Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

ARTÍCULO
DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6 ABIERTO

Plátanos Cavendish transgénicos con resistencia a la

marchitez tropical por Fusarium raza 4
James Dale1, Antonio James1, Jean-Yves Paul1, Harjeet Khanna1,5, Marcos Smith2, Santy Peraza-Echeverría1,6,
Fernando García-Bastidas3, Gert Kema3, Peter Waterhouse1, Kerrie Mengersen4y Robert Harding1

Banana (Musaspp.) es un alimento básico para más de 400 millones de personas. Más del 40% de la producción
1234567890

mundial y prácticamente todo el comercio de exportación se basa en el banano Cavendish. Sin embargo, el
plátano Cavendish está amenazado por un hongo virulento,fusarium oxysporumF. sp.cubense raza tropical 4
(TR4) para la cual no se ha identificado ningún reemplazo resistente aceptable. Aquí informamos la
identificación de Cavendish transgénico con resistencia a TR4. En nuestra prueba de campo de 3 años, dos
líneas de Cavendish transgénico, una transformada conRGA2,un gen aislado de un plátano diploide resistente
a TR4, y el otro con un gen derivado de un nematodo,Ced9,permanecer libre de enfermedades. La expresión
del transgén en las líneas RGA2 está fuertemente correlacionada con la resistencia. Los homólogos endógenos
de RGA2 también están presentes en Cavendish, pero se expresan diez veces menos que en nuestra línea
transgénica más resistente. La expresión de estos homólogos puede potencialmente elevarse mediante la
edición de genes, para proporcionar resistencia no transgénica.

1Centro de Cultivos Tropicales y Biocommodities, Universidad Tecnológica de Queensland, Brisbane, 4001 Queensland, Australia.2Darwin Banana Farming Company
Laguna Lambells 0822 Territorio del Norte de Australia.3Universidad y Centro de Investigación de Wageningen, Plant Research International, Wageningen, 6700,
Países Bajos.4Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Tecnológica de Queensland, Brisbane, 4001 Queensland, Australia.5Dirección actual: Sugar Research
Australia Indooroopilly 4068 Queensland Australia.6Dirección actual: Unidad de Biotecnología Centro de Investigación Científica de Yucatán Mérida 97205 Yucatán
México. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a JD (correo electrónico:j.dale@qut.edu.au)

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496 |DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications 1

