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Hola a todos, bienvenidos a otra conferencia de este curso y, de hecho, con esta conferencia comenzamos otro módulo. Hasta ahora nos hemos centrado en los
antimicrobianos, en la resistencia a los antimicrobianos, y ahora vamos a dar una idea de cómo se prueba esto. ¿Y cómo averiguamos que realmente son resistentes en
el laboratorio, por ejemplo? Mi nombre es Lina Cavaco y trabajo con las pruebas de referencia de resistencia a los antimicrobianos como Laboratorio de Referencia de
la Unión Europea y también para la OMS, para la Organización Mundial de la Salud sobre resistencia a los antimicrobianos. Así que nos centramos mucho en las
pruebas y en cómo podemos descubrir que realmente son las de resistencia que estamos buscando. En esta conferencia, vamos a tener una descripción general de
cómo probamos y por qué probamos, cuál es la importancia de las pruebas. Cómo es en términos de pruebas clínicas y pruebas para investigación, por ejemplo, y sobre
la importancia de tener estándares y hacerlo de la manera adecuada con toda la estandarización que se necesita y cómo medimos realmente la resistencia. Y, mira
desde la medida, desde el punto de vista del laboratorio y también desde el punto de vista genético. Y también cómo, presentamos los datos cualitativos o
cuantitativos, según los métodos que utilicemos. Y luego tenemos una conferencia que se centra en los métodos reales en el resto del módulo.

entonces por qué hacemos esto? Bueno, en principio, hacemos esto porque queremos predecir algo. Queremos predecir, por ejemplo, que la persona enferma puede
recibir tratamiento. Queremos predecir que el tratamiento funciona. También queremos predecir qué pasa en el medio ambiente, qué pasa en la resistencia en nuestro
país, o en el mundo, o en una zona determinada. Queremos detectar que están surgiendo resistencias. Uno nuevo, por ejemplo. Y también queremos comparar entre
diferentes áreas si hacemos cosas diferentes.

Y otra cosa muy importante mientras recopilamos todos estos datos porque queremos hacer algo al respecto. Y si hacemos algo al respecto si hacemos una
intervención. Queremos saber cómo era antes, cómo fue después de que actuamos al respecto y si realmente resolvió el caso, o fue mejor o peor para poder prevenir
lo que suceda. Por lo tanto, los principales objetivos de las pruebas son en realidad utilizar estos datos y estos datos deben ser buenos y confiables. Estamos probando,
por ejemplo, aislamientos contra antimicrobianos. Y queremos, ya sea para la investigación o por el bien del paciente, mire esto en el laboratorio. Por supuesto, en el
laboratorio no es real. No es el paciente, pero queremos predecir cómo funciona.

Tendremos que tener en cuenta que algunos medicamentos son diferentes a otros. Hay que tener en cuenta también que las bacterias son diferentes a las demás. Por
lo tanto, siempre tenemos que considerar la combinación de bacteria versus fármaco porque podría ser muy diferente de una bacteria a otra o de un fármaco a otro y
la combinación de ambos. Entonces, cuando estamos probando, observamos los patrones de resistencia y esto nos ayudaría a elegir el tratamiento. Podría ser que el
patrón determinado, digamos una cepa que sea resistente a cinco antimicrobianos diferentes. Y todas las cepas que están relacionadas con esa cepa también tendrían
el mismo patrón. También podría ayudarnos a escribir.

