Anales de la Facultad de Medicina ISSN 1025 - $583 Universidad Nacional Mayor de San Marcos Vol. 59, N?2- 1998, Copyright @ 1998 Pigs. 105 - 119 Cinética de Autooxidacién del Ascorbato por Iones Ciipricos LUZMILA TRONCOSO, EMILIO GUIA Centro de Investigacién de Bioquimica y Nutriciéa, Facultad de Medicina Universidad Nacional Mayor de San Marcos. RESUMEN La autooxidacién del ascorbate catalizads por Cu™ se realiza u través de una reaceion de primer orden, proceso quees dependiente de la concentracion de Cu y que obedece a una cinética de satwracion. Ello sugiere que en ta sechencia eatalitica xe formaria un complejo inte Himitaria fa formacion de los productos de Ia reaccién, uno de lox cuales es el radical libre hidroxilo, La tiowrea inbibe notable- mente Ja reaccién de autooxidacién, mientras que el glicerol no ejerce efveto alguno. Bl ascorbate 9 el Co, utilizados en las concentraciones en que se produce la autooxidacidn, no escinden el puente distlfure del DTNB. La histidina y el citrato inhiben tanto la reaccidu de autooxidacién como la ruptura del enlace disulfuro del DTNB. Estos resultados Sugieren que la ruptura del puente disulfuro del DTNB se reali de los railicales libres hidroxilo, generados por el sistema axcorbato/C paralelamente mediante un proceso de reducelin o de hidrdlisis. a con intervene Palabras clases: Acido Aseérbico; Cobre; Radicales Libres; Oxido-Reduccién; Antioxidantes. KINETIC OF ASCORBATE-AUTOOXIDATION BY CUPRIC IONS SUMMARY. Ascorbate autooxidation eatalized by Cu* occurs through a Cu*-concentr: reaction, which fulfil saturation kineticrules. Itsuggests that could he an intermedial complex synthetized in the catalitic sequenee, which probably limits the formation of reaction-praducts (v. g., free Fadical hydroxil, and others). Autooxidation reaction is strongly inhibited by thiourea, while effects on it, Disulfure-hinding on DN'TB was not broken by ascorhate and Cu, used in the same concentrations which occurs in autooxidation process. Histidine and citrate inbibits both autoxidation reation and DNTBs« sak. These results suggests that the DNTB-disulfure binding- break was mediated by Ascorhate/Cu® systent-generated hydroxil free radicals, as well as through a reduction process or hydrolisis, dependent first order icerol have no. jsulfure hinding bs Key words: Ascorbic Acid; Copper; Free Radicals; Oxidation-Reduction; Antioxidants, INTRODUCCION es sintetizado por el hombre, por cuyo motivo es im- prescindible que lo incluya én su dieta (*, E] ascorbato es una vitamina que se encuentra am- pliamente distribuida en frutas y verduras ('*), pero no Existen diversos estudios que atribuyen al ascorbato ‘un papel fundamental en las reaceiones de hidroxilaci6n, como un enérgico agente reduetor biolSgico y con pa- peles bien definidos en la sintesis de carnitina y esteroides. !2 absorcién de hierro no hem, 1a formacion Correspondencia Dra. Lucnila Troncoso, Centro de lnvestigacién de Bioguimica y Nuvicién. de colageno, la funcién inmune y €] metabolismo de Fecultad de Medicina, UN MSM. nucledtidos cfcticos, aminodcidos, colesterol, glucosa Apartedo Postal N? 1546 Lima - Peri: y deido {6lico “) 105Anales de la Facultad de Medicina E} 4cido asciirbico en presencia de trazas de metales de transici6n. como el Cu", genera radicales hidroxilo através de un proceso de autooxidacisn (*), La presen cia de EDTA inhibe esta ceacci6n. debido a que form un complejo con el Cu* (9). Cuando el ascorbato se cuentra cn presencia de una concentracién