ARTÍCULO
F
El marchitamiento por usarium o mal de Panamá es una enfermedad
devastadora de los plátanos. En la primera mitad del siglo pasado
provocó una de las epidemias de enfermedades vegetales más
graves de la historia. Durante ese período,F. oxisporumF. sp.cubense (Foc),
el hongo responsable de la marchitez por Fusarium, causó una importante
epidemia en las plantaciones comerciales de banano en América del Sur y
Central en el entonces dominante cultivar de exportación Gros Michel.1.
Esta epidemia fue causada por Foc raza 1 y condujo a la sustitución casi
completa de Gros Michel por Cavendish, que es resistente a Foc raza 1.
Cavendish representa ahora >40% de la producción mundial de banano y
domina completamente el mercado de exportación de banano, que
asciende a hasta el 15% de la producción mundial. A pesar de esto, la raza 1
de Foc continúa causando enfermedades importantes en una amplia gama
de otros cultivares de banano producidos y comercializados localmente.2.
Foc invade a través de las raíces antes de ingresar al cormo y al
pseudotallo, donde causa una necrosis extensa que conduce a la muerte de
la planta.3. El hongo se disemina en el suelo infestado, en el material de
siembra infectado y en el agua, incluidas el agua de riego y las
inundaciones, y puede permanecer en el suelo durante más de 40 años.1. A
principios de la década de 1990, se reconoció en el sudeste asiático otra
forma de Foc, la raza tropical 4 (TR4).4, que se diferencia de Foc raza 1 en
que infecta y mata a Cavendish, así como a otros importantes cultivares
resistentes a la raza 1. Foc TR4 ahora devasta plantaciones de Cavendish en
Indonesia, Malasia, China, Filipinas, Australia y Mozambique. Continúa
moviéndose internacionalmente con informes recientes sobre su
propagación a Jordania, Pakistán y el Líbano.4,5, y es muy probable que el
hongo y la enfermedad sigan propagándose, especialmente en el sur y
sudeste de Asia. De los continentes productores de banano, sólo las
Américas aún no han registrado la TR4. La enfermedad ahora representa
una amenaza muy significativa para la producción comercial de banano en
todo el mundo y, junto con la raza 1, limita severamente el número de
cultivares de banano adecuados para la producción a gran escala o en
pequeña escala.
No existe un control químico eficaz para el TR44y los esfuerzos para
contener la enfermedad mediante cuarentenas internacionales o
intranacionales han sido claramente ineficaces, como lo demuestra la
continua propagación entre continentes, países y regiones. A nivel local,
esfuerzos como la destrucción de plantas infectadas, el aislamiento de
áreas infestadas y la desinfección de vehículos, maquinaria y ropa
probablemente, en el mejor de los casos, reduzcan la tasa de propagación.
Aunque en Taiwán se han generado variantes somaclonales de Giant
Cavendish (Variantes de cultivo de tejido de Giant Cavendish (GCTCV)) con
distintos niveles de tolerancia a TR4 mediante cultivo de tejidos6, estos se
consideran una solución a corto plazo para el control de enfermedades, en
el mejor de los casos, debido a la falta de inmunidad y a rasgos
agronómicos indeseables.7. La falta de medidas efectivas de control de TR4
y el impacto devastador de la enfermedad hacen que el despliegue de
genes de resistencia sea una estrategia obvia y atractiva. Aquí informamos
la generación y pruebas de campo de plantas transgénicas de banano
Cavendish y la identificación de líneas con fuerte resistencia a TR4.
Resultados
Generación y caracterización de plantas de banano transgénicas.
Anteriormente hemos demostrado que elCed9gen anti-apoptosis derivado
del nematodoCaenorhabditis eleganspuede conferir resistencia a Foc raza 1
en plátanos transgénicos Lady Finger8. También hemos aislado
previamente el gen de resistencia análogo 2 (RGA2),un supuesto gen de
resistencia (R) de tipo repetidor rico en leucina y unión a nucleótidos (NB-
LRR), procedente de una plántula deMusa acuminadassp. malaccensiscon
resistencia a TR49. Análisis de secuencia de este gen.7reveló una estrecha
relación filogenética con los genes de tipo NB-LRR, incluidosI210y
formulario-211, que se ha demostrado que codifican la resistencia al
marchitamiento por Fusarium en tomate y melón, respectivamente. Por lo
tanto, construimos ambosCed9-yRGA2- casetes de expresión transgénica
derivados (Fig.1a, b) dondeCed9era
2 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6
bajo el control del promotor de poliubiquitina del maíz (Ubi-P) yRGA2
estaba bajo el control de la Agrobacteriumnopalina sintasapromotor
(Nos-P). Estos casetes se transformaron por separado en el cultivar
Cavendish Grand Nain (GN). Después de seleccionar transformantes
primarios mediante PCR, cincoRGA2líneas (RGA2-2, 3, 4, 5 y 7) y cinco
Ced9Se seleccionaron líneas (Ced9-17, 19, 21, 22 y 26), junto con
controles no transformados, para el análisis Southern. Cada una de las
RGA2Las líneas contenían múltiples copias transgénicas además de
tres endógenas.RGA2homólogos presentes en plantas de control no
transformadas (Fig.1C). El cinco Ced9líneas que contienen entre una y
muchas copias del transgén sin homólogos endógenos identificados
(Fig.1d).
Evaluación de campo de plantas de banano transgénicas.Para determinar si
estos transgenes podrían conferir resistencia a TR4, evaluamos las diez
líneas transgénicas independientes (RGA2-2, 3, 4, 5 y 7; Ced9-17, 19, 21, 22 y
26), junto con cinco PCR positivas adicionales. líneas transgénicas pero para
las cuales no se había realizado análisis Southern (RGA2-6; Ced9-10, 15, 23 y
31), para determinar la resistencia en un ensayo de campo durante un
período de 3 años. El sitio del ensayo fue una plantación comercial de
banano en el Territorio del Norte de Australia, donde la TR4 se ha vuelto
endémica y donde las plantas de banano Cavendish habían sido
previamente devastadas por la enfermedad. Los controles no transgénicos
incluidos en el ensayo fueron los cultivares GN y Williams de Cavendish
susceptibles a TR4, además de los cultivares GCTCV 218 y DPM25 (Dwarf
Parfitt Mutant). GCTCV 218 es una variante de Giant Cavendish seleccionada
en Taiwán por su tolerancia a TR46, mientras que DPM25 es unɣ-Selección
irradiada del cultivar Cavendish Dwarf Parfitt, que tiene resistencia a otra
raza de Foc, raza subtropical 4 (STR4).12. La ubicación del ensayo tiene un
clima tropical y aproximadamente el 90% de la lluvia anual suele caer
durante la estación húmeda (noviembre-abril). El ensayo se plantó durante
la temporada de lluvias a principios de 2012, según un diseño aleatorio, y
se desarrolló durante 3 años, ya que el banano es un cultivo perenne. Para
aumentar la presión del inóculo, se enterró material vegetal infectado entre
cada planta.
El ensayo se inspeccionó periódicamente en busca de plantas que
mostraran síntomas típicos de TR4, como marchitez y/o coloración
amarillenta de las hojas (Fig.2a). Los pseudotallos de individuos
sintomáticos se examinaron más a fondo para detectar la presencia de una
decoloración vascular marrón rojiza característica de la infección por TR4
(Fig.2b). El estado de la enfermedad de las plantas, basado en esta
evaluación visual, se registró a intervalos regulares tanto en la estación
húmeda como en la seca (mayo-octubre) (Figs.3a,b y tabla1). Para la
evaluación final, se puntuó la decoloración vascular de los pseudotallos de
todas las plantas supervivientes y se tomó una selección de muestras y se
analizó la detección de TR4 mediante una combinación de aislamiento de
hongos y ensayos basados en PCR.13,14. De las 118 muestras, 107
procedían de plantas que no mostraban decoloración vascular y todas
dieron negativo para TR4. Las 11 muestras restantes procedían de plantas
con decoloración vascular y, de ellas, 10 dieron positivo para Foc TR4. Esto
confirmó que la decoloración vascular en el ensayo tenía una precisión
superior al 99% como marcador de diagnóstico de infección por TR4.
Al final de la prueba, entre el 67 y el 100 % de todas las plantas de
control estaban muertas o infectadas y todas habían mostrado
decoloración vascular. En general, la enfermedad se desarrolló más
temprano en las plantas de control no transgénicas, aumentó
aproximadamente un 20% por año y fue considerablemente más rápido
durante las estaciones húmedas (Figs.3a,b y tabla1). DPM25, que destaca
por su resistencia a Foc STR412, parecía ser el cultivar más susceptible y
todas sus réplicas se infectaron en 2,5 años, mientras que el GCTCV 218,
supuestamente tolerante a TR4.6era tan susceptible como el cultivar
Williams de Cavendish. Sin embargo, no hubo diferencia estadística en la
proporción total de plantas infectadas sintomáticas entre ninguno de los
controles en comparación con el control de referencia.
|DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6
a
libra 35S-T nptII 35S-P Nos-P
b
libra 35S-T nptII 35S-P Nos-T
C d
RGA2-2
RGA2-3
RGA2-4
RGA2-5
RGA2-7
peso
23.130 pb
9.416 pb
6.557 pb
4.361 pb
Homólogos de RGA2
2.322 pb
2.027 pb
Figura 1Casetes de expresión transgénica y análisis Southern de líneas transgénicas seleccionadas.aRGA2 ybCasetes de expresión Ced9. LB, borde izquierdo; RB, borde derecho.
Determinación del número de copias del transgén enCRGA2ydCed9líneas de banano transgénico mediante análisis de transferencia Southern. ADN genómico de WT,RGA2 yCed9Las
líneas fueron digeridas conHindIII ynavidadYo, respectivamente. La referencia del marcador de peso molecular de ADN II (Roche) se indica en el lado derecho
GN (prueba de diferencia significativa honesta (HSD) de Tukey,p >0,05).
Por el contrario, el 30% o menos de las plantas de cuatro de las cinco
líneas RGA2 caracterizadas y cuatro de las cinco líneas Ced9
caracterizadas fueron sintomáticas durante el ensayo de 3 años. El
desarrollo de síntomas en las cuatro líneas RGA2, RGA2-2, RGA2-3,
RGA2-4 y RGA2-5, fue significativamente menor que en GN (prueba
HSD de Tukey, 0,01 <pag <0,05), mientras que RGA2-7 (60%) no lo fue.
De manera similar, el desarrollo de síntomas fue significativamente
