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G3, 2023,13(8),jkad107
https://doi.org/10.1093/g3journal/jkad107 Acceso
anticipado Fecha de publicación: 18 de mayo de 2023

Informe del genoma

Ensamblaje del genoma a nivel cromosómico deHidractinia

symbiolongicarpus
Koto Kon-Nanjo,1Tetsuo Kon,1,* Helen R. Horkan,2febrimarsa,2Robert E. Steele,3Paulyn Cartwright,4Uri Frank,2,* Oleg

Descargado de https://academic.oup.com/g3journal/article/13/8/jkad107/7170730 por el usuario de Withers el 4 de septiembre de 2023.

Simákov1,*

1Departamento de Neurociencias y Biología del Desarrollo, Universidad de Viena, Viena 1030, Austria
2Centro de Biología Cromosómica, Facultad de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad de Galway, Galway H91W2TY, Irlanda
3Departamento de Química Biológica, Universidad de California Irvine, Irvine, CA 92697-1700, EE. UU.
4Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de Kansas, Lawrence, KS 66045, EE. UU.

* Autor correspondiente: Oleg Simakov, Departamento de Neurociencias y Biología del Desarrollo, Universidad de Viena, Viena 1030, Austria, Correo electrónico: oleg.simakov@univie.ac . en;
Uri Frank, Centro de Biología Cromosómica, Facultad de Ciencias Biológicas y Químicas, Universidad de Galway, Galway H91W2TY, Irlanda, correo electrónico: uri.frank@universityofgalway.ie;
Tetsuo Kon, Departamento de Neurociencias y Biología del Desarrollo, Universidad de Viena, Viena 1030, Austria, Correo electrónico: kontetsuo@gmail.com

Abstracto

Hidractinia symbiolongicarpuses un organismo modelo pionero para la biología de células madre, siendo uno de los pocos animales con células madre
pluripotentes adultas (conocidas como células i). Sin embargo, la falta de disponibilidad de un ensamblaje genómico a nivel de cromosomas ha dificultado
una comprensión integral de los mecanismos reguladores de genes globales que subyacen a la función y evolución de las células i. Aquí, informamos el
primer ensamblaje del genoma a nivel cromosómico deH. simbiolongicarpus(HSymV2.0) utilizando secuenciación de lectura larga PacBio HiFi y andamio
Hi-C. El ensamblaje final tiene 483 Mb de longitud total y 15 cromosomas representan el 99,8% del ensamblaje. Se encontró que las secuencias repetitivas
representaban 296 Mb (61%) del genoma total; Proporcionamos evidencia de al menos dos períodos de expansión repetida en el pasado. En este
ensamblaje se predijo un total de 25.825 genes codificadores de proteínas, que incluyen el 93,1% del conjunto de genes de metazoos Benchmarking
Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO). El 92,8% (23.971 genes) de las proteínas predichas estaban funcionalmente anotadas. ElH. simbiolongicarpus
El genoma mostró un alto grado de conservación macrosintética con elHidra vulgargenoma. Este ensamblaje genómico a nivel cromosómico deH.
simbiolongicarpusSerá un recurso invaluable para la comunidad de investigación que mejore los estudios biológicos amplios sobre este organismo
modelo único.

Palabras clave:hidractinia, ensamblaje del genoma a nivel de cromosoma, HSymV2.0, células madre, hidrozoos

Introducción hidractiniaes el primer animal en el que las células madre y germinales

Hidractinia symbiolongicarpuses una especie de cnidario hidrozoario colonial. El
organismo se distribuye a lo largo de la costa este de América del Norte desde
Maine hasta Carolina del Sur (Buss y Yund 1989). En su hábitat natural,H.
simbiolongicarpusForma colonias sobre caparazones de gasterópodos
ocupados por cangrejos ermitaños. En el laboratorio,H. simbiolongicarpus
También pueden formar colonias en portaobjetos de vidrio y cultivarse en agua
de mar artificial. Se encuentran disponibles varias cepas de laboratorio para
esta especie. Las colonias tienen zooides (pólipos) funcionalmente
especializados, incluido el pólipo alimentario (gastrozoide), el pólipo
reproductivo (gonozoide) y el pólipo defensivo (dactilozoide), que están
conectados por el tejido estolonal, un sistema gastrovascular compartido (
Francoet al. 2020). Mientras forman colonias clonales,H. simbiolongicarpus
También genera gametos diariamente, lo que proporciona un acceso
conveniente a la embriogénesis. Este rasgo facilita la manipulación de la
expresión génica mediante la eliminación genética transitoria mediada por
ARNi (dubucet al. 2020;Quiroga Artigaset al. 2020), edición del genoma mediada
por CRISPR/Cas9 (gahanet al. 2016;Lijadoraset al. 2018), y transgénesis de
fueron descritas por August Weismann en el siglo XIX (Weismann 1883). El
animal tiene una población única de células madre pluripotentes adultas,
conocidas como células madre intersticiales (i-células para abreviar). Las
células i producen continuamente progenitores para todos los linajes de
células germinales y somáticas (dubucet al. 2020;Varleyet al. 2023). Una
sola célula i injertada de una colonia a otra puede autorrenovarse y
diferenciarse en todos los linajes somáticos y células germinales.Varleyet
al. 2023). La pluripotencia deH. simbiolongicarpusi-cells contrasta con la
multipotencia deHidra vulgarCélulas i, que producen el linaje
neuroglandular y las células germinales, pero no las células epiteliales
epidérmicas y gastrodérmicas (Bosch y David 1987;presagio 1996;
Hobmayeret al. 2012;julianoet al. 2014).H. simbiolongicarpuses un
excelente animal modelo para estudiar la función y evolución de las
células madre en organismos multicelulares (Plickertet al. 2012).
El tamaño del genoma deH. simbiolongicarpusse estimó en 514 Mb (
Francoet al. 2020).H. simbiolongicarpusTiene 15 cromosomas revelados
por el método de bandas G (Chenet al. 2023). Este número de
cromosomas es similar en otros cnidarios comoH. vulgaris(Simákovet al.

