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Tendencias en biotecnología

Revisar
Herramientas contemporáneas para regular la
expresión genética en bacterias
Ross Kent1,@y Neil Dixon1,2,@,*

Los conocimientos obtenidos de nuevos paradigmas mecanicistas en el control de la expresión génica han llevado al Reflejos
desarrollo de nuevos sistemas de expresión génica para aplicaciones de bioproducción, control y detección. Junto con Actualmente se dispone de una enorme variedad de
una mayor comprensión de la carga sintética y enfoques modernos y creativos de biodiseño, están surgiendo herramientas de regulación genética que permiten el

herramientas y sistemas contemporáneos de expresión de genes bacterianos que permiten ajustar la expresión, lo control de la expresión genética en todos los niveles

que permite una mayor previsibilidad y maximización de la productividad específica, al tiempo que minimiza los del dogma central.

efectos nocivos sobre la viabilidad celular. Estos avances se han logrado mediante el uso de una gran cantidad de
Hacer coincidir la demanda de producción con
herramientas regulatorias, que operan en todos los niveles del llamado "dogma central" de la biología molecular. En
la capacidad celular puede reducir la carga y
esta revisión, discutimos estas herramientas de regulación genética en el contexto de su diseño, creación de
permitir una producción estable en escalas de
prototipos, integración en sistemas de expresión y aplicación biotecnológica. tiempo más largas.

Modernoen siliconaLas herramientas de diseño

De la sobreexpresión a la regulación precisa: ingeniería del control de la expresión
permiten diseñar y optimizar rápidamente
genética circuitos genéticos complejos.
Históricamente, los investigadores se han basado en un número relativamente pequeño de mecanismos para regular la
expresión de genes heterólogos.[1]. Estos sistemas tradicionales se han centrado en la sobreexpresión masiva de genes en un La creación de prototipos sin células de piezas y
dispositivos genéticos es una herramienta
esfuerzo por maximizar el producto.producir (verGlosario). A menudo, los sistemas desarrollados para la sobreexpresión se
emergente pero poderosa para mejorar el ciclo
adaptanad hocpara la integración en circuitos genéticos. Si bien son adecuadas para la rápida acumulación de altos niveles de
de diseño-construcción-prueba-aprendizaje.
proteínas, estas herramientas a menudo son insuficientes para desarrollar los sistemas más precisos necesarios para muchas
aplicaciones modernas de detección, computación y producción. El uso de circuitos de retroalimentación
para facilitar la regulación dinámica de
En los últimos años se han visto mejoras en la funcionalidad de las herramientas de regulación genética, mejorando la utilidad la expresión genética permite a los
de una regulación dinámica y sintonizable. En cualquier esfuerzo de bioproducción, a menudo existe un importante equilibrio investigadores construir vías de

entre rendimiento, acumulación de biomasa ytítuloque debe ser considerado (Figura 1A). Este equilibrio es importante para respuesta para minimizar la carga
metabólica celular.
una variedad de aplicaciones biotecnológicas para garantizar la viabilidad y estabilidad del proceso. A medida que aumenta
nuestra capacidad para diseñar sistemas más complejos, aumenta la importancia de armonizar la expresión genética con la
La regulación de la expresión ligada al
capacidad metabólica del organismo huésped, ochasis,reduciendo elcargaasociado con la función de ingeniería solo aumenta. estrés permite el acoplamiento de la
En el caso de la producción de proteínas recombinantes, la síntesis aberrante de proteínas puede provocar una sobrecarga de producción heteróloga con vías endógenas
la capacidad celular, como la síntesis o la secreción. Ambas limitaciones de recursos, como la disponibilidad limitada de de respuesta al estrés.
aminoácidos y ribosomas.[2]y síntomas de sobrecarga de capacidad celular, como alteración del plegamiento de proteínas y de
la capacidad de secreción[3–5], puede afectar la viabilidad celular. La demanda de recursos y la sobrecarga también presentan
un desafío para los esfuerzos de ingeniería metabólica donde la concentración de sustrato, intermediario y producto puede
tener efectos nocivos sobre la viabilidad celular.[6]. Este problema se exacerba cuando se consumen metabolitos y/o cofactores
centrales, lo que crea una mayor competencia por los recursos celulares.

Existe una carga celular asociada con el alojamiento de circuitos heterólogos.[7–9]. La carga asociada al circuito es una
consideración importante que debe tenerse en cuenta a medida que intentamos construir circuitos genéticos de complejidad
creciente. Comprender las causas y los efectos de esta carga es importante para construir circuitos que se comporten de
manera predecible, con un impacto reducido en la aptitud celular. Cualquier defecto de crecimiento causado por un circuito
genético puede conducir a una tasa de crecimiento modificada, presión de selección y, en última instancia, deriva genética.
1Instituto de Biotecnología de Manchester y
Facultad de Química, Universidad de
Dados los avances en la cuantificación de la carga y la creciente complejidad de las redes reguladoras de genes sintéticos,
Manchester, Manchester, Reino Unido
nuestra capacidad para diseñar biología de manera predecible está aumentando.[7,9,10]. La carga asociada con la integración
2https://dixonlab.org/
de circuitos heterólogos a menudo es causada por la falta de ortogonalidad, la competencia por los recursos[8,11,12], como
@Gorjeo:@BiotecnologíaDixon(N. Dixon),
ribosomas entre sistemas heterólogos y nativos[13-15], e incluso toxicidad del ARNm[dieciséis]. En el centro de todos los @rwk202(R.Kent).
intentos de equilibrar la demanda con la capacidad celular está la necesidad de ajustar con precisión el flujo de información del * Correspondencia:
ADN al ARN y a las proteínas. Sin embargo, para construir neil.dixon@mancheser.ac.uk

316 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.09.007

ª2019 Los Autores. Publicado por Elsevier Ltd. Este es un artículo de acceso abierto bajo licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Tendencias en biotecnología

