MICROORGANISMOS Y SU PRODUCCIÓN INDUSTRIAL

TEMA 2: AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL

ÍNDICE:
1.- Ventajas de las células eucariotas microbianas para la producción industrial.
2.-Microorganismos de interés industrial.
3.-Criterios para la selección de un microorganismo.
4.-Aislamiento de microorganismos de interés.

VENTAJAS DE LAS CÉLULAS MICROBIANAS:

Esta extensa gama de reacciones hace que exista una gran variedad de microorganismos, así
como de productos y sustratos diferentes para un mismo organismo. Por último es importante
mencionar que es fácil manipularlos genéticamente.

MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL.

1.-BACTERIAS:

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→ E.coli: se ha creado gran número de cepas recombinantes de este organismo, por lo que
está ampliamente utilizada en la producción de sustancias muy diversas. Es interesante en
muchos procesos, como la obtención de insulina o la hormona del crecimiento.
→ Pseudomonas: se utilizan sobre todo en biorremediación, es decir, en la degradación de
tóxicos (cianuro, caucho, degradación de hidrocarburos,....). (Idionella)
→ Xantomonas: están relacionadas con las Pseudomonas, se utilizan sobre todo para la
producción del polímero de xantano. → Es productora de polímeros, como es el xantano. Las
bacterias que producen polímeros, son colonias mucosas, por la liberación de esos polimeros..
Las xantomonas viven en los vegetales, en el suelo,...
→ Acidithiobacillus: es una quimiolitótrofa del hierro y del. azufre que se emplea para
recuperar los metales de las rocas (biominería, para extraer los minerales de las minas, ya que
estas bacterias se encargan de solubilizarlos y biolixiviación).
→ Agrobacterium: se utiliza para fabricar plantas recombinantes. Tiene un plásmido con un
fragmento que se transfiere a las plantas dando lugar a plantas transgénicas. (genera tumores
en plantas)
→ Zymomonas: también están relacionadas con las Pseudomonas. Alternativa a la producción
de bioetanol (etanol como biocombustible) ; ruta diferente a la de las levaduras. Se emplea en
la producción de algunas bebidas alcohólicas como la sidra o el vino.
→ Gluconobacter: productora del ácido acético (vinagre) y del glucónico.
→ Clostridium: etanol, acetona, butanol, enzimas (botox, colagenasas → destructoras de
tejidos). Hace diferentes fermentaciones y da distintos productos; en general es productor de
solventes orgánicos.
→ Bacterias del ácido láctico: derivados lácteos; también producen bactericidas, que tienen
acción antimicrobiana.
→ Bacillus: son los grandes productores de enzimas (todo tipo de enzimas extracelulares),
son capaces de romper prácticamente todo. Además, también sintetizan insecticidas y
antibióticos (aunque pocos y solo durante el proceso de esporulación).
→ Cellulomonas: etanol (combustible) y SCP (proteína unicelular). Utilizan celulosa como
sustrato, lo cual es muy importante porque es un material abundante y barato (en desechos
vegetales).
→ Corynebacterium: producción de glutámico y otros muchos aminoácidos. Es un organismo
casi tan estudiado como E. coli. Cuando crecen liberan aa al medio, y se utilizan para
suplementar dietas, fabricación de bronceadores,...
→ Streptomyces (pertenece al grupo de actinobacterias): produce antibióticos (gran
productora de antibióticos), otros fármacos, enzimas. Pertenece a la familia de los
actinomicetos (tiene nombre de hongo, pero es una bacteria) y es filamentosa. Metabolismo
secundario muy desarrollado: muchos metabolitos secundarios sin estudiar (fármacos y
demás), como antimoduladores o antifúngicos. Depende del medio de cultivo, condiciones de
crecimiento, etc.
→ Thermus: enzimas termoestables (pej. para PCR, mediante la Taq polimerasa). La aisló por
primera vez Brock en el parque de Yellowstone.

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 HONGOS:

*Penicillium nalgiovense: ayuda a proteger al embutido de deterioro y patógenos. Proporciona

aromas y sabores, actuando sobre proteínas y lípidos del embutido. Por ello, es inocuo y ayuda
a la mejor conservación de estos alimentos.

Este tipo de productos fermentados por mohos, se utilizan mucho en la cocina oriental y
enriquecen los alimentos en aa esenciales y en vitaminas, ya que el moho al crecer los
proporciona. Además, hacen una digestión parcial, por lo que su digestión hace que sea más
fácil.

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.