Por ejemplo, para la identificación de la especie, si sabemos que una especie siempre es resistente a un determinado antibiótico. También podemos tener una idea de
que podría ser esa especie. Podemos utilizarlo para proyectos de investigación. Por supuesto, hay muchos proyectos y áreas de investigación en curso sobre la
resistencia a los antimicrobianos. Ahí es donde trabajamos y también trabajamos mucho en monitoreo y vigilancia y ahí es donde queremos conocer las tendencias.
Queremos conocer en el país. Queremos conocernos en el mundo. Queremos saber qué está pasando y cómo se propaga, cómo empeora o cómo mejora. Tanto en
humanos como en animales podría ser diferente a los objetivos que tenemos. Bueno, haremos una prueba y, al hacer una prueba, también tendremos que hacer
algunas exenciones de responsabilidad. Las pruebas son una guía para el tratamiento, no es la verdad absoluta. Podríamos ser algunos factores con los que no
podemos lidiar en la persona, y puede comportarse de una manera diferente. Si se lo damos a una persona o un animal que cuando lo hacemos en el laboratorio. Pero
la respuesta del paciente será la última respuesta a esto, si el paciente es tratado, salió bien, si el paciente no mejora, entonces salió mal, aunque la prueba podría
haber dicho algo diferente. Entonces, cuando estamos, por ejemplo, en un laboratorio clínico, las obligaciones que tenemos, aunque existe esta limitación es dar tanta
información como podamos y la mejor información que podamos. Por lo tanto, queremos brindar la mejor información clínica para la prueba que estamos haciendo.
Queremos proporcionar los mejores antimicrobianos que sean efectivos para ese caso.Lo que no significa que sean solo los mejores, es posible que debamos controlar
también el uso de algunos medicamentos que no deben usarse. Así que en realidad también pensamos en usos inadecuados y deberíamos pensar que deberíamos dar
los que están indicados para ese caso y no demasiados datos.

Y también queremos reducir la aparición de nuevas resistencias. Así que también queremos comprobar qué está pasando y tal vez evitar algunos antimicrobianos para
que la resistencia no empeore en esa zona.

Entonces, cuando hacemos las pruebas, estamos en el laboratorio, tenemos que hacer algo. Tenemos que seguir métodos. Y estos métodos están muy estandarizados.
Tenemos los estándares americanos y europeos, por ejemplo, que realmente se deben seguir. Totalmente, si cambiamos algo en el estándar, necesitamos validar por
qué estamos haciendo esos cambios y validar cómo estamos cambiando y los estándares abarcan todo el método, muy, muy detallado. Entonces, el principio es
estandarizar para que podamos comparar entre los laboratorios y podamos obtener los mejores resultados. Esta estandarización llega hasta el final. Estamos usando
medios de cultivo porque estamos cultivando bacterias en el laboratorio y estamos usando los medios que se definen en el estándar. Estamos complementando, si es
necesario, como se define en la norma. Estamos introduciendo algunas bacterias que también se definen en términos de cuánto, cómo denso debe ser el cultivo y
cuántas bacterias deben incluirse en la prueba. Y estamos haciendo la prueba muy, muy estrictamente bajo las condiciones estándar.

También para que el estándar funcione, también necesitamos cierto control y para eso usamos algunas cepas de control que tienen resultados conocidos o rangos de
resultados conocidos donde verificamos que nuestra prueba va bien. Y en las próximas presentaciones, voy a entrar en mucho más detalle sobre las pruebas, pero
estas son realmente las cosas generales sobre cómo hacemos las pruebas y cómo tenemos que estandarizar. Nuevamente, en términos de estandarización dada una
perspectiva histórica. Bueno, hemos evolucionado usando diferentes tipos de pruebas, y tal vez hemos usado más en el pasado, pero aún así, usamos muchas de estas
pruebas de difusión, que es una prueba fácil, práctica y barata. Nos estamos moviendo más hacia las pruebas de dilución, que son más cuantitativas y más precisas para
la obtención de resultados, y estamos evolucionando hacia tener mucho más laboratorio y acreditado con el aseguramiento de la calidad realmente críticamente
revisado para que tengamos los resultados tan buenos como sea posible, tan confiables. como pueden ser. Y también nos hemos contactado en redes entre
laboratorios para que estemos haciendo las cosas de manera similar no solo en cuanto a los estándares que usamos sino también en cuanto a qué medicamentos
probamos, y para que los resultados entre países se puedan comparar y tener alguna información. que está disponible para todos.