micromolar de Cu, inerementa considerablemente la oxidacion de diversoy compuestos biolégicamente importantes. tales coma las protefnas (*"), polisacaridos (*) ¥ acidos nucleivos ("9 La lipoperoxidacién es estimulada cuando et dcido ascérbico se encucntra en presencia de sales de cobre ohierro, rcaccién que se produce con la formacién de especies reactivas como son los radicales libres hidroxilo; pero en contraposicién a ello, el ascorbato tiene la capacidad de conterir una eficiente proteccisn contra la peroxidaci6n lipidica (!%*) y en ese contexto pucde restaurar las propiedades antioxidantes de la vitamina E oxidada, lo que podria constitvirse en una de las funciones mas importantes de esta vitamina () La formacién de perdxido de hidrogeno que se obser va enel ojo es muy probable quc se cleve debido a la oxidacisn no enzimatica del ascorbato ("). Ei efecto que eventualmente puede ejercer el ascorhato es dependiente de su coneentracién, y en tal sentido puede comportarse como un eficiente antioxidante 0 en su defecto actuar como un prooxidante (92%), Cuando las concentraciones de ascorbuto se cuentran por encima de 1 mmol. actda como un prooxidante en presencia de metales de transicion, tales como Fe" y C Esta vitamina tiene la propiedad de reducir los puen- les disulluro de compuestos de origen biolégico. asf como de aquellos obtenidos por sintesis. La reduccién del scido 5,3° ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) por el sistema ascorbato/Cu™. se incrementa considerable- mente en presencia de cistina (), en cambio. la presen= cia de superdxido dismutasa 0 catalasa ocasiona una di minucidn considerable de la ruptura del puente disulfuro del DTNB (*). En el presente trabajo se describe el pro- ceso cingtico de atooxidacién del ascorbato y ta pro- babilidad de que La ruptura de puentes disulfuro se re: lice exclusivamente por aceién de radicales libres. MATERIAL Y METODOS Materiales En cl manejo experimental se utilizaron acide $.5° ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) ¢ histidina (Sigma 106 Vol. 59, N°2- 1998, Chemical Company). fosfato monoporisico, glicerol, citrato. sulfato de Cobre (E, Merck Darmstadt), acido asesirbico y tiourea (Riedel de Haen). Todas las solu- Giones se prepararon con agua bidestilada en vidrio Métodos Reaccién de autooxidacién Las soluciones de ascorbuto y las de DTNB se pre- pararon inmediatamente previas a la ejeeucisn de cada experimento, La autooxidacién del ascorbato se deter- mind midiendo Ia dismuinucién de fa absorbancia a 265 nm C) utilizando pari ls ealculos un coeficiente de extineién molae de 19 300 M* em, valor que obiuvi- ‘mos experimentalmente en nuestro laboratorie. El me~ dio de reaccidn contenia. en un volumen final de 2.0 mL, tampén fostato de potasio 50 mM. pH 8.0, ascorbate (3,3x10°M) y concentraciones diversas de Cu w otras sustancias motivo de experimentacidn. La reaecidn se realiz6 a temperatura ambient ¥ se inicié mediante la adivién del Cu*. la modificaci6n de fa absorbaneia se Iidi6 en un graficador acoplade a un especteorotsmetro Gilford modelo 240. Ruptura del enlace disulfuro E] dcido 5.5" ditiohis (2-nitrohenzoico) es un compues- to que por escisién de Su puente disulfuro lihera tionitrobenvoato que absorbe a 412 nm (), Bl medio de ensayo contentaen un volumen de 2.0 mL. tampén lostato de potasio 50 mM. pH 8.0, dcido 5.5° ditiobis (2- nitrobenzoivo) 1 mM y concentraciones variables de ascorbato y Cue, La liberacion del tionitrobenzoato se midi a 412 nm co un