HONGOS II: CARACTERÍSTICAS:

Son eucariotas heterótrofos y no fotosintéticos.
o Se alimentan por absorción: rompen las macromoléculas del exterior y luego las incorporan.
o Forman esporas por reproducción sexual y asexual. Sus ciclos de vida son muy complejos y
diversos, algunos tienen incluso varios nombres dependiendo de la fase sexual o asexual
dadas las tremendas diferencias.
o Pueden ser de dos tipos: filamentosos, también llamados mohos, o unicelulares, más
conocidos como levaduras. Además, hay un tercer tipo, aunque no tan importante: los hongos
dimórficos, que van alternando entre las dos morfologías.
o Poseen paredes celulares rígidas de polisacáridos (entre los cuales está la quitina, típica de
hongos, todos los hongos tienen quitina).
o Sus hábitats son muy diversos, pueden ser tanto acuáticos como terrestres.
o La clasificación de los hongos se hace respecto a su morfología.

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o Metabolismo aerobio o anaerobio facultativo, tienen además un complejo metabolismo
secundario
o Las levaduras son hongos
En cuanto a la morfología, los mohos:
- Al conjunto de filamentos se le llama micelio.
- Cada filamento se llama hifa, y acaba en una cabeza que sirve para la reproducción.
- Las hifas que penetran en el sustrato se llaman sumergidas o vegetativas y las que salen
hacia afuera, aéreas. En las hifas aéreas aparecen las estructuras de
reproducción.
- Las hifas son filamentos y pueden ser ramificadas o no, y septadas o no (septos = tabiques
de separación parcial con poros, por donde circulan los orgánulos y núcleos). Por estos septos
circulan citoplasma, orgánulos e incluso núcleos. A las hifas no septadas se las denomina
cenocíticas. Hifa: elemento tubular compuesto de citoplasma y núcleo.

*Sifonadas hifas con septos.

Si no son septados, son hongos menos evolucionados y más antiguos. Los más evolucionados
como candida, saccharomyces, son septados.
Si están ramificadas, también se mira el grado de ramificación (agudo o recto, esto último
ocurre en muy pocos casos)

De la reproducción asexual hablaremos más en profundidad en prácticas. Se hace mediante

esporas asexuales (llamadas conidios), y en este caso se hace por gemación. Para ello tiene
que desarrollarse una estructura en los extremos de las hifas: se van a formar cadenas de
conidios. Al conjunto de la hifa con los conidios se le llama conidióforo. Esta estructura puede
tomar conformaciones muy distintas: por ejemplo, los de Penicillium tienen forma de pincel o
mano, mientras que los de Aspergillus tienen aspecto de pompón.

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En el caso de Aspergillus, al final de la hifa se produce un engrosamiento, una vesícula.
Además, los conidios tienen espículas (espinas).

Además, hay algunos hongos cuyas esporas asexuales crecen en forma de saco, todas juntas.
En ese caso, se dice que son esporas asexuales en esporangio.

La finalidad de estas estructuras es la dispersión del hongo, por ello son extremadamente
frágiles. Los Rhizopus tienen las esporas asexuales en sacos denominados esporangios.

Estas estructuras sirven para la dispersión, para colonizar nuevos lugares. Solamente con
chocar unas con otras se separan las esporas, caen al medio y crecen. Esto hace que sean
muy contaminantes.

TIPOS DE HONGOS:

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1.-MOHOS:

2.-LEVADURAS:

En el caso de las levaduras, la reproducción se hace por gemación (también asexual). En un

extremo de la célula se empieza a formar una protuberancia, llamada yema, para que más
tarde la célula se separe. Este proceso deja una cicatriz de gemación en la célula madre. Una
característica que permite distinguir entre unas levaduras y otras es el lugar donde aparece la
yema.

3.-HONGOS DIMÓRFICOS:

En el caso de los hongos dimórficos, estos alternan su ciclo de vida entre filamentoso y
unicelular(levadura), por lo que se alternan entre dos tipos de fases: fase levaduriforme y
filamentosa. Por ejemplo, Candida albicans es un hongo que en determinadas condiciones
forma hifas y micelio (vagina → candidiasis). Es un patógeno oportunista importante que
produce graves infecciones. Cuando está dentro del cuerpo tiene normalmente forma
filamentosa. No está muy claro cómo pasa de una forma a otra. Se cree que la temperatura y
los nutrientes tienen algo que ver, sin embargo es algo que se está estudiando.

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En cuanto al metabolismo, la mayoría de los hongos hacen respiración aerobia. Algunos
realizan fermentación alcohólica, y alguno todavía mucho más raro respira con nitrato.