integración aleatoria (künzelet al. 2010). Actualmente se encuentran disponibles 2022;cazetet al. 2023). Además, hay mapas de ligamiento genético
disponibles, que se componen de 15 grupos de ligamiento (Chenet al.
varios clones de animales transgénicos (Crisóstomo et al. 2022).
2023). Hasta el momento, la secuencia genómica disponible de

Recibió:06 de marzo de 2023.Aceptado:08 de mayo de 2023

© Th e Autor(es) 2023. Publicado por Oxford University Press en nombre de The Genetics Society of America.
Este es un artículo de Acceso Abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite la reutilización,
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H. simbiolongicarpusestá limitado a un ensamblaje de nivel contig (>4800
contigs) llamado Hsym_primary_v1.0 (https://research.nhgri.nih.gov/
hydractinia/). La falta de disponibilidad de un ensamblaje genómico a
nivel de cromosomas ha dificultado la investigación de muchos aspectos
de la función de las células madre enhidractinia, como las interacciones
promotor-potenciador. Como tal, la producción de un ensamblaje
genómico a nivel cromosómico deH. simbiolongicarpusHa sido anticipado
durante mucho tiempo por la comunidad científica y proporcionará un
panorama completo del genoma.
Aquí, informamos el primer ensamblaje del genoma a nivel
cromosómico deH. simbiolongicarpus(HSymV2.0) utilizando secuenciación
de alta fidelidad (HiFi) de PacBio y andamiaje Hi-C. El ensamblaje final
tiene 483 Mb de longitud total con 15 cromosomas, lo que representa el
99,8% del tamaño total del ensamblaje. Será un recurso invaluable para
estudiar los mecanismos reguladores moleculares que subyacen al
desarrollo, las células madre, la regeneración y su evolución.
Materiales y métodos
La cría de animales
Colonias deH. simbiolongicarpusse mantuvieron como se describió anteriormente (
Francoet al. 2020). Los animales crecieron en portaobjetos de vidrio mantenidos en
agua de mar artificial a 20-22°C. Los animales se mantuvieron en un ciclo constante de
luz:oscuridad de 14:10.
Preparación y secuenciación de bibliotecas de
secuenciación de ADN.
Se extrajo ADN genómico de alto peso molecular de pólipos de alimentación
masculinos (clon 291-10) deH. simbiolongicarpus. Se preparó una biblioteca
PacBio HiFi según el protocolo del fabricante y se secuenció utilizando la
plataforma PacBio Sequel II. Para la preparación de la biblioteca Hi-C, se
utilizaron pólipos de alimentación masculinos (clon 291-10) deH.
simbiolongicarpusfueron congelados y molidos instantáneamente. Siguiendo
las instrucciones del fabricante, se preparó una biblioteca Hi-C utilizando el kit
Dovetail Omni-C (Canta Bio, n.º 21005). Se confirmó que la distribución del
tamaño de inserción de la biblioteca Hi-C estaba aproximadamente entre 350
pb y 1000 pb utilizando el analizador de fragmentos Agilent (Agilent). La
biblioteca Hi-C se secuenció con lecturas de extremos emparejados de 150 pb
utilizando Illumina MiSeq mediante las instalaciones centrales de secuenciación
de próxima generación del BioCenter de Viena.
Ensamblaje y andamiaje del genoma.
Las estadísticas de la calidad de lectura de PacBio HiFi se calcularon
utilizando NanoPlot v1.41.0 (De Costeret al. 2018). Las lecturas de PacBio
HiFi se ensamblaron en secuencias contig utilizando Hifiasm v0.16.1-r375 (
cheng et al. 2021) con parámetros predeterminados. Los andamios a nivel
de cromosoma se construyeron con la combinación de las secuencias
contig y las lecturas de secuenciación Hi-C. Las lecturas de Hi-C se
alinearon con las secuencias contig utilizando Juicer v1.6 (Durandet al.
2016b) con parámetros predeterminados. Luego, se realizó el andamiaje
Hi-C utilizando la tubería de ADN 3D (Dudchenkoet al. 2017) con
parámetros “–editor-repeat-coverage 1000 -r 0”. Los andamios se
seleccionaron manualmente utilizando Juicebox Assembly Tools v1.11.08 (
Durandet al. 2016a). El ensamblaje final se denominó HSymV2.0. La
calidad y la integridad del ensamblaje se evaluaron utilizando QUAST
v5.2.0 (Gurevichet al. 2013) y evaluación comparativa de ortólogos
universales de copia única (BUSCO) v5.2.2 (Simãoet al. 2015) con la base
de datos metazoa odb10 (metazoa_odb10).
Validación del ensamblaje del genoma con
H. simbiolongicarpusmapas de enlace
Para anclar las secuencias contig del ensamblaje Hsym_primary_v1.0
