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UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADÉMICA


FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Fecha: Diciembre de 2014 Código: GRL-006 Versión: 4.0

INFORMACIÓN BÁSICA

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: SIEMBRAS Y CULTIVOS PUROS PRÁCTICA No. 4

ASIGNATURA: Microbiología ambiental

TEMA DE LA PRÁCTICA: Técnicas de cultivo bacteriano y obtención de cultivos puros.

LABORATORIO A UTILIZAR: Microbiología

CONTENIDO DE LA GUÍA

OBJETIVOS.
 Reconocer técnicas de inoculación bacteriana en diferentes medios de cultivo.
 Identificar las características macroscópicas bacterianas en medios sólidos.
 Realizar aislamientos bacterianos hasta obtener cultivos axénicos.

INTRODUCCIÓN.
Uno de los procedimientos más utilizados para obtener microorganismos, lograr estudiarlos y caracterizarlos
es el aislamiento en medios de cultivo. Al conjunto de nutrientes se les llama medio de cultivo y a los
microorganismos que allí crecen cultivo. Los microorganismos necesitan de cierta cantidad de agua para
poder crecer, por esta razón son cultivados en medios compuestos por una solución acuosa que tiene
disponible los nutrientes necesarios. Dentro de estos nutrientes se precisan ingredientes que permitan la
división de las células como: una fuente de energía orgánica e inorgánica, luz, fuente de carbono, fuente de
nitrógeno y las condiciones del micro ambiente que permitan que los microorganismos crezcan y puedan ser
estudiados. Para caracterizar un microorganismo es muy importante la obtención de un cultivo puro o
axénico el cual consiste en aislar un único tipo de microorganismo sobre un medio de cultivo.

MARCO TEORICO
Para la obtención de un cultivo puro se debe evitar la entrada de otros microorganismos llamados
contaminantes. Una vez aislado un microorganismo se puede estudiar su bioquímica, fisiología y genética.
Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo. Este microorganismo proviene de
una sola célula que se ha dividido varias veces por fisión binaria aumentando de tal manera su masa celular
que llega a ser visible al ojo humano, a lo que se le conoce como colonia. Cada una de las colonias
bacterianas observadas pertenecen a la misma bacteria, es decir, inicialmente una célula que llegó al medio
de cultivo se dividió por fisión binaria hasta obtener dos células hijas, luego estas dos hicieron lo mismo hasta
que cada una tuvo otras dos células hijas idénticas a la madre, o clones, y así sucesivamente de tal manera
que se fueron agregando hasta formar la colonia. Como las colonias se originan a partir de un primera célula
que empezó a dividirse, lo más correcto no es hablar de células o masas en los medio de cultivo sino de
Unidades Formadoras de Colonia o UFC (Ver figura1). Como el mecanismo de división bacteriano es la
fisión binaria, es posible afirmar que en una UFC todas las células bacterianas son idénticas y por lo tanto se
pueden aislar para obtener cultivos puros a partir de cada una de ellas.
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Los requerimientos nutricionales varían dependiendo el medio de


cultivo. A la fecha existen más de 100.000 tipos de medio de
cultivo, utilizados dependiendo del grupo de microorganismos que
se quiera obtener. En cuanto a las condiciones del micro ambiente
en el que se encuentran los microorganismos, se debe tener en
cuenta la temperatura, la disponibilidad de agua, presión, cantidad
de oxígeno y pH. Los medios de cultivo pueden ser clasificados
según su estado en líquidos, semisólidos o sólidos en cuyo caso se
adiciona un gel que comúnmente es el agar. Los medios líquidos
son utilizados en tubos de ensayo y los medios solidificados en
Figura 1. Colonias de E. coli en medio cromocult.
Fuente: la Revista Cubana de Medicina General
cajas con tapa llamadas cajas de petri. Estos últimos permiten
obtener masas visibles de microorganismos llamadas colonias.

CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos: Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que
suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para
Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de
levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero
sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento: Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para
favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).
Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un
microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es
selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando
maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia
hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido
y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los
microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento.
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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO COMERCIALES


Los medios de cultivo comerciales, son productos deshidratados, que han sido formulados y probados según
los requerimientos nutricionales de uno o un grupo de microorganismos; generalmente se adquieren en
frascos de plástico, y se preparan según las indicaciones de la casa comercial (figura 2).

Figura 2. Medios de cultivo comerciales. Fuente: Normax. http://www.normax.pt/EN/produto/4

la preparación del medio de cultivo dependerá de las cantidades que se requieran; por ejemplo, si necesita
preparar 100 tubos de agua Peptonada, con 9 ml cada tubo; en total deberá preparar 900ml; si la casa
comercial indica que:

Se deben pesar 20 gramos del polvo y disolverlos en 1000


ml de agua destilada (figura 3); por lo tanto, para el ejercicio
anterior se requiere pesar 18 gramos del polvo y disolverlos
en 900 mL de agua.
Después que la solución se encuentre homogénea, se
distribuyen 9 ml del líquido en cada tubo y se procede a
realizar la esterilización.
Para mayor información, puede consultar el siguiente video:
https://www.youtube.com/watch?v=8x-MisZxD3M
Figura 3. Indicaciones para la preparación de agua Peptonada
Fuente: Foto tomada por docentes de microbiología

En el caso que se requieran preparar medios de cultivos en cajas de Petri, el volumen que se requiera
preparar, dependerá de la cantidad y el tamaño de éstas.Por ejemplo, si desea preparar medio de cultivo,
para 70 cajas de Petri estándar (el volumen que se requiere para cada caja de este tamaño son 25 mL). Por lo
tanto en total se deberán preparar 1750 mL.
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En el caso del agar nutritivo (figura 4), la casa comercial


recomienda suspender 28 gramos del polvo en un litro
de agua destilada, por lo tanto, se disolverán 49 gramos
del polvo en 1750 mL de agua destilada.
Puede consultar sobre la preparación de estos medios
en el siguiente enlace:
https://www.youtube.com/watch?v=cneascR3OEc

Figura 4. Indicaciones para la preparación del agar nutritivo


Fuente: Foto tomada por docentes de microbiología

Algunas bacterias presentan desplazamiento sobre los medios de cultivo sólidos, hasta el momento se han
clasificado en cinco tipos:

1. Swarming: este movimiento se traduce como enjambre o bullir, ya que las bacterias que presentan
esta motilidad forman películas que no permiten el crecimiento de otros organismos; es
característico de proteus sp; Serratia sp; Vibrio parahaemolyticus, Clostridium tetani, entre otros;
para que ocurra este tipo de movimiento, es indispensable que el cultivo provenga de un medio
líquido, como por ejemplo, una muestra de orina.
2. Swimming: hace referencia a bacterias que “nadan” ya que es movimiento que ocurre en medios
semisólidos o sobre las películas de agua que contienen los medios sólidos.
3. Twiching: Hace referencia a un desplazamiento intermitente y desorganizado de algunos bacilos, lo
que permite visualizar las colonias con forma similar a la de un abanico. Este fenómeno es
independiente de la acción flagelar ya que se ha reportado en bacterias flageladas y no flageladas,
por lo que se ha asociado con la presencia de fimbrias polares largas con una distribución peritrica. El
fenómeno se ha descrito en Pseudomonas spp., Neisseria gonorrhoeae, N. Meningitidis, entre otras.
4. Gliding: o bacterias que presentan un movimiento deslizante como el caso de Myxococcus sp.
Flavobacterium johnsoniae, y Mycoplasma mobile. Otras bacterias excretan un polisacárido sobre el
cual se deslizan.
5. Sliding: Este movimiento es producto de la fuerza expansiva que consiste en una reducción de la
fricción que sufren las bacterias que están en el borde de la colonia, ocasionando que resbalen hacia
el exterior de la colonia, éste movimiento se presenta en algunas cepas de Acinetobacter Morarella y
Corynebacterium sp, y actualmente se ha demostrado en Salmonella enterica serotipo
Typhimuriu.