Para disponer de circuitos genéticos robustos y predecibles, es esencial lograr un equilibrio entre la función del circuito y la
viabilidad celular, especialmente si esperamos aplicar el circuito genético dado para fermentaciones a gran escala durante Glosario
escalas de tiempo prolongadas. Las herramientas modernas para regular la expresión genética permiten la construcción de Carga:Impedimento de la función
metabólica y celular normal causado por
mejores plataformas de producción mediante el ajuste fino de la expresión genética, la regulación dinámica y la capacidad de
la incorporación de un elemento genético
respuesta autónoma y sensible a las cargas.comentario[10,17-21]para ayudar a superar esta barrera.
heterólogo. Cascada:Regulación de
múltiples niveles mediante la cual el
La biblioteca en constante expansión de herramientas genéticas hace que sea cada vez más importante definir las control en un nivel conduce al control de

características funcionales y las capacidades reguladoras de un sistema genético.parte.A la luz de la creciente diversidad de los niveles posteriores en un esquema
regulatorio.
herramientas regulatorias, aquí proporcionamos un resumen de las características deseables de los sistemas de control de la
Chasis:Organismo biológico con
expresión génica, herramientas de diseño y creación de prototipos, y nuevos mecanismos regulatorios que se han desarrollado funciones de automantenimiento,
en los últimos años. replicación y capacidad de respuesta
codificadas dentro del genoma,
rediseñado para simplificar la
Características deseables de los sistemas de control de la expresión genética ingeniería adicional, mejorar la
robustez y la ortogonalidad del futuro.
Los sistemas de expresión genética diseñados tienen varias características deseables, incluido un amplio aplicaciones.
rango dinámico, un control estricto sobre la expresión basal y una tasa de expresión ajustable tras la Interferencia de repeticiones
inducción.Figura 1B). Al seleccionar un sistema en particular, es importante decidir si la aplicación requiere palindrómicas agrupadas regularmente
intercaladas (CRISPRi):que comprende
ortogonalidad del chasis y el tipo de dosis-respuesta requerida (es decir, digital o analógica). Al satisfacer
una endonucleasa Cas9 catalíticamente
todas estas características, podemos construir redes de genes que permitan diseñar redes reguladoras con
inactiva (dCas9) y un único ARN guía
funciones complejas, al tiempo que reducen su impacto sobre el metabolismo celular, minimizando así los (sgRNA); puede ser dirigido para unirse al
efectos sobre la viabilidad y maximizando el título del producto. Los sistemas de expresión genética ADN en ubicaciones específicas del
diseñados son herramientas poderosas para la producción de moléculas objetivo, como proteínas genoma.
Comentario:Capacidad de señalización
terapéuticas, enzimas industriales y reactivos de investigación. Además, aprovechando las capacidades de
donde la generación de una señal de
detección y señalización de los sistemas genéticos, es posible: diseñar biosensores de células completas[22]; salida conduce a un cambio en la
regular el flujo de la vía metabólica[23]; construir circuitos genéticos complejos[24]; y realizar cálculos magnitud de una señal de entrada, que a
celulares [24,25](Figura 2C). su vez modifica la salida. Este bucle
regulatorio puede actuar de manera
positiva o negativa. Parte:Unidad genética
Modernoen siliconaSe han desarrollado herramientas, como Cello, para el diseño de circuitos genéticos según un conjunto
que lleva a cabo una función específica
específico de especificaciones, al tiempo que proporciona al usuario una predicción del rendimiento del circuito.[26]. Usar Cello dentro de un sistema o dispositivo.
como parte de una inicialen siliconaEl ciclo de diseño-construcción-prueba-aprendizaje puede informar la selección de piezas y
el diseño de la red reguladora de genes deseada (Figura 2A), aunque la demostración de esta herramienta hasta la fecha se ha ARNP T7:ARN polimerasa del
bacteriófago T7 comúnmente
limitado aEscherichia coli.Una vez que se ha diseñado una función lógica adecuada, Cello o un software similar pueden
utilizada para la sobreexpresión de
seleccionar las piezas apropiadas.[27-29]. La automatización de la generación de circuitos genéticos de esta manera debería
genes recombinantes en bacterias.
ayudar a simplificar el diseño de redes reguladoras complejas, particularmente en organismos bien definidos. Los modelos Título:Cantidad de producto relativa
mecanicistas a menudo no logran predecir la función del circuito genético complejo y rara vez tienen en cuenta la diversidad al volumen de cultivo, expresada en
metabólica de diferentes organismos. Los esfuerzos recientes para abordar esta deficiencia pueden ayudar a fortalecer nuestra g/l.
Productividad volumétrica:cantidad de
capacidad para diseñar racionalmente sistemas y circuitos genéticos complejos y facilitar la biocomputación de células
producto producido por unidad de
completas.[25,30,31]. volumen y tiempo de cultivo (es decir, g/l/
h). Producir:Cantidad total de producto
Las herramientas de diseño genético automatizado dependen de bibliotecas definidas de elementos de ADN, generado por un proceso, en términos
relativos, a la entrada de materia prima o
a partir de las cuales se pueden seleccionar y construir las partes requeridas (Figura 2A). Con la expansión de
biomasa final, como g/g de glucosa o g/
varias bibliotecas de piezas (es decir, el Registro iGEM de piezas estándar[32], bases de datos[33], conjunto OD de biomasa.
de vectores[34,35], repositorios de protocolosiy estándares de datos[36,37]), este proceso de diseño seguirá
avanzando. Para permitir un desempeño robusto y predecible de los sistemas reguladores de genes, a
menudo es deseable construir sistemas que funcionen ortogonalmente a partir de otros componentes
dentro de la célula, incluidas partes heterólogas y maquinaria genética endógena. Si bien las herramientas de
diseño suelen ser eficaces para crear circuitos que funcionan como se espera, predecir interacciones no
deseadas entre los diseños genéticos y la maquinaria celular endógena sigue siendo un desafío importante.
A través de la estandarización de datos, protocolos y mediciones.[38,39], podemos mejorar la compatibilidad
cruzada de protocolos experimentales, datos y el aprendizaje asociado, entre grupos de laboratorio e
instituciones. Recursos comunitarios de biología sintética y gran colaboración, como iGEM[40], demuestran el
poder de la interoperabilidad y el intercambio de piezas de ADN estándar. A medida que avanzamos hacia
tecnologías de caracterización de circuitos más complejas (es decir, para la cuantificación de la transcripción y
traducción[9,41,42]), el uso de estándares para diseñar, ejecutar, medir y registrar esfuerzos experimentales
será aún más esencial.

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 317

Tendencias en biotecnología

Figura 1. Rasgos y características deseables de los sistemas modernos de expresión genética.

