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FUNDACIN UNIVERSITARIA SAN MARTIN EN CONVENIO CON LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA PARASITOLOGA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS Docente: JORGE IVN

ZAPATA VALENCIA

GUA DE LABORATORIO DE PARASITOLOGA 003 II sem 2011 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE MATERIA FECAL
Objetivos Aplicar la tcnica de examen coprolgico directo con solucin salina y lugol, tambin llamado examen coproparasitolgico o coprologa, para la visualizacin de parsitos intestinales. Familiarizar al estudiante con el manejo de muestras de inters parasitario. Adquirir destreza en el manejo correcto del microscopio compuesto, herramienta primordial para realizar el diagnstico de parsitos intestinales. Introduccin. Los parsitos intestinales, as como algunos pulmonares y hepticos o biliares, pueden ser diagnosticados por medio de tcnicas conocidas como examen coprolgico directo. Estas tcnicas se basan en la identificacin directa del parsito con base en sus caractersticas morfolgicas y el conocimiento de los estadios del ciclo de vida que pueden estar presentes en una muestra de materia fecal. Este examen es complementario al examen clnico y los datos aportados por el propietario del paciente. En ciertas ocasiones, por el tamao o el nmero de las formas parasitarias evacuadas en materia fecal, es necesario recurrir a tcnicas de coloracin o de concentracin (enriquecimiento) para aumentar la sensibilidad y especificidad del examen diagnstico. En otros casos, dependiendo del tipo de parsito y su ubicacin se deben usar tcnicas de xenodiagnstico, inmunolgicas o moleculares. Sin embargo, las tcnicas de diagnstico directo son las ms usadas en la rutina de trabajo diario por su confiabilidad, simplicidad y bajo costo. Desarrollo de la prctica de laboratorio. A. Aspectos importantes a tener en cuenta para el diagnstico directo de parsitos en muestras fecales por examen en fresco. 1. La primera cosa que hay que tener en cuenta es que una preparacin en fresco es tridimensional y, por lo tanto, es necesario ajustar el enfoque constantemente mediante el uso del tornillo micromtrico para poder visualizar los objetos que estn en diferentes planos. 2. Verifique que el diafragma del microscopio est abierto para que pase suficiente luz para trabajar adecuadamente. Cuando use los objetivos de 4X y 10X el diafragma debe estar casi cerrado, bralo un poco para el objetivo de 40X y an ms para el de 100X. 3. El condensador se debe llevar a su posicin ms alta. No ajuste la intensidad de la luz con el condensador, use para ello el diafragma. B. Como observar una muestra en fresco. Cuando se examina una lmina en busca de huevos y quistes de parsitos se recomienda empezar a hacer la bsqueda desde una de las esquinas de la laminilla cubreobjetos (22 mm X 22 mm) con el objetivo de 4X, el cual permite observar los huevos de helmintos de manera fcil en toda la preparacin. Una vez realizada esta primera parte del examen se pasa al objetivo de 10X en busca de objetos que parezcan compatibles con las formas qusticas de los protozoarios. Una vez visualizada una de estas estructuras se debe pasar a enfocar en 40X para hacer la identificacin precisa. Tener presentes que al pasar al objetivo de 40X es

necesario abrir un poco el diafragma. Una vez terminado el examen en 10X recorrer al menos un cuarto de la preparacin con el objetivo de 40X para encontrar los quistes o trofozoitos ms pequeos.

