOTERAPIA. Carretero R1, Romero JM1, Rodriguez AB1, Maleno I1, Camacho F2, Rodriguez F2, Real LM3, Ruiz-Cabello F1, Garrido F1, Cabrera T1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves. 2Hospital Universitario Virgen Macarena, 3Neocodex. A pesar de los buenos resultados obtenidos por la inmunoterapia en estudios preclnicos, solo se ha conseguido una regresin tumoral significativa en una pequea proporcin de pacientes. Estos pobres resultados pueden deberse a mecanismos de escape inmunitario por parte de las clulas tumorales, uno de ellos es la alteracin en la expresin de HLA de clase I.

26

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

Hemos estudiado la expresin de MHC de clase I en 16 metstasis obtenidas de dos pacientes con melanoma sometidos a inmunoterapia. Seis fueron obtenidas de un paciente tratado con vacunacin autloga ms BCG (M-VAX) y 10 de otro paciente sometido a dos tratamientos inmunoterpicos, 5 tras interfern-alfa-2b y 5 tras vacunacin autloga ms BCG (M-VAX). Once de las metstasis estaban en regresin en el momento de la extirpacin mientras que 5 estaban en progresin, segn los PET y TAC realizados. Las metstasis en regresin mostraban altos niveles de expresin de HLA de clase I mientras que las metstasis en progresin tenan niveles bajos de HLA de clase I, estos estudios se realizaron mediante tcnicas inmunohistoqumicas con anticuerpos monoclonales especficos frente a diferentes molculas de HLA de clase I y cuantificacin de la beta 2 microglobulina, cadena pesada y los locus A,B y C mediante PCR a tiempo real. Nuestros resultados apoyan la hiptesis de que la alteracin en la expresin de molculas HLA de clase I juega un papel esencial en el escape tumoral del sistema inmunitario que puede ser determinante en la progresin o regresin de las metstasis. La diferente expresin de molculas HLA de clase I en los dos grupos de metstasis puede ser debida a la modificacin del microambiente tumoral por la inmunoterapia, la cual podra aumentar la expresin de clase I solo en las metstasis con alteraciones reversibles.

do: (i) al tropismo selectivo de este tipo celular por ciertas clases de tumores slidos, (ii) a la produccin local y mantenida de agentes teraputicos que, en muchos casos, presentan importantes limitaciones farmacocinticas y de toxicidad sistmica.

ANTICUERPOS RECOMBINANTES TRIVALENTES PARA LA IMAGEN MOLECULAR DEL CNCER. Cuesta Martnez A, Snchez Lpez M, Sanz L, lvarez-Vallina L. Hospital Universitario Puerta de Hierro. El descubrimiento de los anticuerpos monoclonales y el desarrollo de las tcnicas de ingeniera gentica, ha propiciado que los anticuerpos recombinantes (AcR) se conviertan en una slida tecnologa de plataforma para producir molculas diagnsticas, con utilidad para localizar depsitos tumorales in vivo. Los AcR que carecen de la regin Fc, como los fragmentos scFv (del ingls, single chain Fv), ofrecen ventajas: 1) son fciles de producir en sistemas bacterianos, 2) se extravasan ms eficazmente y 3) tienen una mayor capacidad de penetracin tisular. Sin embargo, su vida media es muy corta, ya que las protenas recombinantes con un tamao inferior a 60 Kd son filtradas por el glomrulo y excretadas por la orina rpidamente. Para aumentar su vida media se han propuesto diferentes sistemas, siendo el ms obvio su oligomerizacin. Los AcR mas utilizados son los bivalentes con formato: diabody (scFv con linkers cortos se impiden el apareamiento intramolecular entre dominios VH y VL intracatenarios) y minibody (scFv unido a un dominio CH3/Fc). En este trabajo proponemos un nuevo AcR trivalente (AcR-T) formado por un scFv unido al dominio de trimerizacin del colgeno XVIII. Empleando esta estrategia se generaron AcR-Ts a partir de los scFv: B1.8 (anti-hapteno NIP), L36 (anti-laminina) y MFE-23 (anti-CEA humano). Todos los AcR-Ts se comportaron como trmeros en solucin y fueron muy estables. Para los ensayos de localizacin tumoral (tumor targeting) los AcR-Ts se conjugaron con el fluorocromo cianina 5 (Cy5) que emite en el infrarrojo cercano, y se emplearon tcnicas de imagen molecular, que permiten una visualizacin no invasiva en organismos vivos, y un seguimiento continuado en tiempo real. La conjugacin de los AcR-Ts con Cy5 no alter sus caractersticas moleculares y funcionales. Despus de su administracin sistmica, en ratones portadores de tumores humanos, el AcR-T B1.8 no demostr localizacin tumor-especfica, el AcR-T MFE23 demostr localizacin especficamente en tumores CEA+, y el AcR-T L36 demostr localizacin tumor-especfica en todos los modelos estudiados. Estos datos indican que el formato AcR T es un armazn con propiedades farmacocinticas muy favorables y que equipado con un scFv adecuado presenta una excelente capacidad de localizacin tumoral. Nuestros resultados abren nuevas vas para el desarrollo de procedimientos diagnsticos no invasivos del cncer humano.

CLULAS MADRE MESENQUIMALES: VEHCULOS Y FACTORAS DE ANTICUERPOS TERAPUTICOS. Compte Grau1, Sanz Alcober L2, Vicario JL1, lvarez-Vallina L1. 1Unidad de Inmunologa Molecular, Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2Unidad De Histocompatibilidad, Centro de Transfusin de la Comunidad de Madrid. Las clulas madre mesenquimales (MSC, del ingls Mesenchymal Stem Cells) son clulas multipotentes y con alta capacidad regenerativa. En los ltimos aos se han desarrollado distintos ensayos para evaluar su utilidad y su potencial teraputico en protocolos de terapia regenerativa y terapia celular antitumoral. Estudios recientes han demostrado que MSCs se incorporan y sobreviven en el microambiente tumoral donde contribuyen activamente a la formacin del estroma tumoral, constituyendo as un modelo potencialmente til para la liberacin local de agentes teraputicos. En este trabajo nos planteamos modificar genticamente MSCs humanas (hMSCs), obtenidas de mdula sea, para estudiar su potencial como factoras de un anticuerpo biespecfico recombinante con formato diabody, con especificidad frente a la cadena epsilon del complejo TCR/CD3 humano y frente al antgeno carcinoembrionario (CEA) humano (antiCEA/antiCD3). Para llevar a cabo esta estrategia, generamos un vector lentiviral (pRRL-dAb-IRES-GFP), derivado del HIV-1, tricistrnico que contiene los genes del diabody biespecfico (dAb cadena 1 y dAb cadena 2) y el gen de la protena verde fluorescente (eGFP) unidos a travs de secuencias IRES derivadas del virus de la encefalomiocarditis. En ensayos in vitro, comprobamos que hMSCs infectadas expresaban, de forma estable, altos niveles de eGFP (85%) durante ms de un mes y secretaban niveles apreciables de diabody antiCEA/antiCD3 funcional. Empleando tcnicas de imagen molecular in vivo, observamos que hMSCs se distribuan de forma homognea en el depsito tumoral y expresaban eGFP al menos 30 das postimplantacin de una mezcla (1:2) de hMSCs modificadas genticamente con clulas tumorales gstricas humanas. El estudio inmunohistoqumico de las piezas tumorales demostr la presencia de diabody antiCEA/antiCD3 en el estroma peritumoral. El uso de hMSCs ofrece ventajas potenciales debi-

DESARROLLO Y VALIDACIN DE UN MODELO DE ANGIOGNESIS HUMANA IN VIVO MONITORIZABLE MEDIANTE TCNICAS DE IMAGEN MOLECULAR. Sanz Alcober L1, Santos-Valle P1, Vicario JL2, Serrano A3, lvarez-Vallina L1. 1Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2Unidad de Histocompatibilidad, Centro de Transfusin de la Comunidad de Madrid. 3Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario Doce de Octubre, Madrid. El proceso angiognico, clave en el crecimiento tumoral, implica complejas interacciones moleculares y celulares que no pueden ser

27

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

recapituladas in vitro. Sin embargo, no disponemos de modelos in vivo de angiognesis humana validados para el screening de agentes potencialmente antiangiognicos. Recientemente se ha descrito, en ratones inmunodeficientes, la formacin de vasos humanos mediante la coimplantacin de clulas endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) y clulas madre mesenquimales (MSC) murinas, capaces de diferenciarse en clulas murales de soporte. Con el fin de desarrollar un modelo de angiognesis humana, simple y no invasivo, clulas HUVEC fueron transducidas con un vector lentiviral que codifica el gen reportero de la luciferasa. La deteccin de la bioluminiscencia, producida tras la administracin intraperitoneal del sustrato, permite la monitorizacin no invasiva de la actividad angiognica de las clulas HUVECluc. Con el objeto de que este modelo fuera completamente humano, las clulas endoteliales fueron coimplantadas con MSC humanas (HMSC) derivadas de mdula sea. La actividad luciferasa de las clulas HUVECluc implantadas en ratones atmicos pudo ser detectada durante ms de 120 das, y se correlacion, a nivel histolgico, con la formacin de una vasculatura humana madura y estable. La presencia de clulas HMSC result crtica para la maduracin de la vasculatura neoformada. Para estudiar la utilidad de este modelo de angiognesis humana, en el screening de compuestos antiangiognicos, un grupo de ratones portadores de estos implantes vasculares recibi el frmaco antiangiognico SU5416. La monitorizacin seriada de la actividad luciferasa demostr una disminucin estadsticamente significativa de la actividad luciferasa en el grupo tratado, en comparacin con el grupo control. En conclusin, este modelo ofrece nuevas oportunidades para el estudio longitudinal de mecanismos implicados en el proceso de neoformacin vascular y la monitorizacin de las respuestas a agentes inhibidores de angiognesis.

Se estudi la citotoxicidad de las clulas expandidas y de las diferentes sub-poblaciones mediante ensayos de liberacin de 51Cr. No se observaron diferencias en la capacidad de lisis entre cultivos expandidos a partir de clulas de cordn umbilical y sangre perifrica. La comparacin de la citotoxicidad exhibida por las sub-poblaciones CD8+CD56+ y CD8+CD56- demostr que si bien ambas presentan capacidad citotxica, esta es superior en la poblacin CD56+. Se evidenci citotoxicidad frente a lneas celulares con ausencia o disminucin en la expresin de molculas HLA de clase I, sugiriendo el empleo de mecanismos TCR independientes de citotoxicidad. Las clulas CD8+CD56+ presenta capacidad ltica frente a un nmero determinado de clulas diana. Con el fin de determinar si las clulas CD3+CD56+ pueden ser re-direccionadas frente a clulas dianas no susceptibles, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales biespecficos, empleamos tetrmeros bi-especficos CD3:CD20 y CD3:CD19. Utilizando esta aproximacin hemos conseguidos incrementar de forma significativa la citotoxicidad de los cultivos de clulas totales as como de poblaciones CD3+CD56+ tanto frente a lneas tumorales CD19+ y CD20+ como a clulas leucmicas primarias.

UTILIDAD Y RIESGOS DE LA DETECCIN DEL FENOTIPO ABERRANTE CD19+CD10+CD38-/+ EN LA ENFERMEDAD MNIMA RESIDUAL. Alcal Pea MI, Rodrguez Martn E, Martnez Viambres E, Coll Mart J, Roldn E. Hospital Ramn y Cajal. Madrid. Introduccin. La deteccin de fenotipos aberrantes en los blastos de las leucemias agudas (LA) al diagnstico resulta fundamental en el seguimiento de la enfermedad mnima residual (EMR). Sin embargo, no siempre se tienen datos disponibles sobre la aparicin de tales poblaciones en otro tipo de patologas o en mdulas seas (MO) en reconstitucin. Objetivos. Estudiar la expresin de distintos antgenos de superficie en precursores B de pacientes con leucemia linfoide aguda (LLA), otras patologas y MO sanas, con el fin de determinar si dicha expresin es til en el estudio de la EMR. Mtodos. Deteccin de linfocitos B (LB) CD10+CD38-/+ (baja intensidad) en MO por citometra de flujo (CTF). Se tuvieron en cuenta aquellos eventos que por tamao, granularidad e intensidad de CD19 podan considerarse LB viables. Determinacin de la capacidad proliferativa de LB CD10+ por BrdU. Resultados. Se estudiaron por CTF muestras de diez pacientes con el objeto de detectar un fenotipo considerado clsicamente aberrante: CD19+, CD10+, CD38-/+ (baja intensidad). Cinco fueron controles sanos, dos leucemias mieloides agudas en remisin completa, dos leucemias crnicas y un LNH. En 5 de ellos no se detectaron clulas con dicho fenotipo, mientras que en los casos restantes s se detectaron estas clulas, con un porcentaje comprendido entre 0,0034%-0,029% sobre la celularidad total (media de 0,015%). Por otro lado, el ndice proliferativo de esta subpoblacin de precursores B (clulas BrdU+) fue variable (5,79%-23,88%), al igual que el observado en enfermos con LLA (1,48%-13,54%), por lo que tal caracterstica no diferenci a las clulas de enfermos con LLA de las de los otros grupos. Conclusiones. Aunque el fenotipo aberrante CD19+CD10+CD38/+ (baja intensidad) puede considerarse como un fenotipo til en el seguimiento de la EMR, su deteccin en enfermos de LLA en porcentajes inferiores al 0,03% de la celularidad total medular no excluye la posibilidad de que se trate de blastos linfoides normales.

LOS LINFOCITOS CIK (CYTOKINE-INDUCED KILLERS) EXPANDIDOS A PARTIR DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL Y SANGRE PERIFRICA PUEDEN SER REDIRIGIDOS MEDIANTE ANTICUERPOS BI-ESPECFICOS. Bustamante L, Garca-Snchez F, Vicario JL, Balas A. Centro de Transfusin de Madrid. Las clulas CIK (Cytokine-Induced Killer) son un grupo heterogneos de linfocitos que incluyen fundamentalmente clulas CD3+CD8+ CD56+. Los linfocitos CD3+CD56+ estn presentes tanto en sangre perifrica (1-5%), como en sangre de cordn umbilical (0,1%). Presentan capacidad antitumoral mediante mecanismos independientes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), habiendo demostrado especificidad por un nmero limitado de clulas diana (K562, Jurkat), incluyendo leucemias mieloides agudas y crnicas, as como linfomas B. Partiendo de unidades de cordn umbilical y sangre perifrica de individuos sanos se han realizado expansiones 'in vitro'. Mediante el empleo de IFN, OKT3 e IL-2, se ha conseguido expandir en 21 das 1.461 veces la poblacin inicial de clulas CD3+CD56+ presente en sangre perifrica, y hasta 3.000 veces en 14 das, la misma poblacin presente en unidades de cordn umbilical. Todas las poblaciones incrementan la intensidad de expresin del receptor de activacin NKG2D, as como de perforina, indicando un incremento en la capacidad citotxica de las clulas. Tras 14-21 das de expansin los cultivos se componen de clulas CD3+ 96,2 0,9, CD8+ 60% 12, CD4+ 40 10. La poblacin CD3+CD56+ no demostr uso preferencial de ninguna cadena V.

28

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

DETECCIN DE CLULAS TUMORALES CIRCULANTES EN UN LINFOMA DE EFUSIN PRIMARIA. Alcal Pea MI, Martnez Viambres E, Villar Guimerans ML, Benito Berrinches A, Coll Mart J, Roldn Santiago E. Hospital Ramn y Cajal. Madrid. Introduccin. El linfoma de efusin primaria (PEL), un tipo de linfoma de cavidades, se caracteriza por efusiones y crecimiento en fase lquida de clulas tumorales dentro de cavidades corporales, en ausencia de un tumor slido, adems de infeccin por herpesvirus 8. Aunque se ha descrito que el PEL posiblemente se origine en los centros germinales o postgerminales de los ganglios, hasta el momento no se ha descrito la presencia de clulas tumorales circulantes. Objetivos. Descripcin inmunofenotpica de un caso de PEL en lquido asctico (LA) en varn VIH- y deteccin de clulas clonales en sangre perifrica (SP) como posibles clulas precursoras. Mtodos. Muestras de SP, mdula sea (MO) y LA. El estudio de las poblaciones se llev a cabo por citometra de flujo. Resultados. Paciente diagnosticado desde 2001 de una leucemia mielo-monoctica crnica (LMMC). En 2007 el paciente desarroll ascitis en la cavidad abdominal. En la muestra de LA estudiada se detect una poblacin mayoritaria (87% de la celularidad total) con caractersticas citolgicas aberrantes y cuyo perfil antignico no corresponda con el de la LMMC original. Los resultados inmunofenotpicos descartaron poblacin blstica, de estirpe mielo-monoctica o linfoide. Sin embargo, dicha poblacin presentaba fenotipo de clula plasmtica (CP), con fenotipo CD38+ high, CD138+, CD19-, inmunoglobulina (Ig) de superficie -, kappa citoplsmica+. Mediante la tcnica de inmunofijacin no se detect Ig clonal ni en LA ni en suero. Adems de la poblacin descrita, se detect tanto en SP como en MO una poblacin de linfocitos B (LB) CD19+ con una intensidad de CD79b inferior a lo habitual y kappa de superficie +. Conclusin. Por vez primera se detecta una poblacin tumoral circulante en un PEL, cuyo perfil antignico (LB con una prdida parcial de CD79beta) sugiere una fase madurativa previa a la poblacin mayoritaria que se detecta en LA (clula plasmtica o pre-plasmtica).

marcador de enfermedades alrgicas, ya que la expresin de dicha protena se relaciona directamente con la severidad de la enfermedad. Objetivo. Estudiar la expresin de las protenas SOCS-1, 3 y 5 en linfocitos CD4+ y eosinfilos de sangre perifrica de pacientes con patologa respiratoria Th2 (asma extrnseco y bronquitis eosinoflica) e individuos sanos. Metodologa. Se analiz por PCR cuantitativa a tiempo real, los niveles de expresin gnica de SOCS-1,3 y 5 en los linfocitos CD4+ y eosinfilos de sangre perifrica de pacientes con patologa respiratoria (asma extrnseca y bronquitis eosinoflica) y donantes sanos. Tambin se realiz un anlisis inmunohistoqumico y por inmunofluorescencia en los eosinfilos para corroborar la expresin de la protena SOCS-3 en dichas clulas. Resultados y conclusiones. Los resultados en los linfocitos CD4+ indican que hay diferencias en la expresin de los genes de SOCS-1 y SOCS-3, siendo este ltimo mayor en el grupo de sujetos enfermos frente a los individuos sanos. Sin embargo, no existen diferencias estadsticamente significativas, entre los grupos de sujetos, en la expresin de SOCS-5. En el caso de los eosinfilos, se encuentran diferencias en la expresin de SOCS-3, siendo ms elevada en los eosinfilos de los pacientes. Por lo tanto, se describe por primera vez la expresin de las protenas SOCS en los eosinfilos humanos, existiendo una correlacin en los niveles de SOCS-3 en linfocitos CD4+ y eosinfilos de pacientes, postulando a SOCS-3 como un marcador de enfermedad.

MUTACIONES EN STAT3 EN EL S. DE HIPER IgE. Espaol Boren1, Garces P1, Caragol I1, Hernndez M1, Soler P2, Woellner C3, Grimbacher B3. 1U. Immunologia. H. Vall dHebron.Barcelona. 2U. Infecciosas e Inmunodeficiencias pediatricas. H. Vall DHebron. Barcelona. 3Immunology and Molecular Pathology. Dept. Royal Free Hospital. Londres. Objetivos. El sndrome de Hiper Ig E (HIES) es una inmunodeficiencia primaria (IDP) caracterizada por infecciones recurrentes por hongos y bacterias, eczema, fracturas seas espontneas, lesiones intraorales, eosinofilia y niveles elevados de Ig E > 2000 IU/ml. Los patrones clnicos, inmunolgicos y hereditarios son altamente heterogneos, y el diagnostico diferencial difcil en muchas ocasiones. Se presentan datos clnicos de nuestra serie de casos con los primeros anlisis mutacionales. Material y Mtodos. Revisin de antecedentes clnicos, familiares e inmunolgicos de cinco pacientes diagnosticados de HIES desde 1979 y el posterior anlisis mutacional. Resultados. Los pacientes (3 hombres y 2 mujeres) de entre 4 y 40 aos de edad, se diagnosticaron de HIES. La infeccin por Cndida y/o Aspergillus fue detectada en cuatro de cinco casos. Dos pacientes presentaron neumonia por Staphylococcus aureus con neumatoceles secundarios y fallecieron a los 4 y 14 aos de edad. Las dos mujeres se diagnosticaron a los 2 y 30 aos de edad. Actualmente ambas presentan secuelas pulmonares y reciben tratamiento antibitico profilctico y gammaglobulina ev en la primera paciente. Los niveles de IgE oscilaron entre 2500 y 32000 IU/ml. Se han demostrado dos mutaciones diferentes en el gen STAT3 (cambios aminoacdicos N466T y R382Q) segn estudio realizado en el Royal Free Hospital de Londres, en un caso familiar (herencia autosmica dominante) y en uno aislado, respectivamente. Los dems casos estn en estudio. Conclusiones. HIES es una IDP muy poco frecuente y de clnica muy heterognea. Los estudios genticos abren una puerta importante para facilitar el diagnstico especfico y permitir el consejo gentico.

SESIN 5: INMUNODEFICIENCIAS: ALERGIA Y COMPLEMENTO Moderadores: Dra. Margarita Lpez-Trascasa (Madrid), Dra. Nria Matamoros (Palma de Mallorca) ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE PROTENAS SOCS EN LINFOCITOS CD4+ Y EOSINFILOS DE PACIENTES CON PATOLOGA RESPIRATORIA. Lpez Cernada ME1, Sastre B1, Gmez C1, Chacrtegui M1, del lamo C1, Crdaba B1, Palomino P2, Lahoz C2, del Pozo V2. 1Fundacin Jimnez Daz-Capio y Ciberes (ISCII). 2Fundacin Jimnez Daz-Capio. Introduccin. Los supresores de la sealizacin de citocinas (SOCS) representan una familia de protenas descubierta recientemente que estn implicadas en la regulacin negativa de la sealizacin de citocinas, asociada a la ruta JAK-STAT. Se ha visto que la seal reguladora a travs de miembros SOCS puede tener un papel importante en el balance de citocinas que determinan las respuestas mediadas por Th1 y Th2. SOCS-3 y SOCS-5 son principalmente expresadas en Th2 y Th1 respectivamente y ejercen una inhibicin recproca sobre la diferenciacin de dichas clulas Th. Estudios recientes han descrito a SOCS-3 como un nuevo

29

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LOS ALERGENOS DEL EXTRACTO DEL POLEN DE SENECIO JACOBEA. Gmez Gmez C1, Luengo O2, Moll R1, Lpez E1, Sastre B1, Lahoz C1, del Pozo V1. 1Fundacin Jimnez Daz-Capio y Ciberes. 2Hospital Vall dHebrn. Barcelona. Introduccin. La familia de las Asteraceae es una de las familias ms representadas con ms de 1100 gneros y 20000 especies. Aunque cosmopolita, principalmente se localiza en las regiones templadas y subtropicales; en la Pennsula Ibrica han sido descritas ms de 1500 especies siendo Senecio vulgaris y Senecio jacobea las ms comunes. Objteivos. Determinar la importancia alergnica de S. jacobea e identificar sus alergenos principales; as como estudiar si presenta reactividad cruzada con otras plantas. Material y Metodos. Se reclutan 50 pacientes con rinoconjuntivis y prueba cutnea positiva frente a extracto de S. jacobea. La identificacin de sus alergenos se ha llevado a cabo mediante SDS-PAGE, geles 2D e inmunodeteccin. Posteriormente, la identificacin de estos alergenos ha sido realizada por espectrometra de masas y los resultados obtenidos comprobados por inmunoblot y microarray. Se realizan inmunoblot y ELISA de inhibicin para estudiar la reactividad cruzada de S. jacobea con otras especies de la misma familia y con Parietaria judaica. Resultados. El extracto del polen de S. jacobea presenta bandas de protenas entre 14-100KDa. Se han identificado 3 alergenos mayoritarios de 59, 39-42, y 31KDa. El anlisis 2D revela 8 spots de alrededor de 59KDa y 39-42KDa. Estos spots han sido identificados como malato deshidrogenasa y pectato liasa por espectrometra de masas. Se ha comprobado que la malato deshidrogenasa y la pectato liasa son alergenos de S. jacobea ya que son reconocidos por los sueros de los pacientes alrgicos. Los ensayos de inhibicin demuestran la existencia de reactividad cruzada entre S. jacobea y Artemisia vulgaris, as como entre S. jacobea y P. judaica. Conclusin. Se ha demostrado que S. jacobea es una nueva fuente alergnica y presenta reactividad cruzada con A. vulgaris y P. judaica. Se han identificado dos alergenos mayoritarios, una pectato liasa (alergeno ya descrito en Artemisia y Ambrosa) y una malato deshidrogenada, siendo la primera vez que esta enzima se describe como alergeno en plantas.

Realizamos un estudio caso-control con 199 enfermos y 389 controles sanos. Se estudiaron con sondas Taqman 3 mutaciones funcionales descritas (C104R, A181E, R202H) y 8 SNPs adicionales (rs3751988, rs34562254, rs3818716, rs2274892, rs4985700, rs8074984, rs4985762, rs8079130) para estudiar la variabilidad del gen. Las diferencias en frecuencias genotpicas y allicas fueron comparadas por el test chi-cuadrado o test exacto de Fisher. Las frecuencias haplotpicas se estimaron mediante el algoritmo EM (Expectation-Maximization). Todos los polimorfismos se ajustaron a las proporciones HardyWeinberg en nuestra muestra control. Ningn polimorfismo mostr diferencias significativas entre casos y controles. Sin embargo, se encontr un haplotipo constituido por esos 8 SNPs cuya frecuencia estaba incrementada en pacientes: 8,9% en enfermos vs. 5,1% en controles, p=0,002; pc. Nuestros datos preliminares sugieren que algn elemento en TNFRSF13B, distinto de los asociados a SVC, puede modular la predisposicin a padecer DIGA. En la actualidad, pretendemos confirmar esta asociacin en una muestra familiar de DIGA y pacientes con SVC.