a los mapas de enlace genético informados anteriormente deh.
simbiolongicarpo(Chenet al. 2023), fusionamos las secuencias contig
basadas en las posiciones de los marcadores SNP y construimos 15
secuencias pseudocromosómicas para el mapa de enlace genético
materno y paterno. Estas secuencias de pseudocromosomas se alinearon
con los 15 armazones a nivel cromosómico del ensamblaje HSymV2.0
utilizando minimap2 v2.24 (Li 2018) con los parámetros “-ax asm5 –cs –
secundario=no”. Las alineaciones con calidad de mapeo 60 se conservaron
usando la vista de Samtools (Daneceket al. 2021). Los archivos de
alineación en formato BAM se convirtieron al formato PAF usando
paftools de minimap2 v2.24. Finalmente, las alineaciones se visualizaron
en diagramas de puntos usando D-GENIES (Cabanettes y Klopp 2018).
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Identificación de secuencias repetitivas.
Se generó una biblioteca de repetición personalizada del ensamblaje del
genoma utilizando RepeatModeler v2.0.4 (Flynnet al. 2020) con parámetros
predeterminados. A continuación, se identificaron secuencias repetitivas
utilizando RepeatMasker v4.1.4 (http://www.repeatmasker.org) y la biblioteca
de repetición personalizada. En este paso también se generó una secuencia
enmascarada repetida del ensamblaje HSymV2.0. Finalmente, el resultado de
repetirMasker se resumió utilizando los scripts auxiliares de repetirMasker
v4.1.4. A modo de comparación, secuencias repetitivas en elH. vulgariscepa AEP
(cazetet al. 2023) fueron identificados utilizando la misma tubería.
Anotación del genoma
El ensamblaje del genoma enmascarado repetido del ensamblaje HSymV2.0 se
utilizó para las predicciones genéticas. Identificamos la región codificante de
proteínas y la región no traducida (UTR) para cada gen, con una combinación de
predicción ab initio, predicción basada en homología y predicción basada en
transcriptoma utilizando BRAKER2 (Brunaet al. 2021). Para la predicción basada
en homología, obtuvimos la secuencia del genoma y la anotación deH. vulgaris
cepa 105 (GCA_022113875.1) de la base de datos del genoma del Centro
Nacional de Información Biotecnológica (NCBI); la secuencia del genoma y la
anotación deH. vulgariscepa AEP (cazetet al. 2023) del Portal del Proyecto
Genoma Hydra AEP (https://research.nhgri.nih.gov/HydraAEP/); y la secuencia
del genoma y la anotación del conjunto de referencia a nivel de contig deH.
simbiolongicarpus(Hsym_primary_v1.0) del Portal del Proyecto Genoma de
Hydractinia (https://research.nhgri.nih.gov/hydractinia/). Las secuencias de
proteínas se generaron a partir de las secuencias del genoma de referencia y
las anotaciones del genoma utilizando GffRead (Pertea y Pertea 2020) con el
parámetro “-S -J”. Para cada gen, se extrajo la isoforma más larga para la
predicción basada en homología. Luego, se fusionaron todas las secuencias de
proteínas. BRAKER2 se ejecutó en el ensamblaje del genoma enmascarado
repetido utilizando secuencias de proteínas homólogas con parámetros “–
epmode –softmasking”. Para la predicción basada en transcriptomas, utilizamos
lecturas de RNA-seq disponibles públicamente (números de acceso:
SRR1796501 – SRR1796515, SRR9331388 – SRR9331403 y SRR14265606 –
SRR14265626, SRR18686538 – SRR18686548). El ensamblaje del genoma
enmascarado repetido se indexó utilizando STAR v2.7.10b (Dobínet al. 2013) con
el parámetro “–runMode genomeGenerate”. Las lecturas de RNA-seq se
alinearon con el ensamblaje del genoma indexado utilizando STAR v2.7.10b con
los parámetros “–runMode alignReads –outSAMtype BAM SortedByCoordinate”.
Todos los archivos de alineación se fusionaron usando samtools merge (
Danecek et al. 2021). Luego, se ejecutó BRAKER2 en el ensamblaje del genoma
enmascarado repetidamente utilizando el archivo bam fusionado con los
parámetros “–softmasking”. Se agregaron regiones UTR a las predicciones
basadas en transcriptomas utilizando BRAKER2 con parámetros “–softmasking –
addUTR=on”. A partir de las predicciones iniciales del modelo genético, se
produjeron modelos genéticos de consenso utilizando TSEBRA v1.0.3 (gabrielet
al. 2021). También transferimos las coordenadas del gen de anotación genética
del ensamblaje Hsym_primary_v1.0 al ensamblaje HSymV2.0 usando la
herramienta Liftoff (Shumate y Salzberg 2020). Seleccionamos
 K. Kon Nanjoet al.|3