Cuando no se tiene una amplia experiencia se recomienda en cada lmina portaobjetos hacer dos preparaciones, una con solucin salina y otra con lugol, para mejorar en esta ltima el contraste y as poder observar estructuras claves en la identificacin. C. Coleccin y preparacin de la muestra. Las heces frescas y especialmente aquellas que se obtienen directamente del recto son las ms recomendadas para el examen directo por no presentar contaminacin con elementos ambientales que pueden dificultar la interpretacin de los resultados. De no ser posible esto se toman aquellas muestras que se observen en el momento de su eliminacin. En ltimo caso se tomarn aquellas que se observen ms frescas de las que estn en el piso, pero evitando tomar la parte contaminada con tierra u otros elementos. En algunos casos es recomendable aislar los animales para estar seguros de cual es paciente del que toma la muestra. Cuando se trata de lotes grandes de animales (aves de corral, cerdos, rebaos) se recomienda tomar aleatoriamente muestras al 10% o 20% de los animales, bien de manera individual o haciendo un pool de muestras. Una vez recolectada la muestra se debe rotular el recipiente con su nombre o nmero de identificacin, el lote, fecha etc para el correcto registro de los resultados. La muestra debe ser enviada en el menor tiempo posible al laboratorio para ser procesada y evitar que los trofozoitos de los protozoarios se deterioren y los huevos de los nematodos maduren y eclosionen. Para evitar esto, se pueden enviar las muestras en bolsas tipo Ziploc las cuales deben cerrarse extrayendo todo el aire posible antes de llevarlas al laboratorio. Cuando la muestra es recogida del suelo o de un animal pequeo se pude usar un recipiente limpio de boca ancha y tapa rosca. Cuando se toma la muestra directamente del recto se puede usar el guante o la bolsa plstica que se emple para la toma de la muestra como envase para el envo de la misma al laboratorio. La cantidad de muestra de materia fecal que se debe recoger depende del tamao del animal en cuestin. Para especies mayores son necesarios unos 100 g, para especies de tamao medio unos 50 g y para especies menores unos 20 g. En el caso de los conejos se pueden enviar unos 10 bolos de heces y para las aves la deposicin completa. Como lo aconsejables es realizar un examen seriado de al menos tres muestras en un lapso no mayor a 10 das (una muestra puede detectar el 72% de las infecciones, mientras que tres muestras permiten detectar >95%), las muestras deben recogerse los diferentes das aproximadamente a la misma hora, para reducir la variabilidad por la inestabilidad en la excrecin de los parsitos. En el caso de animales que hayan recibido antibiticos, antiparasitarios o lquidos de contraste para exmenes imaginolgicos debe esperarse hasta por cinco das para recoger una muestra que sea ptima para el examen directo. D. Conservacin de las muestras. Cuando una muestra no puede procesarse inmediatamente se pude conservar por unas horas en la nevera a 4C, excepto si se van a emplear para aislar larvas de nematodos. Si el procesamiento se va a realizar un da diferente a aquel en que se toma la muestra se recomienda conservarla en formol salino al 5% o 10% (formol en solucin salina fisiolgica), en una proporcin 3:1 de formol salino:heces. Puede conservarse de esta manera del 10% al 15%

de la muestra. Siempre que se haga este procedimiento se debe homogenizar muy bien la materia fecal para asegurar que el preservante entra en contacto con toda la muestra. Cuando la muestra se va a emplear para el aislamiento de larvas de nematodos no puede ser fijada pues las tcnicas que se emplean para este procedimiento requieren que los gusanos estn viables. Las muestras enviadas selladas en bolsas Ziploc pueden tenerse a temperatura ambiente hasta por cinco das. Cuando el laboratorio est muy lejos del sitio de toma de la muestra y el envo puede tardar entre 24 y 48 horas, se recomienda colocar los viales (cuyas tapas deben ser hermticas) con las muestras en un recipiente con hielo para su conservacin en buenas condiciones. E. Anlisis macroscpico. Es importante registrar el color, el olor y la consistencia de la muestra, as como la presencia de estructuras parasitarias (segmentos o parsitos completos), moco, sangre o restos alimenticios sin digerir que puedan verse en la muestra. Cuando el propietario refiera que ha detectado la presencia de estructuras parasitarias macroscpicas se le debe recomendar recogerlas en recipientes hermticos con alcohol al 70% o agua y llevarlas al laboratorio tan pronto le sea posible. En algunos casos es aconsejable comparar la muestra con las de animales sanos del mismo lote. Igualmente es bueno preguntar al propietario sobre los alimentos que ingiri el paciente pues podra ser que su cuadro se deba a un problema de tipo intoxicacin alimentaria ms que un problema parasitario. F. Prctica: Preparacin de muestras en fresco para examen microscpico. 1. En una lmina porta-objetos colocar una gota de solucin salina y otra gota de lugol, separadas por unos 2 cm. 2. Con un palo agitador de madera pinchar la muestra en diferentes puntos u homogenizarla (si su consistencia es blanda) y tomar una pequea porcin para hacer una mezcla con cada una de las gotas puestas en el portaobjetos. Hacer primero la mezcla con la solucin salina y luego con el lugol. 2. Si la muestra est lquida, colocar una gota de la misma en el portaobjetos y usar solucin salina si es necesario adelgazarla un poco. 3. Cubrir la muestra con el cubre-objetos, asegurndose que no queden burbujas y que el vidrio quede homogneamente equilibrado. La muestra debe permitir ver las letras de una hoja impresa cuando se mira a travs de ella. 4. Examinar la preparacin como se recomend en el punto B. Como este procedimiento examina una muy pequea cantidad de muestra (no mayor a 0.2 mg) se recomienda principalmente para cuando se sospecha la presencia de trozoitos, si la cantidad de muestra es muy pequea para usar otra tcnica o como tamizaje previo a un sistema de enriquecimiento o concentracin. G. Reporte de laboratorio. 1. Sistema de Cruces: Es un sistema cualitativo ms que cuantitativo. Se basa en el nmero de formas parasitarias observadas por campo de 10X y se utiliza la siguiente tabla: Cruces + ++ +++ ++++ Interpretacin 1-3 parsitos por campo 4-7 parsitos por campo 8-10 parsitos por campo >10 parsitos por campo