menor en las cuatro líneas Ced9, Ced9-22 y Ced9-26 (prueba HSD de
Tukey, 0,01 < pag <0,05), y Ced9-19 y Ced9-21 (prueba HSD de Tukey,
0,001 < pag <0,01) que GN, mientras que Ced9-17 (87,5%) no lo fue.
Las líneas RGA2-3 y Ced9-21 parecían ser inmunes a TR4, ya que no se
observaron síntomas internos (decoloración vascular) o externos de la
enfermedad en ninguna planta durante los 3 años (Figs.2c – f, Figs.3a,
by tabla complementaria1).
Análisis de niveles de expresión génica.Para investigar la base de la
resistencia, y debido a que TR4 es un patógeno transmitido por el
suelo, se analizó la expresión del transgén en las raíces de las líneas
Ced9 y RGA2. El análisis cuantitativo sólo se realizó en líneas RGA2
porque, como gen derivado del plátano,RGA2se consideró el transgén
más adecuado para la desregulación. La PCR con transcriptasa inversa
(RT-PCR) mostró que las cinco líneas Ced9 expresaban el transgén (Fig.
1). Para las líneas RGA2, RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), inicialmente
con cebadores que amplificaban elRGA2 transgén únicamente, se
utilizó para evaluar los niveles de expresión y se observó una fuerte
correlación entreRGA2nivel de expresión y el grado de protección TR4
(Fig.3C). Posteriormente, se repitió qRT-PCR pero con cebadores que
amplificarían tanto elRGA2 transgénico y endógenoRGA2en GN (Fig.3
d). Nuevamente, la línea transgénica más resistente (RGA2-3) fue la
que mayor expresión
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496 |DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications
ARTÍCULO
RGA2 Nos-T RB
Ced9 Ubi-P RB
Ced9-17
Ced9-19
Ced9-21
Ced9-22
Ced9-26
peso
23.130 pb
9.416 pb
6.557 pb
4.361 pb
2.322 pb
2.027 pb
de ARNm de RGA2, mientras que las otras tres líneas resistentes a TR4,
RGA2-2 (20% de infección), RGA2-4 (20% de infección) y RGA2-5 (14,3% de
infección), también mostraron niveles moderados a altos de expresión de
RGA2. . La línea más susceptible, RGA2-7 (60% de infección) tuvo los niveles
de expresión más bajos, que eran aproximadamente diez veces menores
que los de RGA2-3. El nivel de expresión en el cultivar GN Cavendish
altamente susceptible (87,5% de infección) también fue aproximadamente
diez veces menor que el de la línea RGA2-3. La correlación inversa
observada entre la proporción de infecciones y el nivel de expresión de
RGA2en las líneas transgénicas GN no transgénicas y RGA2 fue
estadísticamente significativa (correlación de Pearson = −0,86,t = -3,37, gl =
4,pag =0,028; Correlación de rango de Spearman = −0,90,S =66,45, pag =
0,015). Esta relación inversa persistió cuando sólo se consideraron las líneas
transgénicas RGA2 pero la correlación ya no fue estadísticamente
significativa (correlación de Pearson = −0,85, t = -2,811, gl = 3,pag =0,067;
Correlación de rango de Spearman =
− 0,82,S =36,42,pag =0,089).
Curiosamente, la expresión de RGA2 en diploides salvajes resistentes a TR4
M acuminatassp.malaccensisfue más de cinco veces mayor que en su
hermano susceptible pero más de cinco veces menor que RGA2-3.
Afortunadamente, mejorar los niveles de expresión de RGA2 o Ced9
no parece tener un impacto perjudicial sobre el tamaño del racimo en
las líneas transgénicas. Una calificación visual del tamaño de los
racimos maduros disponibles (Tabla complementaria2) basado en el
número de manos de fruta por racimo no mostró diferencias
estadísticas entre el control sano y el GN transgénico (χ2= 31,7, gl = 28,
pag =0,29).
Posibles mecanismos de resistencia e investigaciones futuras.Estos
resultados indican que el cultivar Cavendish GN posee endógenos.
RGA2loci, que no están suficientemente expresados para conferir
3
ARTÍCULO
Tipo salvaje
a C
b d
Figura 2Síntomas característicos de Foc TR4 en banano susceptible y resistente. Síntomas externos y decoloración vascular interna de color marrón rojizo
de Foc TR4 en WT Cavendish infectadoayben comparación con líneas transgénicas resistentes RGA2-3Cyd,y Ced9-21miyF
Protección TR4. Dada la estrecha relación de GN y los otros cultivares de
Cavendish Williams, GCTCV 218 y DPM25, es probable que estos últimos
clones también poseanRGA2lugares. El aumento de los niveles de RGA2
mediante transgénesis puede reducir la infección por TR4, posiblemente a
través de una vía en cascada similar al gen R. El gen responsable de la
resistencia a Foc TR4 enM acuminatassp.malaccensisno han sido
identificados peroRGA2es un posible candidato. Parece muy poco probable
que la resistencia observada al TR4 en nuestroRGA2 líneas se debe a la
variación somaclonal, porque las variantes somaclonales que exhiben
incluso tolerancia a TR4 son raras, sin embargo, identificamos cuatro de
cinco independientesRGA2Líneas con resistencia. Los análisis de
transferencia Southern indicaron que incluso el GN altamente susceptible
contiene tresRGA2-como secuencias (Fig.1C). Clonación y análisis de estos.
RGA2-secuencias similares confirmaron la presencia de tresRGA2
homólogos, que eran entre 98,6 y 98,7% homólogos con RGA2a nivel de
nucleótidos, lo que resulta en cambios de entre 28 y 32 aminoácidos (Fig.4).
Un análisis más detallado indicó que se trataba de tres alelos de una sola
copia.RGA2homólogo. Para determinar si los niveles bajos de expresión de
los homólogos, las diferencias de aminoácidos o una combinación de los
dos hacen que los tresRGA2 Aunque los homólogos son ineficaces, GN se
ha transformado con cada homólogo, bajo el control del promotor Nos, y la
respuesta de las líneas transgénicas a TR4 se evaluará en futuros ensayos
de campo. El modo de acción deCed9-La resistencia mediada por TR4 en
bananos transgénicos tampoco está clara. Al funcionar como un gen
antiapoptosis, puede prevenir la muerte celular inducida por hongos y
contribuir al mantenimiento de la homeostasis de los orgánulos.
Anteriormente, se había informado de resistencia transgénica a Foc raza
1 en plátanos mediante pruebas en invernadero utilizando genes anti-
apoptosis8,15o interferencia de ARN dirigida a genes Foc esencialesdieciséis.
Este es el primer informe de resistencia al marchitamiento por Fusarium en
bananos transgénicos en el campo. Es un paso muy significativo para evitar
el colapso de la producción de exportación de banano basada en Cavendish
y al mismo tiempo proteger un importante cultivo de subsistencia. Estamos
a punto de comenzar otra prueba de campo más amplia que contiene
nuestras líneas RGA2, así como muchas más líneas nuevas de Cavendish
(cultivares Williams y GN) transformadas conRGA2,para identificar líneas
4 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6
RGA2-3 Ced9-21
mi
F
que sean adecuados para la progresión hasta el lanzamiento
comercial. Además, el descubrimiento de que Cavendish codifica tres
RGA2 homólogos ofrece la interesante perspectiva de utilizar
tecnología de edición de genes para generar resistencia a TR4
mejorando la expresión de estos genes endógenos con o sin editar
también la secuencia codificante.
Métodos
Transformación y caracterización de plantas.Vectores binarios que contienen el
C. elegansgeneCed9bajo el control de un Ubi-P de maíz y un terminador 35s del virus
del mosaico de la coliflor (35S-T)8o elM acuminatassp.malaccensis RGA2bajo el control
de laAgrobacterium tumefaciensSecuencias Nos-P y terminadoras.17
fueron utilizados en este estudioM acuminataCavendish CV. Se prepararon suspensiones de células
embriogénicas GN (subgrupo AAA) a partir de flores masculinas inmaduras y se transformaron mediante
centrifugación asistida.A. tumefaciens-método mediado18. Después de la selección, las plantas derivadas
de embriones únicos se regeneraron y se examinaron para determinar la presencia del transgén
respectivo mediante PCR utilizando cebadores específicos. Un total de seisRGA2y nueveCed9Se generaron
líneas y se multiplicaron hasta 10 réplicas de cada línea transgénica en cultivo de tejidos para análisis de
campo. Tanto el número de líneas transgénicas como el número de réplicas por línea permitidas en el
ensayo de campo estuvieron limitados por las condiciones de la licencia (DIR 107) impuestas por la Oficina
del Regulador de Tecnología Genética (OGTR). También se generaron como controles plantas derivadas
de suspensiones celulares no transformadas. Antes de la siembra en el campo, las plantas de cultivo de
tejidos se aclimataron en una casa de sombra segura durante un período de 3 meses, momento en el cual
habían alcanzado una altura de ~35 cm.
Diseño de prueba de campo.La prueba de campo se llevó a cabo en una plantación comercial de
banano ubicada en Lambells Lagoon, Territorio del Norte, Australia. El sitio se había utilizado
anteriormente para cultivar plantas de banano Cavendish y tiene un historial de alta incidencia
de infección por TR4. La prueba de campo comprendió dos plantaciones, la primera en enero de
2012 y la segunda en mayo de 2012. Debido a la gravedad de la amenaza del TR4 para la
industria bananera australiana, se necesitaron 8 años desde la generación inicial de las líneas
transgénicas para identificar una planta adecuada. ubicación del ensayo de campo y obtener
permiso del propietario de la plantación, los reguladores de bioseguridad tanto en Queensland
como en el Territorio del Norte, y la OGTR para realizar este ensayo. Desafortunadamente, el
ensayo solo se llevó a cabo durante 3 años, no los 5 años previstos, debido a una orden de
terminación forzosa de la cuarentena debido a otra enfermedad.
Se plantaron líneas transgénicas en un diseño aleatorio, con filas que contenían bloques de
diez plantas transgénicas y cada bloque separado por cuatro plantas de control no transgénicas.
Las plantas de control incluyeron plantas de control de líneas celulares (cv selecciones
Cavendish GN y/o Williams) de QUT además de plantas de cultivo de tejidos de Williams, GCTCV
218 y DPM25 suministradas por Mission Beach Tissue Culture Nursery, Queensland. Para
aumentar el nivel y la uniformidad de la presión del inóculo, se
|DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6 ARTÍCULO