LA MUTACIN GLY90SER EN EL GEN CD8A, CAUSANTE DE INMUNODEFICIENCIA DE CD8, SE CONFINA EN POBLACIN GITANA ESPAOLA. Mancebo Sierra ME1, Moreno Pelayo MA2, de la Calle Martn O3, Allende Martnez LM1, Kalaydjieva L4, Bertranpetit J5, Coto E6, Calleja Antoln S1, Ruiz Contreras J7, Paz Artal E1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario 12 de Octubre. 2Unidad de Gentica Molecular. Hospital Ramn y Cajal. 3Servei d'Immunologia. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. 4Western Australian Institute for Medical Research and Centre for Medical Research. University of Western Australia. 5Unitat de Biologia Evolutiva, Departament de Ciencies Experimentals i de la Salut. Universitat Pompeu Fabra. 6Unidad de Gentica. Hospital Universitario Central de Asturias. 7Unidad de Inmunodeficiencias. Hospital Universitario 12 de Octubre. En este trabajo se describe el segundo caso de inmunodeficiencia de CD8, confirmando que el efecto patognico de la mutacin p.Gly90Ser consiste en una ausencia completa de linfocitos T CD8+, aunque las manifestaciones clnicas varan en severidad. Al igual que el primer caso descrito, este paciente es de origen gitano espaol y homocigoto para la mutacin p.Gly90Ser en la cadena alpha del CD8. El paciente sufri infecciones respiratorias de repeticin desde la infancia pero con conservacin del parnquima pulmonar, al contrario que el primer paciente, que muri debido al dao respiratorio. Se ha desarrollado un mtodo de screening de la mutacin por PCR-RFLP con la enzima de restriccin AluI, para el estudio de un total de 1127 controles no relacionados: 734 de origen gitano y de diferentes localizaciones geogrficas de Europa, y 393 controles espaoles (no gitanos). Los resultados indican que p.Gly90Ser est confinada a la poblacin gitana espaola, donde la tasa de portadores es del 0,4%. El anlisis de microsatlites flanqueantes del gen CD8A mutado (D2S2232, D2S388, D2S417, STSCD8A, STSCD8B, D2S2216, D2S2181), revel un nico haplotipo polimrfico lo que sugiere un origen comn para la mutacin p.Gly90Ser que causa la deficiencia de CD8 en la poblacin gitana espaola. La inmunodeficiencia de CD8 debe tenerse en cuenta en el diagnstico de gitanos espaoles con infecciones recurrentes, para establecer recomendaciones especficas en vacunacin y en hbitos de salud y para el consejo gentico de familias afectadas. Molecular Immunology 45(2):479-84; 2008. Financiacin FIS PI06/0170 y PI06/0614

PAPEL DEL GEN TACI EN PACIENTES CON DEFICIENCIA DE IgA EN POBLACIN ESPAOLA. Lpez Mejas R1, del Pozo N1, Garca-Rodrguez MC2, Ferreira A2, Gmez de la Concha E1, Fontn G2, Nez C1, Fernndez-Arquero M1. 1Servicio Inmunologa Clnica. Hospital Clnico San Carlos. 2Servicio de Inmunologa Clnica. Hospital La Paz. La deficiencia selectiva de IgA (DIGA) es la inmunodeficiencia primaria ms comn en caucsicos. Presenta un importante componente gentico pero hasta el momento slo se ha descrito asociacin con diversos alelos del HLA, que explican el 40% de la influencia gentica. TACI (transmembrane activator and CAML interactor), codificado por TNFRSF13B, es un receptor de la superfamilia de TNFR, presente en la superficie de linfocitos B perifricos. La unin de su ligando, APRIL (a proliferation-inducing ligand), induce el cambio de isotipo (fundamentalmente a IgA e IgG) independientemente de las clulas T. Mutaciones funcionales en TNFRSF13B se han visto asociadas al sndrome variable comn (SVC), y se ha postulado un posible papel en DIGA. Nuestro objetivo fue analizar la posible influencia de polimorfismos en este gen en pacientes espaoles con DIGA.

30

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

SNDROME DE WISKOTT-ALDRICH CAUSADO POR UNA MUTACIN PREVIAMENTE ASOCIADA A XLT. Martnez-Martnez L1, Gonzlez-Santesteban C1, Ribes S2, Badell I3, de la Calle-Martn O1. 1Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. 2Hospital Sant Joan de Deu. 3Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Pediatra). El Sndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad ligada al X que se caracteriza por trombocitopenia con microplaquetas, eczema e infecciones recurrentes, y que est causada por alteraciones en el gen WASP. Mutaciones en este gen tambin son responsables de la trombocitopenia ligada al X (XLT), que cursa slo con trombocitopenia y microplaquetas. Presentamos el caso de un nio de 1 ao de edad, segundo hijo de padres no consanguneos, que a partir de los 3 meses padece diarreas sanguinolentas sin relacin clara con infeccin y un eczema mediosevero. El examen hematolgico revel trombocitopenia con plaquetas pequeas. Los estudios de funcin linfocitaria mostraron una respuesta aloreactiva alterada, mientras que la respuesta a mitgenos estaba conservada. El anlisis de las inmunoglobulinas mostr una IgE elevada (764 UI/mL). El estudio de la protena WASP en linfocitos T activados del paciente mediante citometra de flujo y western blot mostr una ausencia completa de dicha protena. El estudio del cDNA de WASP revel la falta de trnscrito normal y la presencia de uno de mayor tamao que contena un fragmento del intrn 6. La secuenciacin del gen WASP determin que el paciente tena la mutacin IVS6+5:G>A, que provoca una alteracin en el splicing, incorporando 38 nucletidos con un codn stop. La madre era la nica portadora de la mutacin (mutacin de novo). La mutacin IVS6+5:G>A ha sido reportada en pacientes con XLT asociada a trnscritos normales residuales que comportan una expresin disminuida de la protena. Nuestro paciente presenta una ausencia total de trnscrito normal y, con ella de protena, lo que explicara el fenotipo de WAS y no de XLT. El paciente fue sometido a un trasplante de progenitores hematopoyticos procedentes de su hermano mayor, HLA idntico. El anlisis de la expresin de la protena WASP en linfocitos T activados mediante citometra de flujo ya mostraba una reexpresin de dicha protena 3 semanas despus del trasplante.

mal en todos los miembros de la familia excepto en el propsitus, en el que era indetectable y se reconstitua con la adicin de C5 purificado. Se analiz el gen de C5, localizado en el cromosoma 9, mediante RT-PCR de 6 fragmentos solapantes a partir de RNA total obtenido de sangre perifrica, detectndose la sustitucin AG>CTCT en el exn 15 del propsitus y en su padre. Esta mutacin afecta a una putativa secuencia exnica reguladora del splicing (ESE) y causa skipping del exn 15, generando una protena truncada en el extremo C-terminal de la cadena alfa, que no es secretada. La secuenciacin del DNA genmico de los 41 exones de C5 revel una segunda mutacin de novo y en trans respecto a la anterior, Y846H, presente solo en el propsitus. En conclusin, aqu describimos el primer caso de un deficiente de C5 heterocigoto compuesto para dos mutaciones, de las que una es de novo.

EL FACTOR NEFRTICO (C3Nef), UN AUTOANTICUERPO DIRIGIDO FRENTE A LA C3 CONVERTASA DEL COMPLEMENTO: ASOCIACIONES CLNICAS Y ANLISI DE FACTORES QUE PUEDEN MODULAR LA APARICIN DE ESTE AUTOANTICUERPO. Domnguez MA1, Garrido S1, Vlagea A1, Martnez Ara J1, Fontn Casariego G1, Lutz H2, Harris C3, Rodrguez de Crdoba S4, Lpez Trascasa M1. 1Hospital Universitario La Paz. Madrid. 2Institute of Biochemistry Eth, Zurich. 3School of Medicine, Cardiff University. 4Centro de Investigaciones Biolgicas. CSIC. Madrid. La Glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP) es una nefropata caracterizada por depsitos de C3, en la que a menudo se detecta la presencia de un autoanticuerpo (autoAc), C3Nef asociado a la activacin de la va alternativa del sistema del complemento. Recientemente se ha puesto de manifiesto la existencia de mutaciones/polimorfismos en genes reguladores de la C3 convertasa de la va alternativa, tanto en el Sndrome Hemoltico Urmico (SHU) como en la GNMP. Se desconoce si este autoAc puede estar relacionado con la aparicin de la enfermedad o con la evolucin clnica de la misma. En la presente comunicacin se presentan varios pacientes con este autoAc. 1. Paciente diagnosticado de GNMP tipo II hace ms de 25 aos, en el que se detect la presencia de este autoAc durante 10 aos. Un anlisis detallado de su especificidad ha mostrado la existencia de Ac anti-C3 y anti-idiotipo. Recientemente, estudios genticos en este paciente han mostrado la existencia de dos mutaciones en el gen de factor H, anlogas a las encontradas en pacientes con SHU. 2. Paciente diagnosticado de GNMP tipo II, presentaba adems del autoAc un polimorfismo en factor B. En este paciente se observ que el efecto estabilizador en la C3 convertasa slo se deba al C3Nef. 3. Se ha encontrado la presencia de C3Nef en al menos dos pacientes sin ninguna evidencia de glomerulonefritis. Una de las pacientes haba sufrido meningitis y la segunda una neumona con derrame pleural. 4. Paciente con un pico monoclonal y un consumo elevado de todos los componentes iniciales del complemento. La IgG purificada del suero de esta paciente no es capaz de estabilizar la C3 convertasa de la va alternativa por lo que vamos a explorar si pudiera estar dirigido frente a la C3 convertasa de la va clsica o del complejo de ataque. Estos resultados nos llevan a considerar que la desregulacin inducida por C3Nef podra tener distintos efectos fisiopatolgicos lo que explicara su asociacin con patologas variadas.

CARACTERIZACIN MOLECULAR DE LA PRIMERA MUTACIN DE NOVO EN UN PACIENTE CON DEFICIENCIA DE C5. Lpez Lera A1, Garrido S1, Mena de la Cruz R1, Ramos JM2, Fontn G1, Lpez Trascasa M1. 1Hospital Universitario La Paz. 2Hospital General Universitari d'Elx. El componente C5 del sistema del complemento es esencial para la formacin del complejo de ataque a membrana en las rutas clsica, alternativa y de las lectinas. Su deficiencia causa una enfermedad autosmica recesiva que se asocia generalmente con episodios de meningitis recurrentes por N. meningitidis. Aqu presentamos el caso de un paciente que sufri varios episodios de meningitis bacteriana durante la infancia, con ausencia total de C5 en suero y perteneciente a una familia sin historia de consanguinidad. Por nefelometra se obtuvieron valores normales de C3 y C4 para el propositus, as como para sus padres y sus dos hermanos. La actividad hemoltica de las rutas clsica y alternativa (CH50, AP50) era nor-

31

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

DEFICIENCIA RECESIVA PARCIAL DE IFN-GAMMAR1 (IFN-GR1). Sologuren I1, Garca-Laorden I1, Santiago E1, Hernndez-Lpez J1, Domnguez A1, Gonzalez-Quevedo N1, Chapgier A2, Florido Y1, Casanova J-L2, Rodrguez Gallego JC1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrn, Las Palmas de Gran Canaria. 2Dpto. de Gentica Humana de Enfermedades Infecciosas, Universidad Ren Descartes, Paris. La deficiencia de IFN-R1 se ha descrito en pacientes con infeccin grave por micobacterias ambientales, BCG, o raramente por Mycobacterium tuberculosis. No suele observarse otro tipo de infecciones, excepto salmonelas en algunos casos. La mayora presentan un defecto recesivo completo (RC, 27 pacientes) o dominante parcial (DP, 54 pacientes). El defecto DP expresa receptores anmalos que ejercen un efecto dominante, y responden a antimicobacterianos, y a IFN-. En ocasiones presentan recidivas. En el defecto RC no se expresa el receptor o expresan receptores mutados que no unen IFN-, la micobacteriosis es crnica y no se resuelve con el tratamiento; el nico tratamiento efectivo es el TMO, en su ausencia los pacientes fallecen antes de los 12 aos. Se han descrito 3 pacientes con defecto recesivo parcial (RP) debido a la mutacin I87T, clnicamente menos severos que el defecto RC. Se presenta el estudio inmunolgico y clnico de 6 pacientes homocigotos para la mutacin I87T y 4 pacientes homocigotos para V63G, la cual se crea que causaba un defecto RC. Se han desarrollado diversas tcnicas que permiten afirmar que los homocigotos para V63G presentan un defecto RP. De los 10 pacientes, 4 presentaron BCGosis tras vacunacin y 1 tuberculosis clnica. Los 6 pacientes con infeccin por micobacterias no-BCG presentaron la enfermedad con una media de 119 aos (1,8-22 aos). No se han observado recurrencias, y todos los pacientes han sobrevivido hasta una edad media de 15,611,4 aos (5 son mayores de 21 aos). Slo 1 paciente ha presentado salmonelosis. Como en el defecto DP, es frecuente la osteomielitis como nica presentacin, lo que no ha ocurrido en ningn paciente con defecto RC. Esta IDP es ms frecuente de lo sospechado inicialmente, puede debutar en edad adulta y no se aconseja TMO. En vista de las importantes implicaciones de pronstico y tratamiento es indispensable un meticuloso diagnstico inmunolgico y molecular en pacientes con deficiencia de IFN-R1.

mia y trompocitopenia autoinmunes, y otro a los 29 aos por carcinoma epidermoide de esfago. Los pacientes producan cantidades normales de IFN- en respuesta a PHA y BCG, aunque no respondan a IL-12, y prcticamente no se observ produccin de IL-17. El anlisis de Th1 y Th2 tambin mostr valores normales. Por otra parte, la paciente sana present una alta produccin de IFN-gamma y TNF-. El estudio de linfocitos de memoria mostr que no se produca IFN- en respuesta a S. enteritidis, toxoide tetnico y Cndidas, y el anlisis de produccin de IFN-gamma en repuesta a antgenos de M. tuberculosis (Quantiferon TB-Gold) fue negativo en los tres pacientes de la familia con dos afectos de MTBC. La presentacin de autoinmunidad y cncer amplia el espectro clnico de la deficiencia de IL-12RB1. En humanos con ausencia de sealizacin IL-12 e IL-23, se observa tras activacin policlonal un nmero normal de linfocitos Th1, un profundo defecto de Th-17, y no se observa incremento de Th2. No se ha detectado la presencia de clulas de memoria productoras de IFN-.

ESTUDIO DEL GEN TNFRSF13B EN LA INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMN. PAPEL DE LA MUTACIN p.C104R. Martnez-Pomar N1, Detkova D2, Arostegui JI3, Escobar D1, Ferrer J1, Serra A1, Vidaller A4, Soler P5, Vendrell M6, Alvarez A6, de Gracia J6, Caragol I2, Espaol T2, Yage J3, Matamoros N1, Hernndez M2. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. 2Unidad de Inmunologa. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona. 3Servicio de Inmunologa. Hospital Clinic. Barcelona. 4Servicio de Medicina Interna. Hospital Bellvitge. Barcelona. 5Unidad de Inmunologa Peditrica. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona. 6Servicio de Neumologa. Hospital Vall d'Hebron. Barcelona. La inmunodeficiencia variable comn (IVC) es la inmunodeficiencia predominante de anticuerpos sintomtica de mayor prevalencia. Aproximadamente el 10% de pacientes presentan mutaciones en TNFRSF13B que codifica para la protena TACI. Se han identificado 17 variantes allicas, si bien, slo se ha demostrado alteracin en la expresin y/o funcionalidad de TACI en algunas de ellas (p. ej. p.C104R). Objetivo. Analizar el gen TNFRSF13B en pacientes con IVC. Material y mtodos. Secuenciacin directa del gen de TNFRSF13B en 98 IVC y en 198 controles sanos. Resultados. El anlisis mutacional entre los pacientes identific 4 individuos homocigotos y 2 heterocigotos sencillos para la mutacin p.C104R y 1 individuo heterocigoto compuesto p.C104R/p.A181E. Entre otras variantes describimos 1 homocigoto y 2 heterocigotos para p.L171R; 3 heterocigotos sencillos para cada una de las variantes: p.C89Y, p.E117G, p.E140K. El anlisis de 29 familiares de primer grado de pacientes con la mutacin p.C104R revel dicha variante en 19 individuos sin patologa infecciosa (16 heterocigotos, 3 homocigotos y 1 heterocigoto compuesto p.C104R/p.A181E). Los niveles sricos de IgG en 2 familiares homocigotos y en el heterocigoto compuesto se hallaron en el lmite inferior de la normalidad. El anlisis de 198 controles sanos (Igs normales), revel 5 individuos heterocigotos para p.C104R. Discusin. Clulas B de pacientes homocigotos para p.C104R presentaron alteraciones en su funcin (Saltzer et al). Garivan et al. sugirieron un efecto dominante-negativo para esta mutacin en heterocigosis. Sin embargo, en nuestra serie de controles sanos y familiares de primer grado, observamos un elevado porcentaje de heterocigotos (n=21) y homocigotos (n=3) sin expresin clnica, lo que indicara que la mutacin p.C104R tiene una penetrancia variable, secundaria a un sistema redundante de sealizacin. Se est estudiando la posible relacin de las variantes p.C89Y, p.E117G y p.E140K y la funcionalidad de TACI.

AUTOINMUNIDAD Y CNCER EN LA DEFICIENCIA DEL RECEPTOR BETA-1 DE LA IL-12 (IL-12RB1). ESTUDIO DE LINFOCITOS TH1, TH2 Y TH17. Garca Laorden MI1, Sologuren I1, Santiago E1, Caragol I2, Hernndez-Lpez J1, Florido Y1, Domnguez A1, Fieschi C3, Casanova J-L3, Rodrguez-Gallego C1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrn, Las Palmas de Gran Canaria. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Vall d'Hebron, Barcelona. 3Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, University of Paris Ren Descartes, Paris. IL-12RB1 forma parte del receptor de la IL-12 y de la IL-23. Los pacientes con deficiencia de IL-12RB1 son susceptibles a infeccin grave por micobacterias. La recurrencia es muy rara y la vacunacin con BCG parece prevenir de posteriores infecciones por micobacterias, sugiriendo la existencia de repuesta secundaria. La salmonelosis es menos frecuente. En ratn, IL-12 e IL-12R son necesarios para la generacin de linfocitos Th1, la IL-23 es necesaria para la expansin de linfocitos Th17, e IL-12/IFN e IL-23/IL-17 estn implicados en autoinmunidad y cncer. Se estudiaron 6 pacientes de dos familias con deficiencia de IL12RB1. Cuatro presentaron infecciones diseminadas por salmonellas y uno por M. avium. Dos padecieron infeccin por M. tuberculosis (MTBC), y su hermana de 21 aos, con la deficiencia, nunca ha presentado infecciones reseables. Un paciente falleci a los 7 aos con ane-

32

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

ASOCIACIN FENOTIPO-GENOTIPO EN DOS CASOS DE SNDROME DE INMUNODISREGULACIN, POLIENDOCRINOPATA Y ENTEROPATA LIGADA AL CROMOSOMA X (IPEX). Escobar D1, lvarez Doforno R2, Juli MR1, Delgado Cervio E2, Martnez-Pomar N1, Melgosa M2, Lamas R2, Rosell A3, Fontan Casariego G2, Matamoros N1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. 2Servicio de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid. 3Servicio de Pediatra. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. Introduccin. IPEX es un sndrome secundario a mutaciones en FOXP3, ligado al cromosoma X, caracterizado por poliendocrinopata autoinmune en el primer ao de vida, enteropata y dermatitis eczematosa. Caso 1. Varn: a los 2 meses enteropata grave de evolucin trpida y dermatitis eczematosa. Requiere: corticoides, gammaglobulina intravenosa (IVIG) y tacrolimus. A los 6 meses: bacteriemias mltiples e hiperglucemia ocasional controlada con insulina y posterior normalizacin. Evolucin favorable. Tratamiento de mantenimiento: IVIG. A los 3 aos retraso pondoestatural, debut brusco diabetes insulino-dependiente. Caso 2. Varn: a los dos meses enteropata secretora; a los 5 aos diagnstico enteropata autoinmune. Tratamiento: corticoides y ciclosporina. Desaparicin de la sintomatologa digestiva, que reaparece al retirar la inmunosupresin. A los 19 aos insuficiencia renal aguda. Materiales y mtodos. Secuenciacin directa de FOXP3. Inmunofluorescencia, ELISA, nefelometra y citometra de flujo. Resultados. Caso 1 linfopenia T, CD4CD25 1%. Hipogammaglobulinemia. IgE elevada (pico 13200 UI/ml); ANCA y AntiGAD: positivos. Biopsia intestinal: atrofia de vellosidades. Mutacin p.R397Q. Caso 2 CD4CD25 2%. Hipogammaglobulinemia. Antienterocito y antimembrana basal tubular positivos. Biopsia renal: nefritis tubulointersticial aguda y nefropata membranosa con IR. Mutacin p.E249K. Conclusiones. Presentamos 2 casos de IPEX con distinto fenotipo clnico. Caso 1. Enteropata, dermatitis y diabetes mellitus. Evolucin trpida desde la infancia. Inclusin en lista para TMO. Caso 2. Enteropata desde la infancia, con evolucin a brotes. Larga supervivencia. A los 19 aos nefropatia autoinmune. Diagnstico IPEX. Posible relacin fenotipo-genotipo: Caso 1: fenotipo severo, la mutacin afecta al dominio forkhead que regula la transcripcin. Caso 2: fenotipo leve, larga supervivencia, una mutacin en el motivo CC, posible alteracin parcial de la funcin proteica.

Filogenia. El hecho de que la mutacin se encuentre en una posicin muy conservada a lo largo de la evolucin desde peces y en una zona crucial para el ensamblaje del TCR, plantea la posibilidad de que pudiera ser un factor de riesgo. Por otro lado, el nico individuo fallecido al empezar el estudio era homocigoto para la mutacin y adems, aparece en heterocigosis en otro paciente de familia no relacionada, aunque con una clnica menos severa. Fenotipo. Analizamos la conformacin del TCR/CD3 en los linfocitos T de los heterocigotos disponibles y observamos los niveles de expresin de CD3 disminuidos. Este inmunofenotipo es similar al encontrado en los heterocigotos para mutaciones deletreas en el gen CD3G, lo que sugiere que p.V131F pudiera serlo tambin. Genotipo. El estudio poblacional realizado en controles espaoles sanos muestra la presencia de p.V131F en homocigosis, lo que la descarta como causa de enfermedad, aunque no como factor de riesgo.

DESARROLLO DE VECTORES LENTIVIRALES TRANSCRIPCIONALMENTE REGULADOS PARA LA TERAPIA GNICA DEL SNDROME DE HIPER IgM LIGADO AL CROMOSOMA X(XHIM1). Romero Z1, Unciti JD1, Carranza D1, Cobo M2, Martn F2, Molina IJ1. 1Centro de Investigacin Biomdica. Universidad de Granada. 2IPB "Lpez Neyra" CSIC. Granada. La terapia gnica de las inmunodeficiencias primarias requiere el desarrollo de vectores seguros y eficientes que minimicen los efectos adversos de una expresin incontrolada del transgen. Esto es crtico en el desarrollo de terapia gnica en el Sndrome de Hiper IgM (XHIM1). En efecto, la reconstitucin de los progenitores hematopoyticos de ratones deficientes en CD40L con vectores retrovirales constitutivos consigui una expresin del transgen en clulas perifricas que logr reconstituir la respuesta humoral y celular: No obstante, estos animales desarrollaron una severa enfermedad linfoproliferativa tmica, de causa no definida pero ligada a la expresin no regulada del transgen teraputico. Por ello, nos hemos propuesto desarrollar vectores lentivirales transcripcionalmente regulados que produzcan una expresin fisiolgica y tejido-especfica en clulas CD4+ de CD40L. Como punto inicial, hemos modificado nuestro vector lentiviral WW, que dirige la transcripcin regulada hematopoytico-especfico del gen WAS a travs de un fragmento proximal de 500 bp del promotor endgeno del gen WAS. Hemos reemplazado en este vector el cDNA de WAS por el de CD40L, amplificado a partir de mRNA de linfocitos T activados, obteniendo as el vector lentiviral WCD40L. Como control, hemos generado el vector lentiviral constitutivo SCD40L, en el que la expresin del trangen es controlada por el promotor constitutivo SFFV. El empaquetamiento viral se realiz mediante cotransfeccin en clulas 293T del plsmido teraputico ms el plsmido conteniendo la envuelta VSVg y un tercero con gag-pol. Los sobrenadantes virales fueron titulados y se utilizaron para translucir un panel de clulas hematopoyticas y no hematopoyticas, a fin de comprobar si el promotor proximal de WAS es capaz de mantener la transcripcin tejido-especfica de CD40L. El anlisis de la expresin se realiz mediante citometria de flujo sobre clulas en las que en paralelo se determin el nmero de inserciones del transgen mediante PCR en tiempo real. Los resultados obtenidos sugieren que el promotor proximal de WAS consigue su mxima regulacin tejido-especfica dirigiendo la transcripcin del propio gen WAS, pero su eficacia para dirigir la expresin regulada de otros genes especficos del linaje hematopoytico, como CD40L, es menor.

MUTACIN p.V131F EN LA REGIN TRANSMEMBRANAL DE CD3G: FACTOR DE RIESGO O POLIMORFISMO? Recio Hoyas MJ1, Busto E1, Crespo A1, Prez V1, Rein J1, Allende L2, Moreno-Pelayo MA3, Van Montfrans J4, Lefranc G5, Regueiro JR1. 1Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. 2Inmunologa. Hospital 12 de Octubre. Madrid. 3Unidad de Gentica Molecular. Hospital Ramn y Cajal. Madrid. 4Wilhelmina Children's Hospital. Utrecht. Holanda. 5Institut de Gntique Humain. Montpellier. Francia. Casos: 1) Paciente con clnica SCID, homocigoto para la mutacin p.V131F en CD3G, familia consangunea de origen libans, fallece a los 7 aos de edad. La hermana, heterocigota para la mutacin, presenta una clnica y analtica similares. Respuesta T normal a mitgenos, pero disminuida frente a OKT3 y antgenos. Padres sanos, heterocigotos para la mutacin. 2) Nio de 2 aos de edad, heterocigoto para la mutacin, familia no consangunea, que ingresa con un episodio severo de neumona por HHV-6. Niveles disminuidos de Igs y una leve linfopenia TCD4. Respuesta T defectuosa frente a antgenos pero normal a mitgenos.