HONGOS DE IMPORTANCIA INDUSTRIAL:

-Rhizopus: producción de ácido cítrico (E330) (acidulante, saborizante en muchos

productos como zumo, mosto…), alimentos orientales.
-Rhizomucor: produce enzimas que cuajan la leche en la producción de quesos, la quimosina
o renina.
-Saccharomyces: bebidas alcohólicas, pan, bioetanol (mayoría del biodiesel), vitaminas,
probióticos.
-Aspergillus: producción de ácidos orgánicos y enzimas. Es el principal productor de ácido
cítrico (E330).
-Penicillium: antibióticos, queso, embutidos, enzimas.
-Trichoderme: es un fungicida, previene infecciones de hongos en plantas. Es un hongo que
mata a otros hongos. Produce, entre otras cosas, quitinasas para romper las paredes de otros
hongos. Además, la quitinasa se utiliza también para degradar los residuos de la industria del
marisco (biorremediación).

ALGAS

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Son fáciles de cultivar y sus características son las siguientes:
- Eucariotas fotosintéticos (autótrofos) fotosíntesis oxigénica
- Aparato fotosintético en cloroplastos
- Filamentosas y unicelulares
- Paredes celulares rígidas con polisacáridos (celulosa)
- Hábitats diversos, terrestres y acuáticos
- Aplicaciones: biocombustibles, compuestos bioactivos (fármacos, antimicrobianos), biomasa,
biofertilizantes, biorremediación
Se cultivan en fotobiorreactores tubulares en grandes extensiones.

CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE UN MICROORGANISMO PARA LA

PRODUCCIÓN INDUSTRIAL
A la hora de seleccionar un microorganismo debemos tener en cuenta diferentes aspectos:

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→ Que sea fácil de manipular y genéticamente estable: es decir que mantenga las
características que se le han dado a lo largo del tiempo, para que si introducimos una mutación
no se pierda al cabo de pocas generaciones. Suelen ser manipulados para convertirlos en
superproductores.
→ Alta productividad → Es importante que produzca mucho, pero aún más importante es la
productividad. De hecho, esta será mayor cuanto menos tiempo se tarde
→ Facilidad en la recuperación del producto (mayor parte del coste del proceso): si hay
subproductos, habrá que separarlos, por lo que es mejor que no los forme. Cuanto más fácil
sea extraer el producto mejor. En el caso de que en el procedimiento se produzcan tóxicos, las
purificaciones y cromatografías necesarias para separarlos encarecen mucho la producción, ya
que existe el peligro de no tratarlos debidamente. Por eso, el retirar esos productos encarecen
mucho el proceso además de ser muy costoso.

El hecho de que se forme espuma es una desventaja, al igual que si producen muchos ácidos,
ya que corroen la muestra (por ejemplo el ácido cítrico). Para evitar esa corrosión, sería
necesario recubrirlos con polímeros.

→ Relación del microorganismo con el equipo: por ejemplo, en la producción de ácido

cítrico, los pH bajos pueden corroer el fermentador (necesarios materiales anticorrosivos).
Además, es mejor que sean células grandes que floculen, para que caigan abajo y podamos
retirarlas fácilmente.

→ Elección entre cultivo puro o mixto: lo ideal es que un solo microorganismo lleve a cabo el
proceso. Un cultivo mixto puede ser interesante cuando un organismo hace parte del proceso, y
el producto de este es el sustrato del otro microorganismo que acaba dando el producto que se
quiere. Es decir, cuando varios microorganismos colaboran en la degradación de un sustrato.
Otra opción es que el microorganismo consuma el producto tóxico que se genera durante el
metabolismo de otro. O que el microorganismo productor solo sintetice el compuesto en
presencia de otro microorganismo → cultivo mixto.

Por ejemplo:

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Si tenemos un microorganismo que utiliza glucosa y otro que necesita glucosa y biotina, es
mejor el que solo utiliza glucosa, porque necesita menos recursos para que crezca y el coste
del cultivo va a ser menor, ya que el hecho de añadir un factor de crecimiento, como la biotina
tiene un coste elevado.