a C
100 1.2
CGTCV 218
90
williams
1

Expresión relativa normalizada

80 DPM25
70 Gran Naín 0,8
Porcentaje de infección

60 RGA2-2*

50 RGA2-3* 0,6
RGA2-4*
40
RGA2-5* 0,4
30
RGA2-7
20
0,2
10
0 0

GN
Mal-R
Mal-S

RGA2-2

RGA2-3

RGA2-4

RGA2-5
12 de enero 13 de enero 14 de enero 15 de enero

b d 1.2
100
Gran Naín
90
Ced9-17 1

Expresión relativa normalizada

80
Ced9-19**
70 Ced9-21** 0,8
Porcentaje de infección

60 Ced9-22*

50 Ced9-26* 0,6
40
0,4
30
20
0,2
10
0 0

GN
Mal-R
Mal-S

RGA2-2

RGA2-3

RGA2-4

RGA2-5

RGA2-7
12 de enero 13 de enero 14 de enero 15 de enero

Temporada húmeda Temporada húmeda Temporada húmeda Temporada húmeda

Fig. 3Análisis de incidencia de enfermedades y expresión génica.a, bNiveles de infección por Foc TR4 en plantas de banano transgénicas y WT seleccionadas durante la prueba de
campo de 3 años.aLíneas WT y RGA2, ybLíneas WT y Ced9. Se indican las estaciones húmedas (noviembre-abril). El número de réplicas biológicas (norte)de cada línea independiente
al inicio de la prueba se proporciona en la tabla complementaria1. Los puntos de datos son el porcentaje de réplicas biológicas infectadas en el momento de la evaluación. *0,01 <
pag <0,05, **0,001 <pag <0,01 al final del ensayo (prueba HSD de Tukey).cdAnálisis deRGA2Niveles de expresión de ARNm en plantas de banano transgénicas y WT.CAnálisis de
transgén (RGA2-Nos) niveles de expresión utilizando cebadores diseñados para amplificar un fragmento de 96 pb que abarca elRGA2transgén/unión terminadora Nos.dAnálisis de
RGA2niveles de expresión de ARNm transgén y endógeno utilizando cebadores diseñados para amplificar un fragmento de 92 pb tanto delRGA2transgén yRGA2secuencias
endógenas. Todos los valores son niveles de expresión normalizados expresados en relación con la línea RGA2-3. PESO GN; TR4-susceptibleM acuminatassp.malaccensis (Mal-S) y
resistente a TR4M acuminatassp.malaccensis (Mal-R). Se analizó una única réplica biológica con tres réplicas técnicas (norte =3). Los datos son malos.±SEM