(A) La introducción de genes heterólogos en una cepa de producción conduce a la competencia por los recursos. En última instancia, esta competencia conduce a una importante
compensación entre la viabilidad y el crecimiento celular y el rendimiento de la producción. Mediante el uso de sistemas de regulación genética sintonizables, esta competencia se puede
reducir, lo que lleva a un equilibrio óptimo entre el rendimiento y la acumulación de biomasa. (B) Los sistemas de regulación genética dinámicos y sintonizables tienen varias características
importantes. La estricta regulación de la expresión genética basal facilita la ortogonalidad, reduce la carga asociada al circuito y permite la inducción oportuna según sea necesario. Es
esencial que la respuesta del circuito sea rápida para permitir una respuesta en tiempo real a las señales ambientales cambiantes. Para permitir una exploración adecuada del espacio de
expresión, resulta ventajoso construir sistemas de regulación genética que permitan la expresión en un amplio rango dinámico. Los circuitos genéticos también deberían permitir que la
cantidad total de expresión genética se ajuste fácilmente en respuesta a una señal de inducción específica.

Tecnología libre de células para la creación de prototipos de redes reguladoras de genes,

detección de alto rendimiento y biodetección
La creación de prototipos mediante síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se está convirtiendo rápidamente en
una herramienta importante para la biotecnología. Se han aplicado sistemas de expresión libres de células para
cuantificar las tasas de transcripción y traducción.[41]y evaluar la carga asociada con las redes genéticas[7,43]. CFPS
permite la creación de prototipos y la evaluación funcional de piezas y circuitos, la medición de su productividad
asociada y la posterior refactorización de la red genética para optimizar el rendimiento. CFPS también se ha utilizado
para la creación rápida de prototipos de redes genéticas.[44–46], caracterización de componentes[47,48], creación de
prototipos de vías metabólicas y descubrimiento de enzimas.[49], biosensores[50,51]y producción terapéutica
[52]. Estein vitroLa creación de prototipos proporciona un método útil para la rápida exploración y optimización de los
grandes espacios experimentales asociados con sistemas genéticos complejos.Figura 2B). Dada la reciente mejora en
la producción de lisado CFPS, es probable que esta herramienta gane popularidad en el futuro. [52–55].

318 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

(A)

(B)

(C)

(La leyenda de la figura continúa en la parte inferior de la página siguiente).

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 319

Tendencias en biotecnología

Recientemente, Swank y sus compañeros de trabajo adoptaron un enfoque interesante para diseñar la funcionalidad del factor
de transcripción (TF).[48]. Al combinar la expresión libre de células con microfluidos de alto rendimiento, los autores pudieron
caracterizar y ajustar la función de una biblioteca de TF sintéticos con dedos de zinc y, en última instancia, utilizar el
conocimiento adquirido a partir de esta caracterización libre de células para construir un nuevo gen regulador. red.

Mecanismos regulatorios en diferentes niveles del dogma central

La evolución ha proporcionado una serie de mecanismos reguladores que operan controlando el flujo de información
en diferentes niveles del llamado "dogma central" de la biología molecular. Esta diversidad ha inspirado numerosos
esfuerzos para introducir regulación en todo el dogma central. Aunque las definiciones modernas del dogma central
incluyen elementos de regulación que están mediados directamente por el metabolismo, por ejemplo a través de
especies reactivas de oxígeno.[56], aquí analizamos específicamente el flujo de información entre el ADN, el ARN y las
proteínas. Para obtener un resumen de estos puntos de control reglamentarios, consultefigura 3(Figura clave). Los
estudios clave se destacan entabla 1.

Regulación del inicio de la transcripción

Los TF regulan el inicio de la transcripción mediante la represión o activación de la unión del factor sigma y el posterior
reclutamiento de la ARN polimerasa (RNAP). Muchos estudios han utilizado la ingeniería de proteínas para modificar la unión
del ligando y la modificación del promotor para alterar la afinidad de la unión del operador del ADN. [48,57–60]. Recientemente,
Meyer y sus compañeros de trabajo lograron avances significativos en la mejora de la biblioteca de herramientas basadas en TF
de alto funcionamiento. Utilizando ingeniería TF avanzada, se optimizaron 12 reguladores transcripcionales inducibles de
moléculas pequeñas separados para aumentar su rendimiento y ortogonalidad en una sola cepa deE. coli[61].

En otro estudio, se aplicó una metodología de contraselección para modificar la especificidad del ligando y el
comportamiento dosis-respuesta del represor triptófano, ampliando los reguladores transcripcionales
ortogonales disponibles.[57]. El LacI[58]y AraC[62]Se han diseñado represores mediante este enfoque para
unirse a fucosa, lactitol y sucralosa, y ácido melavónico, respectivamente.

El control de la expresión génica mediado por el factor sigma es una tecnología reguladora emergente para ajustar el control
transcripcional[63–66]. Huang y sus compañeros construyeron un controlador de retroalimentación cuasi integral que utilizó
factores sigma extracitoplasmáticos y control de ARNs para desacoplar postranscripcionalmente dos genes de interés, cuya
expresión está funcionalmente vinculada mediante el intercambio de recursos celulares, en este caso la disponibilidad de
ribosomas.[66]. Este circuito de retroalimentación dinámica permite la compensación del nivel de ARNm después de una
producción reducida de proteínas, causada por la competencia por un grupo limitado de ribosomas. Este sistema permitió una
expresión genética más estable, a pesar de las fluctuaciones en la disponibilidad de ribosomas.

El principio de separar los elementos reguladores centrales de los dominios de unión al ADN específicos se
ha aplicado a una división diseñadaARNP T7[67]. Aquí, T7 RNAP se segmentó en unbyafragmento de núcleo,
que se colocaron bajo regulación inducible, y un panel desfragmentos que se acoplaron a una variante
específica del promotor T7. Al alterar el nivel del fragmento central, la expresión se puede alterar para
proporcionar un sistema ortogonal y sintonizable análogo a la topología del factor sigma-polimerasa
procariótica, donde cada factor sigma regula un subconjunto específico de genes.

Recientemente,interferencia de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPRi) se

ha utilizado para ajustar la expresión genética. Al dirigir una endonucleasa Cas9 (dCas9) catalíticamente inactiva a
regiones promotoras, es posible utilizar dCas9 como una proteína represora guiada por ARN, capaz de interferir

Figura 2. Diseño y optimización de circuitos genéticos de alto rendimiento.

(Un modernoen siliconaLas herramientas permiten el diseño de una función lógica genética basada en una especificación específica.[26]. Estas herramientas se basan en información sobre
piezas caracterizadas de bases de datos de piezas. Utilizando la información sobre la función de las partes, estas se pueden ensamblar en circuitos genéticos que realicen el cálculo deseado.
Estos circuitos pueden formar la base de dispositivos reguladores de genes dinámicos y receptivos, como la puerta AND que se muestra aquí. (B)in vitro La expresión de proteínas libres de
células se puede aplicar para la creación de prototipos y la optimización de redes reguladoras genéticas.[46,48,138], enzimas[49]y biosensores [50,51]. (C) Mediante la ingeniería y la
construcción de arquitecturas genéticas novedosas, las vías sensoriales nativas y las redes regulatorias se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones regulatorias, informáticas y de
detección dinámica.[20,23,89].