33

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

EXPRESIN DE WASP EN LINFOCITOS T DE PACIENTES CON SNDROME DE WISKOTT-ALDRICH TRAS EL TRATAMIENTO CON INHIBIDORES DE LA CALPANA Y EL PROTEASOMA. Zaldivar G1, Torres S1, Srivastava GK1, Vidal C2, Matamoros N2, Molina IJ1. 1Instituto de Biopatologa y Medicina Regenerativa, Centro Investigacin Biomdica. Parque Tecnolgico de Ciencias de la Salud. Universidad de Granada. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario "Son Dureta". Palma Mallorca. El sndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad ligada al cromosoma X caracterizada por eczema, trombocitopenia e inmunodeficiencia progresiva. El gen mutado, WASP, codifica para la protena WASP que es especficamente degradada por calpana. La protena WIP (WASP Interacting Protein) se une a WASP en su dominio EVH1, presente en el extremo N-terminal de WASP, y se ha demostrado que las mutaciones por cambio de sentido que afectan a la zona de unin WASP-WIP dan como resultado que WIP no pueda unirse a WASP. Hemos postulado, por tanto, que WIP podra proteger a WASP de una degradacin acelerada, y que por consiguiente, aquellos pacientes con mutaciones por cambio de sentido que afectan a la zona de interaccin con WIP podran alcanzar niveles apreciables de WASP tras el tratamiento con inhibidores de la calpana. Igualmente, WIP acta como chaperona protegiendo a WASP a su paso por el proteasoma, por lo que estos mismos pacientes podran beneficiarse de un tratamiento con inhibidores del proteasoma. Por ello, hemos secuenciado a una serie de pacientes con sospecha de WAS y generado lneas celulares aloespecficas de aquellos que presentaban mutaciones que daban lugar a cambios de aminocidos en la zona de interaccin WASPWIP. El anlisis de la expresin de WASP se realiz mediante Western Blot cuantitativo, encontrando niveles ausentes o muy reducidos de WASP. Las clulas T fueron tratadas con calpeptina (inhibidor de la calpana) o con Velcade o MG-132 (inhibidores del proteasoma). La expresin de WASP fue examinada por Western Blot tras 6 horas de tratamiento con los mencionados agentes. Hemos podido comprobar que estos tratamientos conseguan alcanzar niveles de expresin de WASP en dos de los tres pacientes estudiados equivalentes al 25% de la cantidad de WASP encontrada en individuos sanos. El tercer paciente tiene una mutacin en el nucletido 336 T>G, lo que da lugar a un cambio en el AA 101 Leu>Prol. Esta mutacin afecta a la zona final del dominio EVH1, y probablemente se encuentre fuera del lugar de acoplamiento de WIP. Por tanto, el tratamiento con inhibidores de la calpana y proteosoma slo sera efectivo en pacientes con mutaciones que afecten directamente a la zona de interaccin WASP-WIP.

y una expansin de linfocitos T CD8 CD57+ DR+. Se inicia tratamiento sustitutivo con IGIV, con adecuado control de las infecciones. A los dos aos debuta con episodios recurrentes de fiebre sin foco, plaquetopenia, neutropenia y anemia, coincidentes con expansines de T CD8 y con adenopatas, gran esplenomegalia e infiltracin nodular en higado y riones. Se realiza esplenectoma en un intento de controlar la plaquetopenia. Dos aos despus desarrolla una neumona por P. carinii (linfocitos T CD4: 723/mmc), corroborandose la disfuncin T (muy bajas respuestas proliferativas a PHA, IL2 y anti-CD3). Se detectan asimismo concentraciones sricas muy elevadas de IL6, TNFalfa, IFNgamma y CD95L. En Diciembre de 2007 la paciente desarrolla una insuficiencia hepatorenal severa tras un episodio de diarrea, fiebre, pancitopenia y sntomas B, coincidentes con infiltracin sistmica por linfocitos T CD8 de carcter oligoclonal. Los sntomas se atenuan con corticoides y se plantea la posibilidad de un Tx hematopoytico de hermano HLA-identico, como posible solucin terica a la inmunodeficiencia B y T y a la expansin de linfocitos T clnicamente agresiva. Se traslada al hospital ValldHebron para valoracin, y se diagnostica un shunt hepato-pulmonar aadido. El shunt hepato-pulmonar es una patologa de mal pronostico, habitualmente asociada a cirrosis y/o hipertensin portal, y que no se ha descrito en la IDVC. En este punto se replantea la idoneidad de Tx hematopoytico versus inmunosupresin.

SESIN 6: CLULAS B Y NK Moderadores: Dra. frica Gonzlez (Vigo), Dr. Miguel Lpez-Botet (Barcelona) LA LEUCEMIA LINFTICA CRNICA B MIGRA EN RESPUESTA A LOS LIGANDOS DE CCR7 A TRAVS DE UN MECANISMO DEPENDIENTE DE PI3K Y RHO. Cuesta Mateos C, Alfonso Prez M, Lpez Giral S, Muoz Calleja C. Hospital Universitario de la Princesa. Nuestro grupo de investigacin ha demostrado que las neoplasias de clulas B con amplia diseminacin a ganglio linftico expresan altos niveles de los receptores de quimioquinas CCR7, CXCR4 y CXCR5, que median la entrada de los linfocitos en los rganos linfoides secundarios. Los ndices de migracin de la leucemia linftica crnica de clulas B (LLC-B) en respuesta a los ligandos de CCR7, CCL19 y CCL21, correlacionan con la presencia de linfadenopata clnica y mediante experimentos in vitro demostramos que anticuerpos anti-CCR7 eliminan clulas de LLC y bloquean su migracin. El objetivo de este estudio es estudiar las vas de sealizacin que median la migracin de clulas de LLC en respuesta a CCL19/21 dada la posible relevancia de CCR7 como diana teraputica. As, mediante ensayos de inmunoblot y quimiotaxis in vitro, analizamos la participacin de las MAPKs, de PI3K y de la familia Rho de pequeas GTPasas, que se encuentran entre los principales mediadores de la quimiotaxis linfocitaria. Los ligandos de CCR7 indujeron una fuerte activacin de ERK1/2, y en menor medida de p38 y JNK, que sin embargo no jugaron ningn papel en la migracin de clulas LLC. En cambio, las vas PI3K y Rho s regularon la quimiotaxis dependiente de CCR7 de esta leucemia. As, inhibidores de PI3K y del efector de Rho, ROCK, redujeron notablemente la migracin celular de LLC en respuesta a los ligandos de CCR7. Ensayos de inmunoblot evidenciaron niveles de Akt constitutivamente fosforilado que aumentaron tras estimulacin con CCL19/21.

INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMUN CON DISFUNCIN T, SNDROME LINFOPROLIFERATIVO, PANCITOPENIA Y SHUNT HEPATO-PULMONAR: INDICACIN DE TRASPLANTE HEMATOPOYTICO? Sampalo A, Rodriguez-Gutierrez JF, Bernal MJ, Nieto A, Fernandez-Valle C, Giron JA, Espaol T, Barrenechea C, Juli A, Brieva JA. Servicios de Inmunologa, Hematologa y Medicina Interna. Hospital Puerta del Mar (Cdiz), Hospital Vall dHebron (Barcelona). Mujer de 32 aos diagnosticada hace 11 de IDVC por infecciones otosinusales de repeticin que comienzan a partir de una mononucleosis infecciosa de evolucin torpida. Al diagnstico presenta panhipogammaglobulinemia (IgG 258 mg/dl; IgA: < 5 mg/dl, IgM: 9 mg/dl, IgE: < 2 UI/ml), incapacidad de produccin de anticuerpos, baja respuesta proliferativa T y ausencia de linfocitos B (<0.2%) . Tiene una hermana con deficiencia de IgA. El estudio fenotpico inicial confirma un perfil MB0

34

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

Confirmamos el papel de PI3K y Rho en la migracin de LLC-B mediada por CCR7 mediante nucleofecciones transitorias con mutantes dominante negativo y constitutivamente activo de ambas molculas. Por tanto, la sern/treonn quinasa PI3K y la pequea GTPasa Rho juegan un papel primordial en la migracin in vitro de la LLC en respuesta a las quimioquinas homeoststicas CCL19/21, apoyando su posible participacin en la infiltracin ganglionar de esta leucemia.

AID, LA DEAMINASA INDUCIDA POR ACTIVACIN, ES HAPLOINSUFICIENTE. Vidal Sernndez I, Rodrguez Ramiro A. Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO). En respuesta al antgeno, los linfocitos B tienen la capacidad nica de remodelar somticamente los genes de inmunoglobulinas (Igs) mediante dos mecanismos: hipermutacin somtica (SHM) y cambio de isotipo (CSR). Ambos son iniciados por la enzima Deaminasa Inducida por Activacin (AID) a travs de la deaminacin de citosinas en el loci de Igs. Adems, AID promueve la generacin de translocaciones cromosmicas (TCs) linfomagnicas lo que tiene una enorme relevancia clnica, ya que la gran mayora de los linfomas diagnosticados en occidente se originan a partir de clulas B maduras. El estudio de la regulacin de AID es por ello de vital importancia. Nuestro objetivo ha sido determinar si los niveles de expresin de AID son limitantes para su actividad. Analizamos el efecto funcional de la dosis de AID usando linfocitos B de bazo de ratones AID+/+, AID+/- y AID-/- cultivados in vitro en condiciones que promueven el CSR. Observamos por citometra que las clulas B que portan una copia nica de AID reducen la eficiencia de CSR un 50% respecto a cuando existen dos copias. Ocurre tanto para el CSR a IgG1 como a IgG3. Para conocer el efecto de la dosis de AID en la generacin de lesiones linfomagnicas, estudiamos la generacin de TCs c-myc/IgH en animales transgnicos para IL6 y deficientes en p53. Nuestros resultados indican que los ratones IL6tgAID+/-, a diferencia de los controles IL6tgAID+/+, carecen de TCs distales Salfa y que la frecuencia de TCs proximales Smu est reducida al 50% en animales AID+/-p53+/-, con respecto a ratones con dos alelos funcionales de AID (AID+/+p53+/). Conclumos que AID es haploinsuficiente, lo cual es excepcional en genes que codifican actividades enzimticas. Los niveles fisiolgicos de AID estn sometidos a una regulacin estricta, probablemente para asegurar una respuesta humoral eficiente sin comprometer la estabilidad genmica de la clula B.

Nuestros resultados indican que la ausencia de miRNAs 1) bloquea parcialmente la diferenciacin de clulas B en la mdula sea, lo que da lugar a una reduccin de la poblacin B en los tejidos linfoides perifricos, 2) las proporciones de las distintas poblaciones de linfocitos B en bazo se encuentran alteradas, existiendo un incremento de la poblacin de zona marginal y una reduccin de la poblacin folicular, 3) las clulas deficientes para Dicer muestran tambin patrones de hiperactivacin en placas de Peyer. Estos datos indican que los miRNAs tienen un papel crucial en la diferenciacin del linaje B y en la generacin de sus distintas subpoblaciones.

CARACTERIZACIN DE PROTENAS DE LOS CUERPOS NUCLEARES EN LEUCEMIA LINFOBLSTICA AGUDA DE LINFOCITOS B. Gngora Fernndez R, Martn Martn N, Alonso Chamorro L. Universidad de Salamanca. Objetivos. Los cuerpos nucleares (NBs) son complejos proteicos cuyo significado funcional permanece todava mal conocido, aunque pueden regular la expresin gnica, y en consecuencia aspectos tan esenciales como el control de ciclo celular y la apoptosis. PML, el componente prototpico de estos NBs es esencial en la ontogenia y apoptosis de progenitores mieloides, y por otra parte, la protena de fusin PML-RXR es el agente causal de la leucemia promieloctica aguda, una leucemia aguda mieloide. Nosotros hemos visto en ratn que PML no es esencial para el desarrollo y apoptosis de progenitores B, mientras que Daxx otro componente de los NBs, si es esencial para la apoptosis inducida por interfern en estos progenitores. Nuestro inters actual se centra en estudiar la dinmica de los NBs en el crecimiento y apoptosis de clulas con leucemia linfoblstica aguda (B-ALL) en el hombre, la vertiente tumoral de una normal ontogenia B. Mtodos. Nuestro inters se centr en el anlisis de la lnea celular EU-12, que muestra distintas subpoblaciones de linfocitos B en continua diferenciacin. Se estudi la expresin y localizacin de protenas de PML y Daxx en estas clulas, as como su comportamiento en apoptosis, mediante inmunofluorescencia y microscopa confocal. Resultados. No se observ una obvia colocalizacin nuclear de Daxx y PML (como en progenitores mieloides), y la expresin y localizacin de estas protenas no se vio alterada en los mecanismos de apoptosis analizados. El interfern no indujo apoptosis ni la expresin de Daxx (como en progenitores primarios de ratn). Conclusiones. Los componentes de los NBs no se vieron afectados en expresin/localizacin durante la diferenciacin y apoptosis de estas clulas leucmicas. Los NBs podran estar involucrados en el crecimiento aberrante de estos progenitores, pero se hace necesario el estudio de progenitores leucmicos frescos obtenidos de pacientes y de progenitores normales en mdula sea.

LOS MICRORNAS REGULAN LA GENERACIN DE CLULAS B. Belver Miguel L, Rodrguez Ramiro A. Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO). Los microRNAs (miRNAs) son molculas pequeas de RNA no codificantes que actan como reguladores de la expresin gnica, inhibiendo la traduccin o induciendo la degradacin de mRNAs. Los miRNAs controlan importantes funciones celulares y su expresin aberrante se ha ligado a procesos de transformacin celular y linfomagnesis. Los miRNAs se generan a partir de precursores de RNA de mayor longitud que son procesados por la RNAsa Dicer. Para estudiar el papel de los miRNAs en la diferenciacin y funcin de clulas B, hemos generado ratones en los que el gen Dicer est eliminado especficamente en clulas B (Dicer-flox/flox CD19-Cre ki/+).

CD38 IS RELEASED IN ASSOCIATION WITH CD81 AND HSC-70 IN EXOSOMES IN HUMAN LYMPHOBLASTOID B CELLS. Zumaquero Martnez EC1, Muoz Fernndez P1, Pavn Castillero EJ1, Garca Prez A1, Garca Veguillas A1, Sancho Lpez J1, Zubiaur Marcos M1,2. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina "Lpez-Neyra". CSIC. 2Instituto de Salud Carlos III. CD38 a type-II transmebrane protein is specifically recruited to membrane rafts in human lymphoblastoid B cell lines. We have identified several cellular proteins that preferentially associate with CD38

35

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

in the B cell membrane rafts: 1) CD38/CD19/Lyn; 2) CD38/CD81; and 3) CD38/HSC70. These associations are dependent of membrane rafts integrity since they are disrupted in the presence of 60 mM n-octyl[beta]-D-glucopyranoside. Stress and tetrapanin proteins, including HSC-70 and CD81, have been identified in a discrete population of nano-vesicles (40-90 nm in diameter) called exosomes, which are secreted by a variety of cells including B cells. We set for to isolate exosomes from Namalwa B cells and demonstrate that CD38 is released in association with these vesicles. Examining multiprotein complexes from CD38-exosomes vesicles we found that are enriched in HSC-70, Lyn and CD81. Our results present evidence supporting i) the exportation of CD38 out of the cells through the exosome pathway, and ii) the identification in membrane rafts and in exosomes of key signaling components of CD38-protein complexes.

LA DUPLICACIN DE LOS GENES KIR2DL5-KIR2DS3 FACILITA LA GENERACIN DE HAPLOTIPOS CON NUEVAS DELECIONES Y DUPLICACIONES DE VARIOS GENES KIR. Ordez del Valle D1, Meenagh A2, Gmez-Lozano N1, Castao J1, Middleton D2, Vilches C1. 1Inmunologa. Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2N. Ireland Regional Histocompatibility and Immunogenetics Laboratory, Belfast, UK. En el complejo KIR (19q13.4), los genes KIR2DL5 y KIR2DS3 estn localizados de manera consecutiva y muestran una fuerte asociacin entre ellos. A lo largo de la evolucin, se han producido recombinaciones que han resultado en la duplicacin de ambos genes, formndose un grupo centromrico y otro telomrico de 2DL5-2DS3 separados por otros cinco genes KIR. La duplicacin debi haberse producido en un periodo reciente de la historia evolutiva humana, ya que ambos grupos 2DL5-2DS3 difieren uno de otro en pocos cambios de nucletido. La casi total identidad en las secuencias de ambos grupos de genes probablemente facilite que se produzcan nuevas recombinaciones entre ellos. En este trabajo presentaremos la existencia de dos haplotipos inusuales (uno en una familia espaola y otro en una irlandesa), cuyo origen aparente es una misma recombinacin entre los dos grupos 2DL5-2DS3. En el haplotipo de la familia espaola hay una delecin de siete genes KIR localizados en la region central (100 kb aproximadamente), que yuxtapone el gen 2DL5 centromrico con el gen 2DS3 telomrico. El otro haplotipo presenta la duplicacin de los mismos genes que estn delecionados en la familia espaola, formando un haplotipo largo de 18 genes KIR.

in the elderly, likely as a consequence of thymus involution, accompanied by the expansion of effector and effector-memory cells is well established. Moreover, recent evidences also support that many alterations observed in the CD8 T cell compartment can be explained by the chronic activation of the immune system by latent viruses such as CMV. The possibility that this abnormal subset distribution is the consequence of chronic antigen stimulation by latent viruses as CMV has been previously proposed by ourselves and others. The relevance of CMV in this process is underlined by the demonstration of oligoclonal expansion of CMV-specific CD8 T cells. However, it is unclear to what extent the accumulation of CMV-specific CD8 T cells is a major factor contributing to the phenotypic changes found in CD8 T cells. The phenotypic analysis of CMV-specific CD8 cells has demonstrated that the proportion of cells coexpressing CD27 and CD28 is strongly decreased in the elderly when compared with young individuals. Furthermore, the analysis of the differentiation stages defined by the combined use of CCR7 and CD45RA also showed that in elderly donors CMV-specific CD8 T cells exhibit a phenotype associated with effector-memory (CCR7? CD45RA low) or effector (CCR7? CD45RA+) T cells, whereas in young individuals a significant proportion of CMV-specific CD8 cells are included in the nave subpopulation (CCR7+CD45RA+). These results indicate that the majority of CMV-specific CD8 cells in elderly individuals have effector-memory 2 and terminally differentiated effector phenotypes. These cells also have an increased expression of NK associated receptors. The findings that CMV-specific CD8 T cell phenotype in elderly individuals is similar to the predominant phenotype of CD8 T cells in the elderly and that the accumulation of CD28null T cells expressing CD57 and CD56 is preferentially observed in CMVseropositive elderly suggest that the latent infection with CMV can be considered a major factor contributing to the differentiation of CD8 T cells to poorly functional senescent cells with an effector-memory 2 phenotype.

LOS iNKRs REGULAN LA PRODUCCIN DE IFN- INDUCIDA TRAS LA ACTIVACIN DE CLULAS NK CON DENDTICAS INMADURAS O PRODUCTOS VIRALES. Morel Brcena E, Belln Heredia T. Hospital Universitario La Paz. Las clulas Natural Killer (NK) se activan en respuesta a patgenos, tumores y transplantes de clulas hematopoyticas alognicas. Sus funciones principales son: citotoxicidad y produccin de citoquinas, principalmente IFN-. Se ha descrito que la interaccin de clulas NK y dendrticas inmaduras (iDCs) conduce, a travs de la sealizacin de NKp30, a una importante liberacin de esta citoquina. Adems, las clulas NK pueden participar en la respuesta contra infecciones virales mediante el reconocimiento directo, a travs de los Toll-like receptors (TLRs), de productos virales. As, el agonista de TLR3 poly I:C sinergiza con IL-12 para inducir la secrecin de IFN-. La respuesta NK se regula a travs de receptores especficos de molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. En humanos existen tres familias: KIRs (killer cell Ig-like receptors), LIRs/ILTs (leukocyte Ig-like receptor/ Ig-like transcripts) y los heterodmeros de la familia de las lectinas CD94/NKG2. El papel que desempean los receptores NK inhibidores (iNKRs) en el control de la citotoxicidad ha sido ampliamente estudiado; pero existen pocos trabajos acerca del efecto que puedan tener en la liberacin de citoquinas. Por tanto, se estudi el posible papel regulador de los iNKRs sobre la produccin de IFN- inducida en clulas NK tras la interaccin con iDCs alog-

CMV-SPECIFIC CD8 T CELLS ARE EXPANDED IN THE ELDERLY: EXPRESSION OF COSTIMULATORY MOLECULES AND NK ASSOCIATED RECEPTORS. Pita ML1, Gayoso I1, Alonso C1, Peralbo E1, de la Rosa O1, Casado JG2, Tarazona R2, Solana R1. 1Inmunologa. Hospital Universitario Reina Sofia, Universidad de Crdoba. 2Unidad de Inmunologa, Universidad de Extremadura, Cceres. Immunosenescence is a complex series of alterations that are dependent not only on chronological ageing itself, but also on exogenous factors such as persistent antigenic stress leading to chronic activation of the immune system. Ageing is associated with immunological changes in the T cells primarily due to thymus involution resulting in a decreased production of naive cells. The decrease of nave CD8 cells

36

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

nicas o mediante el tratamiento con poly I:C. La concentracin de IFN liberado al medio se cuantific mediante Cytometric Bead Array Flex Set (CBA). Los resultados indican que CD94/NKG2A e ILT2/CD85j regulan la produccin de IFN- inducida tras el cocultivo con iDCs alognicas o estimulada especficamente a travs de NKp30 en un sistema libre de clulas. Finalmente, se comprob que los iNKRs modulan la produccin de IFN- en NKs estimuladas con poly I:C y dosis subptimas de IL-12. Los resultados sugieren los iNKRs participan en la regulacin de la produccin de IFN- inducida por iDCs o ligandos de TLRs a travs del reconocimiento de molculas del MHC de clase I.

EXPRESIN Y LOCALIZACIN INTRACELULAR DE LAS PROTENAS v-SNARE DE LA VA EXOCTICA EN LAS CLULAS NK HUMANAS. Delgado-Prez L, Campos-Caro A. Hospital U. Puerta del Mar. El principal mecanismo por el que las clulas NK ejercen su actividad citotxica es la exocitosis de los lisosomas de secrecin. Existen varias enfermedades hereditarias en las que este proceso se encuentra alterado y entre ellas la causada por la mutacin del gen de la sintaxina 11 un miembro de la familia de protenas SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptors)- y la causada por la mutacin del gen de la munc13-4 un regulador de las protenas SNARE-. Sin embargo, y a pesar de que las protenas SNARE se consideran en eucariotas los mediadores universales de la fusin entre membranas, se desconoce qu miembros de esta familia de protenas participan en la exocitosis citotxica de las clulas NK. Este trabajo se centr en la familia VAMP (vesicle-associtated membrane protein) cuyos miembros constituyen habitualmente el componente v del complejo SNARE. Se estudiaron clulas NK aisladas de sangre perifrica as como lneas celulares NK. Se identificaron los transcritos primarios (RT-PCR) y las protenas (western blot) correspondientes a varios SNARE previamente identificados como elementos de la va exoctica en otros tipos celulares de origen hematopoytico: VAMP-2, 7 y 8. Adems, se confirm su expresin y se determin su localizacin mediante microscopa de fluorescencia confocal. Destaca la localizacin ampliamente coincidente de VAMP7 con los grnulos citotxicos, en consonancia con estudios previos de otros autores. En conclusin, las clulas NK humanas expresan las protenas v-SNARE VAMP-2, VAMP-8 y VAMP-7, y la localizacin intracelular de esta ltima sugiere un posible papel de la misma en la exocitosis de los lisosomas de secrecin.

bidores analizados, se encontr que la clorometilcetona TPCK inhiba la activacin de STAT6 dependiente de IL-4. Sorprendentemente, esta inhibicin estaba acompaada por la prdida de protena de STAT6 por un mecanismo sensible al inhibidor de serina-proteasas AEBSF. Sin embargo, este efecto de TPCK no pareca estar mediado por la inhibicin de proteasas puesto que mltiple inhibidores de proteasas no tenan efecto en la expresin de STAT6. Los datos encontrados indican que el efecto de TPCK fue mediado por su actividad alquilante. As, compuestos reactivos con cistenas y tiol antioxidantes previenen la degradacin de STAT6 inducida por TPCK. Adems, otros agentes alquilantes como la mecloretamina tambin inducen la prdida de STAT6. De hecho, tratamientos conteniendo ciclofosfamida disminuyen la expresin de STAT6 como se observ en clulas obtenidas de pacientes con cncer de mama. Anlisis de otras molculas indican que los agentes alquilantes promueven la prdida de otros miembros de la familia STAT pero no de Shc y c-Rel. Estos datos revelan un novedoso mecanismo por el que agentes alquilantes pueden promover la degradacin de factores de transcripcin STAT, lo que podra ser relevante para comprender su mecanismo de accin.

ACTIVACIN DE LA EXPRESIN DE LAS UL16-BINDING PROTEINS POR HDAC2 Y REPRESIN POR HDAC3 EN TUMORES EPITELIALES. Gonzlez Rodrguez S, Rodrguez Folgueras A, Seto E, Lpez Soto A. Universidad de Oviedo. Las ULBPs son ligandos del receptor activador NKG2D presente en las clulas T y NK. La expresin de las ULBPs se induce en clulas estresadas, infectadas y transformadas, marcando a estas clulas para ser eliminadas por el sistema inmune. En este trabajo caracterizamos que los mecanismos epigenticos desempean un papel esencial en la represin de la expresin de ULBP1-3. Nuestros resultados muestran que los promotores de las ULBP1-3 no estn metilados, pero que la estructura de la cromatina desempea un papel crucial en su expresin. Hemos caracterizado que la desacetilasa de histona HDAC3 se une a los promotores de ULBP1-3 y reprime de una forma muy significativa la trascripcin de estos genes. La sobreexpresin de HDAC3, que se observa frecuentemente en tumores de pacientes con cncer de colon y diversos tumores epiteliales, reprime la expresin de ULBP13; mientras que el bloqueo de su expresin usando siRNA induce significativamente su expresin. Mediante anlisis de sus regiones promotoras y tcnicas de inmunoprecipitacin de cromatina caracterizamos que HDAC3 reprime la expresin de las ULBP1 por la interaccin con los factores de trascripcin Sp1/Sp3. Significativamente, HDAC2 desempea un papel opuesto al de HDAC3, ya que induce la expresin de las ULBPs. Esto sugieren que dado que diferentes desacetilasas de histonas desempean un papel opuesto en la expresin de las ULBPs sera necesario desarrollar inhibidores especficos para cada HDAC para mejorar su eficacia teraputica.