Entre cada planta se enterró un pequeño segmento de pseudotallo tomado de plantas de banano
infectadas con TR4 que crecían fuera del sitio de prueba.
Cuando se planta un plátano, el cultivo de la planta, un pseudotallo que comprende los
pecíolos de las hojas, crece desde el cormo basal y el meristemo vegetativo permanece en la
base del pseudotallo. Cuando se inicia la floración, el meristemo es empujado hacia arriba a
través del centro del pseudotallo, el racimo de fruta emerge por la parte superior del
pseudotallo y se desarrolla hasta la madurez. Después de cosechar el racimo, este pseudotallo
inicial muere y otro nuevo pseudotallo, conocido como primer retoño, crece a partir de un
meristemo diferente en el cormo. Este proceso se puede repetir indefinidamente. El ensayo
consistió en el cultivo de plantas y hasta tres cultivos de retoños.
Evaluación de síntomas y tamaño del racimo.Las plantas se evaluaron periódicamente durante
tres ciclos de cultivo (~3 años) para detectar el desarrollo de síntomas externos característicos
de la enfermedad del marchitamiento por Fusarium.1. Se inspeccionó el pseudotallo de las
plantas que presentaban síntomas externos típicos para confirmar la presencia de una
decoloración vascular interna de color marrón rojizo característica asociada con la infección por
Foc. Si una planta muestra los síntomas externos característicos de marchitamiento y/o
coloración amarillenta de sus hojas, casi invariablemente desarrolla una necrosis vascular
severa seguida de la muerte de ese pseudotallo. En algunos casos, el pseudotallo sintomático
moriría pero un pseudotallo aparentemente sano crecería a partir del cormo basal. Se registró
la primera observación de síntomas para cada planta; sin embargo, se permitió que los retoños
de plantas enfermas se desarrollaran naturalmente hasta completar el período de prueba. Al
finalizar el período de prueba, todas las plantas fueron inspeccionadas para detectar síntomas
externos e internos. La presencia de decoloración vascular interna, que es muy característica de
la infección por Foc TR4, se evaluó en todas las plantas restantes cortando el pseudotallo de
todas las plantas a ~0,5 metros sobre el nivel del suelo. Dónde
Se observó decoloración vascular, se tomó una muestra de pseudotallo de ~3 cm × 1 cm
del borde anterior de la decoloración. Cuando no se observó decoloración vascular, se
tomó una muestra similar de un área equivalente. Se recolectaron muestras de
pseudotallo de 118 plantas y se enviaron por transporte aéreo a Wageningen UR, Plant
Sciences Group, Países Bajos, para un diagnóstico confirmatorio de infección por Foc.
Para evitar cualquier sesgo, a todas las plantas del ensayo se les asignó un número de ensayo de
campo único que no contenía información de identificación. Además, la evaluación de los síntomas de la
enfermedad durante el período de prueba de 3 años fue realizada de forma independiente por el
administrador de la finca (MS), que tiene más de 20 años de experiencia en el manejo de una finca
comercial bananera infestada con TR4. Al finalizar el ensayo, dos de los autores (JD y RH) realizaron la
evaluación de los síntomas internos y externos.
En varios momentos durante la prueba, el tamaño de los racimos de frutas maduras en
plantas transgénicas y no transgénicas sanas se evaluó visualmente y se clasificó en tres
categorías: <6, 6–8 u >8 manos por racimo.
Diagnóstico de infección por Foc.Las muestras de pseudotallo se utilizaron para una combinación de
aislamiento de hongos y análisis de diagnóstico molecular mediante PCR.13,14y PCR cuantitativa (kit qPCR:
“Identificación de ADN Foc TR4 mediante PCR en tiempo real, Detecciones claras”, Países Bajos). Para el
aislamiento de ADN de muestras de plantas, se seleccionaron pequeños trozos de tejido de pseudotallo y
posteriormente se liofilizaron en un liofilizador Epsilon 1-4/2–4 LSC plus (Martin Christ) durante 3 días.
Para un subconjunto de 49 muestras que se recolectaron de los materiales mencionados anteriormente,
se esterilizaron de 2 a 4 piezas del mismo tejido con hipoclorito al 1%, se enjuagaron con agua Milli-Q, se
secaron en papel de filtro y se colocaron en medio Komada para detectar hongos. -aislamiento13.
Después de 5 días, se tomaron muestras de las colonias Foc emergentes para análisis por PCR.13, así
como qPCR. Total

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496 |DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications 5

ARTÍCULO COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6

Tabla 1 Tasas acumuladas de enfermedad Foc TR4 a lo largo del ensayo de campo de 3 años

Línea Número de plantas en el Incidencia cronológica de infección por TR4 (porcentaje de plantas sintomáticas)
campo (norte)
Enero Abril Octubre Abril Octubre Abril Octubre Abril
2012 2012 2012 2013 2013 2014 2014 2015
CGTCV 218 dieciséis 0 0 0 31.3 31.3 68,8 68,8 68,8
williams 27 0 0 0 25,9 33.3 51,9 55,6 66,7
DPM25 9 0 0 22.2 77,8 88,9 88,9 100 100
GN 8 0 0 12.5 37,5 50 62,5 75 87,5
RGA2-2 10 0 0 0 0 0 0 0 20*
RGA2-3 8 0 0 0 0 0 0 0 0*
RGA2-4 10 0 0 0 0 0 0 0 20*
RGA2-5 7 0 14.3 14.3 14.3 14.3 14.3 14.3 14,3*
RGA2-6 6 0 0 16.7 50 50 50 50 66,7
RGA2-7 10 0 0 10 20 40 50 60 60
Ced9-10 8 0 0 12.5 25 37,5 37,5 37,5 37,5
Ced9-15 10 0 0 0 10 10 20 20 50
Ced9-17 8 0 0 25 25 25 37,5 50 87,5
Ced9-19 10 0 0 0 10 10 10 10 10**
Ced9-21 9 0 0 0 0 0 0 0 0**
Ced9-22 10 0 0 0 10 10 10 30 30*
Ced9-23 10 0 0 0 10 10 10 10 20
Ced9-26 10 0 0 20 20 20 20 20 20*
Ced9-31 10 0 0 10 10 10 20 20 20
DPM25, mutante enano Parfitt; GCTCV, variantes de cultivo de tejido de Cavendish gigante; GN, Gran Nain; HSD, diferencia significativa honesta; TR4, raza tropical 4. Los datos son porcentaje de réplicas biológicas infectadas en el
momento de la evaluación. *0,01 <pag <0,05, **0,001 <pag <0,01 al final del ensayo (prueba HSD de Tukey).

