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Ejercicios Fenoll Segunda Parte
Ejercicios Fenoll Segunda Parte
Usando CRISPR se ha obtenido en un solo paso una línea de células humanas pluripotentes
en la que CCR5 (que codifica un receptor del HIV) ha perdido su función. ¿Sería posible con la
misma tecnología restaurar también en un solo paso la versión silvestre de CCR5?
CRISPR es un sistema eficiente para inducir mutaciones y nos pregunta que si lo podemos usar
para reemplazar un gen por otro.
CRISPR si se podría usar para reemplazar un gen por otro. Esto se haría suministrando, junto
con el sistema CRISPR-Cas, un oligonucleótido (fragmento DNA) que tuviese la copia del gen
silvestre, al igual que haríamos con las endonucleasas de diseño. Lo que sucede es que,
mientras que el sistema CRISPR es muy eficiente para inducir mutaciones el reemplazo génico
es muchísimo menos eficiente. Por lo que si se podría hacer pero no es tan eficiente como si lo
usásemos para inducir mutaciones.
EJERCICIO 11
En el diseño de un vector para realizar iRNA se introduce la secuencia deseada para producir
un miRNA que interfiera en el tránscrito Gag de HIV. Como los miRNAs no contienen colas de
poliA, ni estas colas se necesitan para que los sistemas celulares de silenciamiento génico
operen, ¿crees que es necesario incluir una señal de poliadenilación en el vector?
Lo que hacemos es diseñar un vector/fusión génica que vaya a ser capaz de producir in miRNA
que vaya a interferir con un tránscrito importante del HIV como terapia antivírica.
Si es necesario poner una señal de poliadenilación porque lo que nosotros hacemos es generar
un miRNA que se genera explotando todo el sistema celular endógeno de generación de
miRNA, entonces, se introduce una construcción que produce un transcrito poliadenilado que
luego la maquinaria nuclear lo procesa. Entonces, no solo producimos un miRNA, sino que
también se produce el pri-mRNA, luego el pre-miRNA y después el miRNA sale al citoplasma y
el resto de los sistemas celulares de silenciamiento génico basado en miRNA hace su función.
EJERCICIO 12
Tras transformar Arabidopsis con un transgén que produce un iRNA contra el gen que
codifica la subunidad pequeña de la RuBisCO (gen nuclear), ¿se modificará el locus genómico
de dicho gen?
La subunidad pequeña de la RUBISCO está codificada por un gen nuclear y la subunidad grande
está codificada por un gen del cloroplasto. ¿Podemos usar el sistema iRNA para silenciar la
expresión de la subunidad grande de esta proteína cloroplástica?
EJERCICIO 14
Tanto las nucleasas de diseño como el sistema CRISPR-Cas permiten efectuar un corte en el
DNA genómico en una secuencia específica del mismo. ¿Dónde reside esta especificidad en
cada uno de los sistemas?
La especificidad de unión a DNA y por tanto la modificación de DNA de las nucleasas de diseño
y de CRISPR-Cas no reside en el mismo tipo de determinante. ¿Cuáles son los determinantes
en cada caso?
EJERCICIO 15
Comenta la siguiente afirmación: Una limitación muy importante del sistema CRISPR-Cas es
que la secuencia genómica específica a la que se digiere la nucleasa Cas es de tan solo 20 nt,
que además deben estar adyacentes en el genoma a una secuencia PAM. Por ello, habrá
muchas regiones génicas no accesibles a la modificación mediada por CRISPR-Cas.
Habrá mientras que tenemos mucha libertad para diseñar el RNA guía y la secuencia del
genoma que vamos a cortar, para que el sistema funcione bien con cas9 vamos a necesitar que
esa secuencia que elegimos en el genoma esté precedida de un PAM, con lo cual esto limita
bastante nuestra libertad, no nos vale cualquier secuencia, solo aquellas que tengan la
secuencia PAM.