Entonces, la estandarización es un problema muy importante aquí. Todo es muy sensible, todos los métodos son sensibles a cualquier pequeño cambio. Entonces, si
cambiamos algo, influirá en el resultado. Y aquí hay algunos factores que influyen en el resultado, por eso tenemos que controlarlos de forma bastante estricta.
Pequeñas cosas como el inóculo, o el pH, o un poquito en el tiempo o la temperatura harán un cambio, así que tenemos que ser muy estrictos al respecto. Además, si
estamos haciendo, por ejemplo, esta difusión, incluso tenemos que pensar en factores adicionales porque estamos trabajando con agar, y hay cierta profundidad del
agar y sequedad y el crecimiento es diferente. Así que incluso tenemos que tomar más medidas. Pero vamos a hablar de ello más en específico cuando hablamos de los
métodos de difusión.
Entonces, lo esencial aquí en los métodos es, bueno, tenemos algo aquí atrás, un inóculo que está estandarizado para que tengamos la cantidad correcta de bacterias
en la prueba, y luego tenemos un medio donde está creciendo, donde tenemos que verificar las condiciones del medio. Y luego tenemos, cuando están en contacto,
cuando las bacterias están creciendo en el medio, entonces tenemos que verificar la temperatura, las condiciones y los gases, y tenemos que hacer un control de
calidad con cepas de control de calidad que tienen los resultados esperados y rangos. Y cuando lo hacemos en el laboratorio, tenemos que medirlo de alguna manera.
Podríamos hacerlo de varias formas. Ahora estamos hablando principalmente de la forma fenotípica, la forma de hacer crecer las bacterias en los medios y observar el
resultado. Pero también podríamos hacerlo molecularmente.

Muchos de nuestros laboratorios están haciendo pruebas moleculares, ya sea por PCR o por secuenciación genómica, y pueden buscar directamente allí la
determinación de la resistencia. Entonces podemos mirar directamente en los genomas o hacer pruebas para detectar los genes de resistencia. Todavía no es muy
práctico, pero realmente está llegando. Y de hecho, hoy en día es una de las principales formas en que lo hacemos. Ahora, cuando tenemos una nueva resistencia y
acabamos de tener el ejemplo de hace dos semanas en el que tenemos un nuevo gen en camino, la primera cadena con él no estaba probando las cadenas, no las
llevaba todas al congelador. No, verificamos los genomas. Y de esa forma, en un fin de semana, probamos 3.000 hebras. Nunca podríamos hacer eso haciendo pruebas
en el laboratorio. Entonces, cuando tenemos la información, cuando tenemos los datos, cuando tenemos la posibilidad de hacer pruebas moleculares, es realmente
muy práctico, muy rápido.

Cuando no lo hacemos, y luego la información clínica de que también necesitamos la prueba fenotípica, también hacemos pruebas fenotípicas porque es
complementaria a la molecular. También porque da la información clínica que necesitamos para el paciente, realmente in vitro, también porque en las pruebas
moleculares a veces hay genes que están ahí pero no expresados. Así que aquí vemos el efecto. Y podemos tener ambos test cualitativos que dan una clasificación, si es
resistente, intermedio o totalmente susceptible. O podemos tener la clasificación cuantitativa de los resultados donde tenemos la concentración real, una
concentración inhibitoria mínima atribuida a una determinada droga a esa especie que tenemos. Entonces, cuando hacemos estas pruebas, tenemos los métodos,
como les dije, hay mucha estandarización. Están los estándares y elegimos qué métodos. Todavía tenemos algunos métodos para elegir, y los elegimos en función de lo
fáciles que son, lo flexibles, lo que necesitamos, lo que queremos hacer, a veces necesitamos hacer algunos sistemas automáticos que podrían estar disponibles para
que sea más rápido hacer más pruebas. También podría depender de cuánto cuesta y cuántas habilidades técnicas tenemos, y así sucesivamente. Pero estos métodos
se basan básicamente en tres variantes diferentes. Bueno, dos grandes variaciones que son la difusión y la dilución, y luego en la dilución podrían estar en caldo y agar.
Y tienen estas fases, y se desarrollarán a partir de ahí. Todos ellos tienen una estandarización en marcha, y si obtenemos resultados de resistencia cualitativos o
cuantitativos depende de los métodos que utilizamos. Si usamos cualitativo, lo que queremos saber, ¿es resistente? ¿Es susceptible? ¿O obtenemos un resultado
intermedio? Y aquí, básicamente, queremos tomar una decisión para el tratamiento. Es difícil de comparar porque es cualitativo, no tenemos tanta seguridad con los
métodos, a menos que usemos algunos cálculos de estas zonas de diámetro. Por ejemplo, que puedo mostrarte más adelante. Para los resultados cuantitativos,
obtenemos un número, obtenemos una concentración, por lo que es mucho más preciso. Y esta información se puede compartir y comparar entre laboratorios.
Entonces, cuando elegimos esta concentración inhibitoria mínima, que es la concentración antimicrobiana más baja que inhibirá realmente esa especie en particular o
esa cepa en particular.