modelos genéticos que contenían codones de inicio y parada, excluyendo
aquellos que tenían codones de parada internos. Finalmente, las
predicciones de los modelos genéticos de BRAKER2 y los modelos
genéticos de Liftoff se integraron utilizando BEDTools (Quinlan y Hall 2010
). Para validar la integridad de los modelos genéticos finales, se generaron
secuencias de proteínas a partir del ensamblaje HSymV2.0 y las
anotaciones del genoma utilizando GffRead (Pertea y Pertea 2020). Cada
secuencia de proteína se examinó para detectar la presencia de
secuencias homólogas en la base de datos NCBI-nr utilizando BLAST+
v2.13.0 con los parámetros "-evalue 1e-05". La predicción del dominio de
proteínas se realizó utilizando InterProScan v5.60-92.0 (Zdobnov y
Figura complementaria 1a), el mismo individuo genético a partir del cual
se preparó la primera versión del genoma. Un total de 34,0 Gb de lecturas
HiFi (66×)delH. simbiolongicarpusEl genoma se generó con una longitud
de lectura N50 de 13,2 kb (tabla 1yFigura complementaria 1b). Realizamos
el ensamblaje del genoma de novo delH. simbiolongicarpusgenoma
usando Hifiasm (chenget al. 2021). El ensamblaje inicial del genoma
contiene 325 cóntigs con una longitud total de 483 Mb (Tabla 2). La
longitud total del contig es comparable al tamaño del genoma estimado
previamente (Francoet al. 2020). El contig N50 era de 28,8 Mb y el contig
L50 era de 8 (Tabla 2). La longitud máxima del contig fue 42,6 Mb (Tabla 2
). El contenido de GC fue del 35,85% (Tabla 2). También ensamblamos un

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Apweiler 2001). La anotación funcional genética se realizó utilizando
eggNOG-Mapper v2.1.9 (Huerta-Cepaset al. 2019). La anotación del
genoma mitocondrial se realizó utilizando el servidor web MITOS (Berntet
al. 2013). Para la visualización de la anotación del genoma mitocondrial, se
generó un archivo Genbank a partir de la secuencia del genoma
mitocondrial y su anotación utilizando la herramienta EMBOSS Seqret (
Arrozet al. 2000). El mapa del genoma mitocondrial se generó a partir del
archivo Genbank utilizando ApE (Davis y Jorgensen 2022).
andamio de ADN mitocondrial de 15,471 pb que contiene 13 proteínas,
ARNr de subunidades pequeñas y grandes y ARNt de metionina y
triptófano como otras especies de cnidarios (Figura complementaria 2) (
Zouet al. 2012;linet al. 2019). Evaluamos la integridad del ensamblaje del
genoma mediante la búsqueda de conjuntos de BUSCO en las secuencias
contig (Simãoet al. 2015). Utilizamos la base de datos de metazoos odb10
(metazoa_odb10) para este análisis. Identificamos 818 genes BUSCO
completos de 954 genes BUSCO (85,7%), de los cuales 756 estaban
presentes como copias únicas (79,2%) y 62 como duplicados (6,5%).

Análisis de sintenia También identificamos 64 genes BUSCO fragmentados (6,7%). Es de

destacar que estas estadísticas de las secuencias contig son mejores que
Para identificar ortólogos entreH. simbiolongicarpusyH. vulgaris, se prepararon
las del ensamblado Hsym_primary_v1.0, el ensamblado de nivel contig
las isoformas proteicas más largas de los armazones a nivel de cromosomas
reportado anteriormente (Tabla 3). Por ejemplo, el contig N50 del
para ambas especies. Ambos conjuntos de genes se compararon
ensamblado actual es 13 veces mayor que el de Hsym_primary_v1.0 (28,8
recíprocamente utilizando blastp con parámetros predeterminados (Altschulet
Mb vs 2,2
al. 1990). Los pares de genes con mejores resultados recíprocos se identificaron
como ortólogos entre las dos especies. Para cada especie, cada ortólogo fue
numerado según su coordenada genómica. Los gráficos de Oxford se trazaron Tabla 1.Resumen de la secuenciación del genoma.
utilizando la función de trazado en R v4.2.2.
Experimento Secuenciación Número de base total Leer
plataforma lee (base) longitud
(pb)
Resultados y discusión
Entero PacBio 3.049.931 34.014.052.488 13.241
Ensamblaje del genoma a nivel cromosómico de genoma Secuela II (N50)
H. simbiolongicarpus(HSymV2.0) secuenciación
Hola-C iluminar 14.836.376 4.450.912.800 150×2
Se extrajo ADN genómico de alto peso molecular de colonias
MiSeq
masculinas (clon 291-10) deH. simbiolongicarpus(Figura 1ay