320 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

Figura clave

Control de la expresión genética a través del dogma central

Figura 3.Existen numerosas oportunidades para implementar un control regulatorio de la expresión génica a lo largo del llamado "dogma central" de la biología molecular, desde el inicio de
la transcripción hasta la estabilidad de las proteínas. Los puntos clave de la regulación son: (i) control de inducción[58]; (ii) factor de transcripción-unión al ADN[61]; (iii) reclutamiento de ARN
polimerasa[66]; (iv) inicio de la traducción[83]; y (v) degradación de proteínas[118]. Se han desarrollado muchas herramientas regulatorias modernas para permitir el flujo de información a
través de estos puntos de control clave, que incluyen: ingeniería de factores de transcripción para alterar la especificidad del inductor.[57]; Afinidad de unión al ADN y ortogonalidad parcial.
[61]; Interferencia de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPRi) para regular el inicio y el alargamiento de la transcripción. [69,73,113,139,140];
mediado por ARNcisytrans-regulación actuando tanto de la transcripción como de la traducción.[90,100,105,112]; Ingeniería del sitio de unión a ribosomas (RBS) para modificar la tasa de
inicio de la traducción[85,86]; y regulación de la degradación de proteínas mediante la expresión de proteasas sintonizables[78,118].

con transcripción mediante impedimento estérico del tráfico de polimerasa[68–70]. Este poderoso
enfoque permite atacar múltiples genes simultáneamente de una manera sintonizable alterando la
expresión de dCas9[71]o el grado de complementariedad entre el ARN guía sintético (sgRNA) y la
secuencia objetivo[72].

Un estudio reciente combinó la modificación estructural de CRISPRi y ligando de ARN mediante la incorporación de un
dominio aptámero de unión a ligando en un sgRNA. Al modificar el sitio de integración del aptámero, los autores
facilitan la activación o represión de la expresión de la regulación mediada por CRISPRi inducida por ligandos.

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 321

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Cuadro 1. Estudios clave que utilizan la regulación en diferentes niveles del dogma central

Dispositivo regulador Nivel de regulación Mecanismo de control Comentarios Árbitros

y/o sistema

lacI Iniciación de la transcripción TF ReingenieríalacIpara especificidad de [57,58,62]

ligando modificada

Circuito de adicción Iniciación de la transcripción TF Concentración del producto acoplada a la [123]

viabilidad celular.

AraC-LasR Iniciación de la transcripción Promotor – TF Ajuste dosis-respuesta a través de TF [59]

e ingeniería de promotores

Marioneta Iniciación de la transcripción TF 12 biosensores ortogonales [61]

optimizados en una cepa.

rosalinda Iniciación de la transcripción TF Biodetección sin células utilizando TF y [50]

aptámero de espinaca

PAGcsid-Fcs Iniciación de la transcripción Promotor activado por falta de La detección de nutrientes combina el [23]
carbono agotamiento de la glucosa con la expresión

genética para el bioprocesamiento de lignina

CUENTO-TEV Iniciación de la transcripción TALE-proteasa Mediada por TALE sintonizable [78]

regulación de la expresión genética

Promotores estables Iniciación de la transcripción TALE acoplado-promotor Bucle de retroalimentación basado en TALE

para estabilizar la actividad del promotor en

respuesta a cambios en el número de copias

CRISPRi Iniciación y elongación de la dCas9 Cas9 inactivo actúa como un factor de [72]
transcripción. transcripción programable al bloquear el
inicio de la transcripción y el tráfico de la
polimerasa, según la ubicación de
destino.

CRISPRi-Theo Iniciación y elongación de la dCas9 + ARNlig ARN guía diseñado para contener un [73]
transcripción. dominio de aptámero de unión a
teofilina para la represión y
activación de la expresión

ARN antisentido + degradación del ARN y ARNi y CRISPRi Enfoque combinado de ARN [77]
CRISPRi iniciación y elongación de la antisentido y CRISPRi para ajustar la
transcripción expresión genética

Punto de apoyo Iniciación de traducción Trans-ARN Basado en desplazamiento de hebras.trans- [111]

regulación interina de accesibilidad de RBS

Asignador de recursos Iniciación de la transcripción polimerasa T7 Sistema Split T7 con análogo.s- sistema [67]
de factores para la asignación diferencial
de polimerasa

Ribosomas ortogonales Iniciación de traducción ribosoma ortogonal yLacI/ LuxR Asignación dinámica de ribosomas [14,88]
ortogonales a través de retroalimentación.

(Continúa en la siguiente página)

322 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

Tabla 1.Continuado

Dispositivo regulador Nivel de regulación Mecanismo de control Comentarios Árbitros

y/o sistema

bucle para regular la producción de

ARNr 16S ortogonal en condiciones de
alta demanda de ribosomas

Riboswitches Múltiple cis-ARN Regulación de moléculas pequeñas de la [89,90,103,106]

expresión génica a través de ARN-

detección mediada y
transducción de señales encis

ESTRELLAS Alargamiento de la transcripción Trans-ARN Trans-regulación actuante de las [112]

horquillas de terminación

transcripcional

FÉNIX Degradación de proteínas ClpXP/ClpAP y proteasa Nia bajo Sistema dual de proteasas para desacoplar [118]
Ptetacontrol inducible crecimiento y producción

Promotor de estrés– Iniciación/elongación de la transcripción Promotor de respuesta al estrés general [20]

dCas9 acoplado a CRISPRi para
Control programable de la expresión
genética después del estrés.

Comentarios dinámicos Iniciación de la transcripción TF Regulación dinámica en respuesta al [127]

estrés para el estrés de glucosa,
oxígeno y acetato

Comentarios dinámicos Iniciación de la transcripción El perfil de microarrays de las células [121]

después de la toxicidad de FPP reveló

promotores que responden al estrés

específico, lo que permite la construcción de

una vía dinámica utilizando promotores de

respuesta al estrés.