Cuando dudamos entre un neutrófilo y un acidófilo la mejor opción es el acidófilo porque es

menos probable que se contamine el medio y porque es más específico, lo que hace que esa y
la probabilidad de contaminación se reduzca. El inconveniente es que el biorreactor se puede
ver afectado. Si se trata de un microorganismo que produce ácido deberíamos escoger uno que
que no sintetice demasiado con el objetivo de evitar la corrosión del biorreactor. En el caso de
un productor de ácido cítrico debemos recubrir el biorreactor. La espuma tampoco es
benefiautotciosa ya que disminuye la productividad de los microorganismos. Estos se quedan
en la espuma. Como la espuma sube suele haber un filtro en la parte superior del biorreactor.
Además es necesario dejar un espacio del mismo vacío para la producción de espuma y que
esta no toque el filtro, si esto ocurriera se humedecería y se podría contaminar el cultivo. En
ocasiones se suele echar antiespumante. Como conclusión podemos decir que un
microorganismo que produzca espuma tampoco es bueno.

Si tenemos un termófilo y un mesófilo, sería mejor elegir el termófilo que el mesófilo. Si que es
cierto que el mesófilo tiene una temperatura óptima de crecimiento como la temperatura
ambiental, pero cuando hay mucha densidad de microorganismos, eso implica que suba la
temperatura, por eso se ajusta en refrigeración. Así, es mejor elegir el termófilo, que además
reduce la probabilidad de contaminación.

Si tuviéramos que elegir entre un organismo que forma esporas (formas de resistencia) y otro
que no, el ganador sería el primero, ya que resiste más y cuesta menos conservarlos en
general. La desventaja que presentan es que normalmente se inoculan las esporas y se debe
esperar hasta que germinen. Por eso, si forman esporas se conserva mejor y es más difícil
perder la cepa y es más fácil de manipular.

Si tenemos un microorganismo que es autótrofo y otro fototrofo, es mejor el fototrofo porque

nos ahorramos la adición de compuestos orgánicos.

Si tuviéramos que elegir entre un microorganismo productor de 6g de producto por litro y otro
de 3g de producto por litro por hora no podríamos hacer la comparación porque no son las
mismas medidas. ATENCIÓN: es necesario diferenciar entre producción y productividad y tener
en cuenta el rendimiento: 6g producto/L es la producción, mientras que 3g litro/hora es la
productividad, por lo que no son comparables

En el caso de tener un microorganismo capaz de degradar glucosa y otro que no;

escogeríamos al que sí es capaz debido a la abundancia y barato precio de esta materia.

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Entre organismos que produzcan muchos subproductos y otro que no, sería mejor el segundo
porque la extracción del producto de interés será más fácil. Por eso, la desventaja de que forme
subproductos es que luego hay que separarlos.

Si tenemos que elegir entre un productor de amilasas y otro que no, el adecuado será el
productor de amilasas (en la cerveza no sintetizan amilasas).

Cuando se trata de escoger entre células pequeñas que permanecen dispersas o grandes que
floculen, resultan mejores las últimas para que el proceso de separación de las mismas del
caldo sea más fácil. Entre tolerar o no grandes cantidades (concentraciones) de solutos
elegiremos el tolerante puesto que le podemos suministrar una concentración de sustrato
mayor. De hecho es importante que toleren grandes concentraciones de azúcar.

Si hay un microorganismo que fija nitrógeno y otro que no, es mejor si fija nitrógeno ya que no
no será necesario añadir una fuente de nitrógeno ya que lo toma de la atmósfera.

Por último, lo ideal es tratar con un solo microorganismo porque si no es complicado conseguir
que crezcan todos en las condiciones óptimas. Los cultivos mixtos se emplean cuando uno de
ellos produce algo que utiliza el segundo como sustrato y lo transforma en otra cosa. Un
ejemplo concreto es la combinación de Candida sutillis, que no produce amilasas, con otro
organismo más pequeño que si las produce. Primero crecía el microorganismo pequeño, luego
llegaba C.sutillis y conseguía desplazar al otro organismo y quedarse prácticamente solo. Por
lo tanto el 90% del producto es el deseado. Otro ejemplo es para la degradación de un tóxico:
uno consume el tóxico que produce el otro. Se trata de un proceso de una metillotrofa que se
come el metano y produce metanol, fórmico y CO2. A esta bacteria la combinamos con otra
que consuma el metanol, porque si este se acumula resulta tóxico al propio microorganismo

Aislamiento de microorganismos de interés industrial → CRIBADO o SCREENING.

Se hace un cribado, o screening, que consiste en obtener de forma rápida y sencilla un gran
número de cepas (una colección de cepas) potencialmente productoras con las características
adecuadas. Permite procesar muchas muestras a la vez. Las etapas de este proceso son:
elección de la fuente del microorganismo, selección y enriquecimiento, y test sencillos
detectores de actividad.

Objetivo: obtener de forma rápida y sencilla una colección de cepas potencialmente

productoras con las características deseadas.