Estamos diciendo que esa concentración es la MIC y que debería ser similar en otro laboratorio. [TOS] Así que en realidad es la medida básica del efecto de la droga en
esa cadena en particular. ¿Entonces como hacemos esto? Bueno, tenemos la vía cualitativa, el primer método que fue descubierto por Kirby y Bauer, y es básicamente
un método que se lleva a cabo en una placa de Petri con agar, con un medio sólido sobre ella .Y hay un agar , y esparces una capa del inóculo bacteriano. Eso se difunde
de una manera estándar determinada. Y luego colocas estos discos que contienen antimicrobianos en papel. Entonces contiene la droga. La droga se difundirá. Este se
incubará en una incubadora de un día para otro. Y cuando vas allí al día siguiente y miras el plato, ves esto. Ves el crecimiento de las bacterias en la capa y ves algunas
además alrededor de los discos. Y lo que harías es seguir, medir los diámetros, y ese es el diámetro de su zona de inhibición. Estos diámetros de la zona de inhibición se
pueden consultar en tablas. Y para un determinado antimicrobiano y una determinada especie de bacteria, tiene una tabla que le indica si es resistente, es susceptible
o es algo intermedio. Y ese es tu resultado cualitativo.

Cuando utiliza métodos de dilución, obtiene un resultado cuantitativo. Entonces, tienes medios. Que es líquido, por ejemplo, en pocillos, en placas de microtitulación
que tienen aproximadamente 5200 microlitros de medio líquido. O en tubos, que es un volumen mayor, pero es un enfoque similar. Y tienes aquí un rango de
concentraciones de la droga. Y pones la misma cantidad de bacterias y luego lees el crecimiento o no crecimiento. Aquí veríamos crecimiento, aquí no veríamos
crecimiento. Y aquí no hay crecimiento y los turbios tienen crecimiento.

Puede hacer algo parecido, en lugar de hacerlo en tubos, en placas de agar. Entonces, la concentración del antimicrobiano está en las placas. Tiene placas para cada
concentración y luego detecta las bacterias que desea analizar. Si crecen, es crecimiento. Si no crecen, no hay crecimiento.

Y tiene los mismos puntos en cada concentración, por lo que también puede medir su concentración inhibitoria mínima.

Tiene algo intermedio, que es este enfoque de prueba electrónica. Que es una prueba de difusión, pero debido a que es muy especial, tienes una tira donde está el
medicamento antimicrobiano. Pero la droga está en un gradiente de modo que la concentración más alta en este lado y la más baja en este. Y cuando se difunde,
provoca una elipse. Y está hecho de una manera inteligente que realmente puede leer el resultado en la escala como un resultado MIC aquí. Así que este es un enfoque
mixto. No es un método muy estándar, pero se usa bastante. Sin embargo, es bastante caro.

Así que esta fue una introducción a los métodos. Tendremos algunas conferencias detalladas sobre los métodos reales en sí. Muchas gracias