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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS ESCUELA DE INGENIERA AGRONMICA Nombres: Andrea Cevallos Daro Trujillo

1.-TEMA: CORTE DE ADN CON ENZIMAS DE RESTRICCIN 2.-INTRODUCCIN: En Ingeniera Gentica Vegetal es muy til usar enzimas de restriccin para cortar secuencias especficas, y remover informacin gentica individual de un organismo ya que permiten generar fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante, y de esta manera introducir genes que se desean modificar en el vegetal. Los fragmentos de restriccin de ADN, generados al ser cortados por enzimas de restriccin, pueden ser fcilmente separados por gel electroforesis en donde la velocidad de separacin de los fragmentos est en funcin de su longitud, y los fragmentos ms pequeos se mueven mucho ms rpido que los fragmentos largos. Para evaluar la presencia de cidos nucleicos estos se marcan con molculas fluorescentes antes o despus de la electroforesis; en la prctica utilizamos como sustancia fluorescente el Bromuro de Etidio. Finalmente para darle el nombre a las endonucleasas se toma el nombre de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa Fecha: 11-10-14

3.-OBJETIVOS 3.1.-OBJETIVO GENERAL Realizar una digestin total de una muestra de ADN con la enzima EcoRI

3.2.-OBJETIVO ESPECIFICO Conocer el mecanismo que utilizan las endonucleasas para cortar el ADN en fragmentos. Determinar que es la unidad enzimtica Identificar cules son las condiciones que hay que controlar para que la enzima de restriccin cumpla su funcin. 4.- MARCO TERICO Las enzimas o endonucleasas de restriccin son especficas, reconocen 4-bases (tetrmero), 5-bases (pentmero), o 6 bases (hexamero) sitios ubicados en el ADN entrante, y hacer pedazos de doble cadena corta. Los sitios son lo suficientemente cortos que se puede encontrar al azar en el ADN de cualquier organismo, incluyendo el organismo que produce la endonucleasa de restriccin. Para proteger a sus propios sitios, entonces, el organismo productor tiene una metilasa que reconoce y metila el mismo sitio que los recortes endonucleasa. Este proceso se denomina modificacin, la metilacin impide la restriccin. Por lo tanto, un organismo que tiene sus propios sitios protegidos mientras que el ADN entrante carecera de la metilacin adecuada y, por tanto, vulnerables La enzima de restriccin mas conocida es E. coli con un factor R es Eco R I. Algunas otras son: Hin III d la tercera enzima de Haemophilus influenzae cepa d Sma I de la primera enzima Serratia marcesens Bam HI la primera enzima de la cepa de Bacillus amyloliquifaciens H KPN que la primera enzima de la Klebsiella pneumonia Los sitios de restriccin Tecnologa de ADN recombinante se basa en el hecho de que muchas enzimas producen cortes escalonados dejando una sola cola de hebra complementaria. Son complementarias, las colas de cadena sencilla se puede hacer para formar enlaces de hidrgeno entre s y los fragmentos de cohesin puede ser ligado juntos. Dado que las colas se basan nicamente en la secuencia de restriccin, es posible ligar ADN de dos especies diferentes, si han sido cortadas con la misma enzima. La capacidad de endonucleasas de restriccin para producir cohesin de cadena simple cola depende de la simetra del sitio de restriccin y la forma en que la reduccin de la enzima en particular con respecto a la simetra.

Las dos hebras de ADN se dice que son anti-paralelo. Es decir, una cadena corre 5 ' 3' y el otro va de 3 ' 5'. Esto produce una simetra estructural llama simetra rotacional o de pareja. En simetra dada, se puede girar 180 una estructura y obtener la misma estructura:

Para los sitios de restriccin, no slo la estructura general poseen simetra dada, sino tambin la secuencia de ADN en s tiene simetra dada. Por ejemplo, la enzima de restriccin Eco RI reconoce el sitio: Eje de rotacin 5 ------------ G A A T T C ------------ 3 3 ------------ C T T A A G ------------- 5 Cuando esta secuencia hexamerica se rompa sobre su eje, no slo es la polaridad estructural mantenido, sino tambin la secuencia obtenida es idntica. Esta simetra de la secuencia se debe a la naturaleza nica de la secuencia de bases en la que el segundo perodo de tres bases es el complemento, en orden inverso, de los tres primeros: A B C C 'B' A ' Una lnea por lo tanto, es el orden inverso al de la otra. Tal disposicin se refiere a menudo como un palndromico. Escisin Durante la restriccin, la endonucleasa debe cortar cada una de las hebras para generar un corte de doble cadena. La divisin es el resultado de la hidrlisis, una reaccin en la que se aade agua a travs de un bono, por lo tanto que se rompa. En este caso, aadir el agua a travs del enlace fosfodister, cortando los dos nucletidos adyacentes. Divisin (por lo menos por endonucleasas de restriccin) se obtiene 5'fosfato y terminales de 3'-hidroxilo. Por el contrario, los nucletidos estn unidos por reacciones de condensacin, en la que se forman enlaces fosfodister por la divisin de una molcula de agua. ADN ligasas son enzimas que funcionan a travs de la condensacin.

Debido a que cada uno de los cables es idntico entre s, tanto en secuencia y estructura, los cortes se realizan en el mismo lugar en cada rama, en relacin con el eje de rotacin. Esto crea un corte escalonado, dejando colas colgantes en cada extremo. Los cortes realizados por Eco RI son tpicos.

Divisin EcoRI tambin se pueden escribir usando la notacin abreviada de la estructura del ADN. En el ejemplo EcoRI, los cortes se hicieron a la izquierda del eje de rotacin, produciendo salientes 5 '. Otras enzimas, sin embargo, se unir a la izquierda del eje, produciendo salientes 3 ', o en el eje, la produccin de "contundentes" los extremos. 5.-MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS -Tubos eppendorf -Micropipetas de 1-20,10 100, y de 100 -1000 ul de volumen -Puntas para micropipeta -Muestra de ADN de maz a cortar -Buffer de corte para la enzima -Enzimas de restriccin

-Agua destilada -Bao Mara o estufa -Cmara de Electroforesis -Fuente de Poder -Equipo de fotodocumentacin de geles (Transiluminador UV y cmara fotogrfica)

6.-PROCEDIMIENTO 6.1.-Mezclar en el tubo eppendorf agua estril hasta completar 20 ul, ADN 250ng, Buffer de reaccin 2 ul, Enzima EcoRI 1U. 6.2.-Incubar a 37 C por una hora. 6.3.- Preparar un gel para electroforesis. 6.4.-Aadir 3 ul de buffer de carga a cada tubo y mezclar bien. 6.5.-Colocar 2 ul en los pocillos del gel. 6.6.-Colocar 2 ul de marcador de peso molecular (1 Kb ladder de ADN) en un pocillo vaco. 6.7.-Incluir un testigo sin cortar (250 ng de ADN original + 2ul buffer de carga) 6.8.-Aplicar un voltaje de 80 100 V por 1 hora 6.9. Tomar fotografa del gel 7.-CONCLUSIONES: -La enzima EcoRI logr cortar los fragmentos de ADN lo cual se pudo apreciar en el fotodocumentador de geles, sin embargo tambin se observa elementos residuales de la planta que no corresponde a su ADN. -Una unidad enzimtica es la cantidad de enzima necesaria para cortar un ug de ADN en una hora a 37 C. -La condiciones que hay que controlar para que la enzima acte correctamente son: pH, concentracin de sales, temperatura. -La enzima EcoR1 corta las cadenas de ADN dejando extremos pegajosos, esto es de utilidad ya que la EcoR1 puede cortar al gen y este queda complementario al plsmido.

8.-BIBLIOGRAFA Rochester Institute of Technology. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. (en linea). Consultado 13 oct 2011. Disponible en http://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/14%20restriction%20enzymes. pdf