Etapas:

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1) Elección de la fuente del microorganismo (normalmente la fuente es natural porque aquí
podemos encontrar microorganismos nuevos y nuevos productos)
2) Enriquecimiento (no es imprescindible) y selección
3) Test sencillos detectores de actividad

FUENTES DE MICROORGANISMOS:

Podemos seleccionarlos o bien de una colección de cultivos o directamente de la naturaleza.

Hay colecciones de cultivos donde se almacenan cepas que ya han sido aisladas y
caracterizadas. En España tenemos el CECT (Colección Española de Cultivos Tipo); este
catálogo solo contiene hongos y bacterias (aunque existe otro de algas). Cada país tiene sus
propias colecciones de microorganismos e incluso algunas universidades tienen también las
suyas. La colección americana es la ATCC (American Type Culture Collection). Las cepas se
catalogan con números. Sin embargo, es interesante ir a la naturaleza en busca de nuevos
microorganismos, ya que solo se han descritos un 1%, aunque esto es muy costoso y requiere
planificación y preparación (buscar un nicho ecológico y planificar un muestreo). Planificar el
muestreo es muy costoso.

Los organismos extremófilos viven en ambientes extremos, los menos explorados. Estos
guardan microorganismos con características muy interesantes e importantes. Contienen
extremoenzimas (aquellas activas en condiciones ambientales extremas). Entre ellas
encontramos las termoenzimas, las cuales presentan una mayor resistencia frente a agentes
desnaturalizantes; no requieren refrigeración para su mantenimiento en forma activa (las
reacciones metabólicas suelen ser exotérmicas) y presentan vidas medias prolongadas.

EXTREMÓFILOS:

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*También podemos encontrar termófilos en las pilas de estiércol.

Por dar un ejemplo, las polimerasas de la PCR se obtienen de microorganismos que habitan
chimeneas marinas; aunque en una pila de compost también podemos encontrar termófilos.
A los que viven en ambientes secos (baja actividad del agua), como los desiertos, se les
denomina xerófilos. Pueden servir para procesos de producción de medio sólido (bandeja de
tempe): se cultivan mohos en bandejas donde no hay apenas agua. También se emplean en la
producción de salsa de soja.

BIOPROSPECCIÓN.
Búsqueda sistemática, clasificación e investigación de (micro)- organismos con capacidades
económicas útiles, como la producción de nuevos fármacos, enzimas, polímeros, etc. Es decir,
se trata de buscar microorganismos que produzcan algo interesante. Hay incluso empresas que
se dedican a esto: van a ambientes extremos y buscan y encuentran este tipo de
microorganismos.

Ejemplos:
- La “Juanasa”, es una proteasa aislada del krill antártico y clonada en E. coli para
fabricar detergentes en frío. Fue descubierta por un biotecnólogo chileno llamado Juan
Asenjo, quien secuenció la proteína e insertó sus genes en E.coli.
- Proteínas anticongelantes, obtenidas de diversas bacterias como Marinomonas
protea, Pseudomonas sp. Y Moraxella sp. Se emplean, por ejemplo, en la conservación
de órganos o en la conservación de alimentos.
- DNA polimerasas de térmofilos: Termus aquaticus (Taq), Piroccocus furiousus (Pfu)…
de esta última obtenemos una polimerasa a prueba de errores y se trata de una arquea
hipertermófila.
- Fuelzyme TM: amilasa para la reproducción de etanol aislada en fuentes termales
submarinas.

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www.basf.com es la página web de una empresa que desarrolló la Pfu. Además tienen muchas
enzimas de utilidad industrial, una de las cuales es fuelzyme que se emplea para tratar almidón
a altas temperaturas y se les da a las levaduras para producir bioetanol.

Esta imagen presenta parte del dominio filogenético de las bacterias. Muchas de ellas son
proteobacterias (E. coli o Pseudomonas). También tenemos bacteroidetes o actinobacterias.
Estas últimas son un grupo muy importante de Gram +, tienen una morfología rara
(Streptomyces) y son grandes productoras de antibióticos. A la derecha aparece lo que se
conoce como gran anomalía del recuento en placa. La barra verde indica la cantidad de
especies “tipo” → colecciones tipo o cultivos tipo (el primero)descritas (cultivables), y se les
llama T. Por otro lado, la barra roja representa los filotipos, es decir, los fragmentos o la
cantidad de RNA 16S diferentes que se sabe que hay (total de bacterias). Por tanto, tenemos
dos órdenes menos

*100 veces menos de bacterias cultivables que las que realmente hay.