*El termino Darting se usó en las primeras clasificaciones de motilidad, actualmente no es usado para
describir la motilidad bacteriana. Para mayor información sobre los flagelos y las formas de motilidad; puede
consultar el siguiente video: https://www.youtube.com/watch?v=dtDSqZr3QCY
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CONSULTA PREVIA
Realice a mano un Sketchnote del capítulo 2 del libro solar safe wáter de Apella. C; Araujo, P. Microbiología
del Agua. Conceptos básicos. Disponible en:
http://horus.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/02_Capitulo_02.pdf

METODOLOGIA
Esta práctica de laboratorio se realizara en grupos de 4 estudiantes. Cada estudiante sembrara el
microorganismo asignado en cada uno de los medio de cultivo entregados por el docente.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR

Materiales y Equipos Reactivos Materiales Estudiante*


Cajas de petri con agar nutritivo Colorantes de Gram Gafas de seguridad
estéril y Tubos con medio TSI
estéril
Caldo nutritivo. Aceite de inmersión Gorro
120 ml de Agar nutritivo fundido Alcohol diluido Guantes
Cajas de petri vacías estériles Tapabocas
Asas curvas y rectas Bata blanca manga larga
Cepas de Staphylococcus, Marcador de tinta permanente
Pseudomonas sp., E. coli,
Salmonella sp.
Cultivo líquido para siembra en Cinta de enmascarar y Fósforos o
profundidad. encendedor

*El estudiante debe traer todos los elementos mencionados en la guía, de lo contrario no podrá entrar al
laboratorio.

PRECAUCIONES - MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS - CONSULTA DE EQUIPO ESPECIALIZADO.

 Manejar adecuadamente las muestras biológicas teniendo en cuenta las normas de


Bioseguridad aprendidas en la primera sesión de clase.
 Manipular las cepas microbianas en un espacio de 20 cm alrededor de la llama del mechero
 Esterilizar adecuadamente las asas antes y después de manipular los microorganismos.
 Limpiar el microscopio con isopropanol y papel de arroz antes y después de su uso.
 Entregue el microscopio con la platina abajo, enfocado en 4 X y con la graduación de la lámpara en 0.
 Deposite láminas y laminillas en el guardián.
 Limpie y desinfecte su puesto de trabajo al finalizar la práctica
 Lavar las manos al terminar la práctica de laboratorio.
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PROCEDIMIENTO A UTILIZAR

1. Tome el cultivo bacteriano suministrado por el docente y realice una descripción de las
colonias que observa con base en la figura Nº 2:

Figura 2. Descripción macroscópica de las colonias Fuente: Lagunas, S; Vega, L. Manual de prácticas de laboratorio de
bacteriología y micología, 2013. En Stanchi N. O., et al 2007.

2. Siembra en medio liquido:


 Tome un asa curva y esterilícela con el mechero, hasta que se torne naranja.
 Una vez estéril el asa déjela enfriar al lado del mechero y destape el cultivo bacteriano.
 Con el asa tome una colonia y transfiera el inóculo al caldo nutritivo; agitando muy bien el asa en el
interior del tubo para soltar la muestra completa. (Ver Figura 3)

Figura 3. Siembra en medio líquido


Diseño: Adaptado imágenes prediseñadas Office - UMB
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3. Siembra en medio semisólido:


 Esterilice un asa recta y tome el inóculo del cultivo.
 Tome el medio TSI y realice una punción con el asa en el fondo del tubo
 Suba el asa hasta la superficie y realice un zigzag.
 Lleve a incubar a 37°C por 24h. (Ver figura 4)