Comentarios dinámicos Iniciación y elongación de la s32 y dCas9 P regulada por cargahtpG1 [20]
transcripción. promotor que regula CRISPRi

Transductor sin celdas Iniciación de traducción Enzima y TF Conversión de compuestos enzimáticos a [51]
sintiendo un compuesto detectable para ampliar las

capacidades de biodetección sin células

permitiendo una regulación en un rango de 16 veces[73]. Dado que se pueden expresar fácilmente múltiples
sgRNA, esta tecnología tiene potencial para regular hacia arriba y hacia abajo múltiples genes
simultáneamente a través de un solo dCas9. Este puede resultar un método que ahorra recursos para
construir redes reguladoras de genes complejas porque se pueden regular numerosos genes sin necesidad
de expresar múltiples TF, sino transcribiendo sgRNA. Se han implementado enfoques CRISPRi múltiples
alternativos para modular la expresión de múltiples sgRNA y/o dCas9 para ajustar la expresión génica
mediada por CRISPRi en respuesta a la inducción de moléculas pequeñas.[71]y entradas de luz de diferentes
colores[74]. CRISPRi también se ha utilizado para modular el metabolismo central directamente ajustando la
producción de flavonoides.[75]y terpenoides[76].

Los enfoques de ARN antisentido (asRNA) también se han combinado con CRISPRi para apuntar a múltiples sgRNA,
alterando su tasa de degradación y, por lo tanto, regulando simultáneamente la expresión de múltiples genes.[77]. La
modularidad entre el controlador central Cas9 y la secuencia de direccionamiento de sgRNA,

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 323

Tendencias en biotecnología

combinado con el ajuste de asRNA, es un enfoque poderoso para optimizar vías completas dentro de un marco
regulatorio único.

Otra familia detrans-Los elementos reguladores que actúan son efectores similares a activadores transcripcionales
(TALE). Al igual que los sistemas CRISPRi, los TALE se han diseñado para permitir la represión y desrepresión de la
expresión genética. En un ejemplo, se incorporó la adición de un sitio de proteasa TEV a un TALE. Este sistema logró
una activación 78 veces mayor de la expresión genética[78]. Más recientemente, los TALE se han diseñado como parte
de un bucle de retroalimentación incoherente (iFFL) para construir un sistema de control integral, mediante el cual las
alteraciones positivas y negativas en el número de copias del gen conducen a un nivel de expresión TALE modificado.
[79]. Este sistema de regulación iFFL permitió una actividad promotora estable, lo que permitió una producción de
proteínas sólida y consistente a partir de múltiples plásmidos y loci genómicos, independientemente del número de
copias del gen, eventos de perturbación como la división celular y el cambio ambiental.

Regulación mediante ingeniería de ARN

Un método potencial para optimizar el título, el rendimiento y la biomasa es reducir la carga celular
modificando la tasa de inicio de la traducción (TIR) de cada enzima en la vía de interés. Usandoen silicona
herramientas para calcular la fuerza del sitio de unión a ribosomas (RBS) se ha convertido en un método
popular para predecir la en vivorendimiento de un RBS para un gen específico de interés[80–84]. El ajuste del
TIR también se ha ampliado para predecir la supuesta fuerza de las RBS dentro de los operones.[85]. La
calculadora Operon se utilizó para buscar y mapear sistemáticamente una vía de tres enzimas para mejorar
la producción de neurosporeno, utilizando un enfoque conocido como mapa de secuencia-expresión-
actividad (SEAMAP). Este enfoque también se aplicó a la reingeniería racional de una vía heteróloga de
Entner-Doudoroff enE. coli.Al modificar el equilibrio NADH:NADPH, la producción de neurosporenos mejoró
en un 97%[86]demostrando así el poder de este enfoque para mapear y optimizar rápidamente el panorama
de expresión de una vía multigénica.

El uso de ribosomas ortogonales.[87,88]ha permitido construir un innovador asignador de recursos

ortogonal del huésped, utilizando un mecanismo de retroalimentación basado en represores para alterar la
proporción de subunidades de ribosomas nativas:ortogonales en respuesta a la creciente demanda.[14]. Al
utilizar varios pares de ribosomas ortogonales, donde cada par corresponde a un gen particular, se pueden
construir vías donde cada gen se traduce ortogonalmente y se regula dinámicamente, independientemente
del otro nodo. Esto, a su vez, reduce la competencia de ribosomas entre genes nativos y aquellos en una vía
diseñada.

cis-Riborregulación mediada
mediado por ARNcis-Regulación de la expresión a nivel transcripcional y traduccional utilizando riboswitches
naturales, sintéticos y de ingeniería.[89–97]y ribozimas[98–101]Se ha demostrado que proporciona varias de
las características deseables de un sistema de expresión génica. Estos incluyen una estricta regulación de la
expresión basal, un amplio rango dinámico y una alta relación señal:ruido. Los riboswitches también se han
utilizado como biosensores para mejorar la producción de aminoácidos, como el triptófano.[102], lisina
[103]y vitamina B12[104], y para la detección y producción del flavonoide naringenina. [105,106]. Dado que los
ribointerruptores detectan y responden a su ligando afín sin necesidad de proteínas adicionales, estos dispositivos
reguladores producen un tiempo de respuesta más rápido en comparación con los sistemas basados en proteínas y
también deberían suponer una carga reducida para la maquinaria celular.[10]. Además, debido a que los riboswitches
funcionan encis,no hay riesgo de efectos no deseados y no es necesario equilibrar la estequiometría del regulador.

Los riboswitches sintéticos suelen mostrar rangos dinámicos modestos y bajos niveles de expresión, lo que
limita su utilidad en esta aplicación. En un estudio reciente se demostró que, al rediseñar el dominio de la
plataforma de expresión de un riboswitch mediador de traducción, era posible superar estas limitaciones.
[90]. Además, los riboswitches son altamente sensibles al contexto, y varios estudios han tratado de
comprender y superar esta limitación mediante la selección de conectores codificantes 5' optimizados con
codones y péptidos señal.[21,107], o integrando riboswitches en un diseño bicistrónico[108].

324 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

Además de estos desafíos, existe un número limitado de pares riboswitch-ligando de alto funcionamiento.
Metodologías desarrolladas recientemente para seleccionar nuevos dispositivos riboswitch para un ligando de interés
determinado, como la captura SELEX[109], yen siliconaenfoques de diseño[94,95]ayudará a los investigadores a
abordar esta deficiencia en el futuro. Estos métodos de diseño y selección de riboswitch recientemente desarrollados
ayudarán al desarrollo futuro de una variedad de dispositivos riboswitch de alto funcionamiento.