¿POR QUÉ MUCHOS MICROORGANISMOS SON NO CULTIVABLES?

Por una parte es que desconocemos sus requerimientos y porque las condiciones del
laboratorio distan mucho de las naturales, como la temperatura, pH, concentraciones,...

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Uno de los factores que dificultan el cultivo de algunos microorganismos es la gran diferencia
entre las condiciones del laboratorio y las naturales (Temperatura, pH, concentraciones…).
A veces los microorganismos requieren convivir con otros, bien porque les aportan algo o
porque eliminan compuestos tóxicos para ellos. La solución para esta dificultad es hacer
cultivos mixtos (varios microorganismos) → mezclar diferentes tipos de microorganismos.

Puede que necesiten crecer muy lentamente (hay algunos que tardan semanas, e incluso
meses en generar colonias), esto hace que se queden “eclipsados” por los microorganismos
que crecen antes, debido a que estos pueden coger los nutrientes. → La solución sería diluir
los inóculos, ya que aunque encontraríamos menos colonias pero un microorganismo no
eclipsaría a otro.

También puede ser que haya compuestos tóxicos para ellos en los medios del laboratorio; de
hecho, al esterilizar un medio de cultivo que tiene agar y fosfatos en un autoclave, se genera
peróxido de hidrógeno en pequeñas cantidades, el cual puede resultar tóxico para algunas
células→ Esto provoca la inhibición del crecimiento de los microorganismos.Por ello, tenían que
esterilizarlos por separado, es decir, el fosfato por un lado, y el agar con el resto de nutrientes
por otro . Esto fue descubierto por investigadores japoneses: esterilizaron el agar y los fosfatos
por separado y consiguieron cultivar algunas bacterias que hasta entonces no eran cultivables.
Otra razón de que aparezcan tóxicos es lo que se conoce como reacción de Mayard, que se da
cuando sometes un material que tiene azúcares y proteínas a altas temperaturas, formándose
enlaces entre ambos compuestos que puede dar lugar a compuestos aromáticos que pueden
ser tóxicos.

En realidad, muchas veces no sabemos qué necesitan. Imaginemos que cogemos una muestra
de agua. ¿Qué temperatura deberíamos utilizar? ¿Qué pH? Lo ideal sería incubarlo en
diferentes condiciones, añadir diferentes sustratos, diferentes factores de crecimiento…
además, como ya hemos mencionado, es posible que necesiten la presencia de otros
microorganismos. Otro problema del que ya hemos hablado es el crecimiento lento de algunos
microorganismos; esto significa que en los tiempos de incubación establecidos no empiezan a
aparecer, por lo que deberíamos dejar el cultivo durante meses. También puede darse el caso
de que crecen lentamente porque están inhibidos por otros microorganismos.

Existen algunas estrategias para el aislamiento: cultivos in situ con cámaras de difusión y las
trampas microbianas.

-Cultivos in situ con cámaras de difusión-

Se trata de un mecanismo empleado para cultivar microorganismos no cultivables; consiste en
emplear el medio natural: se utilizan membranas semipermeables con microorganismos en un
soporte sólido, recreando las condiciones que se encuentran en su medio natural.

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 -Trampas microbianas-
Otra estrategia es utilizar trampas microbianas: tienen un orificio de entrada muy pequeño por
el que solo puede pasar un microorganismo; así se consigue aislarlo. También tienen una
membrana semipermeable.

Ponemos un soporte de agar solidificante, luego se ponen dos membranas semipermeables

abajo y arriba, permitiendo el paso de los nutrientes pero no los microorganismos.

Actualmente se emplea un utensilio conocido como iChip (una caja de plástico que tiene una
tapa, placa y base).Lo que se hace es introducir la placa en una solución de agar, donde se ha
añadido muestra, donde queda convenientemente diluida, para cuando metan la placa con los
agujeros, las bacterias quedan separadas en los agujeros. Luego las sacan, el agar se
solidifica, y queda la bacteria integrada. Así, además de ofrecernos un método para cultivar in
situ nos permite aislar las bacterias

Se trata de una placa con orificios por los que solo cabe una bacteria. Se prepara una solución
de agar fundido, se recoge una muestra y se introduce. La muestra queda retenida en los
orificios, el agar se solidifica y las bacterias quedan embebidas en el medio. Tras pasar un
tiempo se saca la placa y se observa que se ha conseguido aislar una bacteria. El objetivo
actualmente es buscar nuevos métodos para cultivar aquellas que aún no se han cultivado.