SESIN 7: INMUNOLOGIA TUMORAL - II Moderadores: Dr. Federico Garrido (Granada), Dr. Luis lvarez Vallina (Madrid) REGULACION PROTEOLITICA DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION STAT6 POR AGENTES ALQUILANTES. Perez-G M, Cortes JR, Rivas MD, Borrega P, Zamorano J. Hospital San Pedro de Alcantara. El factor de transcripcin STAT6 se ha implicado en diversas enfermedades por lo que la investigacin de compuestos capaces de regular su activacin tiene importancia biolgica y mdica. La activacin de STAT6 est estrechamente regulada por quinasas, fosfatasas y proteasas. En este estudio, se pretendi inicialmente investigar la utilidad de inhibidores de proteasa en la regulacin de STAT6. Entre los inhi-

ERp5 SE ASOCIA EN LA MEMBRANA DE LAS CLULAS TUMORALES CON MICA Y PARTICIPA EN SU LIBERACIN COMO FORMA SOLUBLE. Gonzlez Rodrguez S1, Kaiser BK2, Yim D2, Chow I-T2, Dai Z2, Mann HH2, Strong R2, Groh V2, Spies T2. 1Universidad de Oviedo. 2Fred Huthcinson Cancer Research Center, Seattle, USA. MICA es un ligando del receptor activador NKG2D. La expresin de MICA se induce en clulas tumorales por el dao genotxico y el

37

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

estrs celular, causando la activacin de las cluas NK y la coestimulacin de los linfocitos T. En tumores avanzados, MICA es liberado en forma soluble de la superificie celular por proteolisis. MICA soluble inhibe la respuesta inmune mediada por NKG2D y favorece la activacin de linfocitos T NKG2D+CD4+ con caractersticas inmunosupresoras, lo que favorece la evasin inmune de las clulas cancergenas. En este trabajo demostramos que MICA est asociado en la superficie de las clulas tumorales con la isomerasa disulfuro ERp5. La inhibicin farmacolgica de la actividad tioreductasa y el silenciamiento de la expresin de ERp5 indican que la actividad de ERp5 es esencial para la liberacin o shedding de MICA soluble. ERp5 y MICA forman complejos transitorios mediante la formacin de enlaces disulfuro en la membrana de las clulas tumorales, de los cuales es liberado MICA soluble despus del procesamiento proteoltico en el dominio 3 prximo a la membrana celular. La reduccin de un enlace disulfuro aparentemente inaccesible en el dominio 3 de MICA por ERp5 produce un cambio conformacional que permite la digestin proteoltica de MICA. Estos resultados describen un nuevo mecanismo por el que se forma MICA soluble, promoviendo de esta manera la evasin de la respuesta inmune. Adems identifica ERp5 como una diana.

c-myc y presentan traslocaciones cromosmicas t(12:15). En conclusin, nuestro estudio muestra la existencia de sinergias entre alteraciones en la regulacin del ciclo celular y de la apoptosis linfocitaria en el desarrollo de patologas autoinmunes y linfoproliferativas.

ANTICUERPOS ANTI-SOX1 COMO MARCADOR DE PARANEOPLASIA EN EL SNDROME MIASTNICO DE LAMBERT EATON. Sabater L, Titulaer M, Saiz A, Verschuuren J, Gure AO, Graus F. Servicio de Neurologia, Hospital Clnic, Universidad de Barcelona, Institut d' Investigaci Biomdica August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Department of Neurology, Leiden, University Medical Center, The Netherlands Molecular Biology and Genetics Department, Bilkent University, Ankara, Turkey El sndrome miastnico de Eaton-Lambert (LEMS) es un desorden de la transmisin neuromuscular mediado por anticuerpos contra canales de calcio. El origen de la enfermedad, en el 50% de los pacientes, es paraneoplsico, esto es, existe una neoplasia subyacente que provoca el sndrome neurolgico, generalmente cncer de pulmn de clula pequea (CPCP). Actualmente no existe ningn marcador biolgico eficaz para predecir los pacientes de LEMS que desarrollarn cncer. Previamente encontramos que el 43% de pacientes con LEMS y CPCP tenan un anticuerpo, que llamamos AGNA (anti-glial nuclear antibody), definido por la inmunoreaccin con los ncleos de la glia de Bergmann del cerebelo. Este estudio se abord para identificar el antgeno reconocido por AGNA y para confirmar la asociacin con el LEMS paraneoplsico en una serie mayor de pacientes. Cribamos una genoteca de cDNA de cerebro fetal con sueros positivos para AGNA. La presencia de anticuerpos contra el antgeno aislado se detect por inmunoblot de calvas de lisis de fagos de dos clones positivos. Estudiamos 105 pacientes con LEMS (55 con CPCP). Como resultado del cribaje de la genoteca de expresin de cerebro fetal con sueros AGNA aislamos el gen SOX1, un antgeno tumoral altamente inmunognico en CPCP. La elucin de la IgG que se una a los clones SOX1 produca la misma immunoreactividad cerebelar que los sueros AGNA. Los anticuerpos SOX1 estaban presentes en el 64% de los pacientes con LEMS y CPCP y en ninguno de los pacientes LEMS idiopticos (p<0.0001). La deteccin de los anticuerpos SOX1 en pacientes con LEMS predice la presencia de CPCP y puede usarse para un seguimiento ms preciso de aquellos pacientes con LEMS sin evidencia de cncer al inicio de la enfermedad.

INTERACCIN ENTRE REGULADORES DEL CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS EN EL DESARROLLO DE AUTOINMUNIDAD Y LINFOMA. Santiuste I1, Iglesias M1, Buelta L3, Snchez M2, Tamayo E4, Merino J4, Merino R4. 1Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Cantabria. 2Seccin de Inmunologa, Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. 3Departamento de Ciencias Mdicas y Quirrgicas, Universidad de Cantabria. 4Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Cantabria. En el desarrollo de enfermedad autoinmune participan conjuntamente mltiples factores genticos, epigenticos y ambientales. El acmulo de un nmero suficiente de estos factores por encima de un determinado umbral impacta sobre los mecanismos que regulan la tolerancia inmunolgica hacia lo propio. Adems, muchas de las anomalas genticas que promueven el desarrollo de patologas autoinmunes, tambin estn involucradas en la aparicin de neoplasias linfoides. Sin embargo, la relacin causa-efecto entre autoinmunidad y cncer aun no se ha clarificado. En el presente estudio, se ha analizado la posible interaccin entre anomalas en la regulacin del ciclo celular y de la apoptosis linfocitaria sobre el desarrollo de autoinmunidad y linfomas en ratones C57BL/6 (B6), no susceptibles a autoinmunidad. Para ello, ratones B6 deficientes en p21 (CIP1/WAF1) (B6-p21-/-), que desarrollan espontneamente un cuadro autoinmune ligero, se cruzaron con ratones B6 que sobre-expresan un transgn (Tg) de la molcula anti-apopttica Bcl-2 humana (hBcl-2) en linfocitos B, obtenindose 4 tipos de ratones B6: p21+/+-hBcl-2-; p21+/+-hBcl-2+; p21-/--Bcl-2y p21-/--Bcl-2+. Se ha analizado el desarrollo de lupus en los 4 grupos, estudiando los niveles sricos de autoanticuerpos en suero, la aparicin de nefropata y la supervivencia de los animales. Nuestros resultados muestran que, en comparacin con los ratones B6 normales o los mutantes simples, los mutantes dobles p21-/--hBcl-2+ presentan ttulos elevados de anticuerpos anti-DNA circulantes a los 8 meses de edad y desarrollan una glomerulonefritis severa a los 10 meses de edad, lo que acelera su mortalidad. As mismo, los ratones B6 mutantes dobles p21-/--hBcl-2+, a diferencia de los Tg simples y no Tg, presentan una incidencia muy alta de linfomas de clulas B. Estos tumores son policlonales, de aspecto plasmocitoide, tienen desregulada la expresin de

GENERACIN Y CARACTERIZACIN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES HUMANOS FRENTE AL RECEPTOR DEL DOMINIO GLOBULAR DEL SUBCOMPONENTE DEL COMPLEMENTO 1Q (GC1QR). Snchez-Martn D1, Fogal V2, Ruoslahti E2, lvarez-Vallina L1. 1Unidad Inmunologa Molecular, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid. 2Burnham Institute for Medical Research (at UCSB), University of California, Santa Barbara, CA, USA. El receptor para el dominio globular de C1q (gC1qR/p33) es una protena celular expresada de forma ubicua que tambin se encuentra en el plasma y en la matriz extracelular. Adems de su implicacin en la modulacin de la activacin del sistema de complemento y la cascada de quinina, gC1qR se ha identificado como un ligando putativo de patgenos endovasculares y como potencial diana antitumoral en un modelo experimental con ratones inmunodeficientes portadores de

38

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

tumores humanos MDA-MB-435 en los que, al ser tratados con anticuerpo policlonal de conejo frente a la regin aminoterminal de gC1qR (obtenido por la inmunizacin con secuencias peptdicas correspondientes a esa regin), se observ una disminucin significativa del crecimiento tumoral. El presente estudio tiene como objetivo la obtencin de una coleccin de anticuerpos humanos en formato de fragmentos variables de cadena nica (scFv single chain Fragment variable) empleando la tecnologa de exposicin de bibliotecas combinatorias en la superficie de fagos filamentosos. Tras dos rondas de seleccin con la biblioteca Griffin.1 (de origen humano y con una diversidad de 1.2x109 clones distintos) frente a gC1qR recombinante humano se obtuvo un sesenta por ciento de clones con capacidad de reconocimiento del antgeno, seleccionndose diez anticuerpos distintos con representantes de las principales familias de cadenas: IGHV1, IGHV3, IGLV1 e IGLV3, as como un clon perteneciente a la familia IGHV4 para estudios preliminares de especificidad y caractersticas de unin mediante ELISA. Tres anticuerpos, sintetizados en formato soluble y purificados, han mostrado su capacidad para detectar la protena en la superficie de lneas celulares por citometra de flujo. Actualmente se est estudiando el posible efecto teraputico en modelos animales portadores de tumores humanos as como su valor diagnstico empleando herramientas de imagen molecular in vivo.

POLIMORFISMO DE LA REGIN TRANSMEMBRANA DEL GEN MICA EN CNCER DE MAMA ESPORDICO. Lavado Valenzuela R1, Bravo Romero MJ1, Benavides Orgaz M2, Als Daz I2, Cobos Dols M2, Alonso Ortiz A1, Caballero Gonzlez A1. 1Servicio de Inmunologa. 2Seccin de Oncologa Mdica. Hospital R. U. Carlos Haya. Introduccin. La respuesta antitumoral la realiza sobre todo la inmunidad innata (NKT, NK y clulas T ?/?). Las clulas tumorales son reconocidas por el sistema inmune a travs de receptores como NKG2D. MICA es un ligando de este receptor y se expresa en clulas estresadas, tales como clulas transformadas. MICA es muy polimrfico. Su exn 5 codifica el dominio transmembrana que tiene un STR (repeticiones GCT), que da lugar a los alelos A4, A5, A6 y A9. El alelo A5.1 produce una forma soluble de la protena. Objetivo. Analizar el polimorfismo de la regin transmembrana de MICA en pacientes con cncer de mama espordico. Material y mtodo. Se incluyeron 110 pacientes de la provincia de Mlaga y 121 controles sanos de la misma regin geogrfica. El anlisis del STR se hizo por PCR y anlisis de fragmentos en secuenciador automtico. Resultados. Al comparar pacientes y controles, slo se observaron diferencias en la frecuencia del alelo MICA-A5, la cual se encontr reducida en pacientes frente a controles (11% vs 20%, X2 (1 d.f.)=6.971; p=0.008). Dado que se haba descrito una asociacin entre HLA-B7 y cncer de mama en nuestras pacientes, se analiz la frecuencia de los alelos MICA en pacientes con HLA-B7 frente a controles HLA-B7. Se encontr que la frecuencia del alelo MICAA5.1 era mayor en pacientes que en controles (58% vs 16%, X2 (1 d.f.)=15.776; p=0.0002). Al comparar la frecuencia del alelo MICAA5.1 en pacientes HLA-B7 y pacientes con otros alelos de HLA-B, los resultados mostraron que se encontraba aumentada en pacientes HLA-B7 (58% vs 22%, X2 (1 d.f.)=20.837; p=0.00005). Esta diferencia no se encontr en controles sanos. Se observ que el 100% de las pacientes que portaban el alelo HLA-B7 tambin tenan el alelo MICA-A5.1. Conclusiones. El alelo MICA-A5 parece conferir proteccin frente al cncer de mama espordico en nuestras pacientes. La combinacin HLA-B7/MICA-A5.1 parece conferir susceptibilidad al cncer de mama espordico en nuestra rea geogrfica.

EL CANCER RENAL SE ASOCIA A UN INCREMENTO EN LA EXPRESION DE MOLECULAS HLA DE CLASE I. Senz-Lpez Garrocha P, Vazquez F, Rodrguez AI, Jimnez P, Czar JM, Tallada M. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Una de las caractersticas de las clulas tumorales es la adquisicin de un estado de baja inmunogenicidad al que contribuyen factores intrnsecos de la clula tumoral y factores extrnsecos, por un deterioro progresivo, al menos in situ, de la respuesta inmune antitumoral. El mecanismo mejor estudiado, y que contribuye a esta baja Inmunogenicidad son las alteraciones en la expresin de antgenos HLA de clase I y en la maquinaria de presentacin antignica. Hemos observado que la transformacin celular en el epitelio tubular renal, lleva aparejada un incremento en la expresin de los niveles de mRNA de la cadena pesada y de b2m . Este incremento de expresin se correlaciona con la mayor expresin de citoquinas proinflamatorias. Estos hallazgos en cncer renal difieren de lo encontrado en una variedad amplia de tumores, que cursan con alteraciones frecuentes en la expresin de antgenos HLA de clase I. En nuestro estudio hemos querido analizar, por inmunohistoqumica, la expresin HLA de clase I en tejido normal y neoplsico en 93 casos de tejidos tumorales de rin de pacientes y 29 muestras de tejido normal. Nuestros resultados confirmaron, el anlsis previo a nivel de RNA sobre muestras microdisectadas: la mayora de los tumores expresaron molculas HLA de clase I en la superficie. La expresin detectada en tejido neoplsico, contrast en intensidad y homogenidad con lo observado a nivel de los tbulos en las muestras de rion normal. Slo en un 16% de las muestras de tejido normal, se detect expresin de molculas HLA. Es probable que el incremento en la expresin de molculas HLA de clase I sea inducido por la mayor infiltracin linfocitaria en el tejido neoplsico. Si el incremento en la expresin observada es una estrategia para evadir la respuesta de clulas NK (que se encuentran en un nmero elevado en el infiltrado del cncer renal) es algo que quedara por demostrar.

CLULAS TUMORALES CON PRDIDA TOTAL DE EXPRESIN DE MOLCULAS MHC DE CLASE I MUESTRAN BAJA EXPRESIN DE LOS GENES: AP-2, MYC, GLIS Y FHIT. Romero Garca I, Stefanski J, Berruguilla Prez E, Linares Dickler I, Garrido C, Garrido Torres-Puchol F, Garca Lora AM. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. En nuestro laboratorio, hemos generado un modelo tumoral murno compuesto por diferentes lneas celulares metastsicas derivadas de metstasis espontneas generadas a partir de un mismo clon tumoral obtenido desde un fibrosarcoma inducido por metilcolantreno. Estas lneas celulares metastsicas presentan diferente expresin en superficie de molculas MHC de clase I, mostrando dos diferentes fenotipos: el primero presenta expresin en superficie de las molculas de clase I Kd, Dd y Ld; el segundo fenotipo H-2 se caracteriza por la prdida total de expresin de molculas de clase I debida a una baja regulacin coordinada a nivel transcripcioonal de varios componentes de la maquinaria de presentacion y procesamiento antignicas (APM). En

39

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

este estudio, teniendo en cuenta que todas las lneas metastsicas derivan del mismo clon tumoral, analizamos los posibles genes que pueden estar implicados en esta prdida de expresin de varios componentes de la APM. Se ha realizado una librera de sustraccin de cDNAs, as como microarrays, comparando las metstasis H-2 positivas con las H-2 negativas. Los genes encontrados expresados diferencialmente, han sido analizados mediante RT-PCR cuantitativa utilizando sondas Taqman. En la librera de sustraccin encontramos 12 genes expresados diferencialmente, entre los que debemos destacar cuatro: AP-2, Myc, Glis1 y Fhit. Estos genes eran expresados en las metstasis H-2 positivas y su expresin disminua en las metstasis H-2 negativas. Esta expresin diferencial fue corroborada por RT-PCR a tiempo real. Estos resultados podrian indicar una relacin directa en tre la perdida de expresin de estos genes y la perdida de expresin de los componentes de la APM y de las moculas MHC de clase I. a continuacin realizaremos estudios de transfeccin y de bloqueo de estos genes mediante siRNA para poder determinar claramente su implicacin en la expresin de molculas MHC de clase I.

NFAT5 PARTICIPA EN LA REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA EN RESPUESTA A LA ACTIVACIN DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL. Minguilln J1,2, Buxad M1,2, Berga R1, Aramburu J1, Lpez-Rodrguez C1. 1Unidad de Inmunologa, Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud (DCEX), Universitat Pompeu Fabra (UPF), Parc de Recerca Biomdica de Barcelona (PRBB), Barcelona. 2Estos autores han participado por igual en el trabajo presentado. Los receptores tipo Toll (TLRs) participan directamente en la respuesta inmune innata ya que, tras su activacin por reconocimiento de patrones moleculares asociados a los patgenos, desencadenan una cascada de seales intracelulares destinada a la induccin de los genes responsables de la respuesta inflamatoria contra los patgenos. Aunque el control transcripcional de la expresin de genes proinflamatorios en respuesta a patgenos resulta clave, nuestro conocimiento de las interacciones moleculares que ocurren a este nivel es todava relativamente limitado. En respuesta a la activacin de los TLRs en clulas inflamatorias macrfagos-, NFAT5 no slo se induce, sino que adems es reclutado especficamente a las regiones que regulan la expresin de diferentes genes proinflamatorios. Asimismo, los macrfagos derivados de mdula sea que carecen de NFAT5 son deficientes en la expresin (mRNA y protena) de diferentes mediadores inflamatorios y antimicrobianos que se inducen tras la activacin de los TLRs. Nuestro trabajo revela que NFAT5 acta como un regulador transcripcional durante la activacin de los TLRs y por lo tanto incrementa el conocimiento de los mecanismos moleculares que actan durante esta respuesta.

SESIN 8: INMUNIDAD E INFECCIN Moderadores: Dr. Francisco Lozano (Granada), Dra. Margarita Bofill (Barcelona) LOS FAGO-RECEPTOSOMAS DE IFN-GAMMA/IL-6 SON COMPARTIMIENTOS DE SELIZACIN Y LISTERICIDAS. Fernndez Prieto L, Gomez Lopez MT, Madrazo Toca F, del Cerro Vadillo E, Alvarez Domnguez C, Carrasco Marin E. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla-IFIMAV. Los fagosomas son compartimientos intracelulares de destruccin de Listeria monocytogenes; as si dichos fagosomas pertenecen a macrfagos activados con ciertas citocinas su potencial listericida es ms exacerbado. Aqu describimos una nueva ruta de sealizacin mediada por Stat1 que implica a las citocinas: IFN-gamma e IL-6 y que se compartamentaliza en fago-receptosomas de IFN-gamma/IL-6. Esta compartimentalizacin permite que tanto la destruccin del patgeno, la respuesta immune especfica y la regulacin de la IL-6 queden ligados en el mismo microambiente. La ruta listericida y compartimentalizada induce dos ondas de sealizacin Stat1-Rab5a dependientes y ligadas a la accin listericida de dos protenas lisosomales; la esfingomielinasa cida y la catepsina-D. Como parte de estas dos seales Stat1dependientes se regulan positivamente los mediadores de la phox: p67phox/Rac2-GTP y se activa la iNOS fagosomal. Por otro lado, la activacin de Rab5a en esta va, induce la transformacin de dichos fago-receptosomas listericidas IFN-gamma/IL-6 en compartimientos de MIIC, donde se localizan molculas MHC-II cargadas con pptidos, se degrada el antgeno listeriolina O y se detectan otros marcadores MIIC como Lamp-2 y Limp-2, pero de forma independiente a Stat1. Nuestro grupo ha verificado la existencia de esta va de compartimentalizacin en macrofagos deficientes geneticamente en los posibles mediadores iniciales de esta va como Stat1 y Stat3 y mediadores finales como esfingomielinasa cida, catepsina-D, Lamp-2 y Limp-2; lo cul ha confirmado el papel de estos ltimos en la inmunidad innata frente a este patgeno.

VACUNAS: EL DIRECCIONAMIENTO AL RECEPTOR DE LA SIALOADHESINA MEJORA LA PRESENTACIN DE ANTGENO A LAS CLULAS T. Poderoso Garca T, Revilla Calvo C, lvarez Vega B, Chamorro Prez S, Martnez de la Riva S, Alonso Moreno F, Ezquerra Martnez A, Domnguez Juncal J. INIA (Instituto Nacional de Investigacin y Tecnologa Agraria y Alimentaria). El principal objetivo de una vacuna es inducir una respuesta inmune capaz de proteger de forma duradera frente un determinado patgeno. Una de las estrategias que se estn investigando para potenciar la respuesta frente antgenos poco inmunognicos es el direccionamiento de stos a clulas presentadoras de antgeno (APCs), mediante su conjugacin con anticuerpos especficos. La sialoadhesina (Sn) es un miembro de la familia de protenas Siglec (sialic acid binding Iglike lectins) cuya expresin est restringida a subpoblaciones de macrfagos tisulares, monocitos inflamatorios y algunas clulas dendrticas. En este estudio hemos analizado la expresin de la sialoadhesina en tejidos porcinos, su regulacin por citocinas y su potencial como receptor para el direccionamiento antignico. En el cerdo, la sialoadhesina se expresa en macrfagos de la zona marginal del bazo y en clulas dendrticas derivadas de monocitos cultivados con GM-CSF y IL-4 (MoDC). Los monocitos sanguneos (Mo) no expresan esta molcula pero puede inducirse mediante un tratamiento previo con IFN-a. Para analizar si el direccionamiento de antgeno hacia este receptor favorece la presentacin a las clulas T, comparamos la respuesta proliferativa obtenida con un anticuerpo monoclonal anti-Sn (1F1) con la obtenida con una Ig control del mismo isotipo (1D9). Como clulas respondedoras se utilizaron clulas T sanguneas de cerdos inmunizados con un pool de Igs de ratn y, como APCs, MoDc o Mo incubados con IFNa. Para obtener niveles similares de proliferacin se necesitaron de 100 a 1000 veces menos cantidad de Ig control que de Ab anti-Sn. En con-

40

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

sonancia con estos resultados, la incubacin de macrfagos y MoDC con mAb 1F1 y 1D9 marcados con Alexa 488 a 37C durante 30 minutos, demostr que la Sn es un receptor endoctico. Estos datos sugieren que el direccionamiento de antgenos hacia la molcula de Sn podra mejorar la eficiencia de su captacin y/o procesamiento por las APCs. Actualmente se est evaluando el potencial in vivo de esta molcula como diana del direccionamiento de antgenos.

MECANISMOS DE ADYUVANCIA INMUNOLGICA: PAPEL DE GITR EN EL EFECTO PROADYUVANTE DE LA ENTEROTOXINA TERMOLABIL DE ESCHERICHIA COLI. Tamayo E1, Postigo J1, Santiuste I2, Riccardi C3, del Giudice G4, Merino R2, Merino J1. 1Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Cantabria. 2Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN. 3Departamento de Medicina Clnica y Experimental, Universidad de Perugia. 4Research Center, Novartis Vaccines. La administracin de antgenos proteicos en superficies mucosas induce tolerancia sistmica a los mismos. Este efecto se evita administrando determinados adyuvantes orales, como la enterotoxina termolabil de Escherichia Coli (LT) junto al antgeno vacunal. No obstante, el uso de LT en vacunacin en mucosas se ve lastrado por su gran toxicidad y por el desconocimiento de los mecanismos inmunolgicos implicados en su efecto adyuvante. Para investigar estos mecanismos se analiz la capacidad de LT para inducir la activacin y proliferacin de los linfocitos a diferentes periodos tras su administracin por va parenteral. El anlisis de la expresin de diferentes marcadores de activacin linfocitaria y de la incorporacin de BrdU en linfocitos, muestra que LT induce selectivamente la expresin de GITR en linfocitos T, pero no su proliferacin. Este efecto es dependiente de la actividad mono-ADPribosiltransferasa de LT, dado que LTK63, un mutante atxico de LT carente de esta actividad y con un efecto pro-adyuvante reducido, no es capaz de inducir GITR en linfocitos T. As mismo, otro adyuvante inmunolgico ampliamente utilizado en animales de experimentacin como el adyuvante completo de Freund, tampoco induce la expresin de GITR en linfocitos T. El tratamiento de ratones adultos con gammaglobulina humana monomrica (GGHM) induce un estado de tolerancia linfocitaria que impide la respuesta frente a la forma inmunognica del antgeno, la gammaglobulina humana agregada (GGHA). Usando este modelo experimental, observamos que LT, pero no LTK63, bloquea la induccin de tolerancia a la GGH. Un bloqueo similar se observa si se administra DTA1, un AcM agonista anti-GITR, al mismo tiempo que la GGHM. Por el contrario, LT no bloquea la induccin de tolerancia a la GGH en ratones deficientes en GITR. En conjunto, nuestros resultados demuestran que la induccin de GITR en linfocitos T por LT constituye uno de los mecanismos implicados en la actividad adyuvante de esta toxina.