Figura 1.Ensamblaje del genoma a nivel cromosómico deH. simbiolongicarpus(HSymV2.0). a) Colonia deH. simbiolongicarpusmacho (clon 291-10) adherido a un portaobjetos de vidrio para
microscopio, que muestra pólipos de alimentación maduros (∼5 mm de altura), yemas de pólipos y red de estolones compartidos (los pólipos sexuales no se muestran ya que se desarrollan más
tarde). b) Mapa de contacto Hi-C que muestra los 15 andamios a nivel de cromosomas y las secuencias no colocadas (Un). Los andamios se ordenan por longitud y se les asignan números.
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Tabla 2.Estadísticas de montaje de laH. simbiolongicarpusgenoma.
contigs Todos los andamios Hi-C (HSymV2.0)
Longitud total (pb) 482.771.323
Número de secuencia total 325
Longitud máxima de secuencia (pb) 42.595.244
N50 (pb) 28.808.060
L50 8 7
Contenido de GC (%) 35,85
Tabla 3.Puntuaciones BUSCO del ensamblaje del genoma.
Estudio actual Hsym_primary_v1.0
(HSymV2.0)
BUSCO completos (C) 818 (85,7%) 796 (83,5%)
completo y 756 (79,2%) 722 (75,7%)
BUSCO de una sola copia (S)
completo y duplicado 62 (6,5%) 74 (7,8%)
BUSCO (D)
BUSCO fragmentados (F) 64 (6,7%) 69 (7,2%)
BUSCO faltantes (M) 72 (7,6%) 89 (9,3%)
Total de grupos BUSCO 954 954
buscado
Mb), y el número de contigs es inferior a una décima parte del de
Hsym_primary_v1.0 (325 frente a 4.840,Tabla 2). Para construir un
ensamblaje genómico a nivel de cromosoma, se generaron 14.836.376
pares de lecturas Hi-C a partir de pólipos alimentarios masculinos (clon
291-10) (Figura complementaria 3). El andamiaje Hi-C generó el
ensamblaje final de 483 Mb de longitud con 15 cromosomas que
representan el 99,8% del tamaño total del ensamblaje (Figura 1byFigura
complementaria 4). El andamio N50 era de 33 Mb. El tamaño del andamio
más grande fue de 42,6 Mb. El tamaño total de las 69 secuencias no
colocadas fue de 1,1 Mb. Cuatro de los 15 andamios (andamios 8, 11, 12 y
15) constan de contigs individuales (Figura complementaria 4). El mapa de
contactos Hi-C del ensamblaje del genoma a nivel de cromosoma muestra
un número bajo de interacciones transcromosómicas en nuestro
ensamblaje del genoma (Figura 1b). En cada cromosoma, la intensidad del
contacto Hi-C en la posición diagonal es más fuerte que la de la otra
posición. Esto indica que secuencias adyacentes de nuestro ensamblaje
tienen un fuerte contacto. Estos hallazgos sugieren la integridad del
ensamblaje del genoma a nivel de cromosomas. El conjunto final del
genoma a nivel de cromosomas se denominó HSymV2.0.
Comparación de HSymV2.0 con los mapas de ligamiento
genético preexistentes y la identificación de cromosomas
sexuales
Para evaluar más a fondo la integridad del ensamblaje HSymV2.0,
comparamos nuestro ensamblaje genómico con los mapas de enlace
genético informados anteriormente deH. simbiolongicarpus(Chenet al.
2023). Con base en los loci de los marcadores SNP en el ensamblaje
Hsym_primary_v1.0, anclamos las secuencias contig de
Hsym_primary_v1.0 a los mapas de enlace genético materno y paterno.
Obtuvimos las secuencias de 15 pseudocromosomas maternos y
paternos. Luego, alineamos los pseudocromosomas maternos y paternos
con nuestros 15 armazones a nivel de cromosomas. Ambos conjuntos de
15 pseudocromosomas se asignaron de forma única a nuestros 15
andamios a nivel de cromosomas (Figuras 2a y b). Las alineaciones
resultantes también revelaron las relaciones colineales entre los 15
armazones a nivel de cromosomas del ensamblaje HSymV2.0 y los
pseudocromosomas maternos (Figura 2a) o pseudocromosomas paternos
(Figura 2b). Estos resultados demuestran la contigüidad
Andamios a nivel de cromosomas Hsym_primary_v1.0
482.928.323 481.835.061 406.663.980
84 15 4.840
42.572.105 42.572.105 11.665.964
33.314.500 33.314.500 2.235.630
7 48
35,85 35,85 35.22
e integridad del ensamblaje HSymV2.0. El estudio anterior demostró que
Descargado de https://academic.oup.com/g3journal/article/13/8/jkad107/7170730 por el usuario de Withers el 4 de septiembre de 2023.
H. simbiolongicarpustiene un sistema de determinación del sexo XX/XY y
que el locus determinante del sexo está ubicado al final del grupo de
enlace 4 (Chenet al. 2023). En ambos grupos de enlace, el grupo de enlace
4 se asignó al cromosoma 1 del conjunto HSymV2.0 (Figuras 2a y b).
Según este resultado, lo más probable es que el cromosoma sexual en el
conjunto HSymV2.0 sea el cromosoma 1 (Figura 2).
Identificación de secuencias repetitivas.
Para la identificación de secuencias repetitivas en el ensamblaje del genoma,
generamos una biblioteca de repetición personalizada de nuestro ensamblaje
del genoma usando RepeatModeler. Esta biblioteca contiene 2.300 familias
repetidas. Luego, se ejecutó RepeatMasker en el ensamblaje utilizando la
biblioteca personalizada. Las secuencias repetitivas representaron 296 Mb
(61%) del ensamblaje HSymV2.0. Las secuencias repetitivas están compuestas
por repeticiones totales intercaladas (58,25%), repeticiones simples (0,70%) y
otras (Tabla 4). El total de repeticiones intercaladas se puede dividir en
retroelementos (5,20%), transposones de ADN (4,94%), círculos rodantes (0,55%)
y elementos no clasificados (48,11%). Entre los retroelementos, los LINE (3,01%)
resultaron ser los más abundantes (Tabla 4). Entre los transposones de ADN,
Tc1-IS630-Pogo (0,48%) y hobo-Activador (0,33%) fueron los dos elementos
principales (Tabla 4). Estos resultados son similares al análisis repetido de laH.
vulgaris genoma. En elH. simbiolongicarpusgenoma, la divergencia de
secuencia de las repeticiones reveló al menos dos períodos discretos de
expansión de repeticiones (Figura 3a). En cambio, en elH. vulgarisgenoma, se
mostró una expansión repetida más continua (Figura 3b), lo que también fue
indicado por el estudio anterior (Chapmanet al. 2010).
Predicción genética y anotación funcional.
Para predecir genes codificadores de proteínas en el ensamblaje HSymV2.0,
adoptamos una combinación de predicción ab initio: predicción basada en
homología y predicción basada en transcriptoma. Para la predicción basada en
homología, utilizamos secuencias de proteínas deH. vulgarisy
Hsym_primary_v1.0. Para la predicción basada en transcriptoma, las lecturas de
RNA-seq disponibles públicamente se alinearon con el ensamblaje utilizando el
alineador STAR (Dobínet al. 2013). Luego realizamos la anotación del genoma
usando BRAKER2 (Brunaet al. 2021) con evidencia de homología o evidencia de
transcriptoma. Finalmente, las anotaciones del genoma resultantes se
integraron utilizando TSEBRA (gabrielet al. 2021) para producir el modelo
genético de consenso. También asignamos las coordenadas genéticas de la
anotación genética del ensamblaje Hsym_primary_v1.0 al ensamblaje HSymV2.0
usando la herramienta Liftoff (Shumate y Salzberg 2020). Finalmente,
predijimos un total de 25.825 genes codificadores de proteínas. De los 22.022
genes codificadores de proteínas en el ensamblaje Hsym_primary_v1.0, 21.686
genes (98,5%) se asignaron a 18.606 genes en el ensamblaje HSymV2.0 (Tabla
complementaria 1). Los genes codificadores de proteínas predichos mostraron
una longitud media del cuerpo del gen de 5.854 pb, una longitud media de la
secuencia codificante (CDS) de 1.346 pb y un número medio de exones de 6,43.
Detectamos 888 genes BUSCO completos de un total de 954 genes BUSCO
(93,1%) en las 25.825 proteínas predichas. Entre estos genes, 813 aparecieron
en copias únicas.
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Figura 2.Colinealidad entre los andamios Hi-C del presente estudio y los mapas de ligamiento genético (Chenet al. 2023). a) Alineamientos de secuencia entre los andamios Hi-C y
los pseudocromosomas basados en el mapa de ligamiento genético materno. b) Alineamientos de secuencia entre los andamios Hi-C y los pseudocromosomas basados en el
mapa de ligamiento genético paterno.

