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Guia Nº04 Siembras y Cultivos Puros - Microbiologia Ambiental 2016 - I
Guia Nº04 Siembras y Cultivos Puros - Microbiologia Ambiental 2016 - I
INFORMACIÓN BÁSICA
CONTENIDO DE LA GUÍA
OBJETIVOS.
Reconocer técnicas de inoculación bacteriana en diferentes medios de cultivo.
Identificar las características macroscópicas bacterianas en medios sólidos.
Realizar aislamientos bacterianos hasta obtener cultivos axénicos.
INTRODUCCIÓN.
Uno de los procedimientos más utilizados para obtener microorganismos, lograr estudiarlos y caracterizarlos
es el aislamiento en medios de cultivo. Al conjunto de nutrientes se les llama medio de cultivo y a los
microorganismos que allí crecen cultivo. Los microorganismos necesitan de cierta cantidad de agua para
poder crecer, por esta razón son cultivados en medios compuestos por una solución acuosa que tiene
disponible los nutrientes necesarios. Dentro de estos nutrientes se precisan ingredientes que permitan la
división de las células como: una fuente de energía orgánica e inorgánica, luz, fuente de carbono, fuente de
nitrógeno y las condiciones del micro ambiente que permitan que los microorganismos crezcan y puedan ser
estudiados. Para caracterizar un microorganismo es muy importante la obtención de un cultivo puro o
axénico el cual consiste en aislar un único tipo de microorganismo sobre un medio de cultivo.
MARCO TEORICO
Para la obtención de un cultivo puro se debe evitar la entrada de otros microorganismos llamados
contaminantes. Una vez aislado un microorganismo se puede estudiar su bioquímica, fisiología y genética.
Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo. Este microorganismo proviene de
una sola célula que se ha dividido varias veces por fisión binaria aumentando de tal manera su masa celular
que llega a ser visible al ojo humano, a lo que se le conoce como colonia. Cada una de las colonias
bacterianas observadas pertenecen a la misma bacteria, es decir, inicialmente una célula que llegó al medio
de cultivo se dividió por fisión binaria hasta obtener dos células hijas, luego estas dos hicieron lo mismo hasta
que cada una tuvo otras dos células hijas idénticas a la madre, o clones, y así sucesivamente de tal manera
que se fueron agregando hasta formar la colonia. Como las colonias se originan a partir de un primera célula
que empezó a dividirse, lo más correcto no es hablar de células o masas en los medio de cultivo sino de
Unidades Formadoras de Colonia o UFC (Ver figura1). Como el mecanismo de división bacteriano es la
fisión binaria, es posible afirmar que en una UFC todas las células bacterianas son idénticas y por lo tanto se
pueden aislar para obtener cultivos puros a partir de cada una de ellas.
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MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADÉMICA
FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Fecha: Diciembre de 2014 Código: GRL-006 Versión: 4.0
A.- Medios sintéticos o químicamente definidos: Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que
suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para
Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B.- Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de
levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero
sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento: Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para
favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).
Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D.- Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un
microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es
selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando
maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia
hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido
y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los
microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento.
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la preparación del medio de cultivo dependerá de las cantidades que se requieran; por ejemplo, si necesita
preparar 100 tubos de agua Peptonada, con 9 ml cada tubo; en total deberá preparar 900ml; si la casa
comercial indica que:
En el caso que se requieran preparar medios de cultivos en cajas de Petri, el volumen que se requiera
preparar, dependerá de la cantidad y el tamaño de éstas.Por ejemplo, si desea preparar medio de cultivo,
para 70 cajas de Petri estándar (el volumen que se requiere para cada caja de este tamaño son 25 mL). Por lo
tanto en total se deberán preparar 1750 mL.
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Algunas bacterias presentan desplazamiento sobre los medios de cultivo sólidos, hasta el momento se han
clasificado en cinco tipos:
1. Swarming: este movimiento se traduce como enjambre o bullir, ya que las bacterias que presentan
esta motilidad forman películas que no permiten el crecimiento de otros organismos; es
característico de proteus sp; Serratia sp; Vibrio parahaemolyticus, Clostridium tetani, entre otros;
para que ocurra este tipo de movimiento, es indispensable que el cultivo provenga de un medio
líquido, como por ejemplo, una muestra de orina.
2. Swimming: hace referencia a bacterias que “nadan” ya que es movimiento que ocurre en medios
semisólidos o sobre las películas de agua que contienen los medios sólidos.
3. Twiching: Hace referencia a un desplazamiento intermitente y desorganizado de algunos bacilos, lo
que permite visualizar las colonias con forma similar a la de un abanico. Este fenómeno es
independiente de la acción flagelar ya que se ha reportado en bacterias flageladas y no flageladas,
por lo que se ha asociado con la presencia de fimbrias polares largas con una distribución peritrica. El
fenómeno se ha descrito en Pseudomonas spp., Neisseria gonorrhoeae, N. Meningitidis, entre otras.
4. Gliding: o bacterias que presentan un movimiento deslizante como el caso de Myxococcus sp.
Flavobacterium johnsoniae, y Mycoplasma mobile. Otras bacterias excretan un polisacárido sobre el
cual se deslizan.