Por tanto, esté afirmación es cierta, pero las PAM son secuencias de los 2-3 nucleótidos,
entonces encontrar una secuencia de 3nt en un genoma es bastante fácil, entonces una
secuencia tan corta como la PAM es fácil de encontrar y además, aunque el sistema de edición
genética por CRISPR-Cas se ha diseñado inicialmente con la Cas9 ahora hay muchas proteínas
Cas distintas y no todas las cas reconocen el mismo PAM. Con lo cual, si queremos hacer un
corte en una secuencia de 20 nt muy específica en un gen va a ser casi siempre posible hacerlo.
EJERCICIO 16
En el esquema se muestra la estructura de un gen, el mRNA maduro derivado de él y la
proteína resultante de la traducción de éste. Diseña una estrategia para:
a) Eliminar del genoma solamente el exón 3 con nucleasas de diseño. Indica a qué sitio o
sitios del gen dirigirías las nucleasas y describe básicamente cómo lo harías.
Para eliminar el exón 3 hacen falta 2 nucleasas. Para diseñar los sitios de unión de estas
nucleasas los podríamos dirigir tanto al principio y al final del exón 3 o para estar mas seguros
dirigirlo a los intrones que hay entre el exón 2 y 3 y el exón 3 y la señal de poliA.
b) ¿Es posible usar el sistema CRISPR-Cas para eliminar con precisión el exón 3?
Si sería posible hacerlo con este sistema, en vez de diseñar los sitios de reconocimiento para
las endonucleasas diseñamos dos RNA guías para que hagan exactamente lo mismo. CRISPR-
Cas es mucho más sencillo de usar.
c) Si se quiere utilizar un sistema de interferencia de RNA para silenciar este gen, ¿sería
necesario diseñar el iRNA específicamente sobre las regiones transcritas alguno de los 3
exones? ¿Por qué?
La respuesta sería que SI. Si queremos que el miRNA funcione tenemos que dirigirlo a alguna
secuencia que este en el transcrito maduro, por tanto, como el diseño lo hacemos
normalmente a partir de la secuencia genómica lo que tendremos que hacer es identificar los
exones de este gen y dirigir el miRNA a alguno de estos exones o a una zona que comprenda
parte de los exones.
La proteína seguiría siendo funcional, por eso al hacer un diseño de este tipo para ver que
región de la proteína queremos eliminar o ver donde queremos introducir las mutaciones, hay
veces que el experimento no funciona porque tendremos una proteína transgénica sin
fenotipo, porque la proteína A va a seguir siendo funcional porque estamos eliminando un
dominio que no es esencial.
Si usamos la estrategia 3 para eliminar la función, (sabiendo que solo hace falta el dominio A),
esperamos que la proteína se produzca porque un miRNA lo que hacemos es impedir por
completo la traducción de la proteína o destruir el mRNA. Por ello, no se va a producir la
proteína en ningún caso.
EJERCICIO 17
Comenta las consecuencias de la inserción en un genoma de estas construcciones:
En esta primera construcción, si añadimos el inductor XVE será activa ya que solo es activa con
el inductor.
En presencia de betaextradiol se reprime la expresión del gen X. Pero, ¿el gen x se está
expresando? No, porque para que se exprese hace falta que UAS se active para lo que
necesitaríamos una proteína GAL4 activadora.
En este caso lo que estamos utilizando es un promotor inducible nativo. Tendríamos que dar
un choque térmico para que se produjese XVE, que activaría a OlexA para que se produjera la
proteína GAL4 represora y esta reprimirá a un gen que no se está expresando, por lo que este
diseño no serviría para nada.
En esta construcción se induce la expresión del gen x con ayuda del choque térmico y en
presencia de betaextradiol.
EJERCICIO 18
Diseña una estrategia y el transgén o trangenes necesarios para obtener una colección de
líneas transgénicas que permita reprimir la expresión de “cualquier” gen en el dominio de
expresión de “cualquier” promotor. No es necesario especificar el organismo ni el
procedimiento de transgénesis.