Un trabajo reciente de Dixon y sus compañeros de trabajo demostró el uso de la regulación mediada por riboswitch utilizando
un sistema T7 basado en RNAP.cascadapara mejorar el control de la expresión y permitir la valoración de la expresión
[21]. La regulación estricta y ajustable que ofrece el sistema RiboTite dio como resultado un rango dinámico que
había aumentado >10 000 veces tras la inducción. Esto hizo posible igualar la tasa de producción de proteínas con la
capacidad de secreción, reduciendo la sobrecarga de la vía dependiente de secYEG y aumentando los títulos de
secreción en la fermentación por lotes alimentados.[21].

Trans-Riborregulación mediada de la producción de proteínas.

La regulación a nivel de ARN también se puede aplicar para regular la producción de proteínas entrans,por ejemplo,
usando asRNA[110]y riboreguladores sintéticos, denominados "interruptores de pie"[24,111]. Recientemente,
Chappell y sus compañeros de trabajo utilizaron métodos computacionales para diseñar pequeños ARN activadores
de la transcripción (STAR), lo que dio como resultado un rango dinámico de -400, que se mejoró aún más hasta 9000
veces al expresar una variante inestable de GFP, que redujo en gran medida la señal de fondo de GFP.[112]. Este
impresionante control de la expresión demuestra el poder de la regulación de la expresión génica mediada por ARN.
Recientemente se aplicaron riboreguladores de punta junto con CRISPRi para modular la función del sgRNA en
respuesta a los ARN desencadenantes intracelulares, como el que responde al hierro.rybARNs y ARNm heterólogo de
mCherry[113].

Regulación postraduccional
Se han realizado intentos para modular la expresión a nivel postraduccional mediante la regulación alostérica de la
actividad RNAP. Los primeros ejemplos de esto incluyen los inhibidores de T7 LysS/E.[114]y LysY[115], que reducen la
expresión basal en sistemas basados en T7 RNAP. Un trabajo más reciente ha utilizado aptámeros inhibidores de la
polimerasa, junto con cleptámeros antisentido para ajustar la tasa de actividad de la polimerasa.
[116]. Si bien esta tecnología sólo ha sido evaluadain vitrohasta la fecha, su desarrollo paraen vivoLa regulación del
inicio de la transcripción puede resultar interesante.

En lugar de utilizar un inhibidor específico de un regulador maestro como T7 RNAP para controlar la actividad de las
proteínas, también es posible alterar la tasa de recambio de proteínas.[78,117]. Un ejemplo reciente de este marco de
regulación es el sistema FENIX, que utiliza un sistema de proteasa dual para la regulación postraduccional de la
función de las proteínas.[118,119]. Se insertaron dos etiquetas de degradación de proteínas, NIa y ssrA, en el marco
en el extremo C de la proteína de interés (Figura 4MI). Luego, las proteasas endógenas ClpXP y ClpAP reconocieron la
etiqueta ssrA, lo que llevó a la degradación constitutiva de la proteína. Tras la inducción de la niágen, la etiqueta ssrA
se escindió, deteniendo la degradación y permitiendo que se acumulara la proteína activa. La naturaleza simple y
modular de este sistema regulador significa que la función de cualquier proteína puede regularse mediante la simple
integración del motivo de proteasa dual FENIX en el extremo C terminal. Se demostró que este sistema desacopla la
producción de poli-3-hidroxibutirato del crecimiento en ambosE. coliyPseudomonas putida[118,119].

Regulación autónoma de la expresión genética para aliviar la carga metabólica

Dada la complejidad de los circuitos genéticos modernos, es importante minimizar la carga sintética que supone producir la
maquinaria necesaria para una regulación adecuada. Esto es particularmente importante en el caso de experimentos de
evolución dirigida y fermentación a gran escala. El crecimiento de poblaciones bacterianas al volumen y densidad celular
necesarios para la fermentación a gran escala es un proceso que requiere mucho tiempo y que a menudo requiere entre 60 y
80 generaciones de células para alcanzar la cantidad requerida de biomasa. Cualquier presión selectiva presente durante esta
fase de crecimiento conducirá inevitablemente a una deriva genotípica y a la selección de organismos "tramposos" no
productores.[120]. Al reprimir fuertemente la expresión de proteínas durante esta biomasa

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 325

Tendencias en biotecnología

Tendencias en biotecnología

Figura 4. Enfoques de bioprocesamiento de dos fases para mejorar la producción.

(A) El desacoplamiento del crecimiento y la producción puede permitir una mayor productividad y elimina la necesidad de equilibrar los
recursos requeridos por los esfuerzos de producción con el requisito celular para el crecimiento. Aprovechar los sistemas nativos de
hambre nos permite diseñar redes de regulación genética en las que la producción se activa en condiciones de limitación de recursos.
[23,90,127]. (B) La construcción de circuitos genéticos inteligentes y con capacidad de respuesta automática nos permitiría, en última
instancia, construir redes reguladoras genéticas que sean capaces de detectar, responder y remediar las causas de una carga excesiva o de
la pérdida de viabilidad.[20,121]. Dispositivos como estos pueden permitir una producción armoniosa al tiempo que reducen la inhibición
de la acumulación de biomasa. El desacoplamiento se ha logrado utilizando varios mecanismos diferentes, entre ellos: (C) producción
dependiente del carbono[23]; (D) control de múltiples capas mediado por riboswitch de la expresión basal y regulación ortogonal para
desacoplar el crecimiento y la expresión[21]; y (E) control inducible y dependiente de proteasas de los niveles de proteínas funcionales[118]
.

fase de acumulación y optimizando el circuito genético involucrado en la regulación, puede ser posible minimizar esta
presión selectiva y eliminar el riesgo del proceso de ampliación.

Para minimizar la carga asociada con tales procesos biosintéticos, varios estudios recientes han buscado desarrollar
circuitos de retroalimentación autorregulados que sintonicen la expresión genética en respuesta directa a

326 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

Un estímulo de estrés mediante la integración del circuito genético recombinante con sistemas endógenos de respuesta al
estrés.[20,121]. Al colocar un elemento regulador clave del circuito de interés bajo el control de un promotor inducido por
estrés, la expresión genética puede activarse cuando la célula entra en un estado de estrés. Ceroni y sus compañeros de
trabajo llevaron a cabo una demostración impresionante de este principio, que utilizaron RNAseq para identificar promotores
endógenos que están regulados positivamente después de la inducción de la expresión de proteínas heterólogas.[20]. Con
base en la caracterización de estos promotores regulados positivamente, elhtpG1El promotor se utilizó para impulsar la
expresión de sgRNA. Cuando se combinó con dCas9 para CRISPRi, este sistema permitió la construcción de un circuito de
retroalimentación impulsado por la carga para controlar la tasa de expresión de proteínas heterólogas. Se utilizó un enfoque
ómico similar para identificar promotores inducidos por el estrés para mejorar el flujo metabólico de una vía para el pirofosfato
de farnesilo (FPP).[121].