5. Sliding: Este movimiento es producto de la fuerza expansiva que consiste en una reducción de la
fricción que sufren las bacterias que están en el borde de la colonia, ocasionando que resbalen hacia
el exterior de la colonia, éste movimiento se presenta en algunas cepas de Acinetobacter Morarella y
Corynebacterium sp, y actualmente se ha demostrado en Salmonella enterica serotipo
Typhimuriu.
*El termino Darting se usó en las primeras clasificaciones de motilidad, actualmente no es usado para
describir la motilidad bacteriana. Para mayor información sobre los flagelos y las formas de motilidad; puede
consultar el siguiente video: https://www.youtube.com/watch?v=dtDSqZr3QCY
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CONSULTA PREVIA
Realice a mano un Sketchnote del capítulo 2 del libro solar safe wáter de Apella. C; Araujo, P. Microbiología
del Agua. Conceptos básicos. Disponible en:
http://horus.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/02_Capitulo_02.pdf
METODOLOGIA
Esta práctica de laboratorio se realizara en grupos de 4 estudiantes. Cada estudiante sembrara el
microorganismo asignado en cada uno de los medio de cultivo entregados por el docente.
*El estudiante debe traer todos los elementos mencionados en la guía, de lo contrario no podrá entrar al
laboratorio.
PROCEDIMIENTO A UTILIZAR
1. Tome el cultivo bacteriano suministrado por el docente y realice una descripción de las
colonias que observa con base en la figura Nº 2:
Figura 2. Descripción macroscópica de las colonias Fuente: Lagunas, S; Vega, L. Manual de prácticas de laboratorio de
bacteriología y micología, 2013. En Stanchi N. O., et al 2007.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.
TORTORA Gerard J, Funke Berdell y Case Christine. 2007. Introducción a la microbiología. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=9500607409
MONTOYA Hugo H. 2008. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=9587140907
DIAZ Ramón, Gamazo Carlos, López Ignacio. 2005. Manual práctico de microbiología. Recuperado de:
http://books.google.com.co/books?isbn=8445815199
MADIGAN, M. (2004). Biología de los Microorganismos: Brock 10a. ed. Madrid: Pearson Educación.
BETSY, Tom; Keogh, Jim. (2005). Microbial Growth and Controlling Microbial Growth. Microbiology
Demystified. Estados Unidos de América. McGraw-Hill Companies.
Nombre: Equipo docentes Nombre: Mic. Andrea Cortés B. Nombre: Ing. Claudia Fernandez
laboratorio de microbiología
INFORME DE LABORATORIO
ESTUDIANTES: GRUPO:
NOTA:
CARRERA:
RESULTADOS
1. Descripción macroscópica del cultivo inicial dado por el docente (remítase a la figura 2) :
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2. Medio líquido:
3. Medio Semisólido:
¿Por qué?
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Describa las características macroscópicas de las colonias que observa (remítase a la figura 2)
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¿Las colonias que crecieron corresponden a la morfología característica de los microorganismos que usted
sembró?
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CUESTIONARIO
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Fuente: Adaptado de: Calvo, P: Ziñiga D. Caracterización fisiológica de cepas de Bacillus spp. Aisladas de la rizósfera de papa
(Solanum tuberosum). Ecología Aplicada, 2010: 9(1):31:39.
c) Streptococcus pneumoniae
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Fuente: Adaptado de: Facklam, R; Streptococcus pneumoniae bacteria. 2010. Disponible en:
http://www.historyofvaccines.org/content/streptococcus-pneumoniae-bacteria
3. Usted necesita realizar un pase de E. coli de agar nutritivo a un medio de cultivo selectivo y diferencial
a) ¿Qué medio de cultivo usaría? Justifique su respuesta.
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b) ¿Cuáles son los componente de dicho medio de cultivo que lo hacen selectivo y diferencial?
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4. Usted debe preparar 57 tubos con agar urea. Para preparar agar urea la casa comercial recomienda
suspender 2,4 gramos del agar base en 95 ml de agua destilada, llevar a ebullición hasta disolver
completamente y esterilizar por autoclave. Posteriormente dejar enfriar a 50°C y añadir 5 ml de una
solución de urea al 40%. Mezclar y distribuir 10 ml del medio de cultivo en tubos de ensayo.
c) ¿En cuántos mililitros de agua destilada debe disolver la base urea? ¿Por qué?
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5. Realice los cálculos para preparar 50 cajas de petri (tamaño estándar) para el medio de cultivo empleado
en el aislamiento de microorganismos degradadores de Celulosa. Entregue los cálculos anexos a la guía
especificando el total de medio a preparar. Tenga en cuenta la siguiente información para el cálculo de
cada componente.
COMPONENTES mL o g/L
Na2HPO4 0.1 g
K2HPO4 001 g
CaCl2 0.5 g
Peptona 2.5 g
Extacto de levadura 2.5g
Celulosa en polvo 10 g
Agar 15 g
Agua 1000 mL
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CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA UTILIZADA