Objetivo. Conocer la prevalencia de la respuesta inmune de clulas T frente al VHC en parejas heterosexuales de pacientes con hepatitis crnica VHC. Mtodo. Se han incluido 30 parejas heterosexuales, sin Anticuerpos-VHC ni ARN-VHC (PCR a tiempo real, Taqman, Roche y Elisa, Bep III, Dade Behring). Se realiz encuesta sobre riesgos de exposicin. Adems se estudiaron 15 pacientes en diferentes situaciones respecto al VHC (infeccin activa, respondedores y aclaramiento espontneo) y 10 controles sanos. Para la deteccin de una poblacin de clulas T memoria que responden a antgenos del VHC solubles, se parti de sangre completa, que se enfrent a los siguientes 6 pptidos del VHC: 1)NS3 (aa 1241-1260); 2)NS3 (aa 1531-1550); 3 NS3 (aa 1581-1600); 4)NS4b (aa 1771-1790); 5)NS5b (aa 2571-2590); 6)NS5b (aa 2941-2960). Tras 6 horas de incubacin en presencia de molculas coestimuladoras y brefeldina A (BFA), se lisaron los hemates y fijaron los leucocitos, para proceder al anlisis mediante citometra de flujo, donde se analizaron la siguientes combinaciones: CD69/CD3; CD69/CD4; CD69/CD8; IFN?-IL-4/CD3; IFN-IL-4/CD4; IFN-IL-4/CD8. Todos estos datos se analizaron estadsticamente mediante el programa SPSS v.14.0 (H de Kruskal-Wallis y U de Mann Whitney). Resultados. Los valores mayores que la media de los 10 controles, y mayores que la media ms dos desviaciones estndar de los 10 controles para cada mezcla, fueron considerados positivos. Se comprob mayor activacin de CD4+ frente al pptido 5) en parejas que en controles. Estos signos de respuesta inmune son significativamente mayores en pacientes que en controles, y se comprob mayor porcentaje de clulas CD3+ y CD8+ que secretan IL-4 frente al pptido 3). Conclusiones. Las parejas de pacientes infectados crnicamente por VHC muestran signos de haber entrado en contacto con el virus y de respuesta inmune celular especfica a pptidos VHC. El papel potencial de esta respuesta en la proteccin contra la infeccin por VHC es de gran inters.

LA APOPTOSIS DE LINFOCITOS MADUROS INDUCIDA POR LA TOXINA TERMOLABIL DE E. COLI IMPLICA TANTO A LOS RECEPTORES DE MUERTE EN MEMBRANA COMO A LA VIA MITOCONDRIAL. Postigo J1, Tamayo E1, Fernndez-Rey M1, Merino R2, Merino J1. 1Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Cantabria. 2Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN. En estudios previos hemos demostrado que la enterotoxina termolabil de Escherichia Coli (LT) promueve apoptosis en linfocitos T y B inmaduros en el timo y mdula sea, respectivamente. Esta apoptosis no implica a las vas de membrana de Fas o TNF, pero es inhibida tras la hiperexpresin de Bcl-2. As mismo, demostramos que LT induce la secrecin por las glndulas suprarrenales de niveles elevados de glucocorticoides que son los responsables directos de la apoptosis en linfocitos inmaduros. En vista de estos hallazgos, nos planteamos analizar en primer lugar la posible participacin de receptores de muerte diferentes de Fas y TNFR, o de mecanismos independientes de la activacin de caspasas mediados por AIF, en el efecto pro-apopttico de LT sobre los timocitos inmaduros (como ejemplo de linfocitos inmaduros). En segundo lugar, analizamos si LT promueve tambin apoptosis en linfocitos T y B maduros y sus posibles mecanismos. Para ello, estudiamos el efecto proapopttico de LT sobre timocitos y linfocitos T maduros en ratones deficientes AIF en linfocitos T o en Bim as como en animales transgnicos para un dominante negativo de FADD (FADD-DN Tg) en linfocitos T, que bloquea la apoptosis inducida por todos los receptores de muerte.

RESPUESTA CELULAR INMUNE ESPECFICA AL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) EN PAREJAS HETEROSEXUALES DE PACIENTES INFECTADOS. Roque Cuellar MC1, Aguilar Reina J1, Alvarez Mquez MA2, Garca Lozano JR2, Gonzlez Escribano MF2, Nuez Roldan A2, Snchez Snchez B2. 1Seccin de Hepatologa. Servicio de Aparato Digestivo. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Virgen del Rocio. En algunas series se ha encontrado respuesta inmune celular especfica al VHC en parejas y familiares de pacientes con infeccin aguda o crnica.

41

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

Nuestros resultados muestran que la ausencia de AIF o la sobre-expresin de FADD-DN en timocitos no bloquea la apoptosis inducida por LT. La ausencia de Bim reduce significativamente esta apoptosis en concordancia con el papel regulador de Bcl-2 en la misma. Por el contrario, la apoptosis inducida por LT en linfocitos T maduros esta reducida en los animales FADD-DN Tg a un nivel similar al observado en ratones que sobre-expresan Bcl-2 en linfocitos T o adrenalectomizados. En este sentido, la inhibicin fue completa en ratones FADD-DN/Bcl-2 dobleTg. Estudios preliminares con ratones lpr o tratados con un mAb antiTRAIL sugieren que el receptor Fas es el responsable de la muerte inducida por LT mediada a travs receptores de membrana. En conclusin, nuestro estudio demuestra que LT promueve apoptosis de linfocitos maduros e inmaduros mediante mecanismos diferentes.

CARACTERIZACIN DE LAS CLULAS PRODUCTORAS DE IL10 EN RGANOS LINFOIDES DE CERDOS AFECTADOS NATURALMENTE POR CIRCOVIROSIS PORCINA. Crisci E1, Domnguez J2, Segals J1,3, Montoya M1. 1Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autnoma de Barcelona, Barcelona. 2Departamento de Biotecnologa, Instituto Nacional de Investigacin y Tecnologa Agraria y Alimentaria (INIA), Madrid. 3Department de Sanitat i dAnatomia Animals, Facultat de Veterinaria, Universitat Autnoma de Barcelona (UAB), Barcelona. La circovirosis porcina es una enfermedad de distribucin mundial que afecta a los cerdos. Se considera un proceso multifactorial causado esencialmente por circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Esta enfermedad se caracteriza patolgicamente por deplecin linfocitaria e inflamacin granulomatosa en los rganos linfoides, y actualmente se sabe que el sistema inmune es clave en la patognesis de la enfermedad. Estudios previos han revelado un perfil de citoquinas indicativo de inmunosupresin de clulas T, una discapacidad en la respuesta innata y sugieren que la interleuquina 10 (IL-10) tiene una importante funcin durante el curso de la infeccin. El objetivo principal de este estudio fue caracterizar y localizar las subpoblaciones de clulas inmunitarias involucradas en la secrecin de IL-10. Para ello, se us la inmunofluorescencia indirecta en criosecciones de rganos linfoides (bazo y linfonodo mediastnico) de 4 animales sanos y 4 animales afectados con la enfermedad. Los resultados obtenidos mostraron que las subpoblaciones linfocitarias CD4+ y CD8+ producen IL-10 en los tejidos estudiados, mientras que en las clulas presentadoras de antgeno (MHCII+), los macrfagos/monocitos (CD163+) y los granulocitos no se detect co-localizacin con la IL-10. Mediante el contaje visual de las clulas doblemente positivas, los resultados indicaron que el nmero de clulas productoras de IL-10 es aproximadamente el doble en los animales enfermos en comparacin con los sanos. Este es el primer estudio de caracterizacin de las clulas productoras de IL-10 en animales con circovirosis porcina. Actualmente se est estudiando su correlacin con la presencia de PCV2 en las mismas secciones.

contribuye a la persistencia viral inhibiendo la respuesta inmune celular especfica. En este estudio se analiza el nivel, fenotipo y grado de activacin de las Treg en pacientes con infeccin por VHC y/o VIH. Mtodos. Se estudiaron 91 pacientes: 20 controles, 20 pacientes VHC-/VIH+, 20 VHC+/VIH- y 31 coinfectados VHC+/VIH+. Las Treg se definieron como CD4+Foxp3+. El nivel, fenotipo (basado en CD25, CD45RA, CD27 y CD127) y el grado de activacin (basado en CD38) de estas clulas fueron analizados por citometra de flujo de 5 colores. Las diferencias entre grupos se evaluaron con pruebas estadsticas no paramtricas. Resultados. El nivel de Treg fue mayor en pacientes VIH+ que en controles y que en pacientes VHC+/VIH- (p=0.01). Tanto en pacientes como en controles slo el 50% de las Treg expresaron CD25. El 95% de las Treg CD25+ tenan fenotipo CD45RA-CD127- en todos los grupos, mientras que las Treg CD25- fueron ms heterogneas en su fenotipo. El 65% de las Treg fueron CD45RA- CD27+ (memoria central), sin diferencias entre controles y pacientes. Sin embargo, las Treg CD45RA+CD27+ (naive) fueron menos frecuentes en pacientes que en controles (p=0.04). La activacin de las Treg fue mayor que la de clulas CD4+ totales en todos los grupos (p<0.0001). Conclusiones. La infeccin por VIH induce un incremento de las Treg activadas. CD25 define dos poblaciones de Treg con diferente perfil fenotpico. El nivel de Treg aumenta en paralelo a la disminucin de CD4, lo que podra contribuir al curso acelerado de la lesin heptica en pacientes VHC+/VIH+.

ESTIMACIN DE LA INFECCIN TUBERCULOSA EN DONANTES DE SANGRE DE LA COMUNIDAD DE CANTABRIA MEDIANTE LA DETERMINACIN DE IFN-GAMMA TRAS ESTIMULACIN CON ANTGENOS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Villegas N1, Gonzalo Ocejo-Vinyals J1, Amunrriz C2, Ausn F1, Leyva-Cobin F1, Arroyo JL2. 1Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. 2Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria. Introduccin. Las comunidades del norte de Espaa, como Cantabria, junto con Portugal tienen la mayor incidencia y prevalencia de infeccin tuberculosa en Europa. En los ltimos aos, la introduccin de un ensayo para medir mediante enzimoinmunoanlisis (ELISA) la produccin especfica de IFN-gamma (interferon-gamma release assay, IGRA) tras estimulacin de las clulas linfoides con antgenos de Mycobacterium tuberculosis, ha contribuido a aumentar la sensibilidad y especificidad en el diagnstico inmunolgico de la infeccin tuberculosa. Nuestro objetivo ha sido utilizar el IGRA para conocer la prevalencia de la infeccin por M. tuberculosis en la poblacin sana donante de sangre de nuestra Comunidad. Materiales y Mtodos. Se incluyeron en este estudio 167 donantes de sangre (111 varones, 56 mujeres) con edades comprendidas entre 19-65 aos y que tras ser adecuadamente informados consintieron participar en este estudio. Todos fueron sometidos a los cuestionarios y anlisis habitualmente establecidos en un Banco de Sangre. Para este estudio, el IGRA utilizado fue el comercialmente conocido como QuantiFERON-TB Gold In-Tube. Se obtuvieron tres muestras de sangre circulante en tubos estriles con vaco previo. Un tubo contenia antgenos de M. tuberculosis (ESAT-6, CFP-10 y TB 7.7), otro una concentracin ptima de fitohemaglutinina y un tercero sin aditivos. Todos los tubos se incubaron (37C, 16-24 hr) y tras centrifuga-

NIVEL, FENOTIPO Y ACTIVACIN DE LAS CLULAS T REGULADORAS FOXP3+CD4+ EN PACIENTES CON INFECCIN POR LOS VIRUS DE LA HEPATITIS C Y/O VIH. Ibn Ralln N, Lpez M, Soriano V, Garca-Samaniego J, Romero M, Labarga P. Hospital Carlos III. Introduccin. Las infecciones por VIH y VHC pueden alterar la poblacin de clulas T CD4+ reguladoras (Treg). Esta poblacin

42

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

cin (4oC, 15 min, 2,000 X g), se determin la concentracin de IFNgamma presente en el plasma recogido mediante ELISA. Los resultados se interpretaron con un soporte informtico proporcionado por el proveedor. Para el anlisis estadstico se utiliz la prueba de Chi 2 con correccin de Yates o la prueba exacta de Fisher cuando fue necesaria. Resultados. De los 167 individuos analizados, 27 presentaban concentraciones elevadas de IFN-gamma y fueron considerados positivos (16,17%). No se encontr una diferencia estadsticamente significativa entre sexos (20 varones, 7 mujeres). Sin embargo, si que existan diferencias significativas cuando se agruparon los donantes en tres grupos de edad (18-35, 36-50 y 51-65 aos) siendo la prevalencia mayor en el grupo de ms edad (prueba de homogeneidad entre niveles, p = 0.02; prueba de tendencia lineal, p = 0.006). Conclusin. La utilizacin del IGRA supone una ventaja para el despistaje de la infeccin por M. tuberculosis frente al mtodo clsico de la intradermorreaccin de Mantoux, pues aporta mayor sensibilidad y especificidad. Los resultados de este estudio apuntan a una elevada prevalencia de infeccin tuberculosa en la poblacin sana donante de sangre de Cantabria.

LA EXPRESION DE LA MOLECULA MR1 (MHC-RELATED 1) HUMANA EN LA SUPERFICIE CELULAR NECESITA LIGANDOS QUE SON INDEPENDIENTES DE LA ACTIVIDAD DEL PROTEASOMA. Abos Gracia B, Gmez del Moral M, Gozalbo Lpez B, Cedenilla Horcajuelo M, Martnez Naves E. Universidad Complutense. Madrid. Introduccin. MR1 (MHC-related 1) es una molcula HLA de clase I no clsica que restringe el desarrollo de los linfocitos MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells), caracterizados por poseer un TCR invariante. La funcin de las clulas MAIT se desconoce, pero parecen tener propiedades inmunoreguladoras. Tampoco se conoce el ligando presentado por MR1 a los MAIT. Objetivos. Analizar la expresin de MR1 en la superficie celular, su dependencia de temperatura (como marcador de dependencia de ligando) y de la actividad del proteasoma. Metodologa. La expresin celular de MR1 se analiz mediante tcnicas de citometra de flujo e inmunohistoqumica utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales anti-MR1. Se analizaron lneas celulares de diferente linaje incluyendo L721.221 y C1R transfectadas con MR1 y denominadas MR1.221 y MR1.C1R respectivamente. Resultados. Las lneas transfectadas MR1.221 y MR1.C1R expresaron altos niveles de MR1 en la superficie, a diferencia del resto de lneas analizadas. Sin embargo a 26 C MR1 fue detectable en todas las lneas linfoblastoides y las clulas transfectadas tambin incrementaron la expresin de MR1. Esto sugiere que la expresin de MR1 en la superficie celular est limitada por la disponibilidad de ligandos ya que su comportamiento es similar a las molculas HLA de clase I clsicas. Tambin estudiamos la dependencia de la expresin de MR1 del proteasoma. Para ello analizamos la re-expresin en superficie de MR1 en la lnea MR1.221 despus de someterla a condiciones de elucin a pH cido. Hemos observado que MR1 es sensible al tratamiento cido, al igual que lo son las molculas HLA de clase I clsicas. Sin embargo, al contrario de lo que sucede con stas, la re-expresin de MR1 en la superficie despus de la elucin cida no es bloqueada por inhibidores especficos del proteasoma. Conclusin. La expresin de MR1 en la superficie celular necesita de ligandos que son independientes de la actividad del proteasoma.

SESIN 9: CLULAS DENDRTICAS Moderadores: Dr. ngel Corb (Madrid), Dr. Francisco Borrs (Barcelona) MHC DE CLASE I PROTEGE DEL RECORTE POR AMINOPEPTIDASAS DEL RETCULO ENDOPLSMICO IN VITRO. Infantes S1, Samino Y2, Lorente E1, Jimnez M1, del Val M2, Lpez D1. 1Unidad de Protemica. 2Unidad de Inmunologa Viral. Centro Nacional de Microbiologa. ISCIII. En la denominada va clsica de presentacin antignica asociada a molculas MHC de clase I, las protenas virales sufren diversos cortes proteolticos que generan pptidos de diferente longitud, algunos de los cuales pueden ser posteriormente transportados al lumen del Retculo Endoplsmico (ER) en donde se encuentran expuestos a la actividad de aminopeptidasas del ER (ERAAP). Actualmente, se han propuesto dos modelos diferentes para explicar el mecanismo de accin de ERAAP. El primero denominado "molecular ruler" propone la unin del sustrato largo por sus extremos a la enzima. El carboxilo terminal interacciona con un pocket hidrofbico y el amino terminal queda accesible al sitio activo de la enzima que va eliminado los residuos de forma no procesiva. Los productos finales de 9-10 aminocidos se uniran despus a MHC. El segundo modelo propuesto o template model supone que los precursores peptdicos largos se unen primero a MHC por su extremo carboxilo, dejando accesible su extremo amino protuberante a la actividad de la enzima. Hemos estudiado la degradacin por ERAAP de un ligando natural de 16 aminocidos que es reconocido por linfocitos T citolticos. Los datos in vitro obtenidos indican que este pptido amino-protuberante es eficientemente recortado por ERAAP hasta el eptopo mnimo de 9 residuos mientras se encuentra soluble y que su unin a la molcula de histocompatilibidad lo protege de la actividad proteoltica de la enzima.

FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE IREM-2 RECEPTOR (CD300e) IN HUMAN MONOCYTES. Brckalo T1, Cassatela MA2, Lpez-Botet M1. 1Universitat Pompeu Fabra. 2University of Verona. The CD300e (IREM-2) was originally reported to be expressed by mature monocytes and peripheral blood myeloid dendritic cells The receptor was associated with the DAP-12 adaptor in co-transfected cells and was capable of inducing NFAT transcriptional activity upon engagement by a specific mAb (Aguilar et al. 2004. J. Immunol. 173:6703-6711). In this study we have investigated the functional effects of CD300e ligation in various responses of human monocytes. Upon engagement by an agonistic mAb, CD300e triggered an intracellular calcium mobilization and the release of reactive oxygen intermediates in freshly isolated cells. Stimulation via CD300e triggered the release of pro-inflammatory chemokines and cytokines (i.e. IL-8/CXCL8 and TNF), up-regulated the expression of cell surface activation markers (i.e. CD25, CD83 and CD86) and promoted cell survival. Primary monocytes differentiated into alternatively activated macrophages following the activation through CD300e, as evidenced by higher expression of CD14, CD16 and CD163 cellular markers. Monocytes sti-

43

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

mulated by IL-4, GM-CSF, but not M-CSF modulated CD300e expression within the first 24h of culture. Overall, our data demonstrate that CD300e is a functional activating receptor in human monocytes involved in regulating the innate immune response.

CARACTERIZACIN DE MACRFAGOS PERITONEALES ALTERNATIVAMENTE ACTIVADOS (MAA): IMPLICACIONES PARA UN PAPEL EN MECANISMOS DE FIBROSIS RELACIONADOS CON ANOMALAS EN LA MEMBRANA PERITONEAL. Martnez Cabeza V, Lucendo B, Auxiliadora Bajo M, Castro MJ, del Peso G, Selgas R, Belln T. Hospital Universitario La Paz, Madrid. La dilisis peritoneal puede desencadenar un proceso de fibrosis peritoneal que finalmente condiciona el estado funcional de la membrana peritoneal. Las infecciones peritoneales y la composicin de los lquidos de dilisis influyen en el estado del peritoneo. Los macrfagos peritoneales (Mp) no han sido asociados con capacidades defensivas eficientes contra infecciones en pacientes de dilisis peritoneal. Esto sugiere que los Mp podran haber desarrollado otras funciones como las que presentan los macrfagos alternativamente activados (M2/MAA) cuya capacidad para participar en fibrosis de rganos ha sido demostrada. Se ha usado citometra de flujo, RT-PCR y qRT-PCR para analizar el fenotipo de los macrfagos de efluente peritoneal en pacientes a los que se les realiza dilisis peritoneal, y se ha probado su capacidad para estimular la proliferacin de la lnea celular de fibroblastos humanos IRM90 y de fibroblastos primarios de piel. Se han comparado Mp de pacientes con y sin peritonitis activa. Los resultados muestran la presencia de M2/MAA en el peritoneo y sugieren que distintas subpoblaciones de M2/MAA podran participar en fibrosis peritoneal produciendo citoquinas y quimioquinas profibrognicas y estimulando el crecimiento de fibroblastos.

Objetivos. Implementar una metodologa Dual Beam System (SEM/FIB) - que combina las tcnicas ya conocidas de microscopa electrnica de barrido (SEM) con aquellas derivadas del uso de un can de iones (FIB), como la obtencin de cortes en lminas muy finas (tcnica de milling)- que permita la localizacin y el seguimiento de nanopartculas de oro en el interior celular. Metodologa. Se incubaron macrfagos peritoneales durante 24h con Nps de oro recubiertas con slice (NPs de 50nm de dimetro). Se fijaron y se incluyeron en resina Epoxy y se realizaron cortes de dichas preparaciones mediante la tcnica de miling. Las preparaciones fueron visualizadas mediante SEM (detector de electrones retrodispersados) y se realiz una composicin tridimensional del conjunto de las observaciones. Resultados. Las Nps de oro aparecen fundamentalmente en los fagosomas y endosomas de los macrfagos, sin observarse la llegada de ninguna Np al ncleo celular. El estudio de diversos cortes realizados con un Dual Beam System y la posterior composicin tridimensional, muestra varias Nps en el interior del mismo fagosoma, y hasta un total de 14 vesculas mostraron en su interior nanopartculas. No se observ una polarizacin del proceso de fagocitosis, observndose NPs distribuidas bastante homogneamente por el interior de los macrfagos. El estudio se complet mediante la tcnica de TEM, que permiti confirmar los datos obtenidos por SEM-FIB. Conclusiones. La combinacin de las tcnicas de SEM y FIB puede ser empleada con xito para la visualizacin intracelular de nanopartculas de oro en el interior de distintos compartimentos celulares.

TLR-TRIGGERING ON TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS RESULTS IN TLR2 ENHANCEMENT AND AN IMPAIRED PROINFLAMMATORY PROGRAMME. Chamorro Prez S1, Garca-Vallejo JJ1, Unger W2, Fernandes R1, Bruijns S CM1, Laban S2, Roep BO2, THart BA3, Van Kooyk Y1. 1VUmc, msterdam, 2 LUMC, Leiden, 3 BPRC, Rijswijk. Dendritic cells modulated with either cytokines or pharmacological mediators offer a therapeutic potential to ameliorate or prevent autoimmune diseases. These modulated tolerogenic cells (TDC) inhibit adaptative immune responses by using immunosuppressive mechanisms as anergy induction or Treg generation. However, little is know about their TLR repertoire and how TLR agonists different than LPS modulate their responses. We here have made a full analysis and comparison of the innate characteristics of three types of human tolerogenic DC obtained by addition of either IL10 (IL10-DC), dexamethasone (DX-DC) or calcitriol (1,25(OH)2D3-DC) to monocyte-derived dendritic cells. A detailed analysis of TLR mRNA expression (TLR1-TLR10) was performed by qRT-PCR. Likewise we investigated the effects on maturation, cytokine release, allostimulatory capacity and T cell driven differentiation on TDC triggered by TLR2, 3, 4 and 5 agonists. We show that TDC are endowed with the same TLR set as monocyte-derived dendritic cells although responding differently to TLRmediated stimulation. Strikingly, only tol-DC upregulated the expression of TLR2 (mRNA and protein) in response to specific TLR agonists (pam3CSK4, poly I:C, LPS and flagellin). TLR2 increase decodes TDC to further pam3CSK4 restimulation and it is partially modulated by p38MAP kinase. TDC expressed low/no IL12-related cytokines and remarkably elevated IL10 levels. Nevertheless differences among stimulated-TDC were detected, DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC upregula-

VISUALIZACIN DE NANOPARTCULAS POR LA TCNICA DE SEM-FIB EN EL INTERIOR DE MACRFAGOS. Daz-Freitas B1, Mndez J2, Pastoriza I3, Snchez-Espinel C1, Faro J1, Magadn S5, Lz Marzn L3, Gonzlez-Fernndez A1. 1rea de Inmunologa -Campus Lagoas Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 2Centro de Apoyo Cientfico-Tecnolgico a la Investigacin (CACTI)-Campus Lagoas Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 3Grupo de Qumica Coloidal- Campus Lagoas Marcosende, Universidad de Vigo (Pontevedra). 4Estudos Avanados de Oeiras, Instituto Gulbenkian de Cincia, Oeiras, Portugal. 5Instituto Superior de Saude do Alto Ave (ISAVE), Quinta de Matos, Geraz do Minho, Portugal. Antecedentes. La nanotecnologa ha irrumpido con fuerza en el campo biomdico especialmente en el campo del diagnstico, pero en los ltimos aos tambin se est evaluando su gran potencial en terapia humana. La mayora de las nanoparticulas (Nps) son reconocidas y rpidamente fagocitadas por los macrfagos del sistema retculo endotelial (fundamentalmente en hgado y bazo). Este proceso depende del tamao, cobertura e hidrofobicidad de las Nps. Las Nps pequeas (inferiores de 90 nm de dimetro) son fcilmente visualizables mediante microscopa electrnica de transmisin (TEM), pero sta es una tcnica costosa y tediosa, mientras que la tcnica de microscopa electrnica de barrido (SEM), no permite visualizar el interior de las clulas. Por todo ello, el desarrollo y uso de nuevas tcnicas de microscopa electrnica podran ayudar a conocer las rutas de internalizacin de estas nanoestructuras, proporcionando mapas intracelulares.

44

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

ted TLR2 irrespective the TLR triggered whereas LPS-mediation was observed on IL10-DC. Likewise DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC exhibited reduced allostimulatory properties, impaired ability to maturate and hampered capacity to differentiate nave T cells to effector Th1 cells. Therefore both DX-DC and 1,25(OH)2D3-DC display the strongest tolerogenic and anti-inflammatory features and might be beneficial for the treatment of autoimmune diseases.

IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN FENOTPICA, MORFOLGICA Y FUNCIONAL DE LOS PRECURSORES DE CLULAS DENDRTICAS PLASMOCITOIDES EN MDULA SEA DE ADULTOS SANOS. Martn Martn L1,2, Almeida Parra J1,2, Hernndez Campo PM2, Snchez Garca ML2, Lcrevisse Q1, Orfao de Matos A1,2. 1Centro de Investigacin del Cncer (CSIC/USAL), Salamanca. 2Servicio de Citometra y Departamento de Medicina, Universidad de Salamanca. Introduccin. Actualmente se desconoce la secuencia de maduracin de los precursores de clulas dendrticas plasmocitoides (preCDp). Objetivo: analizar las caractersticas fenotpicas, morfolgicas y funcionales de los pre-CDp durante su maduracin en mdula sea normal (MON) de adultos. Metodologa. El estudio fenotpico (n=33 MON) se realiz mediante citometra de flujo con combinaciones sxtuples de anticuerpos monoclonales; la caracterizacin morfolgica (n=4) sobre pre-CDp purificados, teidos con May-Grmwald-Giemsa; la secrecin de IFN-alfa (n=3) se determin mediante ELISA, tras estimulacin de poblaciones purificadas con CpG, y la capacidad de endocitosis (n=3), mediante captacin de dextrano. Resultados. Sistemticamente se identificaron tres estadios madurativos de pre-CDp, de acuerdo a la expresin de HLA-DR/CD34/ CD45/CD123. La expresin de molculas presentadoras de antgeno se mantuvo alta a lo largo de la maduracin, mientras que la de las molculas asociadas a CDp aument progresivamente. Curiosamente, CD86 se expresaba en las clulas ms inmaduras, siendo indetectable en las ms maduras, mientras que CD40 slo se detect en el estadio ms maduro. El anlisis morfolgico de las subpoblaciones purificadas de pre-CDp de MON revel un aumento progresivo de la indentacin nuclear y una disminucin de la basofilia citoplasmtica con la maduracin. Slo se observaron prolongaciones citoplasmticas en los pre-CDp estimulados con CpG. La nica poblacin capaz de secretar IFN-alfa tras estimulacin fue la ms madura, mientras que la de mayor capacidad endoctica fue la ms inmadura. Conclusiones. En MON de adultos existen al menos tres estadios de diferenciacin de la lnea de CDp, con caractersticas fenotpicas, morfolgicas y funcionales distintas; adems, nuestros hallazgos sealan que los pre-CDp ms inmaduros tendran capacidad de endocitosis y/o presentacin antignica, lo que sugiere que podran tener un papel relevante en la induccin de tolerancia.

que la actividad inmunitaria est disminuida. La apoptosis de las clulas inmunitarias ha sido propuesta como un mecanismo para el mantenimiento del privilegio inmunolgico, participando no solo el sistema TRAIL-TRAIL-R sino tambin el sistema FAS-FASL. Por otro lado la expresin de receptores inhibidores, como el ILT2, participaran en la deshinibicin de las funciones citotxicas. La actividad inmunolgica materna frente al feto podra ser un mecanismo biolgico eficiente para eliminar fetos cuando se presente algn problema con la gestacin, determinndose que solo los fetos en un estado adecuado llegarn al final de la gestacin. Objetivo. El objetivo del presente trabajo es determinar la expresin de FAS, FASL e ILT2 en decidua de aborto espontneo y decidua normal. Materiales y mtodos. Las muestras de decidua normal (ABI) y de aborto espontneo (ABE) fueron procesadas y tratadas por gradiente de Ficoll-Histopaque. Las clulas dendrticas fueron estudiadas mediante citometra de flujo en base a la expresin de DC-SIGN (marcador caracterstico de las DC inmaduras, iDC), estudindose mediante doble marcaje la expresin de FAS, FASL e ILT2. Resultados. La poblacin DC-SIGN+ (marcador de iDC) indica una poblacin principal de iDC, confirmada por la baja expresin de CD83 (marcador de mDC). Se ha podido ver la co-expresin de FAS, FASL e ILT2 tanto en ABI como en ABE, siendo esta expresin inferior en ABE y con diferencia estadsticamente significativa. Conclusiones. Las DC de ABE participaran en menor grado en los mecanismos de apoptosis que tiene lugar en la decidua, y seran menos susceptibles a ella en comparacin con las DC de ABI. Adems estaran menos protegidas de la actividad citotxica celular debido a la menor expresin del receptor inhibidor ILT2.

CONTRIBUCIN DE LAS CLULAS DENDRTICAS PLASMACITOIDES INTRATMICAS A LA GENERACIN DE CLULAS T REGULADORAS NATURALES. IDENTIFICACIN DE PROGENITORES FISIOLGICOS. Martin Gayo E, Toribio Garca ML. Centro de Biologa Molecular. El timo constituye un rgano clave en la educacin de los linfocitos T. Durante el desarrollo intratmico, los progenitores de los linfocitos T generan timocitos CD4+CD8+ (DP) que expresan por primera vez un TCR, que participa directamente en los procesos de seleccin positiva y negativa mediante el reconocimiento de antgenos presentados por clulas del epitelio cortical (TEC) o por clulas dendrticas medulares (DCs), respectivamente. Adems, el timo es tambin el lugar de generacin de las clulas T reguladoras naturales (Treg), caracterizadas por el fenotipo CD4+ CD25+ Foxp3+. Estas clulas son potentes inmunosupresoras, que pueden inhibir la proliferacin de linfocitos perifricos va la secrecin de citoquinas tales como IL-10 y TGF. Actualmente, el origen de las Treg intratmicas es desconocido, aunque algunos estudios sugieren que estas clulas podran proceder de timocitos auto-reactivos que logran escapar de la seleccin negativa. En el timo humano habitan dos tipos de DCs: DCs convencionales (cDCs) y DCs plasmacitoides (pDCs). Estudios previos sugieren una implicacin de las cDCs intratmicas en la generacin de Treg, mientras que la capacidad de las pDCs en dicho proceso no ha sido analizada. En este estudio demostramos que las pDCs intratmicas activadas con CD40L e IL3 (MpDCs), pero no las pDCs inmaduras, son capaces de inducir la generacin de clulas CD25+Foxp3+, con caracters-

EXPRESIN DE FAS, FASL E ILT2 POR LAS CLULAS DENDRITICAS DE DECIDUA HUMANA NORMAL Y DE ABORTO ESPONTNEO. Tirado Gonzlez I, Muoz-Fernndez R, Blanco O, Leno E, de Lamata Espinosa C, Ortiz-Ferrn G, Abada Molina AC, Olivares G. Centro de Investigacin Biomdica. Introduccin. La decidua es el tejido materno que se encuentra en ntimo contacto con el trofoblsto fetal. Es un lugar privilegiado en el

45

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

ticas funcionales idnticas a las descritas para clulas Treg, a partir de timocitos 4SP y linfocitos CD4+ perifricos alognicos. Adems, hemos identificado una poblacin de timocitos DP TCRhiCD69hi que contiene progenitores capaces de generar clulas Treg en respuesta a MpDCs autlogas. Por ltimo, hemos descrito la expresin de la molcula HLA-G en las pDCs intratmicas y su implicacin en el proceso de induccin de Treg. Por tanto, estos resultados indican que las pDCs intratmicas podran desempear una importante funcin en el establecimiento de la tolerancia central va la generacin de Treg naturales en el timo.

NOTCH1 CONTROLA LA EXPANSIN DE LOS PROGENITORES HUMANOS DE CLULAS T Y DE CLULAS LEUCMICAS A TRAVS DE LA REGULACIN DEL RECEPTOR DE IL-7. Gonzlez Garca S1, Garca Peydr M1, Martn Gayo E1, Ferrando AA2, Toribio ML1. 1Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa, Madrid. 2Institute for Cancer Genetics, Columbia University. New York, USA. La diferenciacin de los linfocitos T implica la adquisicin de un patrn de expresin gnica especfico, el silenciamiento de genes de desarrollo de linajes no-T y la expansin de los progenitores T. En este proceso participan coordinadamente las vas de sealizacin de Notch1 y del receptor de interleuquina 7 (IL-7R). Recientemente mostramos que la cadena alfa de IL-7R (IL-7R) es una diana transcripcional directa de Notch1, va el factor de transcripcin CSL. En este estudio hemos analizado el papel funcional de la va de Notch y de IL-7R durante el desarrollo intratmico humano. Estudios de expresin gnica muestran una alta correlacin en el patrn de expresin de ambas vas durante la maduracin de los linfocitos T. En ensayos funcionales de diferenciacin de clulas T, demostramos que la inhibicin de la seal de Notch provoca una drstica reduccin en los niveles de expresin en membrana de IL-7R, bloqueando la proliferacin de clulas pre-T. Sin embargo, este bloqueo en proliferacin es rescatado tras la sobre-expresin de IL-7R mediante vectores retrovirales, indicando que el papel de Notch durante los estadios ms inmaduros de diferenciacin T es el mantenimiento de la proliferacin en respuesta a IL-7. As mismo, mostramos que este mecanismo de regulacin del IL-7R mediado por Notch ocurre tambin en leucemias linfoblsticas agudas T dependientes de Notch, en las cules la sobre-expresin del IL-7R es capaz de rescatar el bloqueo en proliferacin consecuente a la inhibicin de Notch. Por tanto, proponemos que la sealizacin por Notch1 contribuye a la proliferacin de los precursores T y de clulas T leucmicas regulando los niveles de expresin del receptor de IL-7 y la capacidad de respuesta a IL-7.

SESIN 10: CLULAS T Moderadores: Dr. Manel Joan (Barcelona), M Luisa Toribio (Madrid) LA PROTENA ADAPTADORA AKAP450 REGULA LA TRANSLOCACIN DEL MTOC, LA ORGANIZACIN DE LA SINAPSIS INMUNE Y LA SEALIZACIN TRAS LA ACTIVACIN DEL TCR EN CLULAS T. Robles Valero J1, Martn-Cfreces NB1, Lamana Domnguez A1, Ros RM2, Snchez-Madrid F1. 1Hospital Universitario La Princesa. 2Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Sevilla. La translocacin del centro organizador de microtbulos (MTOC) es un evento temprano que tiene lugar cuando una clula T o NK interacciona con una clula presentadora de antgeno (APC), con la consiguiente formacin de la denominada sinapsis inmune. Sin embargo, es ahora cuando se empiezan a conocer los mecanismos moleculares implicados en la polarizacin del MTOC al rea de contacto. AKAP450, miembro de la familia de las protenas de anclaje a PKA (AKAPs) localizada fundamentalmente en el centrosoma, es una protena adaptadora de gran peso molecular capaz de ensamblar y compartimentalizar mltiples molculas sealizadoras y estructurales, adems de servir de nexo entre el MTOC y el aparato secretor. En el presente estudio abordamos el posible papel que podra desempear AKAP450 en la polarizacin del MTOC, la organizacin de la sinapsis inmune y la activacin de la clula T. La sobreexpresin del dominio C-terminal de AKAP450 unido a GFP, que acta como dominante negativo, y oligos de interferencia (siRNA) especficos que reducen considerablemente la expresin de la protena, previenen el anclaje del MTOC en la zona de contacto entre la clula T y la clula presentadora, llegando a evitar la propia translocacin, utilizando tanto un sistema antgeno como superantgeno especfico. Adems, AKAP450 es requerida para una correcta sealizacin tras la activacin del TCR en respuesta a presentacin de antgeno, ya que el silenciamiento de la protena provoca un descenso considerable de la fosforilacin de protenas tales como LAT, PLC1 o PKC. Este defecto en sealizacin corrobora con una reduccin considerable de la produccin de IL-2 medida mediante ELISA. Igualmente, AKAP450 es necesaria para la polarizacin a la sinapsis de ciertas molculas bsicas para la formacin correcta de la misma, tales como PKC. Por ello, nuestros resultados sugieren un papel fundamental de AKAP450 en la organizacin de la sinapsis inmune y en la reorientacin antgeno especfica del MTOC.

ICOS (CD278) ES NECESARIO PARA LA HOMEOSTASIS PERIFRICA DE LAS CLULAS Treg CD4+CD25+FoxP3+. Ojeda G1, Pini E1, Bello R2, Portols P1, Rojo JM2. 1Centro Nacional de Microbiologa, I.S. Carlos III. 2Centro de Investigaciones Biolgicas, CSIC. ICOS (CD278) es una molcula coestimuladora de la familia de CD28, expresada de modo caracterstico por los linfocitos T activados. Comparando linfocitos de ratones genticamente deficientes en ICOS (ICOSko) y de ratones normales, se ha examinado el posible papel de ICOS en el desarrollo y las funciones de la poblacin de clulas T reguladoras naturales CD4+CD25+FoxP3+ derivadas del timo. En primer lugar, se ha observado que las clulas CD4+CD25+ de ratones deficientes en ICOS son plenamente funcionales, de acuerdo con los datos de ensayos de Treg in vitro. As, la capacidad para suprimir la proliferacin o la produccin de IL-2 en clulas CD4+CD25- es comparable usando Treg de ratones ICOSko o de ratones normales, independientemente del origen (ICOSko, o normales) de las clulas respondedoras y accesorias. Esto indica que ICOS no es necesario para la funcin supresora de estas clulas. En cambio, el nmero de clulas Treg CD4+CD25+ se encuentra significativamente reducido en el bazo de ratones ICOSko, si se compara con el bazo de ratones normales de la misma edad y sexo. Esta reduccin no es debida ni a una expresin ms baja de CD25 por las clulas Treg CD4+FoxP3+ en los ratones ICOSko, ni a una generacin deficiente en el timo de las clulas Treg CD4+CD25+FoxP3+. Adems, las clulas T CD4+ de ratones ICOSko pueden recibir eficientemente coestmulos de CD28

46

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

y producir IL-2, que son dos factores muy importantes en la generacin eficiente de clulas Treg CD4+CD25+. En cambio, s se ha observado una mayor susceptibilidad a la apoptosis espontnea en las clulas Treg CD4+CD25+ procedentes de ratones deficientes en ICOS. Esto podra contribuir a su menor nmero en estos animales y a explicar algunos fenmenos ligados a ICOS, incluyendo la mayor sensibilidad de los ratones ICOSko a enfermedades autoinmunes como EAE.

CARACTERIZACION FUNCIONAL DE CELULAS TH17/1 INTESTINALES EN PACIENTES CELIACOS. Santamaria Ossorio M2, Fernandez S1, Ortega C1, Carillo J2, Rodriguez F2, Snchez F2. 1Unidad de inmunologia Facultad de Medicina Universidad de Cordoba. 2H.U. Reina Sofia. Se ha estudiado la presencia de celulas productoras de IL-17 en biopsias de duodeno distal de pacientes con enfermedad celiaca. Las biopsias fueron cultivadas en presencia de Il-2 (20UI) durante 12 dias. Las poblaciones de celulas T obtenidas clonadas mediante dilucion limite y los clonos resultantes fueron testados mediate RT-PCR para determinar si expresaban seal especifica de Il-17 e IFNgamma. Se encontraron clonos productores de cada una de ellas de manera aislada y conjunta. El analisis de los clonos positivos indica que son celulas memoria/efctoras, con un fenotipo caracterizado por la expresion en superficie de CCR6 y receptor de IL-23. las celulas resultaron Th17/1 en base al patron de citounas que secretan y que se determinaron mediante ELISA y marcaje intracelular. Es interesante que ademas d las citoquinas mencionadas, las celulas Th17/1 de pacientes celiacos expresan TGF beta 1. Il17 se ha demostrado estar regulada por el factor de transcripcion RORA y C en humano. Tambien se necesita IRF4 para su diferenciacion en el raton. Nosotros encontramos expresion elevada de RORC y aun mas marcada de IRF4. Esta es la primera demostracion de que en humanos IRF4 se encuentr upregulado en celulas diferentes de Th2. Funcionalmente se trata de celulas capaces de responder a estimulos mediados por CD3/TCR, no son citotoxicas ni reguladoras y tampoco sensibles a regulacion al igual que sucede con este tipo celular en enfermedades autoinmunes digestivas como enfermedad inflamatoria intestinal. Nuestros datos indican que el papel de TGF beta secretado por ellas parece ser facilitar la regulacion positiva de RORC e IRF siguiente a la estimulacion CD3/TCR.

apunta a un posible papel de este virus en el origen y expansin de las linfocitosis monoclonales LGG-TCD4+. Objetivo. Analizar la especificidad de la respuesta inmunolgica frente a CMV de las clulas T clonales de pacientes con distintos sndromes linfoproliferativos crnicos T, SLPcT. Metodologa. Se analiz in vitro la respuesta funcional frente a CMV y EBV en 30 sangres perifricas de pacientes con linfocitosis LGGTCD4+TCRalphabeta+ (n= 12) u otros SLPcT (n= 18). En 4 pacientes con expansin monoclonal de LGG-TCD4+TCRVbeta13.1+ se evalu la respuesta al pptido de CMV MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK complementario de HLADRB1*0701. Mediante microarrays de expresin se identificaron los genes que experimentaban cambios en los LGGTCD4+ en respuesta a CMV. Resultados. Los casos con linfocitosis LGG-TCD4+ mostraron una respuesta funcional frente a CMV caracterstica y especfica, que no se encontr en otros SLPcT. Esa respuesta se reprodujo frente al pptido MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK en los pacientes con haplotipo HLADRB1*0701+ y expansin monoclonal de LGG-TCD4+TCRVbeta13.1+. Adems la respuesta a CMV en los LGG-TCD4+ clonales se asociaba a cambios especficos en la expresin de genes implicados en respuesta inflamatoria e inmune, progresin de ciclo celular, resistencia a apoptosis e inestabilidad gnica. Conclusiones. Por primera vez se demuestra que las clulas clonales de un grupo de neoplasias de clulas T (LGG-TCD4+) son especficas de antgenos de CMV, que podran ser responsables de la iniciacin y mantenimiento de la enfermedad.

REEVALUACIN DE LA CONTRIBUCIN DE HLA-DRB3 EN LA RESPUESTA CELULAR T. Faner Canet MR1, James E2, Yang J2, Houston L2, Pujol-Borrell R1,3, Kwok WW2,4, Juan M5. 1Laboratory of Immunobiology Research and Applications to Diagnosis (LIRAD). Banc de Sang i Teixits. 2Benaroya Research Institute at Virginia Mason, USA. 3Department of Cell Biology, Physiology and Immunology. Universitat Autnoma de Barcelona (UAB). Badalona, 4 Department of Immunology, University of Washington, Seattle, USA. 5Servei dImmunologia. Centre de Diagnstic Biomdic. Hospital Clnic. Barcelona. En la regin HLA hay diversos loci DRB (DRB1/3/4/5) que codifican para diferentes cadenas DR beta. Dichas cadenas beta se combinan con la misma cadena alfa y forman las diferentes molculas HLADR que se encuentran en la superficie de las clulas presentadoras de antgeno. La funcionalidad y relevancia de la molcula DRB1 ha sido extensamente estudiada, pero habitualmente se ha despreciado la contribucin de las molculas DR generadas a partir de los loci DRB3/ 4/ 5 a la presentacin de antgenos. Tanto es as que an hay cierta controversia en referencia al nivel de expresin de dichos loci DRB secundarios. Por ello hemos cuantificado los niveles de mRNA producidos por DRB3 y comparado con los producidos por el DRB1 de su haplotipo DR52 [DRB1(52)]. Esta comparacin se ha realizado en clulas CD19+ y CD14+, observando en ambos tipos celulares una menor produccin de DRB3 en relacin a su DRB1, pero una muy diferente distribucin de la abundancia relativa de dichos transcritos, mostrando en las clulas CD14+ una proporcin mayor de DRB3 respecto a DRB1. Estos resultados se han corroborado a nivel proteico analizando la tincin de superficie de ambas molculas en dichos tipos celulares. Para analizar el papel funcional de DRB3 hemos generado tetrmeros de HLA-DRB3 y usado TGEM (Tetramer-guided epitope mapping) en la valoracin de la contribucin de DRB3 a la respuesta inmu-

EXPANSIONES MONOCLONALES DE LINFOCITOS GRANDES GRANULARES (LGG)-T CD4+ RECONOCEN ANTGENOS DE CITOMEGALOVIRUS (CMV). Rodrguez Caballero MA1, Garca Montero AC1, Brcena P1, Almeida J1, Ruiz-Cabello F2, Tabernero MD3, Garrido P4, Muos-Criado S5, Balanzategui A6, Orfao A1. 1Centro de Investigacin del Cncer/IBMCC. CSIC-Universidad de Salamanca. 2Servicio de Anlisis Clnicos. Hospital Universitario Virgen de Las Nieves. Granada. 3Unidad de Investigacin, IECSCYL. Hospital Universitario de Salamanca. 4Servicio de Hematologa. Hospital Universitario Virgen de Las Nieves. Granada. 5Servicio de Microbiologa, Hospital Universitario de Salamanca. 6Servicio de Hematologa, Hospital Universitario de Salamanca. Introduccin. Estudios recientes sugieren que las linfocitosis monoclonales LGG-TCD4+ se originaran por una estimulacin antignica crnica, como se ha demostrado en otros sndromes linfoproliferativos cuyo desarrollo est favorecido por infecciones vricas persistentes (p.ej. HTLV-1, EBV, HHV8). El hecho de que en individuos sanos seropositivos frente a CMV, se hayan detectado expansiones (oligo)clonales de clulas T CD4+ con fenotipo de LGG en respuesta a CMV,

47

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

ne T frente a antgenos altamente inmunognicos como el toxoide tetnico y la protena de la matriz del virus de la gripe. En ambos antgenos hemos identificado eptopos presentados por DRB3 y al evaluar el nmero de linfocitos T CD4+ que responden a ellos, hemos observado que es similar al descrito para DRB1. Todos nuestros resultados sugieren que DRB3 juega un papel en la presentacin de antgenos equivalente al atribuido a DRB1 pero con un repertorio de eptopos que al ser diferente se complementa. De este modo DRB3 parece ampliar y completar el repertorio peptdico que puede ser presentado por HLA-DR. Financiado por ayuda FIPSE 36487/05, FIS 07/0329 y Profit FIT 010000-2006-38.

EPH/EPHRINAS B COMO REGULADORAS DE LA MADURACIN DE LOS TIMOCITOS Y LA MORFOGNESIS EPITELIAL TMICA. Cejalvo Goyanes T1, Garca-Ceca J1, Alfaro Snchez D1, Jimnez Prez E2, Muoz Oliveira JJ3, Zapata Gonzlez A1. 1Dpto. Biologa Celular, Facultad de Biologa, UCM. 2Dpto. Biologa Celular, Facultad de Medicina, UCM. 3Centro de Citometra y Microscopia, UCM. Resultados previos de nuestro grupo demuestran que los receptores EphB2 y EphB3 son expresados tanto por timocitos como por clulas epiteliales tmicas (TECs) y participan tanto de forma autnoma como no autnoma en la diferenciacin y el desarrollo de ambos tipos celulares as como en las interacciones que los dos realizan entre si. Con el fin de definir la importancia de las seales trasmitidas por estos receptores y profundizar en el conocimiento de su papel en las interacciones celulares tmicas se analiz el efecto de diferentes mutaciones en las ephrinas B1 y B2, ligandos de Eph B2 y Eph B3, sobre los distintos componentes celulares del timo El anlisis de la diferenciacin T, en animales con timocitos deficientes en la ephrina B1 o en la ephrina B2, mutantes condicionados generados mediante tecnologa LoxP-Cre, revela una reduccin en la celularidad tmica y alteraciones en la diferenciacin T con diferente grado de severidad dependiendo del background gentico de la cepa de ratn utilizada, lo que confirma un papel autnomo de estas molculas sobre la maduracin del timocito. Sin embargo, al menos en el caso de los mutantes para la ephrina B2, la red epitelial no presenta alteraciones importantes. Por otro lado, animales ephrinaB2 LacZ/+ y ephrina B2 LacZ/LacZ en los que el alelo ephrina B2 LacZ codifica para una forma de ephrina B2 que carece del dominio citoplsmico, mostraban nuevamente menor celularidad tmica pero, en este caso, tambin alteraciones histolgicas en la red epitelial tmica indicando la necesidad de estas protenas no solo como estimuladoras de Ephs sino como receptores, as como su participacin autnoma en el establecimiento de la red epitelial. El presente trabajo discute finalmente el papel global de las interacciones Eph-ephrinas B en la modulacin de las interacciones celulares tmicas homo y/o heterotpicas que determinan la histognesis del rgano y la diferenciacin de los linfocitos T.

De este modo, el NFAT5 selecciona los mismos elementos de DNA que unen in vivo las protenas NFATc (Lpez-Rodrguez et al., 1999) y, por otra parte, el NFAT5 conserva la estructura presente en todas las protenas NF-B para controlar su dimerizacin, unin a DNA y transactivacin (Lpez-Rodrguez et al., 2001; Stroud et al., 2002). Aunque el NFAT5 se caracteriz inicialmente como un importante regulador de un programa de expresin de genes osmoprotectores (Lpez-Rodrguez et al., 2004; Aramburu et al., 2006), tambin regula la migracin de clulas de carcinoma, participa en la miognesis de msculo esqueltico, y acta como factor husped para el HIV (Jauliac et al., 2002; OConnor et al., 2006; Ranjbar et al., 2006). La expresin del NFAT5 en clulas primarias y rganos est bastante restringida a ciertos tejidos proliferantes (Aramburu et al., 2006), como linfocitos T activados y timocitos (Trama et al., 2000; Lpez-Rodrguez et al., 2001; Lpez-Rodrguez et al., 2004), donde los niveles de NFAT5 son relativamente altos y su distribucin subcelular es predominantemente nuclear (Trama et al., 2000; Lpez-Rodrguez et al., 2001; datos de nuestro laboratorio). Modelos de ratn desarrollados recientemente (Trama et al., 2002; Lpez-Rodrguez et al., 2004; Go et al., 2004) apoyan la idea de un papel de NFAT5 durante el desarrollo de los linfocitos T y sugiere su implicacin en la proliferacin de clulas T y su supervivencia. Los ratones deficientes en NFAT5 presentan una inmunodeficiencia consistente en una linfopenia de clulas T que es ms acusada para las clulas CD8+. Estas observaciones son de relevancia sustancial ya que, in vivo, los ratones deficientes en NFAT5 son incapaces de producir una respuesta inmune mediada por clulas CD4+ (Go et al., 2004) o CD8+ (datos de nuestro laboratorio). Datos recientes de nuestro laboratorio indican que los ratones deficientes en NFAT5 sufren de hipernatremia en plasma como resultado de su incapacidad de inducir un programa de expresin de genes osmoprotectores a nivel sistmico (Lpez-Rodrguez et al., 2004). Para analizar selectivamente los efectos intrnsecos de las clulas T derivados de la falta de NFAT5, y con ayuda de la tecnologa CRE-LOX, hemos llevado a cabo un modelo de ratn que elimina la expresin de NFAT5 en estados tempranos (Lck-CRE NFAT5Flox/Flox) o ms tardos (CD4CRE NFAT5Flox/Flox) del desarrollo de los timocitos. El anlisis de estos ratones revela que NFAT5 participa en la ontogenia de las clulas T en estados tempranos. Asimismo, nuestros datos indican que la falta de NFAT5 altera la homeostasis de diferentes poblaciones de clulas T en periferia.