espectrotitimeiry Gilford modelo 240 acoplado a un graficador. y se cuantities utilizando un coeticiente dé extineidn molar de 13.600M em" RESULTADOS El ascorbato es una vitan medio acuoso y en presencia de oxigeno sufre un proceso de autooxidacisn que es acclerado a pH atealin por meta~ les de transici6n, La autooxidacidn del ascorbato se guid midicndo la disminucidn de la absorbancia a 265 hm en un medio de reacciGn ajustado a pH 8.0 al que se le adicioné concentraciones diferentes de Fe’. Co 0 Cue La autooxidacisn del ascorb ausencia de los metales de transicién antes mencionados. fue muy baja En la Tabla NY 1 se observa que el ascorhato se auitooxida en presencia de Cn’ en un grado notable ‘mente mayor que CUaNdo Se utilizaron los metales Co"Anales de la Facultad de Medicina Vol. 59, N°2- 1998 0 Fe. los que. en concentraciones dos veces mayores 1 queel Cu. produjeron una muy discreta autooxidacion 0.04 _- del ascorbato. ‘Tabla N* 1.- Autooxidaci6n del ascorbato en 003, presencia de metales de transivign.* Metal Concentrac (nmimin) Foor “ cut 33,33 pmol 35.17 oot 7 co 66,30 umol 0,83 Few 66.30 pmol 0.42 ° come ° T El medio de ensayo contenta: tampén foxfato de porasio 30 o o we 132 iM pH 8,0, ascorbato 33 yM y los metales en las concentra: ciones indicadas. El efecto ocasionado por cl Cu"* se pudo observar al utilizar concentraciones de este metal comprendidas tre 3.33 y 13.4 UM, este proceso se realiza a través de una reaccién de primer orden. Cuando se grafican las constantes de velocidad de primer orden en funcién de Jas voncentraciones de Cu*, se observa que esta depen- dencia no cs lineal. sino que corresponde a una curva de naturaleza hiperbdlica, resultado gue sugiere una cinética de saturacion, tal como se muestra en la Fig, N° 1, donde es posible apreciar que el valor mximo de la concentra- Gién de Cu** que hemos utitizado para calcular la cons- tante de velocidad corresponde a 0,0134 mM. La regraticacién de los resultados anteriormente obtenidos, en doble reefproca permite obtener una recta, 10 que in- dicarfa que la generacién de cadivales libres es saturable can respecto a la concentracién de Cu', de Lo que tam= bign se desprende el hecho que durante cl proceso de autooxidacién se forme un complejo intermedio, Estos resultados se ajustarian a la siguiente ecuaci6n: on kK KIX)" k donde = constanie de velocidad observada Ka constante aparente de disociacisn del compleio intermedio. complejo intermedio, constante de velocidad de primer orden en la sa- turacién. 107 Cue (mM) x 10 Fig. N? 1.- Efecto de la concentracién de Cu" sobre la autooxidacion del ascorbato, Medio de reaceion: Tam- On losfato de potasio 50 mM pH 8,0, ascorbato 0,033 mM y Cu** en concentraciones variables El valor de 1a constante de velocidad de primer or- den en la saturacion es igual a 0,045 seg? y tue calcula- dita partir del valor en cl imercepto de la regraficacién en doble recfpvoca, mientras que la constante aparente de Uisociacién corresponde a 4,07 x 10% M. En el gedtico competitive que se muestra en ta Fig. N® 2, se observa que la ourea. compuesto que tiene la propiedad de captar radicales libres, inhibe la antooxidacion del ascorbato, proceso que es lineal en las condiciones experimentales deseritas, habiéndose calcu- lado a partir del mencionado grafico una constante de protecci6n de 1,75 x 10°M La utilizacién del gticerol con el mismo propésito, permitio observar que la autooxidacién de} ascorbato en presencia de Cu* no sufre alteracisn alguna, tal como, se muestra en