“AÑO DE LA UNIDAD, LA

PAZ Y EL DESARROLLO”

TECNOLOGÍA MÉDICA EN LABORATORIO CLÍNICO Y

ANÁLISIS PATOLÓGICO

Informe: Hepatitis B - Elisa

Curso: Instrumentación y Automatización en

Laboratorio Clínico

Docente: Lic. T.M. Zorrilla Ayllon Francois

NRC: 15711

Semestre: II, III Y IV

Estudiantes:
○ Nieto Chuco Sol Elizabet

2023
 HEPATITIS B: ELISA

1. OBJETIVO

Determinar el Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección del antígeno

de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)

2. FUNDAMENTO

HBsAg ELISA es un método inmunoenzimático directo tipo sandwich. Los pocillos

de la policubeta están recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs
(anti-HBsAg) que actúa como anticuerpo de captura. La muestra se incuba en uno
de los pocillos. Si la misma contiene HBsAg, éste formará un complejo con el
anticuerpo unido a la placa. El material no unido se elimina por lavado. En el
siguiente paso se agrega el anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con
peroxidasa, que se unirá con los complejos anticuerpo-antígeno formados
previamente. El conjugado no unido se remueve por lavado. Posteriormente se
agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. En
los casos en que el HBsAg esté presente en la muestra, se desarrolla color
celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico.

3. SIGNIFICANCIA CLÍNICA

La hepatitis B es una enfermedad viral del hígado causada por el virus de la

hepatitis B (HBV). Puede cursar en forma asintomática, o como un proceso agudo
o crónico. En los casos más graves puede derivar en cirrosis hepática y
carcinoma hepatocelular primario. Se transmite principalmente por contacto
parenteral, percutáneo, o sexual. También se ha observado transmisión perinatal
y horizontal. El HBV está constituido por una nucleocápside que contiene el ADN
asociado a proteínas core y una envoltura cuyo principal componente es una
proteína conocida como antígeno de superficie (HBsAg). El HBsAg generalmente
aparece 6 semanas después de la exposición al HBV y persiste durante 4-14
semanas. Está presente durante el periodo de incubación, antes de la aparición
de la enfermedad clínica y puede ser detectado en sangre 2 a 8 semanas antes
de la aparición de ictericia o de evidencias bioquímicas de disfunción hepática.
Así, el HBsAg es un primer indicador de infección por el HBV. La hepatitis B
crónica se define como la presencia del HBsAg en sangre durante más de 6
meses. La detección del HBsAg es importante para el diagnóstico de las hepatitis
agudas y crónicas, el control de portadores en bancos de sangre y unidades de
diálisis, de trasplantados y gestantes y para el control de preparados de sangre y
derivados destinados a transfusiones.
4. PROCEDIMIENTO

Llevar a temperatura ambiente los reactivos.

Preparar el buffer de lavado (wash): 58,2 ml de agua destilada + 2 ml de

wash y ponerlo en el rotador para que disuelve los cristales de sales.
Llevar los pocillos en el soporte, que incluye: 2 pocillos control positivo, 2

Agregar 50 ul ul de CP en los primeros pocillos, 50 ul de CN en los siguientes

pocillos y 50 ul de muestra del paciente.
Agregar 50 ul del Reactivo HRP - conjugado picante a cada pocillo y mezclar
suavemente.
Cubrir los pocillos e incubar durante 30 min en la estufa por 37°C .

Realizar el lavado de 280 ul con el wash por unas 5 veces y voltear la placa y
colocar sobre papel absorbente.
Agregar 50 ul del Sustrato A + Sustrato B de cada uno y homogeneizar
suavemente.

Incubar en un fondo oscuro por 10 min a 37°C .

Agregar 50 ul de Solución Stop.

Finalmente se lee en el espectrofotómetro a 450 nm

5. CÁLCULOS

Se obtienen las absorbancias en el espectrofotómetro.

Para hallar el cuttof se realiza los sgtes cálculos:

Cuttof: N x o.4 + P x 0.6

N: promedio del control negativo

P: promedio del control positivo

Resultado: 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 ≥ 1. 00

Positivo <1.00
6. RESULTADOS

Realizando los cálculos correspondientes:

Determinamos que el punto de corte o cuttof es 1.3556
Y la absorbancia de la muestra fue de 1.966
Haciendo la resta no da un valor de 1,4212

Lo que resulta negativo para la prueba de Hepatitis B - elisa

7. RECOMENDACIONES

Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por duplicado. Si una o
ambas repeticiones dan reactivas, la misma debe considerarse reactiva. Una
muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones.
Esto puede deberse a:

- Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva.

 - Contaminación de la muestra durante la dispensación, imprecisión en el
dispensado de muestra, conjugado y/o revelador en el pocillo. - Reutilización
de tips.

- Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes. En

ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reacción
falsamente reactiva, tanto en el análisis inicial como en sus repeticiones.

Algunas causas de este fenómeno pueden ser:

- Contaminación de la muestra durante la extracción, procesamiento o

conservación.

- Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos,

fármacos, etc.

- Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lavado (sistema

obstruido).

8. CONCLUSIONES

Las pruebas del virus de la hepatitis B son análisis de sangre que muestran
si usted tiene o no una infección activa por hepatitis B. Las pruebas también
pueden mostrar si ha tenido la infección en el pasado.

Para realizar este procedimiento, se debe tener en cuenta varios aspectos,

como la forma de preparado de reactivos, el tiempo en la estufa como
incubación, la temperatura correcta, el lavado correcto con el wash y la
lectura adecuada en el espectrofotómetro ya que esta determinación es muy
sensible y estos factores en una forma negativa podría afectar el resultado,
por lo tanto para ejecutar esta prueba tenemos que tener concentración y
las buenas prácticas de laboratorio.

CUADRO DE PORCENTAJE DE TRABAJO

Nieto Chuco Sol Elizabet 100 %