BIOSENSORES AL SERVICIO DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Mònica Campàs, Mònica Mir, Ciara O’Sullivan, Ioanis Katakis

DINAMIC Centre d’Innovació Tecnològica
de la Xarxa d’Innovació Tecnològica, CIDEM
Universitat Rovira i Virgili, Escola Tècnica Superior d’Enginyeria
Av. Països Catalans 18, 43007 Tarragona,
tel.: 977559655, e-mail: ikatakis@etse.urv.es

Resumen
Los biosensores son herramientas analíticas que consisten de un transductor
(electroquímico u óptico) íntimamente unido a una biomolécula que dota a la
herramienta con la capacidad de reconocimiento. Los biosensores están
particularmente adaptados al control de calidad y al control del proceso tanto
en agricultura como en la industria alimentaria, donde especificidad de análisis
es fundamental en mezclas complejas pero las condiciones de medida son
ambientales. Los sensores de afinidad se pueden adaptar para el análisis
microbiológico, los sensores de ADN para la detección e identificación de
patógenos y los sensores de detección de sustancias alergénicas se pueden
incorporar a sistemas de medición y control en línea. Otras aplicaciones
incluyen el control de todo tipo de fermentaciones o del proceso de
pasteurización con la medición de varios tipos de azúcares, el desarrollo de
sistemas integrados para el tratamiento de aguas residuales de todo tipo y la
detección de pesticidas y otros residuos tóxicos. Algunas de las aplicaciones
de futuro que se basan en biosensores son los envases inteligentes y los
sistemas de control integral de cultivos por ordenador. En esta comunicación se
describen éstas y otras aplicaciones que desarrolladas en el centro DINAMIC.

Introducción
En general, un biosensor está compuesto por un elemento de
bioreconocimiento y un transductor. El elemento de bioreconocimiento participa
en una reacción específica con el analito y produce un producto que
directamente o después de una cierta manipulación se puede detectar por el
transductor. La señal obtenida es proporcional a la concentración del analito y
debido a la especificidad de la biomolécula, la detección se puede hacer
directamente en muestras complejas, sin previo tratamiento, como las que se
encuentran en la industria agroalimentaria.

De los varios tipos de biosensores, los más convenientes son los

electroquímicos porque producen una señal cuantitativa en forma de electrones
que se puede usar para el control directo de procesos. Los biosensores ópticos
por otra parte, producen señales semi-cuantitativas y es necesaria una
transformación de la señal antes de su uso en sistemas de control.

Según el tipo de biomolécula utilizada, los biosensores se dividen en sensores

de afinidad (si la reacción de bioreconocimiento es de afinidad entre un
anticuerpo o una secuencia de ADN) y catalíticos (si se usa una o más enzimas
para la reacción específica con el analito).
Cualquiera que sea el tipo del biosensor, los problemas más frecuentes para su
uso son la estabilidad, que incluye la estabilidad de la biomolécula tanto en
funcionamiento como en almacenaje, la fiabilidad, que incluye las interferencias
de la muestra con el sistema de transducción y la capacidad de producir
biosensores a escala industrial.

En esta comunicación se revisan nuestros esfuerzos para inventar esquemas

de biosensores para la detección de manera fiable de analitos relacionados con
la industria alimentaria y para resolver los problemas más comunes con el uso
de biosensores.

Biosensores de afinidad
En los biosensores de afinidad se usan principalmente anticuerpos y cadenas
de oligonucleótidos como elementos de bioreconocimiento. Dichos sensores se
pueden aplicar para la detección de material genético de microorganismos, la
presencia de patógenos, o de pesticidas y de cualquier tipo de sustancias que
pueden causar una respuesta inmune (y por consiguiente, permitir el desarrollo
de anticuerpos). En general, en estos casos es importante conseguir la
multidetección (i.e. la posibilidad de analizar la presencia de varios analitos en
el mismo sensor). Los arrays son plataformas multi-sensóricas en las que se
han inmovilizado elementos de bioreconocimiento específicos para distintos
analitos y que permiten su detección simultánea, rápida y selectivamente. La
detección mediante chips permite reducir el tiempo y los costes de laboratorio
y, además, una vez miniaturizados, se puede reducir el volumen de muestra y
utilizar in situ. Los microarrays se pueden aplicar tanto a análisis genómicos
como proteómicos. Mientras que los microarrays genómicos están basados en
la inmovilización de ADN, en los proteómicos se inmovilizan proteínas,
normalmente anticuerpos, u otras moléculas como ligandos o drogas. Dichos
microarrays permiten la multi-detección de microorganismos, patógenos,
agentes biológicos tóxicos en suelos, agua y alimentos. La Figura 1 muestra un
array de 9 electrodos (matriz de 3 x 3).