El crecimiento heterogéneo durante los bioprocesos a gran escala puede conducir a condiciones subóptimas debido a los
efectos de la transferencia de gases y la disponibilidad de nutrientes. A su vez, esto puede conducir a estrés metabólico local,
deriva fenotípica y, en última instancia, genotípica (recientemente revisado en[122]). Los sistemas de retroalimentación que
responden a estas tensiones pueden ayudar a minimizar la formación de poblaciones genotípicamente heterogéneas, que en
última instancia conducen a un escape mutagénico, al redirigir el flujo metabólico lejos de la vía de producción, lo que permite
a la subpoblación celular afrontar mejor las condiciones de estrés. Un método para reducir el impacto de la deriva genética en
la productividad se analiza enCuadro 1 [123].

Sistemas modernos de expresión genética para una separación eficaz de las fases de
crecimiento y producción
Una aplicación interesante de los circuitos genéticos acoplados a la respuesta al estrés es el desacoplamiento de la
fermentación en dos fases distintas: una fase de crecimiento y una fase de producción.Figura 4A). Al controlar
estrictamente la expresión basal no deseada, se minimizan los efectos de la carga metabólica, lo que permite la
máxima acumulación de biomasa durante las primeras fases de la fermentación. Una vez que se ha alcanzado una
alta densidad celular, se puede inducir la expresión y desviar recursos del crecimiento hacia la producción de la
proteína deseada. Sin embargo, el diseño de circuitos genéticos simples capaces de expresar simultáneamente altos
niveles de proteína en la inducción y lograr bajos niveles de fuga cuando no se induce es un desafío.

Un enfoque ampliamente utilizado para desarrollar circuitos genéticos autorreguladores de dos fases desacoplados
es aprovechar mecanismos endógenos de detección de estrés, como la detección de quórum o la inanición.[23,124–
126], permitiendo una regulación inteligente y autóloga de la expresión (Figura 4B). Se ha utilizado la regulación del
TF para generar un sistema de dos entradas donde la producción depende de la disponibilidad del sustrato de la vía y
del agotamiento de la glucosa.[23]. Este sistema de dos entradas significa que los recursos celulares se reasignan a la
producción del biocatalizador sólo cuando se ha agotado la glucosa, lo que permite desacoplar las fases de
crecimiento y producción.Figura 4C).

Otros estudios han utilizado principios similares para integrar la regulación genética dinámica con mecanismos de
detección celular y desacoplar el crecimiento de la expresión genética. Estos sistemas permiten la regulación en
respuesta al O2limitación, falta de glucosa, producción de acetato[127], temperatura y pH[128]y densidad celular
mediante detección de quórum[124]. Para obtener una descripción detallada de la regulación dinámica y la
fermentación en dos etapas, recomendamos la revisión de Burg y compañeros de trabajo.[129].

En estudios recientes se han explorado varios mecanismos de desacoplamiento, entre ellos: detección de análogos de
inductores metabólicamente ortogonales y diseños de circuitos desacoplados.[130]; el uso de una cascada de
expresión multicapa que utiliza regulación transcripcional y traduccional (para permitir una regulación estricta de la
expresión basal)[89,131]; regulación postraduccional de la degradación de proteínas[118]; y regulación mediada por
detección de quórum y metabolitos de doble capa[132]. Recientemente se implementó el control optogenético
automatizado de la expresión génica enE. colimediante el uso de un sistema de dos componentes de cianobacterias
(CcaSR) conmutable por luz para controlar la expresión de un gen esencial,asignar,acoplado con circuitos electrónicos
controlados por algoritmos de control predictivo modelo, para encender y apagar una luz, lo que a su vez modula la
tasa de crecimiento[133]. Más recientemente, se utilizaron herramientas optogenéticas para desacoplar la fase de
crecimiento y producción para la regulación de la organización de orgánulos sintéticos.

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 327

Tendencias en biotecnología

[134]y producción de isobutanol[135]enSaccharomyces cerevisiae.Para una revisión exhaustiva de este tema,

recomendamos la revisión de Lalwani y compañeros de trabajo.[136].

Observaciones finales
Está claro que la aplicación de una mentalidad de ingeniería biomolecular ha llevado a un aumento significativo de
herramientas de regulación genética diversas e innovadoras en todos los niveles del dogma central. Una regulación genética
adecuada permite un control estricto sobre la expresión basal "con fugas", a menudo mediante el uso de una regulación de
doble capa. Se han desarrollado herramientas con un rango dinámico impresionante, curvas de dosis-respuesta tanto digitales
como analógicas, control ajustable de la tasa de expresión y rendimiento sólido. Mediante el uso deen siliconaGracias a las
herramientas de diseño y la creación rápida de prototipos sin células, nuestra capacidad para diseñar, seleccionar y optimizar
herramientas para regular la expresión genética para aplicaciones biotecnológicas nunca ha sido mayor. Un mayor avance
hacia la medición estandarizada permitirá la comparación directa del desempeño, lo que permitirá una selección más sólida de
las herramientas y sistemas de regulación genética más apropiados (ver Preguntas pendientes).

La regulación dinámica inducida por el estrés y su aplicación en la fermentación a gran escala proporciona un modelo
para la construcción de circuitos "inteligentes" y sistemas de expresión regulados de forma autónoma. Al aprovechar
la riqueza de componentes reguladores disponibles, estos sistemas pueden diseñarse para regular con precisión una
producción genética en respuesta a un estrés detectado y modificar el comportamiento del circuito en consecuencia,
para aliviar ese estrés. Estos sistemas dinámicos y receptivos permiten el equilibrio de recursos, lo que significa que el
metabolismo celular puede recuperarse antes de que se reanude la producción de la molécula deseada. El
acoplamiento de estos circuitos con marcos de control computacional abiertos, como los desarrollados por Milias-
Argeitis y compañeros de trabajo, es de particular interés para el control en tiempo real.