Tabla 4.Resumen de los resultados de RepeatMasker.

h. H. vulgaris
simbiolongicarpo
Número de Longitud ocupada Porcentaje de Número de Longitud ocupada Porcentaje de
elementos (pb) secuencia elementos (pb) secuencia

Retroelementos 50.329 25.095.050 5.20 316.787 153.628.253 17.05

SENOS: 12.586 1.987.472 0,41 21,296 3.637.401 0,40
Penélope 9.072 2.726.592 0,56 52.322 17.817.731 1,98
Líneas: 27.013 14.541.672 3.01 281,818 140.096.759 15.55
CRE/SLACS 1.786 821.583 0,17 298 150,224 0,02
L2/CR1/Rex 9.860 6.205.894 1.29 207,793 111.582.339 12.39
R1/LOA/Jockey 0 0 0.00 659 166.379 0,02
R2/R4/NeSL 1.415 881.271 0,18 0 0 0.00
RTE/Bov-B 3,902 3.319.744 0,69 3.759 1.136.092 0,13
L1/CIN4 128 79,792 0,02 0 0 0.00
Elementos LTR: 10.730 8.565.906 1,77 13.673 9.894.093 1.10
BEL/Pao 1.500 1.411.183 0,29 2,320 2.078.705 0,23
Ty1/Copia 2,594 1.823.078 0,38 135 160.597 0,02
Gitano/DIRS1 5.721 4.579.944 0,95 9.802 6.193.847 0,69
retroviral 155 104,124 0,02 0 0 0.00
transposones de ADN 56.331 23.868.445 4.94 536.767 243.675.039 27.05
hobo-activador 3.454 1.578.931 0,33 183.730 81.989.900 9.10
Tc1-IS630-Pogo 11.142 2.305.486 0,48 128,135 56.913.582 6.32
En-Spm 0 0 0.00 0 0 0.00
PiggyBac 338 264,413 0,05 4.776 2.483.575 0,28
Turista/Preagio 5.311 1.339.873 0,28 6.623 1.752.620 0,19
Otro 3.354 1.092.285 0,23 30.175 13.042.137 1,45
círculos rodantes 9.783 2.673.725 0,55 6.653 3.214.957 0,36
Desclasificado: 410.631 232.360.741 48.11 764.256 184.468.711 20,48
Total intercalado 281.324.236 58,25 581.772.003 64,57
repite
ARN pequeño: 12,289 8.667.551 1,79 13,979 1.876.864 0,21
Satélites: 918 166.061 0,03 0 0 0.00
Repeticiones simples: 51.000 3.398.212 0,70 376.701 41.350.470 4.59
Baja complejidad: 10,920 531.858 0,11 49.800 2.588.884 0,29
Bases totales enmascaradas: 295.609.498 61.21 630.803.178 70.02