la Figura N° 3.Anales de la Facultad de Medicina i (seg) o 005) OL OAS O25 Tiourea (mM) x 10" 1g. N° 2. Efecto de la tiourea sobre la autooxidacin del ascorbato catalizada por el Cu*Medio de reaccién: Tampdn fostato de potasio $0 mM pH 8.0, ascorhito 0,033 mM y Cu 0,0066 mM y tiourea en diferentes concentraciones. Cuando se utilizaron voncentraviones de Cu** 1,34 x 10M y ascorbato 3.3 x 10M. que son las que se usa~ ron para el proceso de autooxidacisn, no Lue posible escindir el puente disulluro del dcido 5,5" ditiobis (2- nitgobenzoico) (DTNB): en cambio, si se incrementa la concentracién de ascorbato a 2,0 mM manteniéndose la de Cu’ a una concentraci6n 0,01 mM, la liberacion de lionitrobenzoato, que es ef compuesto que se produce como consecuencia de la ruptura del puente disulturo del DTNB. ocurre a una velocidad de 1,3 uM/miin, Tabla N°2.- Efecto de inhibidores sobre los procesos de autooxidacién y ruptura de puentes disulturo del DTNB. Inhibidor Inhibicién dela Inhibicién de la ruptura (05 mmol) autooxidacibn de puentes disull (e) (%) Histidina 89.02 85.56 Citrate 50,00 53,00 * Las condiciones de ensavo se deseriben en Métados 108 Vol. 59,N*2- 1998, La presencia de histigina o citrato en el medio en que €1 ascorbato se autooxida por accidn del Cu". ovasioné una notable inhibie ndo mayor el efecto produci o por la histidina, Un efeeto similar se abtuvo cuando los compuestos anteriormente mencionados estuvieron n una concentracién 0.5 mM enel medio donde presentes. se produce la ruptura del puente disulfuro del DTNB por accidn del sistema ascorbato/C: 4,044 k (see) 0.03) d 1 ° 3.33 6.66 9.99) 1332 Glicerol (mM) p- N° 3.- Etecto del gliverol sobre la autooxidacién, del ascorhato catalizada por Cu’ Medio de reaceién ‘Tampon fostato de potasio 50 mM pH 8,0. ascorhato 0,033 mM y Cu** 0.0066 mM y glicerol en concentra- Giones variables. DISCUSION Diversos estudins sobre fa cinétiva de oxidacisn del ascorhato catalizada por cobre, permitieron formular inicialmente un mecanismo que ineluye una interacei6n entre el ion ascorbato y el ion edprico. hecho que Facili- tala transferencia interna de un electr6n. El ion cuproso. formado es oxidado por cl oxigen molecular. y Ja for ma de semiquinona del asvorbato, por el oxigeno y los iomes copricos (°).Anales de la Facultad de Medicina La autooxidacion de! ascorbata por metates de tran- sici6n ha sido descrita por diversas autores (7). este proceso se realiza conjuntamente con la reduceién del oxigen molecular por un electron y ta Formaciéin de radivales libres hidroxilo (*). Los resultados mostrados en la Fig, N° 1 sugivren que en este proceso de autooxidacisn se formaria un complejo intermedio que limitaria dicha reaceidin, lo gue esta corroborado por la Tegruticacin en doble reeiproca También se hu mostrado que la oxidacién del ascorbato se estiniula ligeramente en presencia de Fe™. reaceién gue muestra un marcado ineremento cuando seadiciona EDTA. y es inhibida en forma muy discrcta por Ia supersxido dismutasa; estas observaciones per- miten sugerir qué ef ascorbato es oxidado por el com- pleio EDTA/Fe™. lo que estaria acorde con un inere- mento del potencial rédox del ion férrico cuando forma complejo con el EDTA (). Nuestros resultados son si- inilares a las observaciones deseritas anteriormentte, con- forme se aprecia en la Tabla N° 1. la presencia de Fe 0 Co™ oeasioné una disereta autooxidacién del ascorbuto, en comparacidn con aquella producida por el C Siendo el pKa del ascorbato 4.25, significa que a pH