Figura 4. Siembra en medio semisólido


Diseño: Adaptado imágenes prediseñadas Office - UMB

4. Siembra por aislamiento en medio sólido:


 Recuerde que hay diversas formas de aislamiento de bacterias y levaduras en medio sólido, las cuales
puede visualizar en la figura número 5.
 Para realizar este procedimiento usted deberá escoger una colonia aislada del medio suministrado y con
un asa estéril, tómela y siémbrela por agotamiento en una caja de petri con medio nutritivo estéril (Ver
Figura 6).
 Incubar a 37ºC durante 24h en posición invertida. Para mayor información; puede consultar el siguiente
video: https://www.youtube.com/watch?v=0QVeqeEsfYA

Figura 5. Diferentes formas de aislamiento por agotamiento en medio sólido


Fuente: My scientific blog.Microbial pure culture. 2010 disponible en: http://upendrats.blogspot.com.co/2010/02/microbial-pure-culture.html
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Figura 6. Esquema de una siembra por aislamiento


Diseño: Adaptado imágenes prediseñadas Office - UMB

5.Siembra en profundidad en medio sólido:


 Coloque una caja de petri estéril y vacía cerca al mechero.
 Coloque 1 ml de un cultivo líquido suministrado por el docente.
 Adicione el medio de cultivo, agar nutritivo, previamente fundido a una temperatura aproximada de 45ºC
(figura 7).
 Suavemente mezcle por rotación el medio con la muestra para que los microorganismos se distribuyan
homogéneamente.
 Deje solidificar el agar.
 Lleve a incubar la caja por 24h a 37°C en posición invertida.

Figura 7. Procedimiento para siembra en profindidad


Fuente: http://intranet.tdmu.edu.ua. Theme 6. Main methods, principles and steps of isolating of bacteria’s pure cultures.
En Brock. Biology of microorganisms, 11.ed.:
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BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.

 TORTORA Gerard J, Funke Berdell y Case Christine. 2007. Introducción a la microbiología. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=9500607409

 MONTOYA Hugo H. 2008. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=9587140907

 DIAZ Ramón, Gamazo Carlos, López Ignacio. 2005. Manual práctico de microbiología. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=8445815199

 MADIGAN, M. (2004). Biología de los Microorganismos: Brock 10a. ed. Madrid: Pearson Educación.

 BETSY, Tom; Keogh, Jim. (2005). Microbial Growth and Controlling Microbial Growth. Microbiology
Demystified. Estados Unidos de América. McGraw-Hill Companies.

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

Firma: Firma: Firma:

Nombre: Equipo docentes Nombre: Mic. Andrea Cortés B. Nombre: Ing. Claudia Fernandez
laboratorio de microbiología

Fecha: Enero 2016 Fecha: Enero 2016 Fecha: Enero 2016


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INFORME DE LABORATORIO

ESTUDIANTES: GRUPO:





NOTA:

CARRERA:

Formule tres objetivos que desee cumplir con la Práctica de Laboratorio




Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Práctica de Laboratorio.


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RESULTADOS

1. Descripción macroscópica del cultivo inicial dado por el docente (remítase a la figura 2) :
_________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

2. Medio líquido:

Hubo crecimiento bacteriano: SI___ NO___


¿Por qué el medio de cultivo está turbio?
________________________________________________________________________________

Esta puro el cultivo: SI___ NO___


¿Cómo puede determinarlo?
________________________________________________________________________________

3. Medio Semisólido:

Hubo crecimiento bacteriano: SI___ NO___


¿El medio cambio de color? SI___ NO___.

¿Qué color(es) observa?


________________________________________________________________________________

¿Por qué?
________________________________________________________________________________

¿Hay presencia de bacterias anaerobias? SI___ NO___.