(85,2%), mientras que 75 existían como duplicados (7,9%) (Tabla 5). Estas puntuaciones
BUSCO fueron mejores que las de las secuencias de proteínas predichas del
ensamblaje Hsym_primary_v1.0 (Tabla 5). De todos los genes codificadores de
proteínas predichos en nuestro ensamblaje, 20.985 genes codificadores de proteínas
(81,3%) tenían una homología significativa con las secuencias del NCBI.
base de datos no redundante (nr) (Figura 4ayTabla complementaria 2). Del total
de 20.985 genes que mostraron una homología significativa con los genes de la
base de datos NCBI-nr, 16.670 genes (79,4%) correspondieron a genes de
Cnidaria (Figura 4a). 4.255 genes (20,3%) fueron afectados por genes de
Bilateria (Figura 4a). Los restantes 42 (0,2%) y 18 (0,1%) genes alcanzaron el
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Fig. 3.Paisaje repetido intercalado de laH. simbiolongicarpusgenoma yH. vulgarisgenoma. a) Paisaje repetido intercalado deH. simbiolongicarpus. b) Paisaje repetido
intercalado deH. vulgaris. ElX-El eje representa el nivel de sustitución de Kimura para elementos repetidos de las secuencias de consenso (edad relativa). ElyEl eje
representa la abundancia relativa de cada familia repetida en el genoma. Las repeticiones activas antiguas se colocan en el lado derecho del gráfico y las repeticiones
activas recientes están en el lado izquierdo.

anotación. Por ejemplo,Piwi1es un marcador conocido para las células i (

Tabla 5.Puntuaciones BUSCO a partir de las proteínas predichas.
bradshawet al. 2015;gahanet al. 2016). En el ensamblaje HSymV2.0, Piwi1está
Estudio actual Hsym_primary_v1.0 en la cadena positiva de ADN en el cromosoma 13, que se extiende desde la
(HSymV2.0) posición del par de bases 16.493.941 a 16.509.130 (Figura 4c). Otro ejemplo es
el factor de transcripción AP2 (Tfap2). Este gen es un regulador del compromiso
BUSCO completos (C) 888 (93,1%) 882 (92,5%)
completo y 813 (85,2%) 785 (82,3%) de las células germinales (dubucet al. 2020).Tfap2se encuentra en el
BUSCO de una sola copia (S) cromosoma 5 desde la posición del par de bases 20.139.307 a 20.141.788 en la
completo y duplicado 75 (7,9%) 97 (10,2%) cadena positiva del ADN (figura 4d).
BUSCO (D)
BUSCO fragmentados (F) 20 (2,1%) 12 (1,3%)
BUSCO faltantes (M) 46 (4,8%) 60 (6,2%)
Total de grupos BUSCO 954 954
Análisis de sintonía entreH. simbiolongicarpus y
buscado H. vulgaris
Investigamos la relación sinténica entreH. simbiolongicarpusyH.
vulgaris. Se identificaron un total de 8.974 ortólogos (Tabla
complementaria 5). Generamos el diagrama de puntos de Oxford
Genes de esponja y placozoa, respectivamente. Identificamos que 22.199 genes entreH. simbiolongicarpusyH. vulgariscon estos ortólogos (Figura 5a
codificadores de proteínas (86,0%) tenían dominios proteicos utilizando InterProScan ( ). En general, este gráfico reveló que la sintenia a escala
Tabla complementaria 3) (Zdobnov y Apweiler 2001). También utilizamos eggNOG- cromosómica (macrosintenia) está altamente conservada sin
Mapper (Huerta-Cepaset al. 2019) para los genes codificadores de proteínas predichos colinealidad entre estas especies (Figura 5a). Además, los pares de
y encontró que 18,547 genes estaban funcionalmente anotados (Tabla cromosomas (andamio 5 y 15 deH. simbiolongicarpusvs HVAEP3 y
complementaria 4). En general, el 92,8% (23.971 genes) de todos los genes HVAEP5 delH. vulgaris, andamio 2 y 14 deH. simbiolongicarpusvs
codificadores de proteínas predichos tenían anotaciones funcionales respaldadas por HVAEP7 y HVAEP14 delH. vulgaris) mostró relaciones sinténicas que
una o más de las bases de datos anteriores (Figura 4b). Los genes del factor de células sugieren translocaciones intercromosómicas pasadas después de la
madre están bien predichos en nuestro genoma divergencia entre las especies (Figuras 5b yc).
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Figura 4.Anotación genética del ensamblaje HSymV2.0. a) Resultados de búsqueda BLAST del total de 25.825 genes codificadores de proteínas predichos en la base de datos NCBI-nr. Se
identificaron un total de 20.985 coincidencias genéticas en la base de datos NCBI-nr. Las 20 principales especies de origen de los éxitos de BLAST se muestran como un diagrama de barras. El
gráfico circular insertado representa el resumen de los orígenes de las especies. La combinación de colores del gráfico de barras corresponde a la del gráfico circular insertado. b) Diagrama de
Venn que muestra anotaciones funcionales de los genes codificadores de proteínas predichos del ensamblaje HSymV2.0. c) Estructura genética dePiwi1en el cromosoma 13. d) Estructura genética
deTfap2en el cromosoma 5.