Figura 1. Representación esquemática de un

array para la multi-detección de analitos.

En cada uno de los electrodos se ha inmovilizado un anticuerpo distinto y, por

lo tanto, después de la adición de un analito o mezcla de analitos, cada uno de
ellos responde de distinta manera (distinta coloración en el dibujo superior). El
dibujo inferior muestra la amplificación de uno de estos electrodos, con el
anticuerpo inmovilizado y la interacción de afinidad con el analito modificado
con el marcaje, el cual dará una respuesta proporcional a la concentración de
dicho analito.

Fabricación de arrays de ADN

Nuestro grupo está desarrollando un nuevo método para la fabricación de
arrays de ADN. Este método, aunque aplicado en este caso a ADN, es
genérico y puede aplicarse a otros arrays de afinidad. Uno de los requisitos
más importantes a la hora de fabricar un array es el método de inmovilización
de los distintos elementos de bioreconocimiento y la resolución de dicha
inmovilización. Nuestra tecnología está descrita en la Figura 2. Dicha
tecnología se basa en la conjugación de oligonucleótidos de secuencia
determinada a nanopartículas de oro coloidal consiguiendo los denominados
“nanomódulos de bioreconocimiento”. A continuación, dichos nanomódulos son
depositados selectivamente, mediante la aplicación de potencial, en arrays de
electrodos con resolución fotolitográfica. De esta manera, se obtienen arrays
con varios oligonucleótidos inmovilizados, cada uno con distinta secuencia de
bases. Puesto que la tecnología es genérica, mediante la conjugación de otros
elementos de bioreconocimiento con a las nanopartículas de oro coloidal, por
ejemplo anticuerpos específicos para distintos compuestos tóxicos o
microorganismos que pueden estar presentes en bebidas o alimentos, se
pueden obtener arrays para distintas aplicaciones.

conjugación

oligonucleótido
oro coloidal

deposición
oro coloidal -
oligonucleótido
deposición selectiva

Figura 2. Estrategia para la fabricación de arrays de ADN.

Nuestro trabajo en el laboratorio ha permitido la síntesis de los nanomódulos

de bioreconocimiento y su caracterización. Además, se ha demostrado la
funcionalidad de dichos conjugados, es decir, su capacidad de hibridar con los
oligonucleótidos de secuencia complementaria, y su resistencia a temperaturas
necesarias para la hibridación. También se ha demostrado la deposición
dirigida y selectiva en arrays de electrodos. En la Figura 3 se ha representado
el resultado de la deposición selectiva en dos electrodos, la posterior
hibridación con una secuencia complementaria en un electrodo y una
secuencia con 4 mutaciones en el otro, y la medida electroquímica. Como
puede observarse, el array permite la detección de oligonucleótidos y la
discriminación entre ellos, cuando la secuencia contiene 4 mutaciones.
 20 complementaria
4 mutaciones

I (nA) 15

10

Figura 3. Respuesta electroquímica obtenida después de la

hibridación de los nanomódulos de bioreconocimiento inmovilizados
con secuencias complementarias y con 4 mutaciones.

Detección de TCA en la industria del vino

Otro ejemplo de biosensores de afinidad se basa en anticuerpos. Un problema
importante para la industria del vino es la presencia de 2,4,6 tricloroanisol
(TCA) que procede del corcho u otras fuentes y que puede estropear el sabor
del producto. Hemos desarrollado anticuerpos específicos para TCA y se han
desarrollado Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (ELISAs) para la
detección selectiva y sensible de 2,4,6-tricloroanisol y 2,4,6-triclorofenol en
corcho y en las aguas del proceso de la producción de corcho. Con estos
anticuerpos se han desarrollado ensayos competitivos directos utilizando
anticuerpos marcados con peroxidasa y alcalina fosfatasa, y haptenos sub-
óptimos como antígenos de recubrimiento. Se demostraron límites de detección
de hasta 0,01p.p.t. de TCA y TCP en 90 minutos con tan sólo la adicción de
dos reactivos.

Figura 4. Típica respuesta de inmunoensayo ELISA

competitivo para la detección de TCA en agua.

Para implementar ELISA, en el proceso, la inversión necesaria es de 10,000

EUROs para el lector de placas ELISA y el coste por análisis es de 3 EUROs.
En un esfuerzo para rebajar los costes, actualmente el DINAMIC trabaja en el
desarrollo de inmunostrips (tiras reactivas) para la detección de TCA/TCP.

Figura 5. Representación esquemática de inmunostrip.