¿Por qué?
________________________________________________________________________________

¿Observa presencia de CO2? SI___ NO___

4. Aislamiento en Medio sólido:

Hubo crecimiento bacteriano: SI___ NO___


Hay colonias aisladas: SI___ NO___

Cuantas morfologías bacterianas observa macroscópicamente: _____


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Describa las características macroscópicas de las colonias que observa (remítase a la figura 2)
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________

¿Las colonias que crecieron corresponden a la morfología característica de los microorganismos que usted
sembró?
________________________________________________________________________________

5. Siembra por profundidad en Medio sólido:

Hubo crecimiento bacteriano: SI___ NO___

Hay colonias aisladas: SI___ NO___

Cuantas morfologías bacterianas observa:_____

Número aproximado de UFC de aerobios mesófilos:_____

Número aproximado de UFC de anaerobios:_____

CUESTIONARIO

1. Describa las características macroscópicas de las colonias:

a) Staphylococcus aureus en agar Baird parker.

_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________

Fuente. Eo Labs. Disponible en: http://www.eolabs.com/baird-parker-agar.html


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b) Bacillus sp en agar Triptona Glucosa Extracto de levadura

_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________

Fuente: Adaptado de: Calvo, P: Ziñiga D. Caracterización fisiológica de cepas de Bacillus spp. Aisladas de la rizósfera de papa
(Solanum tuberosum). Ecología Aplicada, 2010: 9(1):31:39.

c) Streptococcus pneumoniae

_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________

Fuente: Adaptado de: Facklam, R; Streptococcus pneumoniae bacteria. 2010. Disponible en:
http://www.historyofvaccines.org/content/streptococcus-pneumoniae-bacteria

2. Marque con una x según corresponda y sustente su respuesta

I. Según su estado Físico (consistencia) el agar EMB es:


a) Medio líquido
b) Medio sólido
c) Medio semisólido
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
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II. El caldo brilla se puede clasificar como medio de cultivo:


a) Enriquecido
b) Diferencial
c) Selectivo
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________

III. El agar sangre se puede clasificar como medio de cultivo:


a) Enriquecido y selectivo
b) Selectivo y diferencial
c) Enriquecido y diferencial
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________

3. Usted necesita realizar un pase de E. coli de agar nutritivo a un medio de cultivo selectivo y diferencial
a) ¿Qué medio de cultivo usaría? Justifique su respuesta.
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

b) ¿Cuáles son los componente de dicho medio de cultivo que lo hacen selectivo y diferencial?
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

4. Usted debe preparar 57 tubos con agar urea. Para preparar agar urea la casa comercial recomienda
suspender 2,4 gramos del agar base en 95 ml de agua destilada, llevar a ebullición hasta disolver
completamente y esterilizar por autoclave. Posteriormente dejar enfriar a 50°C y añadir 5 ml de una
solución de urea al 40%. Mezclar y distribuir 10 ml del medio de cultivo en tubos de ensayo.

a) ¿Cuantos ml de la solución de urea al 40% debe preparar?


________________________________________________________________________

b) ¿Cuánto debe pesar del agar base urea?


____________________________________________________________________

c) ¿En cuántos mililitros de agua destilada debe disolver la base urea? ¿Por qué?
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
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5. Realice los cálculos para preparar 50 cajas de petri (tamaño estándar) para el medio de cultivo empleado
en el aislamiento de microorganismos degradadores de Celulosa. Entregue los cálculos anexos a la guía
especificando el total de medio a preparar. Tenga en cuenta la siguiente información para el cálculo de
cada componente.
COMPONENTES mL o g/L
Na2HPO4 0.1 g
K2HPO4 001 g
CaCl2 0.5 g
Peptona 2.5 g
Extacto de levadura 2.5g
Celulosa en polvo 10 g
Agar 15 g
Agua 1000 mL
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CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS:

CONCLUSIONES

APLICACIÓN PROFESIONAL DE LA PRÁCTICA REALIZADA

BIBLIOGRAFIA UTILIZADA

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