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
550 560 570 580 590 600 610 620 630 640
Mal-R RGA2 110
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 970
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
980 990 1.000 1.010 1.020 1.030 1.040 1.050 1.060 1.070 1.080
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
1.090 1.100 1,110 1,120 1.130 1.140 1.150 1.160 1.170 1.180
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2
1.190 1.200 1.210 1.220 1.230 1.233
Mal-R RGA2
Alelo GN 1 RGA2
Alelo GN 2 RGA2
Alelo GN 3 RGA2

Figura 4Alineamiento de la secuencia de proteínas de laRGA2secuencia del transgén resistente a TR4M acuminatassp.malaccensis (Mal-R) y los tres consensos RGA2
secuencias homólogas de WT GN. Se destacan las diferencias de aminoácidos.

El ADN de plantas y hongos se extrajo utilizando el kit Sbeadex maxi plant (LGC Genomics). Las
extracciones de ADN de todas las muestras de plantas y hongos se repitieron de forma independiente al
menos dos veces. Las PCR analíticas también se repitieron técnicamente dos veces. qPCR se realizó en un
volumen total de 20µL mezcla de reacción que contiene 10µL de mezcla de PCR ClearDetects, 2µL de
juego de imprimaciones Foc TR4, 3µL de potenciador de PCR, 0,2
µL de tinte de referencia ROX II (Takara), 3µL de plantilla de ADN y agua Milli-Q en un sistema de PCR en
tiempo real 7500 (Applied Biosystems). Las condiciones de ciclo térmico para la amplificación fueron una
activación enzimática inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos, cada uno de los cuales consistió
en 95 °C durante 10 s, 63 °C durante 60 s y 72 °C durante 30 s. Finalmente, para la curva de fusión de PCR
de 0,2 a 0,5 °C, se incluyeron pasos a 72 a 95 °C. la amplificación