SESIN 11: AUTOINMUNIDAD - II Moderadores: Dra. Carmen Gelp (Barcelona), Dra. M Rosa Juli (Palma de Mallorca) ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICO DE ANTICUERPOS DE CLASE IgG, IgM Y COMPLEMENTO EN LA ESCLEROSIS MLTIPLE. Sdaba Argaiz MC1, Tzartos J2, Sloan C2, Gonzlez-Porqu P1, Espio Martnez M1, lvarez-Cermeo JC1, Villar-Guimerans LM1, Esiri M2. 1Servicio Inmunologa. Hospital Ramn y Cajal. 2Neuropathology Department. John Radcliffe Hospital. Introduccin. La esclerosis mltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria de posible etiologa autoinmune. Su principal caracterstica patolgica es la placa de desmielinizacin, aunque tambin se ha demostrado dao axonal desde los primeros estadios. Si bien se ha con-

ESTUDIO DE NFAT5, UN FACTOR DE TRANSCRIPCIN DE LA FAMILIA REL, EN EL DESARROLLO Y LA HOMEOSTASIS DE LOS LINFOCITOS T. Berga Bolaos R, Lpez Rodrguez C. Parc de Recerca Biomdica de Barcelona. El NFAT5 es un factor de transcripcin que pertenece a la familia de protenas Rel (NF-kB y protenas NFATc) (Aramburu et al., 2006).

48

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

siderado clsicamente a la EM como una enfermedad Th1, existen evidencias de la importancia de los anticuerpos y el complemento en su fisiopatologa. Objetivos. Estudiar la presencia de IgM, IgG y complemento en cortes de pacientes con EM. Materiales y mtodos. Bloques de tejido del sistema nervioso central incluidos en parafina y fijados con paraformaldehido. Se analizaron 62 cortes de 15 pacientes y 5 cortes de 2 controles. Se pusieron a punto las tcnicas inmunohistoquimicas correspondientes para analizar la presencia de IgG, IgM y C3B en las muestras obtenidas. Se realizaron mediante inmunofluorescencia dobles marcajes IgG/C3b e IgM/C3b. Resultados. Se pudo observar heterogeneidad en las lesiones dentro de un mismo paciente. Un 20% no mostraban depsitos de anticuerpos ni complemento, en un 90% se detect IgG y un 60% presentaban IgM. Algunos cortes con sustancia blanca aparentemente normal (SBAN) tambin presentaban dichos depsitos. En las placas que mostraban anticuerpos se determinaron los siguientes patrones de reconocimiento: 1. Axonal. 2. Oligodendrocitos. 3. Mielina. Al analizar el factor C3b del complemento se vieron los mismos patrones y mediante doble inmunofluorescencia se demostr que anticuerpos y complemento colocalizan. Tambin se observ la presencia de macrfagos con anticuerpos fagocitados junto a los depsitos de anticuerpos. Conclusiones. Anticuerpos, complemento y macrfagos intervienen en la desmielinizacin y en el dao axonal. Adems, la presencia de anticuerpos en la SBAN indica que podran ser el mecanismo efector primario en la enfermedad.

con respecto a controles (8% en EC vs 6% en controles, p=0.02; 9% en EM, p=0.006). En EM se observ un efecto ms fuerte en pacientes con la forma clnica primaria progresiva (PP) (16%, p=0.004). Adems, la frecuencia de heterocigotos para el SNP rs7517847 es significativamente mayor en este grupo de pacientes (81% PP vs 48% controles, p=0.0002). Conclusin. El alelo minoritario del polimorfismo funcional Arg381Gln (rs11209026) aumenta la susceptibilidad a EC y EM, resultado opuesto al descrito anteriormente para EII. En EM se observa un efecto ms fuerte en pacientes con la forma clnica primaria progresiva.

ANLISIS DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS ASOCIADOS CON LA RESPUESTA CLNICA AL TRATAMIENTO CON IFNB EN LA ESCLEROSIS MLTIPLE. Lpez Garca C1, Rio J1, Nos C1, Deishenhammer F2, Espejo C1, Montalban X1, Comabella M1. 1Institut de Recerca, Unitat de Neuroimmunologia, Hospital Universitari Vall d'Hebron. 2Clinical Department of Neurology. Innsbruck Medical University. Introduccin. El tratamiento con interferon-beta (IFNb) ha demostrado tener un efecto beneficioso en pacientes con esclerosis mltiple remitente-recurrente (EMRR). Actualmente existe una ausencia de marcadores biolgicos que correlacionen de forma fiable con la respuesta al tratamiento. Diversos estudios han implicado a los receptores de quimiocinas en la patogenia de la EM ya que intervienen en el paso de leucocitos a travs de la barrera hematoenceflica. Objetivo. Identificar receptores de quimiocinas asociados con la respuesta al tratamiento con IFNb. Mtodos. Se incluyeron 41 pacientes con EMRR en tratamiento con IFNb clasificados como respondedores (27) y no-respondedores (14) en base criterios clnicos. La expresin de receptores de quimiocinas (CCR1-5, CXCR2-4, CXCR6) se analiz mediante citometra de flujo en clulas T y monocitos antes del tratamiento, y tras 3, 6, 12, y 24 meses. Resultados. El IFNb aument el porcentaje de clulas T y monocitos que expresaban CCR4, CXCR2, y CXCR4, y disminuy la expresin de CCR2 en monocitos. Los pacientes no-respondedores mostraron mayor expresin de clulas T CD8+CXCR2+ que los pacientes respondedores. Finalmente, se observ una tendencia hacia una mayor expresin de CCR4 en clulas T de pacientes no-respondedores. Conclusiones.El IFNb podra modular los niveles de expresin de receptores de quimiocinas en clulas T y monocitos. Las diferencias de expresin de CXCR2 y CCR4 en clulas T de pacientes respondedores y no-respondedores podran utilizarse como potenciales marcadores de respuesta clnica.

INFLUENCIA DEL LOCUS IL23R EN LA SUSCEPTIBILIDAD A ESCLEROSIS MLTIPLE Y ENFERMEDAD CELACA EN LA POBLACIN ESPAOLA. Cnit MC1, Dema B1, Nez C1, Polanco I2, Maluenda C3, de las Heras V4, Arroyo R4, de la Concha EG1, Urcelay E1, Martnez A1. 1Servicio de Inmunologa Clnica, Hospital Clnico San Carlos (Madrid). 2Servicio de Gastroenterologa Peditrica, Hospital la Paz (Madrid). 3Servicio de Pediatra, Hospital Clnico San Carlos (Madrid). 4Unidad de Esclerosis Mltiple, Hospital Clnico San Carlos (Madrid). Introduccin y objetivos. El receptor de IL-23 est formado por dos cadenas, una de ellas compartida con el receptor de IL-12, denominada IL-12R1, y otra cadena especfica denominada IL-23R. El gen IL23R codifica dicha subunidad especfica y est ubicado en la regin 1p31. IL-23 interviene en el desarrollo de los linfocitos Th17, implicados en procesos de autoinmunidad. Estudios recientes han mostrado asociacin de algunos alelos de IL23R con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), psoriasis y espondilitis anquilosante. Nuestro objetivo es el estudio de la implicacin del gen IL23R en enfermedad celiaca (EC) y esclerosis mltiple (EM). Material y mtodos. Realizamos un estudio caso-control incluyendo 598 pacientes con EC, 414 pacientes con EM y 546 controles espaoles blancos. Tras extraer el DNA de todos los individuos, todas las muestras fueron genotipadas para dos SNPs (single nucleotide polymorphisms), rs7517847 (localizado en un intrn) y rs11209026 (Arg381Gln) mediante sondas Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). El anlisis estadstico fue llevado a cabo mediante la prueba Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher (si los valores observados eran menores de 5) utilizando el programa EpiInfo. Resultados. Observamos que la frecuencia del alelo minoritario del SNP exnico est incrementada significativamente en EC y EM

VARIANTES GENTICAS DEL GEN TSHR QUE AFECTAN A SU EXPRESIN EN EL TIMO CONFIEREN SUSCEPTIBILIDAD A LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW. Colobran Oriol R, Armengol Barnils MP, Ruiz Riol M, Martnez Cceres E, Otero MJ, PujolBorrell R. Banc de Sang i Teixits (BST) / Universitat Autnoma de Barcelona (UAB). La enfermedad de Graves como modelo de tiroiditis autoinmune, y causa de hipertiroidismo ms comn, est mediada por la produccin de anticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHR). La hiptesis de este trabajo es que variaciones gen-

49

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

ticas del gen TSHR que modifiquen su expresin pueden afectar a su proceso de tolerizacin central. Recientemente nuestro grupo ha descrito un conjunto de SNPs y haplotipos de este gen que presentan una distribucin significativamente diferente entre los pacientes con enfermedad de Graves y la poblacin control, destacando algunos de ellos por su elevada significacin (p<0,0008 y ORs de hasta 5,94). Para determinar el posible papel de estos polimorfismos en la expresin del TSHR en el timo, se ha optimizado un protocolo de cuantificacin especfica de alelo utilizando PCR a tiempo real. La cuantificacin especfica de alelo se aplica en muestras de individuos heterozigotos para la variante de estudio, asegurando que las diferencias sean debidas a variaciones del propio gen y no por variaciones del resto del genoma (como puede suceder cuando se comparan grupos de individuos). Se ha realizado la cuantificacin especfica de alelo del mRNA del TSHR proveniente de timo total de 44 individuos donantes heterozigotos para la variante de inters (SNP11 A/G), que es el marcador ms significativamente asociado a la enfermedad y que, a su vez, representa los principales haplotipos asociados a la enfermedad. Los resultados indican que el alelo protector (G) produce claramente una mayor expresin de TSHR en el timo respecto el alelo de susceptibilidad (A). La ratio media de expresin del alelo G vs A en las 44 muestras es de 1,65. Este efecto es especfico del timo ya que en los tiroides analizados no se observa este fenmeno. Estos resultados muestran que existen variaciones del gen TSHR que confieren susceptibilidad a la enfermedad de Graves posiblemente a travs de un proceso deficiente de tolerizacin central.

PERFIL DE EXPRESIN GNICA DE GLNDULAS TIROIDEAS DE PACIENTES DE CORTA Y LARGA EVOLUCIN CON GRAVES-BASEDOW. IMPLICACIN DE LAS SEALES DE PELIGRO Y MECANISMOS PERPETUADORES. Ruz Riol M1, Armengol Barnils MP1, Colobran Oriol R1, Martnez Cceres E1, Lucas Martn AM2, Pujol Borrell R1. 1Hospital Universitari Germans Trias i Pujol (Badalona), Facultat de Medicina, Universitat Autonnoma de Barcelona. 2Servei d' Endocrinologia i Diabetes. La enfermedad de Graves-Basedow (GB) es una de las patologas autoinmunes rgano especficas ms frecuentes. Se desconocen los mecanismos que desencadenan y cronifican esta enfermedad, pero se postulan las seales de peligro como molculas importantes en este proceso. Para valorar la contribucin de stas en el inicio y en la perpetuacin de la enfermedad, hemos estudiado el perfil de expresin gnica diferencial por microarrays en 6 tiroides agrupados segn el tiempo de evolucin de la enfermedad (corta < 9 meses y larga > 36 meses) y en 2 controles sanos. Los genes diferencialmente expresados relacionados con el sistema inmune fueron clasificados en: 1/ seales de peligro/receptores y dao celular, 2/ homing a HEV y zonas de inflamacin, 3/ inflamacin, 4/ inmunidad innata, 5/ inmunidad adaptativa, y 6/ neognesis de tejido linfoide. De los 297 genes diferencialmente expresados entre controles vs corta evolucin, aproximadamente el 20% de los del sistema inmune estaban en el grupo de seales de peligro/receptores y respuesta a dao celular (ej: Hsp90, AGER, MT1G). Precisamente en la comparacin corta vs larga evolucin, 212 genes se hallaron diferencialmente expresados, principalmente incluidos en las categoras de homing hacia HEV, IFN signature e inmunidad adaptativa. Entre controles vs larga evolucin (n=540 genes), se repartan entre todos los grupos establecidos (quimiocinas y receptores, molculas relacionadas con procesamiento y presentacin de antgeno, y reordenamiento de Igs). Para validar los resultados del primer grupo, los genes seleccionados (OAS2, NOD27, IRF8, HSP90, MT1G, AGER, CD36, CD163, SERPINA, AIF1, ISG15, IFN-alpha, -beta, -gamma) han sido estudiados por inmunofluorescencia y RT-qPCR. Los resultados obtenidos hasta el momento apuntan a la participacin de macrfagos y clulas dendrticas en el inicio y en la evolucin de la patologa.

PATRN DE EXPRESIN DEL GEN DEL RECEPTOR DE LA TSH EN EL TIMO HUMANO: IMPLICACIONES PARA LA PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW. Armengol Barnils MP, Ruz Riol M, Colobran Oriol R, Martnez Cceres EM, Pujol Borrell R. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol (Badalona), Facultat de Medicina, Universitat Autonnoma de Barcelona. Se acepta que el timo es el rgano en el que se imparte la tolerancia a los linfocitos T y recientemente se considera que esta funcin incluye la tolerancia a los antgenos expresados en tejidos muy diferenciados o perifricos. Se conoce la participacin del gen AIRE como factor regulador de la expresin de algunos de ellos en el timo. El timo, aunque de forma decreciente, contribuye a mantener hasta edad avanzada el pool de clulas T circulantes y su diversidad, por tanto variaciones en el nivel de expresin de autoantgenos y en la cantidad y calidad de los linfocitos T exportados por el timo influyen en la aparicin y curso clnico de las enfermedades autoinmunes. La enfermedad de Graves-Basedow (GB), est mediada por la presencia de autoanticuerpos contra el receptor de la tirotropina (TSHR). Para valorar la variabilidad interindividual de la expresin del TSHR se ha cuantificado mediante qRT-PCR con sondas Taqman los niveles de expresin tmica de las dos isoformas del TSHR y su correlacin con los niveles de AIRE, GAPDH, Leptina, Keratina-14 en 200 timos humanos (4 das a 82 aos). Los resultados obtenidos muestran una variabilidad interindividual de los niveles de TSHR en el timo que se mantienen en todos los rangos de edad. A pesar de que la abundancia en clulas epiteliales medulares tmicas aumenta con la edad respecto al peso total de la glndula, la falta de correlacin con los niveles del TSHR indicara una menor transcripcin del gen por clula epitelial y una reduccin en la eficiencia de las clulas medulares epiteliales tmicas en la seleccin negativa a partir de una cierta edad.

LAS HORMONAS SEXUALES INFLUYEN EN EL EFECTO PROTECTOR DE LA AUTOINMUNIDAD MEDIADO POR LINFOCITOS T QUE SOBRE-EXPRESAN BCL-2. Iglesias M1, Santiuste I1, Gonzlez J2, Postigo J2, Ferndez-Rey M2, Merino J2, Merino R1. 1Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN. 2Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Cantabria. Recientemente nuestro grupo ha demostrado que la sobre-expresin de Bcl-2 humano en linfocitos T (hBcl-2-T) de ratones transgnicos (Tg), protege contra el desarrollo de autoinmunidad. Este efecto protector esta mediado por linfocitos T reguladores CD4+ CD25+. Dada la asociacin de algunas enfermedades autoinmunes con el sexo de los pacientes, estudiamos la influencia de las hormonas sexuales sobre la capacidad moduladora de Bcl-2 en el desarrollo de artritis inducida por colgeno (AIC), tras inmunizacin con colgeno bovino de tipo II (articular). Para ello, se compar en primer lugar el desarrollo de AIC entre ratones (DBA/1 x C57BL/6)F1-hBcl-2-T (F1.Tg) y (DBA/1 x C57BL/6)F1 (F1.no-Tg) machos y hembras. Como se ha descrito ante-

50

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

riormente, los machos F1.no-Tg desarrollan una AIC ms acelerada e intensa que las hembras y las hembras F1.Tg estn protegidos contra el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, los machos F1.Tg desarrollan una AIC similar a la observada en las hembras F1.no-Tg. En segundo lugar, se observ que la castracin de los machos F1.Tg inhibe el desarrollo de AIC y que la administracin de 5alfa-dihidrotestosterona a hembras F1.Tg bloquea el efecto protector observado en los controles no tratados. En conclusin, nuestros resultados muestran que las hormonas sexuales condicionan la capacidad de Bcl-2 para modular la actividad de los linfocitos CD4+CD25+ reguladores y el desarrollo de AIC.

SOBREEXPRESION DE CITOCINAS TH17 EN LA FIBROSIS PULMONAR INDUCIDA POR ADMINISTRACIN ENDOTRAQUEAL DE ADRIAMICINA. Fernandez Rey M1, Buelta L2, Tamayo E1, Iglesias M3, Merino J1, Merino R3. 1Departamento de Biologa Molecular, Universidad de Cantabria. 2Departamento de Ciencias Mdicas y Quirrgicas Universidad de Cantabria. 3Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Cantabria, CSIC-Universidad de Cantabria-IDICAN. La bleomicina es un antibitico genotxico con actividad antitumoral, que induce fibrosis pulmonar cuando se administra por va i.v., endotraqueal e incluso subcutnea. Por ello es el modelo experimental de esclerodermia ms utilizado. La administracin subcutnea de adriamicina o doxorrubicina, otro antibitico empleado en el tratamiento de mltiples tumores, tambin provoca fibrosis cutnea en el sitio de puncin, pero no afecta al pulmn. No existiendo reportes previos, hemos puesto a punto un modelo de fibrosis pulmonar mediante inyeccin endotraqueal de adriamicina y hemos analizado los mecanismos inmunolgicos que intervienen en el desarrollo de las lesiones. Los resultados de expresin (Q-PCR) de distintos tipos de colgenos, de citocinas y de factores de transcripcin especficos de linaje de diferenciacin de clulas T-CD4, muestran un marcado aumento en la expresin de colgeno-I (fibrilar) y colgeno IV (membranas basales) en relacin con el incremento en la expresin de citocinas asociadas a clulas TH17 y del factor de transcripcin RORgT, especfico de este linaje. En las clulas obtenidas mediante lavado broncoalveolar en estos animales hemos constatado un incremento en la frecuencia de linfocitos CD4+ activados productores de IL-17. Estos resultados sugieren un papel destacado de los linfocitos TH17 en la produccin de fibrosis pulmonar por adriamicina.

expresin de S100A8 y S100A9 en procesos inflamatorios. Se analizaron 30 muestras de pacientes con lupus previamente diagnosticados segn los criterios de reumatologa americano, y 16 muestras de personas sanas voluntarias que sirvieron como controles. Las PBMCs se obtuvieron por centrifugacin en gradiente de densidad con Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich qumica S.A Spain) de sangre perifrica a la que se le ha aadido el anticoagulante K2-EDTA (BD Vacutainer). La separacin de las protenas en geles 2-DE se realiz utilizando el sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primera dimensin y el sistema CRITERION (Bio-Rad) en la segunda. Los geles se tieron secuencialmente con Pro-Q-Diamond, Sypro-Rubi y Bio-Safe Coomassie. La identificacin de protenas por MALDI-TOF MS o por secuenciacin utilizando nano(n)ESI. IT MS/MS se realiz de forma idntica a la de nuestro trabajo previo. Hemos podido identificar por espectrometra de masas S100A9 wild-type (spot 7), S100A9 truncada en su extremo N-terminal (spot 6 inferior), S100A9 wt fosforilada en la Thr C-terminal (spot 6 superior) y S100A9 truncada y fosforilada en la Thr C-terminal (spot 19). La expresin de las variantes del spot 6 est aumentada en pacientes con lupus eritematoso sistmico respecto a controles sanos. La utilizacin de geles 2-D, tincin secuencial con Pro-Q-Diamond y SyproRuby e identificacin de las protenas por MS y posterior secuenciacin de pptidos especficos por MS/MS permite identificar modificaciones postraduccionales como fosforilacin en treonina o truncaciones naturales, as como determinar cambios relativos de estas modificaciones en situaciones patolgicas (enfermedad autoinmune vs controles sanos).

TRATAMIENTO CON IL-4 INCREMENTA LA ACTIVACIN DE STAT6 POR IFN. Cortes JR, Perez-G M, Rivas MD, Zamorano J. Hospital San Pedro de Alcantara. El interfern es una citoquina con numerosas actividades biolgicas lo que explica sus aplicaciones clnicas. La respuesta celular est mediada por la activacin de la va JAK/STAT, principalmente STAT1, 2 y 3. Recientes estudios indican que interferones tipo I tambin pueden activar STAT6. La regulacin de STAT6 por IFN podra tener importantes consecuencias biolgicas debido al papel propuesto de STAT6 en enfermedades autoinmunes donde IFN es empleado. Puesto que STAT6 est principalmente regulado por la IL-4, nuestro objetivo fue investigar la interaccin entre IL-4 e IFN en la activacin de STAT6. Nuestros resultados confirman que el IFN puede inducir la activacin de STAT6. Sin embargo, la fosforilacin de STAT6 inducida por IFN es muy inferior a STAT1 o a la inducida por IL-4, indicando que STAT6 no es un principal sustrato para IFN. Sin embargo, cuando las clulas fueron pre-tratadas con IL-4, la activacin posterior de STAT6 por IFN fue considerablemente aumentada llegando a niveles de fosforilacin similares a los inducidos por IL-4. El empleo de inhibidores descarta un papel de fosfatasas o raft de lpidos en este proceso. Los resultados obtenidos sugieren la regulacin por la IL-4 de una protena adaptadora implicada en la activacin de STAT6 por el IFN puesto que: 1) inhibidores de la sntesis de protenas inhiben el efecto de la IL-4 sobre la activacin de STAT6 por el IFN, 2) la unin de STAT6 al receptor del IFN est aumentada tras el tratamiento con IL-4, 3) IL-4 induce la sntesis de RACK1, una protena adaptadora que facilita el reclutamiento de STATs por el receptor de interferones. La interaccin entre IL-4 e IFN en la activacin de STAT6 podra ser relevante para enfermedades como la esclerosis mltiple donde tienen un papel destacado.

EXPRESIN DIFERENCIAL DE LA CUATRO ISOFORMAS DE LA PROTENA DE UNIN A CALCIO S100A9 (CALGRANULINA B) EN CLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFRICA DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO RESPECTO A CONTROLES SANOS. Pavn Castillero EJ1, Callejas Rubio JL2, Ortego Centeno N2, Zubiaur Marcos M1,3, Sancho Lpez J1. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. 2Hospital Clnico Universitario San Cecilio, 3 Instituto de Salud Carlos III. La S100A8 y la S100A9 pertenecen a la familia S100 de protenas de unin a calcio. Normalmente forman un heterodmero (S100A8/S100A9) llamado Calprotectina. Se expresan preferentemente en clulas de origen mieloide. Se han descrito incrementos en la

51

COMUNICACIONES ORALES

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

PREVENCIN DE LA DIABETES TIPO 1 EXPERIMENTAL MEDIANTE ADMINISTRACIN DE CLULAS DENDRTICAS Y CUERPOS APOPTTICOS. Marn Galln S1, Clemente X1, Planas R1, Ampudia RM1, Carrillo J2, Carrascal J2, Pujol-Borrell R3, Verdaguer J2, Borrs FE1, Vives-Pi M1. 1Lirad-BST. Fundacio Institut d'Investigaci en Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol. Badalona. 2Unitat d'Immunologia. Universitat de Lleida. 3Banc de SAng i Teixits. Badalona. La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune causada por la destruccin selectiva de las clulas beta pancreticas. Dada su etiologa desconocida, hasta el momento no se ha desarrollado una terapia preventiva o curativa para esta enfermedad. Nuestro objetivo es valorar la eficiencia de las clulas dendrticas singnicas pulsadas con cuerpos apoptticos de clulas de islote pancretico, como tratamiento preventivo de la DT1. El estudio se ha llevado a cabo en un modelo experimental de DT1, el ratn NOD (Non Obese Diabetic) que expresa la citocina IFN-beta en las clulas productoras de insulina. Este modelo desarrolla diabetes acelerada a partir de las tres semanas de edad con una incidencia del 60%. Hemos generado clulas dendrticas (DCs) inmaduras a partir de mdula sea de ratn NOD mediante cultivo con GM-CSF. La terapia ha consistido en administrar DCs pulsadas con cuerpos apoptticos de la lnea celular beta pancretica murina NIT-1 (DCs-NITapo) a ratones de 12-14 das por via intraperitoneal. Como controles, se han transferido: 1) DCs; 2) Cuerpos apoptticos de clulas insulares NIT-1; 3) Sham o suero fisiolgico. El seguimiento de los ratones se ha llevado a cabo durante 30 semanas para determinar el efecto de la inmunoterapia en la incidencia de la DT1. Los resultados indican una prevencin de la diabetes con DCsNITapo (incidencia 15%). El anlisis de la insulitis muestra una disminucin de la intensidad de infiltracin leucocitaria con esta terapia. El tratamiento con DCs no pulsadas no vara la incidencia de la enfermedad respecto a la colonia (60%). Por otro lado, la administracin de cuerpos apoptticos de NIT-1 resulta en una disminucin en la incidencia de DT1 (25%) aunque sin alcanzar los valores obtenidos con DCs-NITapo. La determinacin de los mecanismos implicados en el establecimiento de tolerancia mediante este tratamiento contribuir a valorar su futura aplicacin.

efecto de la dexametasona incrementado la expresin de Foxp3 fue mucho ms pronunciado en el caso de las clulas Treg generadas con TGF . Todas las clulas generadas con el esteroide eran anrgicas, sin embargo, al estudiar la capacidad antiproliferativa, se observ que slo aqullas generadas con TGF? eran capaces de inhibir la proliferacin, y que el incremento en la expresin de FoxP3 no supona un aumento significativo del porcentaje de inhibicin (25.2% vs 32.6%). Estos resultados estn de acuerdo con los encontrados en el estudio de pacientes de LES, en los que la actividad supresora de los linfocitos T CD4+CD25+ aislados de pacientes con tratamiento esteroideo fue similar a la de las clulas aisladas de pacientes sin este tratamiento. Estos resultados indican que aunque los esteroides incrementan significativamente la expresin de FoxP3, tanto in vivo como in vitro, no son capaces de generar clulas con funcin reguladora y sugieren que FoxP3 no es un buen marcador de clulas Treg en humanos, apoyando las diferencias descritas entre humanos y ratones en la regulacin de la actividad supresora/reguladora de esta poblacin celular.