Los inmunostrips se basan en el principio de los strips inmunocromatográficos y

se basan en el mismo concepto de detección que los ELISAs desarrollados.
Sin embargo, con los inmunostrips lo único que se le requiere al operador es la
adición de muestra en el strip, y al cabo de 15 minutos se obtiene una
respuesta cuantitativa. Los inmunostrips se pueden implementar como alarma
en el proceso de la producción de corcho y pueden medir TCA y TCP,
proporcionando los resultados a través de un pequeño dispositivo portátil y no
se requiere personal preparado ni espacio de laboratorio específico.

La medida de TCA tiene también un impacto importante en las industrias de

empaquetamiento de frutos secos, producción de cerveza y en el control de
calidad de agua potable.

Detección de gluten en alimentos

Otro tipo de biosensor de afinidad que se desarrolla en el centro DINAMIC es
un sensor para la detección de gluten en la comida. El gluten es una proteína
que causa efectos indeseables a los individuos que padecen la enfermada
celíaca. Esta es una enfermedad incitante del intestino delgado, que resulta de
la ingestión de gluten en individuos genéticamente susceptibles. Algunos
estudios que se han llevado a cabo recientemente en Europa así como en los
Estados Unidos subrayan que el número de casos de enfermos celíacos es
mucho más alto que el que se creía previamente, con una frecuencia del 1% de
la población. El único tratamiento para la enfermedad celíaca es evitar
completamente el consumo de gluten y el Codex Alimentarius de la
Organización Mundial de la Salud (World Health Organisation) requiere
urgentemente un ensayo patrón para la cuantificación de gluten para facilitar el
control y el establecimiento de límites admisibles en comestibles.

Hasta la fecha, la detección de gluten en alimentos se ha visto enfrentada a

una plétora de problemas que van desde la extracción ineficaz hasta la
carencia de un método selectivo para la cuantificación. DINAMIC ha llevado a
cabo una investigación que no sólo puede aplicarse a los problemas
previamente observados con los ensayos de gluten, sino que también puede
ayudar a simplificar el ensayo mediante un formato de biosensor - fácil,
económico y rápido, que se integrará con un módulo de microextracción en un
microsistema de un sólo uso, el cual permitirá la detección de gluten en
alimentos en 15 minutos.

Algunos estudios recientes han mostrado cuál es la secuencia específica de

péptidos del gluten que provoca la enfermedad celíaca. También se ha
demostrado que esta secuencia se encuentra en la cebada, el centeno, el maíz
y el trigo. Los biosensores que desarrollamos explotan los últimos adelantos en
biología molecular para producir biocomponentes novedosos para la detección
de dicha secuencia tóxica. Al mismo tiempo, estamos trabajando en el
desarrollo de en un método universal para la extracción de gluten del alimento
crudo, cocinado, procesado y sin procesar. Además, junto con colaboradores
internacionales, estamos intentando integrar la extracción y la detección en un
microsistema plástico de un sólo uso (para tirar después de su utilización).

Se prevé que esta tecnología se pueda usar para controlar la calidad a través
del procesamiento de ingredientes sin gluten y producción de alimentos sin
gluten, para el uso por los productores de alimentos, las autoridades
reguladoras (e.g. la Autoridad Europea de Alimento), los vendedores de
alimento sin gluten y, eventualmente, las víctimas de la enfermedad.

Biosensores Catalíticos
Los biosensores catalíticos se basan principalmente en enzimas. En DINAMIC
se desarrollan una serie de biosensores con estas características para su uso
en la industria alimentaria.

Identificación de antibióticos y lactulosa en la leche

Para la industria lechera, por una parte el grupo está desarrollando un sistema
que permite la multi-detección de analitos para identificar antibióticos en la
leche que entra en las lecherías. Estos sensores de afinidad se basan en
anticuerpos y dan una respuesta cualitativa a la presencia de antibióticos en 1
minuto y una respuesta cuantitativa en 10 minutos. Los sensores de un sólo
uso se conectan a un instrumento portátil, permitiendo el análisis en el punto de
entrega de la leche entrante, previniendo así la contaminación en la fuente y
garantizando un producto de mejor calidad.

También se ha desarrollado un biosensor multi-enzimático, que utiliza las

enzimas galactosidasa y fructosa deshidrogenasa o galactosa oxidasa para
detectar lactulosa como indicador de la reacción de Maillard. Este sensor usa
enzimas termoestables, las cuales pueden utilizarse a las elevadas
temperaturas empleadas en la pasteurización y en la producción de leche UHT.
 Figura 6. Reacciones enzimáticas que se aprovechan para la detección de
lactulosa en la leche y esquema de construcción de electrodos nanoestructurados
que permiten la modulación de las propiedades analíticas de los sensores.

Los sensores pueden ser de un sólo uso o de uso continuo (para 1-7 días) en
una celda de flujo conectada a un dispositivo automatizado de microdiálisis
para la adquisición de la muestra. Los sensores también se pueden conectar a
plataformas remotas telemáticas, facilitando el control completo de múltiples
pasteurizaciones de manera centralizada.