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 AISLAMIENTO SELECTIVO DE CÉLULAS → PINZAS DE LÁSER

Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido equipado con un láser
infrarrojo enfocado con precisión y un instrumento de micro manipulación → La luz del láser
incide sobre una célula y así, el láser crea una fuerza que arrastra a una célula y la aisla.

METAGENÓMICA:
Pero, a pesar de que no podamos cultivar muchos microorganismos (microorganismos no
cultivables), podemos extraer sus genes, para poder expresar sus genes y así conseguir los
productos de interés. La metagenómica trata de extraer los genes de un medio natural: se
extraen muestras y de ellas el DNA. Un metagenoma es el conjunto de genes de un ambiente.
El material genético se une a los plásmidos que funcionan como vectores y se introducen en
una célula, como puede ser Escherichia coli, para así poder ver qué genes son los
responsables de la síntesis de un producto, lo que se puede utilizar para sintetizar nuevos
fármacos.

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Primero se filtran las muestras, se rompen las células y se extrae el DNA. Este se inserta en los
plásmidos, se introduce en bacterias y allí se replica. De esta manera se consigue una
biblioteca metagenómica. Estas bacterias se cultivan y se observa qué es lo que producen, y si
son compuestos de interés. Una de las moléculas que más se estudia es el RNA 16S, el “DNI”
de las bacterias. Estudiando esta molécula se ha descubierto que la sangre de una persona
contiene RNA 16S, al igual que la leche materna. Esto revela que no es estéril, tiene
microorganismos que provienen del intestino. El mismo descubrimiento se hizo con la placenta.
Con este método podemos detectar la presencia de microorganismos sin necesidad de
cultivarlos.

BIOSPRECCIÓN.
Después de lo que acabamos de ver es necesario ampliar el término de bioprospección.
Búsqueda sistemática, clasificación e investigación de (micro)- organismos con capacidades
económicas útiles, como la producción de nuevos fármacos, enzimas, polímeros,...O GENES
que codifican proteínas de interés....

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A parte de la búsqueda de microorganismos consiste también en la búsqueda de genes que
codifican proteínas de interés. Actualmente se ha empezado un nuevo proyecto: el protocolo
Nagoya; va en contra de la biopiratería, ahora todo está regulado de manera que los países de
donde procedan las muestras también reciban cierto beneficio de la patente.

Una vez que se obtienen los fragmentos, se pueden reconstruir los genomas completos o casi
completos comparando las secuencias entre ellos. → Finalmente, debemos mencionar que el
futuro de todo esto está en la bioinformática; teniendo miles de millones de fragmentos, existe
la posibilidad de reconstruir el genoma completo. Un ejemplo es la reconstrucción metabólica
de Oceanospirillales. Es un genoma completo (o casi), con sistemas de transporte, capacidad
de producir sideróforos y peptidasas y le permite degradar el ciclohexano (pueden ser útiles
para su uso en la biorremediación ya que puede degradar los hidrocarburos).

**Tomaría una muestra del suelo (muy variable) para aislar un microorganismo acidófilo,
formador de endosporas y productores de antibióticos (Penicillium,Bacillus, Actinobacterias,
Streptomyces.) y capaz de utilizar almidón como fuente de carbono.

20
 SELECCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO:

Cuando el microorganismo deseado se encuentra en baja proporción y su aislamiento es poco

probable

¿QUÉ PASOS HAY QUE SEGUIR?

1- Favorecer el enriquecimiento de aquellos microorganismos que posean las

características deseadas en detrimento de otros. Por eso, lo primero que deberíamos hacer es
aumentar la población, es decir, favorecer el enriquecimiento del que buscamos en detrimento
del resto de microorganismos. Esto se consigue mediante cultivos de enriquecimiento. No
confundir los cultivos de enriquecimiento con los medios enriquecidos (que llevan, además de
nutrientes, compuestos como sangre, leche, etc.).

Los CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO (aumentan la proporción de un tipo de

microorganismo) → El microorganismo deseado se encuentra en baja proporción y su
aislamiento es poco probable

2- Aislamiento: Una vez que hemos aumentado la población pasamos a aislarlo. Los cultivos
de enriquecimiento aumentan la proporción de un tipo de microorganismo.

En los cultivos de enriquecimiento debemos hacer dos distinciones entre si la característica

deseada es una ventaja selectiva o no se puede emplear como una ventaja selectiva.

→ Si la característica deseada es una ventaja selectiva se emplea en el enriquecimiento.