Recuadro 1. El acoplamiento de la viabilidad celular y el título difiere la formación de poblaciones no productivas

Un desafío importante para la bioproducción sostenible de productos químicos es la ampliación. El desarrollo de procesos
a escala industrial desde la prueba de concepto hasta la escala industrial sigue siendo un desafío importante[137]. La carga
metabólica causada por la expresión de genes heterólogos genera una presión selectiva. La formación espontánea de
poblaciones no productivas dentro de una cultura, junto con la carga metabólica, a menudo conduce a una reducción en
productividad volumétrica.Esas células más productivas y menos aptas deben competir con subpoblaciones menos
productivas y más aptas. Si bien la ingeniería metabólica y los métodos de optimización de vías pueden minimizar la carga
metabólica, aún puede ser un desafío anularla por completo. Un enfoque alternativo es aplicar una estrategia de selección
condicional, como resistencia a los antibióticos o auxotrofia, para mejorar la homogeneidad genética (es decir, el
mantenimiento del plásmido).

Recientemente, Rugbjerg y sus compañeros desarrollaron un circuito de "adicción sintética"[123]acoplando la producción

de ácido mevalónico (MVA) a la viabilidad celular (Figura I). Aquí, ya sea una arabinosa o una unión a MVA (AraC o AraCmev)
TF regula la expresión de dos genes esenciales ubicados cromosómicamente, que codifican la fosfoglucosamina mutasa
(GlmM), que produce glucosamina-1-fosfato implicada en la biosíntesis de lipopolisacáridos y peptidoglicanos, y la
dihidropteroato sintasa (FolP), que es necesaria para la biosíntesis de tetrahidrofolato. El circuito de arabinosa AraC se
caracterizó por primera vez y demostró que el crecimiento sin arabinosa condujo a una reducción significativa (-40 %) en la
viabilidad celular, mientras que la suplementación con arabinosa en los medios condujo a un aumento de la viabilidad.

Una vez comprobado el concepto de adicción, se cambió el AraC por AraCmev.Tras la introducción de una vía de síntesis de
MVA, el estudio demostró que el circuito de adicción conduce a la extensión del cronograma de fermentación productiva
de -55 generaciones a>95, al inhibir la aparición de subpoblaciones de aumento de condición física causadas por la
reducción de la productividad de MVA. Los autores continuaron investigando las variaciones genéticas que conducen al
fenotipo no productivo en una cepa productora de MVA no adicta. El uso de secuenciación profunda de ADN (>1000 veces)
reveló la inserción de dos elementos móviles,IS1yES10.Se encontró que estos elementos móviles interrumpen la vía de
producción de MVA transmitida por plásmidos en el 94-100% de la población.

Esta metodología puede ayudar a ampliar la escala de futuros esfuerzos de bioproducción; sin embargo, aunque poderosa,
puede ser que, si se impone una carga mayor a la tensión de producción, la adicción sintética no sea suficiente. Es posible
que el escape mutagénico interrumpa el circuito de la adicción, por ejemplo eliminando la PMALOoperador de lafolP-glmM
casete. En tales casos, un enfoque combinatorio que aplique optimización, regulación dinámica de la síntesis y adicción a la
síntesis puede ser esencial para facilitar la ampliación industrial.

328 Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3

Tendencias en biotecnología

Preguntas pendientes
A partir de la infinidad de herramientas de
regulación genética disponibles, ¿cómo pueden
los usuarios determinar qué herramientas
implementar para aplicaciones específicas?
¿Cómo podemos predecir o evaluar
rápidamente el rendimiento de las
herramientas genéticas disponibles y
¿Sistemas de expresión en diferentes
condiciones para desarrollar
bioprocesos exitosos?
Las mediciones actuales a escala de
laboratorio no son suficientes para
predecir el rendimiento a escala. ¿Qué
medidas y análisis en tiempo real se
pueden realizar para permitir una mejor
comprensión de los procesos reducidos?

¿Cómo se puede aplicar la regulación

genética dinámica para aumentar la
transición exitosa de una prueba de
concepto a una escala industrial?
Dada la complejidad de los sistemas
modernos de regulación genética,
particularmente aquellos que son
dinámicos o responden a múltiples
entradas, ¿podemos combinar enfoques
computacionales y experimentales para
garantizar mejor una función robusta y una
reducción de ruido?
¿Podemos aprovechar mejor las 'ómicas para
alejarnos de la optimización de los sistemas
de expresión basada en genes informadores
simples (por ejemplo, GFP)?
¿Podemos seguir alejando la biología
sintética de los estudios de prueba de
Figura I. Estudio de caso de control de retroalimentación mediado por el estrés
concepto para demostrar su rendimiento a
Al combinar el título del producto y la viabilidad celular, Rugbjerg y sus compañeros pudieron extender drásticamente la
escala y/o respaldar la necesidad de
vida productiva de una cepa de ácido mevalónico (MVA) productora deEscherichia coli[123]. El circuito de la “adicción
herramientas regulatorias en organismos
sintética” muestra este acoplamiento. Unión de MVA a un factor de transcripción (AraCmev) induce la expresión de los genes
no modelo?
esencialesseguiryglmM;por lo tanto, las células que mantienen el fenotipo productor de MVA siguen siendo viables.
Abreviatura: ADNg, ADN guía.1

de procesos de fermentación a gran escala[133]. Por lo tanto, los circuitos genéticos dinámicos son muy prometedores a la
hora de mantener una expresión genética equilibrada para evitar la limitación de recursos, la toxicidad metabólica y la deriva
genética, que conducen a una productividad reducida y una robustez deficiente. Por lo tanto, sistemas como estos serán sin
duda vías interesantes para futuras investigaciones y desarrollo.

Un desafío futuro es cómo aplicar mejor estas herramientas para mejorar la transición de nuevos bioprocesos desde
la prueba de concepto a la escala industrial.[122,137]. Para diseñar sistemas robustos, debemos seleccionar el
mecanismo regulador óptimo, con el proceso final en mente, seleccionando piezas y dispositivos que sean robustos a
los tipos de variación ambiental y genética que se enfrentan durante los bioprocesos industriales. La aplicación de la
biología sintética ha permitido grandes avances en biotecnología a través de herramientas y redes avanzadas de
regulación genética. Por lo tanto, el desarrollo futuro de herramientas de regulación genética de diseño con
características de rendimiento definidas en combinación con métodos de alto rendimiento para

Tendencias en biotecnología, marzo de 2020, vol. 38, núm. 3 329

Tendencias en biotecnología
La creación de prototipos y la selección de cepas probablemente potenciarán el rápido desarrollo de cepas robustas
con capacidades de producción mejoradas.
Contribuciones de autor
R.K. y N.D. concibieron y escribieron el manuscrito. R.K. compuso todas las figuras.
Agradecimientos
N.D. posee una beca BBSRC David Phillips (BB/K014773/1) y R.K. cuenta con el respaldo de BBSRC DTP
(Subvención BB/M011208/1).
Recursos
iwww.protocolos.io
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