6 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496 |DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6
Los resultados se analizaron con el software 7500 Real-Time PCR v 2.3 (Applied
Biosystems).
Análisis de expresión transgénica.Debido a las restricciones de cuarentena, no pudimos
transportar muestras de plantas de banano dentro de Australia para su análisis. Por lo tanto, los
análisis de transcripción se realizaron utilizando muestras tomadas de las plantas madre
originales almacenadas en cultivo de tejidos en QUT, Brisbane, Australia. Plantas de cultivo de
tejidos de tipo salvaje (WT) susceptibles y resistentes a TR4M acuminatassp.malaccensisfueron
utilizados como controles19,20.
El ARN total se extrajo de 200 mg de tejido radicular mediante un protocolo21que se
modificó aumentando la relación tejido:tampón de extracción a 8, incluido un paso de
centrifugación (18.000xgramodurante 5 min) antes de la extracción inicial con disolvente y la
omisión de fenol en todos los pasos de extracción. El ARN (3 μg) se trató con ADNasa utilizando
un kit RQ1 RNase-free DNase (Promega) y las muestras de ARN sin ADN (1,8 μg) se
transcribieron de forma inversa a ADN complementario utilizando un cebador oligo(dT)18 y la
transcripción inversa GoScript. Sistema (Promega) según las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, las muestras de ADNc se diluyeron 1:10 (v/v) o 1:8 (v/v) en agua libre de RNasa
antes de su uso en RT-PCR y qRT-PCR, respectivamente. Para garantizar la eliminación completa
de la posible contaminación de ADNg en nuestras muestras antes de RT-PCR y qPCR, el ARN
total, el ARN tratado con ADNasa y el ADNc se analizaron mediante PCR utilizando ciclofilina (
CIP)cebadores de genes de mantenimiento (Tabla complementaria3).
Las mezclas de reacción para RT-PCR contenían 1 × mezcla maestra GoTaq Green (Promega),
0,25µM de cada cebador (Tabla complementaria3), ADNc diluido (2µL), y agua libre de nucleasas
en un volumen final de 20µL. Las condiciones de ciclo térmico incluyeron un paso de
desnaturalización de 2 minutos a 94 °C seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 20 s, 55–62 °C
(dependiente del cebador) durante 30 s y 72 °C durante 1 min Kbp.-1del tamaño de amplicón
esperado, y una extensión final a 72 °C durante 5 min.
qRT-PCR se realizó en un sistema de detección de PCR en tiempo real táctil CFX384 (Bio-Rad)
utilizando la tecnología SYBR Green I. Por reacciones de 10 μL, se agregaron 2,5 μL de ADNc diluido a 1 ×
GoTaq qPCR Master Mix (Promega) premezclado con cebadores (Tabla complementaria3) a una
concentración final de 0,2 μM. Se utilizó el siguiente programa de amplificación: activación de la
polimerasa Hot-Start a 95 °C durante 2 min, seguida de 45 ciclos de 10 s de desnaturalización a 95 °C y 30
s de hibridación/extensión a 60 °C. Al final de cada ejecución, se produjo una curva de disociación entre 65
y 95 °C para confirmar la especificidad del amplicón de cada conjunto de cebadores. Se utilizó una curva
estándar de ocho diluciones seriadas al doble de ADNc para determinar la eficiencia de qPCR de cada uno
de los conjuntos de cebadores utilizados.22. Todas las reacciones de PCR mostraron un coeficiente de
correlación.R2>0,98 y eficiencias >99% (Fig.2). Todas las muestras se analizaron por triplicado y cada
ejecución incluyó reacciones de control sin plantilla por triplicado para cada uno de los conjuntos de
cebadores utilizados en esa ejecución. Además, se sometieron a electroforesis muestras seleccionadas de
cada ejecución a través de geles de agarosa al 2 % para validar la producción de un único amplicón.
Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el software CFX Manager 3.1 (Bio-
Rad) y el método ΔΔCT.23. Los datos de Ct obtenidos del gen diana de interés se normalizaron
utilizando valores de Ct de los dos genes de referencia estables.CIPy proteína ribosómicaS2
(RPS2),y expresado en relación con los valores de la línea RGA2-3. Todos los cebadores se
diseñaron utilizando el software gratuito Primer3Plus (http://www. bioinformatics.nl/cgi-bin/
primer3plus/primer3plus.cgi).
Análisis de transferencia Southern.Para la determinación de la integración del número de copias
del transgén mediante análisis Southern, se extrajo el ácido nucleico total24de tejido de hoja de
plátano, tratado con ARNasa A, y se digirieron alícuotas de 15 μg de ADN genómico durante la
noche con 20 U de enzima de restricción.HindIII onavidadI (New England Biolabs) durante la
noche a 37 °C. El ADN digerido se sometió a electroforesis a través de geles de agarosa al 0,9%,
se transfirió a una membrana de nailon (Roche) y se entrecruzó con UV. Las sondas específicas
de genes se amplificaron mediante PCR utilizando ADN polimerasa Taq (Sigma-Aldrich) en
mezclas de reacción que contenían los cebadores apropiados (Tabla complementaria3), 2 ng de
plantilla de plásmido y mezcla de etiquetado DIG PCR (Roche). La hibridación de la sonda se
realizó en condiciones estándar.25y la detección se logró utilizando CDP-star (Roche), según las
instrucciones del fabricante. Las películas de rayos X (Fuji) se expusieron durante hasta 1 h
dependiendo de la intensidad de la señal y se revelaron manualmente.
Aislamiento y análisis de homólogos endógenos de Cavendish RGA2.Todo el marco de
lectura abierto del Cavendish endógenoRGA2La secuencia se amplificó a partir del ácido
nucleico total preparado.24a partir de tejido foliar recolectado de plantas WT GN.
Cebadores RGA2geneF (5'-ATGGCTGGTGTCACATCACAGGCAG-3′)y RGA2geneR (5'-
TCAGGTGGTGCTACAGCGACATGG-3′)fueron diseñados en base a laM acuminatassp.
malaccensis RGA2secuencia9. La PCR se llevó a cabo utilizando GoTaq Long Master Mix
(Promega) o Expand Hi-Fidelity Enzyme Mix (Roche). Las mezclas de PCR de GoTaq Long
contenían 20 µl de mezcla maestra GoTaq Long 2×, 10 µmol de cada cebador, 0,5 µl de
extracto de TNA y 17,5 µl de agua. Las condiciones de ciclismo fueron
95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C por 15 s, 50 °C por 15 s, 65 °C por 8 min y una
extensión final a 72 °C por 10 min. La PCR usando Expand se llevó a cabo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, con el ciclado como se indicó anteriormente, excepto la extensión
realizada a 68 °C. Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% y se
visualizaron utilizando una tinción de gel de ADN segura SYBR (Thermo Fisher Scientific). Los
productos de PCR del tamaño esperado se cortaron de los geles y se ligaron en pGemT Easy.
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496 |DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications
ARTÍCULO
(Promega), y el choque térmico transformado en competenteEscherichia coliXL-1 Células azules
(Invitrogen). Se usó selección azul/blanco para identificar supuestas colonias recombinantes,
con seis clones derivados de cada amplificación por PCR seleccionados y cultivados en cultivos
durante la noche. El ADN plasmídico se purificó utilizando el asistente.MásSistema de
purificación de ADN SV Miniprep (Promega) y digerido usandoNoI para identificar clones con
inserciones del tamaño esperado. Luego, los plásmidos se secuenciaron utilizando la mezcla
BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
con lecturas de secuencia generadas en el Centro de Investigación de Genética Molecular de la
Universidad Tecnológica de Queensland. Se utilizaron cebadores específicos para secuenciar
completamente los insertos en ambas direcciones. Las lecturas de secuencia sin procesar se
compilaron en secuencias de longitud completa utilizando el programa ContigExpress del
software VectorNTI Advance V11 (Life Technologies), mientras que las alineaciones de secuencia
se llevaron a cabo utilizando AlignX. Secuencias de consenso de la WT GNRGA2Los homólogos
se compararon con losM acuminataespeciesmalaccensis RGA2secuencia, para determinar el
nivel de similitud de secuencia de nucleótidos y aminoácidos.
Análisis estadístico.Las diferencias en las proporciones totales de plantas infectadas
entre los grupos de tratamiento y control, y entre líneas, se evaluaron utilizando
modelos lineales generalizados de efectos simples y mixtos y los correspondientes
análisis de varianza, suponiendo una respuesta binomial y con la respectiva suma o
resta de 0,5 para 0 o Infecciones totales.
Las comparaciones por pares entre tratamientos y líneas, ajustadas para comparaciones