Por ejemplo, las capacidades para:
- Utilizar sustratos: si puede usar almidón, solo ponemos almidón.
- Crecer a pH extremos: ponemos varios pH muy bajos o muy altos.
- Crecer a temperaturas extremas.
- Crecer a altas concentraciones de Na.
- Crecer en presencia y ausencia de O2.
- Producir endosporas: para seleccionar un formador de endosporas calentamos la muestra (no
es lo mismo que cultivar a altas temperaturas, que es cultivar a altas temperaturas desde el
principio del cultivo, sin someter la muestra a un cambio brusco), la sembramos y cultivamos. A
este proceso se llama enriquecer la muestra en endosporas → Calentando la muestra
eliminamos todo lo que no son esporas y una vez que tenemos las esporas, se siembran en el
medio adecuado para que germinen. (Buscamos termoresistentes, no termófilos)

*Se llevan a cabo en medio líquido y el aislamiento posterior se hace en medio sólido

21
→ Si la característica deseada NO se puede utilizar como una ventaja selectiva.

Entonces se busca el grupo o taxón. Por ejemplo: buscamos un productor de antibióticos, ¿qué
taxones buscaremos? En este caso, Penicillium y otros hongos filamentosos; Streptomyces y
relacionados dentro de las actinobacterias; o Bacillus son grupos a los que deberíamos prestar
principal atención.

Lo siguiente es pensar qué medio de cultivo vamos a utilizar. Utilizaremos aquellos que
permitan la máxima expresión del material genético, que obliguen al microorganismo en
cuestión a expresar el material genético que nos interesa.. En los medios para la
superproducción empleamos nutrientes limitantes (C, N, P, O); sin fuentes de C y N fáciles
(como por ejemplo, en el operón lac, en la cual la glucosa inhibe la expresión de B-
galactosidasa), con abundancia de cofactores (Fe, Mn, Co, Ni… para que funcione el enzima
que queremos, dado que posiblemente necesite cofactores), tamponados…

TEST SENCILLOS PARA DETECTAR LA ACTIVIDAD

Muchas veces es necesario detectar si los microorganismos son:

- Productores de enzimas, de antibióticos
- Productores de aminoácidos
- Productores de otros factores de crecimiento.

1.-TEST PARA PRODUCTORES DE ENZIMAS:

Son medios diferenciales y produce cambios en:
• pH
• Turbidez
• Estado de oxidación de un indicador
• Hidrólisis de un sustrato (revelado con colorantes).

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DETECCIÓN DE PRODUCTORES DE PROTEASAS:

Se ponen los organismos en medios diferenciales en los que la actividad de la enzima produce
cambios (ph, turbidez, estado de oxidación de un sustrato, hidrólisis de un sustrato con
posterior revelado con colorantes)

¿QUÉ MEDIO DE CULTIVO UTILIZAMOS?

En la búsqueda de un microorganismo con unas características concretas → Se utilizan medios

de cultivo que permitan la máxima expresión del material genético:
- Nutrientes limitantes, C, N, P, O
- Sin fuentes de C y N “fáciles”
- Con abundancia de cofactores, Fe, Mn, Co, Ni...
- Tamponados

DETECCIÓN DE PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS - (búsqueda del taxón Streptomyces)

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Se usan medios con nutrientes limitantes para que el microorganismo no tarde tanto en
expresar el halo de inhibición, ya que si no tiene problemas para crecer, no hay producción de
antibióticos. Por ello es necesario conocer los mecanismos de regulación del microorganismo
en cuestión (por ejemplo el operón)

→ Test de sensibilidad de antibióticos.

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DETECTAR A UN PRODUCTOR DE AMINOÁCIDOS U OTROS FACTORES DE
CRECIMIENTO.

Se emplea un medio mínimo que carece del factor de crecimiento, se forman colonias aisladas.
Se detectan los microorganismos que producen el aminoácido en exceso, es decir, lo liberan al
medio. Se forma un sándwich de auxótrofos, el auxótrofo solo crece alrededor de las colonias
que producen el aminoácido en exceso.

AISLAMIENTO EN ESTRÍA POR AGOTAMIENTO DEL INÓCULO.

Se toma un inóculo de las colonias de los productores y se obtienen cultivos puros haciendo
aislamientos → Se inocula en una parte de la placa, se esteriliza el asa y se hacen estrías a
partir de lo inoculado, de forma que cada vez es menos denso. Se obtienen así colonias
aisladas. Se hacen varios aislamientos y se comprueba que solo hay un tipo de colonia. (lo
vamos a hacer en prácticas)

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