Detección de almendras amargas

Otra de las aplicaciones de biosensores en la industria alimentaria en las que
esta trabajando nuestro grupo de investigación es la detección de la almendra
amarga. La almendra es uno de los frutos secos más importante por su sabor,
aroma y posibilidad de elaboración, ya que tiene diferentes aplicaciones en
pastelería, preparados alimenticios, recetas de cocina y como base cosmética,
de resinas tintes y pinturas. Pero toda la aplicabilidad de la almendra se puede
ver truncada por la transformación de la almendra dulce en almendra amarga.
Las almendras amargas contienen amigdalina y una hidrólisis enzimática de
ésta mediante ß-glucosidasa libera glucosa y 2-hidroxi-3-fenilacetonitril, que,
por la acción de una segunda enzima, la mandelonitril liasa, convierte éste en
benzaldehído y cianuro.

Figura 7. Estructura química de la amigdalina.

El cianuro formado en la almendra amarga es un peligroso veneno y perjudica

la calidad de ciertos productos, por lo que es muy importante poder detectar la
presencia de almendra amarga en los procesos que involucran la utilización de
almendras.
Para realizar la detección, DINAMIC está desarrollando un biosensor
amperométrico multienzimático para la detección de amigdalina, compuesto
que sólo se encuentra en la almendra amarga y no en la dulce. Este tipo de
biosensores se podría utilizar en diferentes etapas en el procesado de
almendras. Un biosensor en la entrada de materia prima controlaría la calidad
de la almendra de entrada, estando el precio a pagar al proveedor en función
de dicha calidad, lo que comportaría un ahorro para la empresa y una
motivación para el proveedor para mejorar su producto. También se puede
utilizar este tipo de biosensores dentro de la cadena de producción, para evitar
que se mezclen almendras amargas en el producto acabado disminuyendo así
su calidad. Finalmente se podría utilizar en el control de calidad final del
producto.

Otra ventaja para la industria sobre la utilización de biosensores para la

detección y separación de la almendra amarga, es la posibilidad de utilizar las
almendras amargas en otro tipo de industria, ya no son sólo un veneno, sino
que también son un producto de alto valor añadido. Así pues, una industria
procesadora de almendra que separase la almendra dulce de la amarga,
además de conseguir una mejor calidad de sus productos y un ahorro en su
producción, también se abriría un nuevo camino para la comercialización de la
almendra amarga mejorando así sus beneficios.

Multi-detección de azúcares
Los biosensores que pueden discriminar entre diferentes tipos de azúcares en
la misma muestra son útiles para la monitorización a tiempo real de todo tipo de
fermentaciones, de las cuales la vinificación es la más importante. Después de
varios años de trabajo con sensores individuales de azúcares, el centro
DINAMIC en colaboración con la Universidad de Alcalá de Henares ha
desarrollado una celda en la que se pueden medir cinco diferentes tipos de
azúcares de manera simultánea. La celda necesita un volumen de menos de
200 /\VHSXHGHLQFRUSR
UDUGLUHFWDPHQ
WHDXQIHUPHQ
WDGR
U En una aplicación
se han podido medir simultáneamente sacarosa, glucosa, lactosa, galactosa y
fructosa en muestras de 150 /FRQXQDSRVLEOHIUHFXHQ FLDGHLQ\HFF
LyQFDGD
200s.

Conclusión
Con esta breve revisión del trabajo que se lleva a cabo en el centro DINAMIC
en materia de biosensores para la industria alimentaria, se demuestra que las
posibilidades que se abren con la implementación de esta tecnología son
infinitas. El objetivo no debe ser simplemente la medida y el análisis sino
también el uso de estas singulares herramientas para la mejora de los
procesos de elaboración de los productos alimentarios ya que se ofrecen
posibilidades que no existían anteriormente. De igual manera, será posible,
cuando los biosensores sean más fiables, realizar nuevos productos que
respondan a la demanda del consumidor para un producto alimenticio de alta y
constante calidad y más seguro. Este tipo de biosensores se podrá aplicar
desde el campo de cultivo o la ganadería hasta el producto elaborado final.
 Agradecimientos
La investigación revisada ha sido posible gracias al apoyo de la CICYT, CIRIT y
varios proyectos subvencionados por la Comisión Europea. Incluye partes no
confidenciales de contratos con el sector privado. El centro DINAMIC es un
centro dedicado a la transferencia de innovación y tecnología a la empresa
privada y sobre todo la PYME catalana, española y europea. El centro resuelve
de manera innovadora problemas de este sector y ayuda a la mejora y diseño
de nuevos productos. Se ha creado con el apoyo del CIDEM de la Generalitat
de Cataluña.