múltiples, se evaluaron mediante la prueba HSD de Tukey. El ajuste del modelo se evaluó
utilizando una χ2-test de desviación y criterio de información de Akaike (AIC).
La equivalencia de las calificaciones de los racimos de frutas del control, las líneas RGA2 y las
líneas Ced9 como número de manos en el racimo (<6, 6–8 y >8) se evaluó mediante un χ2
-prueba de homogeneidad.
La hipótesis de una relación (lineal) entre la proporción de infecciones y el nivel de
expresión para cada una de las líneas RGA y la línea de control GN se evaluó mediante
correlaciones paramétricas (Pearson) y no paramétricas (Spearman), y las pruebas
asociadas.
La significancia estadística se afirmó al nivel del 5% (pag <0,05). Los análisis se
realizaron en R utilizando funciones estadísticas básicas y los paquetes lme4, lmer y
multcomp.
Disponibilidad de datos.Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este
estudio están disponibles en el artículo y/o en su archivo de información complementaria. Todos los datos
relevantes también están disponibles a través de los autores previa solicitud.
Recibido: 26 de julio de 2017 Aceptado: 5 de octubre de 2017
Referencias
1. Ploetz, RC Manejo del marchitamiento del banano por Fusarium: una revisión con especial
referencia a la raza tropical 4.Cultivo. Prot.73,7-15 (2015).
2. Karangwa, P., Blomme, G., Beed, F., Niyongere, C. y Viljoen, A. La distribución e incidencia
del marchitamiento por Fusarium del banano en los sistemas agrícolas de subsistencia
en África oriental y central.Cultivo. Prot.84,132-140 (2016).
3. Stover, RHMarchitez por fusarial (enfermedad de Panamá) del banano y otras especies de
Musa. (Instituto Micológico de la Commonwealth, 1962).
4. Ploetz, RC El marchitamiento por Fusarium del banano es causado por varios patógenos
denominadosfusarium oxysporumF. sp.cubense. Fitopatología.96,653–656 (2006).
5. García-Bastídas, F. et al. primer informe defusarium oxysporumF. sp.cubense raza tropical
4 asociada con la enfermedad de Panamá del banano fuera del sudeste asiático.
Desinfección de plantas.98,694 (2014).
6. Hwang, SC y Ko, W.-H. Cultivares de banano Cavendish resistentes al marchitamiento por Fusarium
adquiridos mediante variación somaclonal en Taiwán.Desinfección de plantas.88,580–587 (2004).
7. Ploetz, RC, Kema, GHJ y Ma, L.-J. Impacto de las enfermedades en la exportación y la
producción de banano en pequeña escala.Año. Rev. Fitopatol.53,269–288 (2015).
8. Paul, J.-Y. et al. Los genes relacionados con la apoptosis confieren resistencia al marchitamiento
por Fusarium en los plátanos transgénicos 'Lady Finger'.Biotecnología vegetal. J.9,1141–1148
(2011).
9. Peraza-Echeverria, S., Dale, JL, Harding, RM y Collet, C. Clonación molecular yen
siliconaanálisis de potencialfusariumGenes de resistencia en banano.Mol.
Criar.23,431–443 (2009).
10. Ori, N. y col. La familia I2C del locus I2 de resistencia a la enfermedad del marchitamiento pertenece a
la superfamilia repetida de genes de resistencia de plantas rica en leucina y unión de nucleótidos.
Planta. Celúla.9,521–532 (1997).
11. Joobeur, T., King, JJ, Nolin, SJ, Thomas, CE y Dean, RA El locus de resistencia al
marchitamiento por fusariumformulario-2del melón contiene un único gen de resistencia
con características complejas.Planta. J.39,283–297 (2004).
7
ARTÍCULO
12. Smith, MK y cols. Hacia el desarrollo de un banano Cavendish resistente a la raza 4
de marchitez por fusarium: irradiación gamma de Dwarf Parfitt micropropagado
(Musaspp., grupo AAA, subgrupo Cavendish).Agosto. J. Exp. Agr.46,107–113 (2006).
13. Dita, MA, Waalwijk, C., Buddenhagen, IW, Souza, MY Jr & Kema, GHJ Un diagnóstico
molecular para la raza tropical 4 del patógeno del marchitamiento por fusarium del banano.
Patol de plantas.59,48–357 (2010).
14. Leslie, JF y Summerell, BAManual de laboratorio de fusarium. (Wiley-
Blackwell, 2006).
15. Ghag, SB, Shekhawat, UKS y Ganapathi, TR Genes nativos de muerte celular como
candidatos para desarrollar resistencia al marchitamiento en plantas de banano
transgénicas.Plantas AoB6,plu037 (2014).
16. Ghag, SB, Shekhawat, UKS & Ganapathi, TR El silenciamiento génico postranscripcional mediado por
ARN en horquilla inducido por el huésped de genes fúngicos vitales confiere una resistencia eficiente
contra la marchitez por Fusarium en el banano.Biotecnología vegetal. J.
12,541–553 (2014).
17. Peraza-Echeverria, S. Clonación molecular y caracterización de genes potenciales de
resistencia a Fusarium en banano (Musa acuminadassp.malaccensis).Tesis doctoral,
Universidad Tecnológica de Queensland (2007).
18. Khanna, H., Becker, D., Kleidon, J. y Dale, JL Centrifugación asistida Agrobacterium
tumefaciens-transformación mediada (CAAT) de suspensiones de células
embriogénicas de plátano (Musaespecies Cavendish AAA y Lady Finger AAB). Mol.
Criar.14,239–252 (2004).
19. Walduck, G. & Daly, A. Identificación de variedades de banano con resistencia a la raza
tropical 4 del marchitamiento por Fusarium. Informe para Horticulture Australia Limited,
Proyecto No. FR00043 (2007).
20. Peraza-Echeverria, S., Dale, JL, Harding, RM, Smith, MK & Collet, C. Caracterización de
genes candidatos de resistencia a enfermedades del tipo sitio de unión de
nucleótidos (NBS) del plátano y correlación de un polimorfismo transcripcional con
resistencia afusarium oxysporumf.sp.cubensecarrera 4.Mol. Criar.22, 565–579
(2008).
21. Valderrama-Cháirez, ML, Cruz-Hernández, A. & Paredes-López, O. Aislamiento de
ARN funcional de frutos de cactus.Planta Mol. Biol. Reps.20,279–286 (2002).
22. Rasmussen, R. enPCR en tiempo real de ciclo rápido, métodos y aplicaciones (eds.
Meuer, S., Wittwer, C. y Nakagawara, K.) 21–34. (Springer-Verlag, 2001).
23. Schmittgen, TD y Livak, KJ Análisis de datos de PCR en tiempo real mediante el
método comparativoCtmétodo.Nat. Protocolo.3,1101–1108 (2008).
24. James, AP, Geijskes, RJ, Dale, JL y Harding, RM Desarrollo de una nueva técnica de
amplificación de círculo rodante para detectar el virus del rayado del plátano que también
discrimina entre secuencias de virus integradas y episomales.Desinfección de plantas.95,
57–62 (2011).
25. Sambrook, J. y Russell, DWClonación molecular: un manual de laboratorio. (
Laboratorio Cold Spring Harbor, 2001).
8 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA|8: 1496
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6
Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada por una subvención de vinculación del Consejo Australiano de
Investigación con LaManna Group como socio de la industria. Agradecemos a Martin Dickman
(Universidad Texas A&M) por proporcionar el original.Ced9secuencia.
Contribuciones de autor
JD concibió el proyecto y con RH negoció la prueba de campo, la diseñó y evaluó.
AJ participó en la evaluación y el muestreo del ensayo y la caracterización
molecular. JYP participó en la caracterización molecular de las líneas. HK
transformó y regeneró las líneas transgénicas. PW participó en el análisis de los
datos. MS gestionó el juicio. SPE diseñó y generó el casete RGA2. FGB y GK
realizaron el análisis de qPCR y los aislamientos de hongos. KM analizó
estadísticamente los datos. JD, RH, PW, JYP y AJ escribieron el manuscrito con
contribuciones de otros autores.
Información adicional
Información suplementariaacompaña este artículo en doi:10.1038/s41467-017-01670-6.
Conflicto de intereses:Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.
Reimpresiones y permisola información está disponible en línea enhttp://npg.nature.com/
reprintsandpermissions/
Nota del editor:Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas
publicados y afiliaciones institucionales.
Acceso abiertoEste artículo tiene una licencia internacional
Creative Commons Attribution 4.0, que permite usar, compartir,
adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé
el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente, proporcione un enlace a la licencia
Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros
en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se
indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la
licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa
legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los
derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visitehttp://creativecommons.org/
licenses/by/4.0/.
© El autor (es) 2017
|DOI: 10.1038/s41467-017-01670-6|www.nature.com/naturecommunications