Este mtodo est cada vez en mayor desuso pues su interpretacin es muy subjetiva y no permite mayor certeza para cuando hay que hacer seguimiento a un tratamiento. 2. Recuento usando cmara de McMaster: Este mtodo cuantitativa se basa en el empleo de una cantidad estndar de muestra y una lmina porta-objetos con una cuadrcula y un volumen

especfico que permite hacer la cuantificacin de los huevos, quistes y ooquistes por gramo de heces. 3. Reporte de presencia o ausencia de parsitos. Es un mtodo cualitativo en el cual no se realiza ningn tipo de recuento. Cuando no se observan formas parasitarias es aconsejable no reportarlo como Negativo si no expresarlo como No se observaron parsitos. En cualquiera de los casos se deben informar la especie (indicando Gnero y especie) y estadio(s) observado(s). H. Trabajo en grupo previo al laboratorio. Responda las siguientes preguntas y elabore un trabajo escrito en grupos de 4 estudiantes. Solo se reciben trabajos escritos a mano en legra legible, no pierda el tiempo hacindolo en computador pues no los recibir. El trabajo debe entregarse el mismo da en que se programe la prctica de laboratorio. El trabajo debe ir acompaado de las referencias bibliogrficas que consultaron para responder cada pregunta. 1. Por qu para el diagnstico de algunos parsitos el examen directo por microscopia no es suficientemente sensible para detectarlos? 2. Por qu para algunos parsitos es necesario usar coloraciones especiales? Mencione dos coloraciones tiles en diagnstico de parsitos intestinales y dos para parsitos hemticos 3. Por qu en el diagnstico de algunos parsitos es necesario usar tcnicas de concentracin?. Mencione tres parsitos en los cuales son tiles estas tcnicas y mencione 2 tcnicas que se empleen con frecuencia 4. Por qu cuando una muestra de heces no se va a procesar inmediatamente se mezcla con formol salino? Que otras sustancias (mencione 2) pueden emplearse para preservar las muestras de materia fecal? 5. Qu utilidad ofrecen las tcnicas de esporulacin en dicromato de potasio y en cido sulfrico? 6. Por qu para algunos parsitos intestinales es til la tcnica de la cinta transparente o cinta de Graham?

I. Referencias Bowman DD. Parasitologa para Veterinarios. 8 Edcn. Elsevier. 2004 Cordero del Campillo M y Rojo Vsquez FA. Parasitologa veterinaria. McGraw-Hill. 1999 Urquhart GM et al. Parasitologa Veterinaria. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. 2001 Velez RA. Guas en Parasitologa Veterinaria. Exitodinmica Editores. Medelln. 1983 www.scholar.google.com

Materiales y reactivos para la prctica: Muestras de materia fecal Palos agitadores de madera Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Solucin salina fisiolgica Solucin de lugol Microscopio compuesto Toallas absorbentes Guantes

Recuerde dejar el microscopio apagado y limpio. Igualmente el laboratorio debe quedar ordenado y limpio.