fisioldgico la forma predominame corresponde al ani6n ascorbato, compuesto que oxidativamente for- ma acide dehidroascérbico, proceso que ocurricfa me- diante la oxidacidn reversible con la formacion de un. compuesto intermedio de radical ascorbilo ("). Las propiedades anioxidantes del ascorbato tienen relaci6n ton Ja baja reactividad que tiene el radical semidchidro- ascorbato (") El efecto ejercido por la tiourea en el sentido de in- hibir la autooxidaci6n del ascorbato por et Cu°*, proba- te haya sido ocasionado por la propiedad que te ne este compuesto para ligarse a metales (*), tambi existe la posibilidad de que la tiourea reaccione con el perdxido de hidrigeno que se forma en la secuencia de Feacciones que se produce durante la autooxidacion del ascorbato, aunque no debe descartarse Ia alta afinidad gue tiene 1a tiourea por cl ion cuproso, cuya oxidacion permite la generacién de radicales hidroxilo (), resul tado que es similar a la inhihici6n ejercida por este com puesto sobre la hidroxilaci6n del salivilato por accin del ascorbato, Cu" y perdxido de hidrégeno. El gritico de competicidn lineal mostrado por la tiourea, sugiere que este compuesto compite con el ascorbato en el pro- tos Vol. $9, N°2 - 1998 ceso antes descrito, en cambio el glicerol no ejerci6 efee to alguno, pero sf fue capa de inhibir considerablemente la ruptura del enlace disulluro del DTNB (°9. La modificacidn selectiva de un residuo de histidina de Ia angiotensina 1. se produce en condiciones en las, cuitles el ascorhato reacciona con cantidades catalitivas, ue Cu®, El dafio oxidative que dicho sistema ovasiona al péptido se realiza especiticamente en ta posicién C-2 del anillo imidazdlico del residue de histidina del péptido, Nuesiros eesultados tienen cierta correlacién con los an- Teriormente deseritos, ya que Ta presencia de histidina en) el medio de reaceisn de autooxidaci6n produce una no~ lable inhibici6n det proceso. Tanto el uscorhato como el Cu® y Ia histidina son compuestos que normalmente se encucntran en los alimentos y en las células del organis- mo C4, No ha sido posible encontrar evidencias de la for- macin de} radical superdxidy durante el proceso de autooxidacion del ascorbato. ta acciGn inhibitoria mos- trada por Ja superxido dismutasa era probablemente, Ucbida al efecto de la molécula proteica de la enzima, y hho a la remocisn del radical superdxido C9. Ciertos autores han indivado que la ruptura del puente disulfuro del DTNB por cl sistema ascorbato/Cur* se realiza exclusivamente por accidn de los radicales li- bres hidroxilo (), ya que en presencia de catalasa 0 manitol se produce una notable inhibicidn, El hecho que, la ruptura del puente disulluro del aeido 5,5" ditiobis (2-nitrohenzoico) no ocurra en las mismas condiciones experimentales en que se autooxida el ascorbato, per- ite sugerir que dicha esvisién se producena solamen- te por electo de los radivales libres generados por el sistema ascorbato/Cu*, sino que debe operar otro me- canismo en forma paralela, tal como Ta reduccién 0 1a hidesdlisis: to que tmbién estarfa sustentado por el efecto Inhibitorio que ejerce el glicerol sobre la ruptura del enlace disulfur det DTNB. asi como por el hecho de no afeetar en forma alguna la autooxidacién del ascorbato, A FRADE IMIENTO Finaneiado por el FEDU (Fon: ario), Proyectos N® El presente wabajo tu do Especial de Desarrollo Unive 4240003 y 5240112.Anales de la Facultad de Medicina BIBLIOGRAFIA, ‘Sauherlicl H. 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