Figura 5.Diagrama de puntos de Oxford de ortólogos entreH. simbiolongicarpusyH. vulgaris. a) Diagrama de puntos de Oxford utilizando los 8.974 ortólogos. Para ambas especies, los ortólogos
se numeran secuencialmente según sus posiciones genómicas. Cada punto representa los ortólogos. b) Diagrama de puntos de Oxford utilizando ortólogos en los andamios 5 y 15 de
H. simbiolongicarpusensamblaje del genoma y aquellos en HVAEP3 y HVAEP5 delH. vulgarisensamblaje del genoma. c) Diagrama de puntos de Oxford usando
ortólogos en el andamio 2 y 14 deH. simbiolongicarpusensamblaje del genoma y aquellos en HVAEP7 y HVAEP14 delH. vulgarisensamblaje del genoma.

Conclusión Mb y N50 de 28,8 Mb. El siguiente andamiaje Hi-C dio como resultado 15
andamios a nivel de cromosomas que contienen el 99,8% del ensamblaje
En resumen, realizamos el ensamblaje del genoma de novo deH. total del genoma. Este ensamblaje HSymV2.0 es el primer ensamblaje
simbiolongicarpusy obtuvo secuencias contig con un tamaño de 483 genómico a nivel cromosómico deH. simbiolongicarpus. En
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En el ensamblaje HSymV2.0, predijimos 25.825 genes codificadores de
proteínas, y el 92,8% de estos genes (23.971 genes) estaban funcionalmente
anotados. Las repeticiones y anotaciones genéticas del ensamblaje del genoma
y el análisis comparativo del genoma entreH. simbiolongicarpusyH. vulgaris
Destacar una evolución genómica única deH. simbiolongicarpus. Nuestro nuevo
ensamblaje genómico a nivel de cromosomas deH. simbiolongicarpusserá un
recurso importante para la biología de este organismo. También puede resultar
útil en estudios genómicos comparativos sobre la evolución de células madre
en organismos multicelulares.
Disponibilidad de datos
El ensamblaje HSymV2.0, la anotación genética y los archivos
relacionados se han depositado en Figshare (https://doi.org/10.6084/
m9.figshare.22126232.v1). El conjunto HSymV2.0 también se ha
depositado en el NCBI con el número de acceso JARBIS000000000.
Las lecturas de PacBio HiFi están disponibles en Sequence Read
Archive (SRA) con el número de acceso SRR23493933. Las lecturas de
Hi-C se han depositado en la SRA con el acceso SRR23493932.
Material suplementariodisponible en G3 en línea.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Darrin Schultz (Universidad de Viena, Viena,
Austria), Thea Rogers (Universidad de Viena, Viena, Austria), Nina
Znidaric (Universidad de Viena, Viena, Austria) y Angela Caballero
Alfonso (Universidad de Viena, Viena, Austria) por sus consejos sobre
el experimento Hi-C. Los autores agradecen a Atsushi Ogura
(Instituto Nagahama de Biociencia y Tecnología, Nagahama, Japón),
Hiromasa Tabata (Instituto Nagahama de Biociencia y Tecnología,
Nagahama, Japón) e Ikuyo Takemura (Instituto Nagahama de
Biociencia y Tecnología, Nagahama, Japón) por sus consejos sobre el
análisis de andamios Hi-C. Los autores también agradecen a Juan
Daniel Montenegro Cabrera (Universidad de Viena, Viena, Austria)
por sus consejos sobre la anotación del genoma. También
agradecemos a Laura Ryan por el cuidado de los animales, a Patricia
Calcagno por la imagen que aparece enFigura 1ay a los miembros de
Frank Lab por su ayuda en la recolección de muestras. La mayoría de
los cálculos se realizaron en el Life Science Compute Cluster (LiSC) de
la Universidad de Viena.
Fondos
Este trabajo fue apoyado por el premio Wellcome Trust Investigator
no. 210722/Z/18/Z a UF, por la Science Foundation Ireland Centre for
Research Training in Genomic Data Science (subvención n.° 18/CRT/
6214) a HRH, el Austrian Science Fund FWF (I4353) a OS y KK-N ., la
Fundación Científica Takeda a TK, la Fundación Mochida Memorial
para la Investigación Médica y Farmacéutica a TK y la Fundación
Internacional de Investigación Médica a TK
Declaración de conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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Editor: J. Parker