EFICACIA TERAPEUTICA DE LA POLINEUROPATIA MIXTA SENSITIVO-MOTORA CON FATIGA INCAPACITANTE EN EL SINDROME DE SJGREN TRAS TRATAMIENTO CON RITUXIMAB. Velastegui Ordoez A, Oliver D, Rodrguez-Mahou M, Gil J, Fernandez-Cruz E, Sanchez-Ramon S. Hospital Gregorio Maraon. Madrid. Introduccin. Las manifestaciones neurolgicas en pacientes con Sndrome de Sjgren Primario (SSP) pueden aparecer hasta en el 20% de los casos, sin embargo su diagnstico en muchas ocasiones puede resultar difcil. Presentamos un caso clnico de SSP refractario al tratamiento convencional (corticoides, inmunosupresores, IGIV) cuyo sntoma principal es la fatiga incapacitante en el contexto de Polineuropata Mixta Sensitivomotora y con sintomatologa leve de sndrome seco tratado con Rituximab en monoterapia. Objetivos. Determinar la correlacin entre evolucin de sntomas y signos clnicos con niveles de anticuerpos asociados al SSP tras el tratamiento con Rituximab en monoterapia. Y evaluar la mejora en la calidad de vida del paciente. Mtodo. Administracin de Rituximab (375 mg/m2 I.V. cada 4 semanas) con seguimiento de parmetros de laboratorio, estudio isotpico de gandulas salivares, test de Schirmer, biopsia glandular, estudio neurofisiolgico y TAC craneal. Se monitorizaron en tiempo basal, 1 mes, 6 mes, 9 mes, 1 ao. Peridicamente se evalu la respuesta subjetiva del paciente en relacin al grado de incapacidad para actividades cotidianas mediante los Test de calidad de vida SF-36 y WHOQOL-100 de la OMS. Resultados. Se objetiv mejora progresiva y mantenida principalmente de los sntomas de fatiga incapacitante y debilidad en miembros inferiores, asociado con una mejora leve de la conduccin nerviosa en los estudios neurofisiolgicos. A pesar de la evolucin favorable de los sntomas clnicos neurologicos y de la xerostoma/xerotalma, comprobado por estudio isotpico de glndulas salivares y Test de Schirmer, no existi cambio en los ttulos sricos de FR y Ac. AntiRO/SSa. No se objetivaron efectos adversos en la terapia con Rituximab, ni fue necesaria la administracin concomitante de IGIV ni otros tratamientos. Con mejora de la calidad de vida del paciente. Conclusiones. En este paciente se comprob la efectividad de rituximab en monoterapia con control del cuadro tipico de SSP y de las complicaciones atribuibles a la Polineuropata mixta sensitivo-motora.

LA DEXAMETASONA INCREMENTA LA EXPRESIN DE FOXP3 INDEPENDIENTEMENTE DE LA ACTIVIDAD SUPRESORA. Prado C1, Gmez J2, Lpez P1, de Paz B1, Gutierrez C1,2, Surez A1. 1Dpto. Biologa Funcional. Universidad de Oviedo) 2Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Central de Asturias. Dado que los pacientes de LES tratados con corticoides presentan un mayor porcentaje de clulas Treg, nos planteamos si estos agentes eran capaces de generar clulas Treg in vitro. Para ello se trataron clulas CD4+CD25- durante 24 h con dexametasona y se expandieron con anti-CD3/CD28 en presencia de IL-2 durante 14 das. En las clulas obtenidas se analiz el fenotipo, la expresin gnica de FoxP3, GITR y CTLA-4 y la actividad funcional. Igualmente se analiz el efecto de la dexametasona sobre las clulas Treg generadas con TGF . Las clulas expandidas tras el tratamiento con dexametasona presentaron un fenotipo similar al de las clulas Treg (CD4lowCD25highCD127GITR+iCTLA4+CD69lowFoxp3+), mientras que los linfocitos sin dexametasona posean una expresin significativamente menor de FoxP3 y iCTLA-4 (mRNA y protena) y mayor de CD69. Es de destacar que este

52

INMUNOLOGA

COMUNICACIONES ORALES

RESPUESTA CLINICA FAVORABLE DE UVEITIS REFRACTARIA TRAS USO DE INFLIXIMAB. Carbone J, Sarmiento E, FernndezCruz E. Hospital Gregorio Maraon. Madrid. La uveitis agrupa a una serie de enfermedades inflamatorias oculares que afectan la capa media del ojo (iris, cuerpo ciliar y coroides) pudiendo causar prdida visual grave. Un subgrupo de uveitis de causa no infecciosa es de etiologa autoinmune. Objetivo. Evaluar la respuesta a infliximab (anticuerpo monoclonal anti-TNF alfa) en pacientes con uveitis refractaria. Mtodos. Revisin del curso clnico de 2 pacientes con pan uveitis bilateral refractaria a terapia convencional tratados con infliximab en la Unidad de Inmunologa Clnica del HGUGM. Respuesta teraputica: incidencia de recurrencias de uveitis, evidencia oftalmolgica de disminucin de la actividad inflamatoria ocular, agudeza visual, reduccin de la dosis de glucocorticoides sistmicos y efectos adversos; a mes 0, 3, 6 y 12. Protocolo: 3 infusiones de infliximab las semanas 0, 2, y 6. Se evalu respuesta clnica en semana 10. Si haba respuesta clnica se continuaba con una infusion en semana 14 y luego cada 8 semanas hasta el ao.

Resultados. Dos pacientes [1H (29a), 1M (46a)]. Ambos haban utilizado distintas combinaciones de corticoides sistmicos, azatioprina, ciclosporina y gammaglobulina intravenosa a alta dosis. Tiempo de enfermedad: 60 m y 41 m. Tratamiento de base al comenzar infliximab: prednisona 50 mg/d + azatioprina 100 mg/d y prednisona 90 mg/d. Tiempo de seguimiento tras primera dosis de infliximab: 24 m y 18 m. A sem 10 ninguno de los pacientes tena actividad inflamatoria ocular y completaron el protocolo hasta el ao. Al ao ninguno tena actividad inflamatoria ocular. A 12 m y 6 m tras ltima infusion de infliximab ambos siguen libres de uveitis. No se registraron efectos adversos salvo un episodio de prurito transitorio en la penltima infusin en la paciente. El tratamiento inmunosupresor se pudo reducir en ambos pacientes: El paciente varon suspendi azatioprina y redujo prednisona hasta dosis actual de 5 mg de prednisona cada semana; la paciente redujo la dosis de corticoides hasta dosis actual de deflazacort 7.5 mg cada 48 horas. Durante el seguimiento tras uso de infliximab la paciente tuvo ANA positivo a ttulo bajo. Conclusiones. Infliximab fue bien tolerado y efectivo en 2 pacientes con uveitis refractaria de larga duracin.

53

Posters
Inmunologa Vol. 27 / Supl. 1/ Mayo 2008: 55-120
SESIN 1: AUTOINMUNIDAD - I Moderadores: Dra. Joana Ferrer (Palma de Mallorca), Dra. Jlia Sequ (Madrid) 1. ASOCIACIN INDEPENDIENTE DE LOS GENES IL23R E IL12B CON ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL: NO EVIDENCIA DE INTERACCIN. Mrquez Ortiz AM1, Mendoza JL2, Taxonera C2, Daz-Rubio M2, Gmez de la Concha E1, Urcelay E1, Martnez-Doncel A1. 1Servicio de Inmunologa Clnica, Hospital Clnico San Carlos. 2Servicio de Gastroenterologa, Hospital Clnico San Carlos. Estudio genmicos recientes han identificado a los genes IL23R e IL12B como loci de susceptibilidad a enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Nuestro objetivo es dilucidar si estos genes tambin se asocian a la enfermedad en nuestra poblacin as como analizar la posible interaccin gentica entre polimorfismos localizados en los genes IL12B e IL23R, ligando y receptor r espectivamente. En este estudio se incluyeron 707 pacientes con EII, 344 con enfermedad de Crohn y 363 con colitis ulcerosa, y 547 controles sanos caucsicos. Se analizaron cuatro polimorfismos de un solo nucletido (SNPs), dos de ellos localizados en el gen IL23R (rs7517847 y rs11209026) y otros dos en el gen IL12B (rs3212227 y rs6887695). Las frec uencias genticas se analizaron mediante un test CHI-CUADRADO. Nuestros datos muestran una asociacin con EII de los dos SNPs localizados en el gen IL23R, siendo estadsticamente ms fuerte para el marcador rs7517847 (OR=0.79, frecuencias del alelo minoritario: 0.355 in pacientes con EII vs. 0.410 en controles; p=0.005). Ambos polimorfismos presentaban un efecto mayor en los pacientes de Crohn (OR=0.74) que en los enfermos de colitis (OR=0.84). Uno de los marcadores analizados en el gen IL12B (rs6887695) mostr una asociacin dbil con EII (OR=1.24, frecuencias del alelo minoritario: 0.375 in pacientes con EII vs. 0.326 en controles; p=0.012), con un efecto ms fuerte en colitis ulcerosa (OR=1.31, p=0.007). La estratificacin de los pacientes atendiendo a caractersticas clnicas no mostr diferencias significativas. No se observ interaccin entre ninguno de los polimorfismos estudiados en los genes IL12B e IL23R. Nuestro estudio confirma la asociacin de los genes IL23R e IL12B con EII en poblacin espaola, no encontrando evidencias de interacc in entre los dos genes analizados. Los polimorfismos hallados para el grupo control fueron: IL-1alpha/ - 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 45 CT/15 TT), IL-1beta/ 396 (60 CC/35CT/5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (5 CC/47.5 CT/47,5 TT), IL1R/psti 1970 (50 CC/40 CT/10 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 45 GT/40 TT), IL-2/ 166 (50 GG/40 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 27.5 GT/ 62,5 TT), IL-4/ - 590 (72.5 CC/25 CT/ 2,5 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (60 AA/35 AG/5 GG), IL-6/ - 174 (20 CC/ 40CG/40 GG), IL-6/ 565 (12.5 AA/52,5 AG/35 GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (50 CC/40 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (25 AA/50AG/25 GG), IL-12/ - 1188 (62.5 AA/32.5 AC/5CC), IFN gamma/utr 5644 (32.5 AA/42,5 AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (10 AA/25 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25 CC/50 CT/25 TT), TGF beta1/codon 25 (0 CC/15 CG/85 GG) Grupo Pacientes Artritis Reumatoide: IL-1alpha/ - 889 (57.5 CC/40 CT/2.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/ 50 CT/10 TT), IL-1beta/ 3962 (50 CC/32.5CT/7.5 TT),IL-1RA/mspa 11100 (0CC/50 CT/50 TT), IL1R/psti 1970 (45 CC/52.5 CT/7.5 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 50 GT/35 TT), IL2/ 166 (55 GG/35 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 22 GT/ 70 TT), IL4/ - 590 (75CC/25 CT/ 0 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (75 AA/15 AG/10 GG), IL-6/ - 174 (15CC/ 45CG/40 GG), IL-6/ nt 565 (10 AA/50 AG/40 GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (55 CC/35 CT/10 TT) IL-10/ - 1082 (20 AA/50AG/30 GG), IL-12/ - 1188 (65 AA/35 AC/0 CC), IFN gamma/utr 5644 (35 AA/40AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (5 AA/30 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (20 CC/50 CT/30TT), TGFbeta1/codon 25 (0 CC/15CG85 GG).

3. ICAM-1 NO MUESTRA EVIDENCIAS DE ASOCIACIN A ENFERMEDAD CELACA EN POBLACIN ESPAOLA. Dema Jimnez B1, Martnez Doncel A1, Polanco I2, Malvenda C1, Figueredo MA1, Fernndez-Arquero M1, Gmez de la Concha E1, Urcelay E1, Nez Pardo de Vera C1. 1Hospital Clnico San Carlos. 2Hospital La Paz. La enfermedad celaca (EC) es una enfermedad inflamatoria crnic a intestinal que se desarrolla en individuos genticamente susceptibles tras exposicin al gluten. El gen ICAM1, localizado en la regin de ligamiento a EC 19p13, codifica la molcula de adhesin intercelular-1 (ICAM-1). En celacos se ha observado mayor expresin de ICAM-1 en el subepitelio intestinal y en suero. Adems, la gliadina induce la expresin de ICAM-1 en cultivos de biopsias de pacientes. Recientemente, polimorfismos en ICAM1 se han asociado a EC en poblacin franc esa. Nuestro objetivo es estudiar si polimorfismos en ICAM1 estn asociados a EC en la poblacin espaola. Para ello se llev a cabo un estudio caso-control, con 608 pacientes y 535 individuos sanos, todos espaoles blancos. La mayora de los enfermos fueron peditricos (debut anterior a 15 aos). Estudiamos 4 polimorfismos de un nico nucletido (SNPs) de ICAM1: rs281432 (intrnico), rs1799969 (G241R), rs1801714 (P352L) y rs5030400 (R478W), con sondas Taqman. Los haplotipos se estimaron con el algoritmo EM (Expectation-Maximization). La comparacin de frecuencias genotpicas, allicas o haplotpicas caso-control no mostr diferencias estadsticamente significativas. La subdivisin de pacientes por edad de debut tampoco mostr diferencias significativas entre ambos grupos, ni la estratificacin por el principal factor gentico de susceptibilidad a EC conocido, HLA-DQ2. Esto nos permite concluir

2. COMPARACION DEL LOS POLIMORFISMOS DE GENES DE INTERLEUCINAS EL PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE Y UN GRUPO CONTROL. Leon Moya V1, Leon Arroyo A2, Montilla C3, Gomez S3. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitario de Salamanca. 2Laboratorio Pediatria e Inmunologia. Universidad de Valladolid. 3Serv. de Reumatologia, Hospital Universitario de Salamanca. Hemos estudiado polimorfismos de IL en 22 pacientes diagnosticados de artritis reumatoide y 28 controles. Los polimorfismos fueron analizados empleando el kit Citokine genotiping Kit (Pel-freez). No hemos encontrado diferencias significativas enter los grupos de pacientes de artritis reumatoide y el control.

55

POSTERS

VOL. 27 SUPL. 1/ 2008

que, en contra de lo descrito en poblacin francesa, en la que el polimorfismo G241R pareca conferir susceptibilidad a EC, con mayor efecto en poblacin adulta, nosotros no observamos que ninguno de los 4 polimorfismos estudiados aumente el riesgo a padecer EC, a pesar de tener ms del 99% de potencia para detectar el efecto de G241R descrito en pacientes peditricos. Nuestra escasa muestra de pacientes con debut de la enfermedad en edad adulta (posterior a 18 aos) no permite descartar que ICAM1 afecte slo a este subgrupo de enfermos.

4. EPTOPO COMPARTIDO Y ANTICUERPOS ANTI PPTIDO CITRULINADO: RELACIN CON EDAD DE COMIENZO Y TIEMPO DE EVOLUCIN DE LA ARTRITIS REUMATOIDE. Varad Lpez J1, Loza-Santamara E2, Perdigones N1, FernndezArquero M1, Figueredo MA1, Rodrguez L2, Gmez de la Concha E1, Fernndez-Gutirrez B2, Urcelay E1, Martinez-Doncel A1. 1Inmunologa Clnica Hospital Clnico San Carlos. 2Reumatologa Hospital Clnico San Carlos. Introduccin. La artritis reumatoide es una patologa compleja con un fuerte componente autoinmune; el principal factor gentico de riesgo conocido hasta ahora son ciertos alelos del complejo principal de histocompatibilidad (HLA). Los alelos de susceptibilidad en DRB1 comparten una secuencia comn; denominada eptopo compartido (SE). Los anticuerpos anti-pptido cclico citrulinado (anti-CCP) son uno de los mejores marcadores predictores del desarrollo de AR. En este estudio queremos analizar la relacin entre SE, anti-CCP y edad de inic io de los sntomas de AR, teniendo en cuenta el posible efecto de la duracin de la enfermedad. Materiales y mtodos. Analizamos, en un estudio transversal, 411 pacientes de AR que fueron genotipados para HLA-DRB1 con el kit Lifecodes HLA-SSO; los anticuer pos anti-CCP se determinaron por ELISA con el ensayo Immunoscan Euro-Diagnostica. El anlisis estadstico se realiz con el paquete estadstico STATA v9.0. Resultados. Como esperbamos, SE y anticuerpos anti-CCP estaban fuertemente correlacionados (p<10-5). Observamos una modesta correlacin entre la edad de inicio de los sntomas y ambos marcadores (SE: p=0.12; anti-CCP: p=0.07). Observamos que existe una correlacin entre la edad de inicio de los sntomas y el tiempo de evolucin de la enfermedad (p<10-7, r=-0.43). Al corregir este efecto mediante un anlisis multivariado, se pone de manifiesto que los anticuerpos anti-CCP estn correlacionados con el tiempo de evolucin de la enfermedad (p=0.009) pero no con la edad de inicio de los sntomas (p=0.52). Conclusin. Nuestros datos sugieren que los anticuerpos anti-CCP no slo son detectables antes de que aparezcan los primeros sntomas de la enfermedad, como se describe en la literatura, sino que tambin pueden aparecer durante el desarrollo de la misma como resultado del proceso inflamatorio en los pacientes genticamente proclives.

cin linfocitaria efectora, las clulas Th17. Esta poblacin y sus mediadores (IL-17, IL-22, as como tambin la citocina activadora de esta respuesta, IL-23) se han identificado como determinantes en la patologa de diversas enfermedades inflamatorias as como en modelos experimentales de colitis. Objetivo. Caracterizar la contribucin de la respuesta Th17 frente a la Th1 en la enfermedad de Crohn. Mtodos. Aislamiento de linfocitos CD4+ de sangre de controles sanos y pacientes con enfermedad de Crohn activa o en remisin. Cultivo de estas clulas y determinacin de la proporcin de clulas productoras de citocinas por marcaje intracelular y citometra de flujo. En algunos experimentos, activacin de las clulas con a-CD3/aCD28 y adicin de IL-12, IL-23 o medio de cultivo. Cuantificacin por ELISA de la produccin total de IFN-, IL-17 e IL-22 en el sobrenadante de los cultivos. Resultados. Los pacientes con enfermedad de Crohn activa presentan un mayor porcentaje de clulas IL-17+ (p-valor<0.05) as como un aumento en la secrecin de IL-17 con respecto a los enfermos en remisin y a los controles. El porcentaje de clulas IL-22+, y tambin la cantidad de esta citocina, en los enfermos activos es mayor que en los inactivos. Por el contrario, tanto el porcentaje como la cantidad de IFN- no se correlacionan con la enfermedad ni con su actividad. Adems, los enfermos que presentan su primer o segundo brote de actividad no se comportan como los activos con antecedentes sino que sus niveles de IL-17 son ms bajos y comparables a los de los enfermos inactivos y los controles. En respuesta a activacin los linfocitos CD4+ producen ms IFN- y ms IL-17. La adicin al cultivo de IL-23 no afecta a la secreci n de IFN- pero en cambio pone de manifiesto una mayor sensibilidad de los enfermos de Crohn a esta citocina ya que provoca un incremento en la produccin de IL-17 (p-valor<0.01) no observado en los controles. Conclusiones. Nuestros experimentos muestran que la respuesta linfocitaria tipo Th17, y no la Th1, se correlaciona con la actividad de la enfermedad de Crohn. Adems esta subpoblacin Th17 aparece aumentada en los enfermos crnicos pero no en los primeros brotes de la enfermedad sugiriendo que este tipo de respuesta puede jugar un papel importante en los estadios crnicos pero no en el debut de la enfermedad.

6. EL GRADO DE INFLAMACIN MODIFICA EL FENOTIPO DE LAS CLULAS T REGULADORAS EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. Marn Alberca MG1, Prez Garca V1, Peris Pertusa A1, Navarro Blasco FJ2, Sempere Ortells JM1. 1Universidad de Alicante, Departamento de Biotecnologa, Divisin de Inmunologa. 2Hospital General Universitario de Elche, Unidad de Reumatologa. Introduccin. Las clulas T reguladoras (Treg) participan en la tolerancia perifrica evitando la activacin y correcto funcionamiento de clones autorreactivos y, por tanto, la aparicin de enfermedades autoinmunes como la Artritis Reumatoide (AR). Objetivos: Caracterizar de manera ms completa el fenotipo de membrana de Treg de sangre perifric a de pacientes con AR, para buscar posibles cambios dinmicos en estos parmetros segn el grado de actividad de la enfermedad (DAS28) y los periodos de actividad/remisin. Metodologa: Se analizaron muestras de sangre perifrica de 58 pacientes con AR y 38 controles sanos. 22 pacientes estaban en remisin (DAS28?3.2), 21 presentaban una actividad moderada (>3.2 DAS28?5.1) y 15 se encontraban muy activos (DAS28>5.1). Se analiz la expresin de los mar-

5. RESPUESTA Th17 FRENTE A Th1 EN LA ENFERMEDAD DE CROHN. Veny M1, Closa D1, Esteller M1, Pique JM2, Pans J2, Salas A1. 1Departament d'Isqumia i Inflamaci, IIBB-CSIC-CIBEREHD, Barcelona. 2Departament de Gastroenterologia, Hospital Clnic, IDIBAPS-CIBEREHD, Barcelona. Introduccin. La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crnica del tracto digestivo caracterizada por un exceso de respuesta linfocitaria Th1. Recientemente se ha descrito una nueva pobla-

56

INMUNOLOGA

POSTERS

cadores de membrana CD28, CD45RA, CD45RO, CD45RBlow, CD38, CD62L, CD134, CD152 y CD154 en linfoci tos CD4, CD8 y CD19, con o sin baja, intermedia o alta expresin de CD25. El anlisis se realiz por citometra de flujo. Resultados: Descenso del porcentaje de CD4+CD25+ en pacientes (p<0.0005), especialmente CD4+CD25high y CD4+CD25int. Pacientes ms activos presentan menor porcentaje de clulas CD4+CD25high y CD4+CD25int (p=0.007). Tambin descienden CD4+CD38+ (p<0.0001), CD4+CD62L+ (p<0.005), CD8+CD25highCD45RA+ y CD8+CD25intCD45RA+ (p<0.01) en pacientes. Aumenta la expresin de diferentes antgenos como CD134 (p<0.05), CD45RBlow (p<0.0001) o CD152 (p<0.000001) en clulas CD4+CD25+, y la proporcin de otras Treg como las CD4+CD152+ (p<0.05) o las CD8+CD28- en pacientes. Demostramos que la mayora de estos cambios guardan relacin con el grado de inflamacin, alcanzando sus menores o mayores niveles en pacientes moderados/activos respecto a controles y, en algunos casos, frente a inactivos. Conclusiones: Un balance apropiado de estas poblaciones de Treg, podra determinar el grado de inflamacin y, por tanto, podra r elacionarse con los periodos de actividad/remisin.

8. EL ESTADO HETEROCIGOTO PARA LOS POLIMORFISMOS DEL GEN VDR ES PROTECTOR DE CELIAQUA. Manzanares Martn B, Casado A, Gonzlez Fernndez R, Jimenez Gmez J, Snchez Ruiz F, Rodriguez Reynoso F, Quesada Gmez M, Pea Martnez J. Hospital Reina Sofia. Introduccin. La enfermedad celiaca (MIM 212750) es un desorden crnico autoimmune causado por intolerancia al gluten en sujetos genticamente susceptibles. Los genes HLA slo confieren un 40% del riesgo gentico de padecer esta enfermedad. Los enfermos celiacos (EC) presentan alteraciones en el metabolismo de la vitamina D, que adems de su efecto en el metabolismo del calcio, tiene un efecto inmunomodulador. Recientemente se han demostrado diferentes asociac iones entre los polimorfismos del gen del receptor de la vitamina D (VDR) y enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, en el presente estudio nos planteamos determinar si los polimorfismos CDX-2, BSM-I, FOK-I deVDR son factores de r iesgo de EC. Se estudiaron 50 familias con al menos un hijo con EC y algn hermano HLA idntico al paciente. Se tiparon por PCR-SSO de Dynal (tipaje genrico) y PCRSSO Innogenetics (AR) los loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQB1 y DQA1 de los padres, el paciente y sus hermanos para confirmar la identidad HLA. El paciente y su(s) hermano(s) HLA idntico(s) fueron genotipados para el polimorfismo de VDR (CDX 2, Fok I, Bsm I) usando una amplificac in por PCR seguido por digestin por endonucleasas de restriccin y electroforesi s en geles de agarosa. Resultados. La comparacin de los genotipos VDR de los pacientes con sus hermanos HLA idnticos demostr que la proporcin de heterocigotos en CDX-2, Bsm-I y Fok-I para los tres polimorfismos estudiados era significativamente superior en el grupo de los hermanos sanos. Ningn EC result ser heterocigoto para los tres polimorfismos a la vez. En el grupo control tambin encontramos una mayor proporcin estadsticamente significativa de sujetos heterocigotos respecto a los pacientes celiacos. Cuando se compararon los haplotipos resultantes de las combinaciones de dos polimorfismos (CDX + Bsm I, CDX-2 + Fok I, Bsm I + Fok I) el porcentaje de dobles heterocigotos fue mayor en los hermanos sanos (28%, 28%, 28% respectivamente) con relacin a EC (4.35%, 8.7%, 17.39%). Los controles se comportaron como los hermanos sanos.

7. DETECCIN DE FOXP3 EN CLULAS T REGULADORAS DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE A DIFERENTES GRADOS DE INFLAMACIN. Prez Garca V1, Marn Alberca G1, Peris Pertusa A1, Navarro Blasco F2, Sempere Ortells JM1. 1Universidad de Alicante. 2Hospital General Universitario de Elche. Introduccin. La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crnica inflamatoria de carcter autoinmune, en la cual los pacientes sufren una dinmica inflamatoria caracterizada por fases de remisin/activacin. Las clulas T reguladoras, fundamentales para el mantenimiento de la autotolerancia y la prevencin de enfermedades autoinmunes, expresan de manera constitutiva el factor de transcripcin FoxP3. Objetivos. Analizar la expresin de FoxP3 por citometra de flujo en diferentes poblaciones celulares de sangre perifrica en pacientes AR (vs. controles sanos), y determinar si existen cambios en su deteccin asociados al grado de inflamacin segn el DAS28 (Disease Activity Score). Mtodos. Clulas mononucleares de sangre perifrica de 23 pacientes AR (5 en remisin, 11 con actividad inflamatoria moderada, 7 muy activos) y 10 controles sanos fueron analizadas. Las clulas fueron marcadas con anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC o anti-CD19-FITC en combinacin con anti-CD25-Pe-Cy5. Posteriormente, las clulas se procesaron segn el Kit FoxP3-PE Staining Set (clone PCH101, eBioscience). FoxP3 fue analizado por citometra de flujo teniendo en cuenta diferentes intensidades para el CD25. Resultados. El porcentaje de clulas FoxP3+ aparece aumentado en las clulas CD4+ (p<0.01) y subpoblaciones CD4+CD25low/int/hig