R.A. 451 sub F/O MAFSAFF tla UNIVERSIDAD DE “eee foun FACULTAD DE ODONTOLOGIA en ° CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COLUTORIOS ORALES TESIS DOCTORAL M* Soledad Ferreiro Cotorruelo SEVILLA 1998 Fdo., EL DoCTOKAM>PO :UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGIA Sevilla, 23 de noviembre de 1998 PEDRO BULLON FERNANDEZ, Catedratico de Medicina Bucal y Periodoncia de la Facultad de Odontologia de la Universidad de Sevilla. GUILLERMO MACHUCA PORTILLO, Profesor Titular de Odontologia Integrada de Adultos de la Facultad de Odontologia de la Universidad de Sevilla. CERTIFICAN: Que M* Soledad Ferreiro Cotorruelo, Licenciada en Medicina y Cirugia por la Universidad de Sevilla y lLicenciada en Odontologia por la Universidad de Granada, ha realizado bajo su tutela y direccién el trabajo titulado Capacidad Antioxidante de los Colutorios Orales, que consideramos satisfactorio para optar al Grado de Doctor en Odontologia. Fdo.P: 5 ll6n Fernandez £. Machuca PortilloAGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi gratitud a los profesores Pedro Bullén Fernandez y Guillermo Machuca Portillo de la Facultad de Odontologia de la Universidad de Sevilla por sus sabios consejos para la realizacién del presente trabajo. Quiero agradecer a mis amigas y compafieras M* del Carmen Machuca Portillo, M* del Mar Gonzalez Santiago e Isabel Gallardo el apoyo que me han prestado. Por ultimo, agradecer a la Dra. Silvia Svegliati Baroni de la Universita degli Studi di Ancona (Italia) su colaboracién activa en el trabajo de laboratorio, al Dr. José L. Quiles de la Universidad de Granada el haberme orientado en el mundo de los radicales libres y antioxidantes, y a Ricardo Ferreiro Almeda las informaciones sobre especialidades farmacéuticas que me ha facilitado.DEDICADO amis padresINDICE INTRODUCCION. 1.1. PERIODONTITIS. Epidemiologia. Caracteristicas histopatoldgicas. Patogénesis. Anomalias leucocitarias. 1.2, RADICALES LIBRES: GENERALIDADES. Nomenclatura y propiedades de radicales libres y ero. Estrés oxidativo. Balance oxidativo. Los blancos del dafio oxidativo. 1.3, ANTIOXIDANTES. Mecanismos de prevencién. Mecanismos que interrumpen la cadena de la peroxidacion lipidica. Mecanismos de reparacién. Mecanismos de adaptacién. 1.4, HIGIENE ORAL EN PERIODONCIA. 1.5. COLUTORIOS COMO VIA DE ADMINISTRACION DE PRODUCTOS DE HIGIENE, PREVENCION Y TRATAMIENTO. Prevencién de caries. Control de placa y gingivitis. Aditivos inhibidores del sarro. Control de la hipersensibilidad dental. Combatir la halitosis. Otras sustancias presentes en los colutorios comerciales. Pag. 15 17 18 23 26 31 31 35 40 41 42 48 49 50 56 56 57 57Importancia de los solventes en los colutorios. Efectos indeseables del uso de colutorios. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. MATERIAL Y METODO. MATERIALES . PREPARACION DE LOS REACTIVOS. PROCEDIMIENTO. RESULTADOS. DISCUSION. CONCLUSIONES. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. FIGURAS.INTRODUCCION1.1. PERIODONTITIS. La periodontitis (PE) se ha definido tradicionalmente como una enfermedad indolora, lentamente progresiva caracterizada por inflamacién de la encia, provocada por la colonizacién bacteriana de la superficie dental adyacente y que a través de los tejidos periodontales profundos llega a colonizar y destruir estas estructuras provocando la formacién de bolsa con reabsorcién de hueso, movilidad y caida de los dientes. Actualmente se considera que la periodontitis es un grupo de estados inflamatorios de los tejidos de soporte dentario, causado por bacterias, con distinta etiologia, historia natural, progresién de la enfermedad y respuesta al tratamiento, pero que tienen en comin una cadena de hechos. Por ejemplo, las caracteristicas histopatolégicas y estructurales en la destruccién, cicatrizacién y regeneracién tisular son muy similares, aunque no idénticas, en todas las formas de periodontitis. Siempre es necesaria la presencia de bacterias para el inicio y progresién de 1a enfermedad, aunque no suficiente: factores del huésped, tanto genéticos como ambientales, son determinantes para la prevalencia y la severidad de las manifestaciones clinicas (Page y cols., 1997), Del cambiante equilibrio de las interacciones huésped - bacterias surge el estado de salud o enfermedad; cuando este equilibrio se rompe, bien del lado bacteriano (elevado nimero de bacterias, gran virulencia bacteriana,...), bien del lado del huésped (reacciones de hipersensibilidad, reduccién de lacapacidad defensiva por alteracioén inmunitaria,...), se desarrolla la enfermedad. EPIDEMIOLOGIA La interpretacién de los datos epidemiolégicos en la enfermedad periodontal es dificil debido a la inconsistencia de la metodologia usada. Es necesario sistematizar los criterios clinicos (muy discutidos) para definir la periodontitis establecida y evitar falsos positivos; asi la pérdida de insercién, la profundidad de la bolsa y el indice CPITN son los mas utilizados. También es importante la valoracién de la pérdida de dientes como secuela de la enfermedad (caries o periodontitis); la permanencia de la denticién natural en los individuos de més edad incrementa la prevalencia. Todo ello dificulta la comparacién y extrapolacién de datos de los diferentes estudios (Papapanou, 1996). Periodontitis juvenil (PJ) La aparicién temprana de la periodontitis es infrecuente. Un estudio sueco (Sjédin y Matsson, 1994) indica que la frecuencia de pérdida é6sea en nifios de 7 a 9 afios se situa entre el 2 y el 4.58. Sjédin y cols. en 1993 demuestran que entre el 20 y el 52% de los sujetos con periodontitis juvenil tenian ya pérdida osea en la denticién decidua, con lo cual la aparicién de la periodontitis juvenil seria mds temprana, en ciertos individuos, de lo que hasta ahora se pensaba.La prevalencia de la periodontitis juvenil se sitta alrededor del 1%. Entre los 14 y 17 afios la forma localizada afecta al 0.53% y la generalizada al 0.13% (Loé y Brown, 1991). Varios estudios corroboran que la aparicién temprana es mas frecuente en paises en desarrollo y en sujetos de raza negra; la forma localizada afecta mas al sexo femenino y la generalizada a la raza negra (Lée y Brown, 1991; Cogen y cols., 1992). Ambas son mds frecuentes en niveles socioeconomicos bajos (Aass y cols., 1994). Periodontitis del adulto (PA) Existen numerosos factores de riesgo que afectan tanto a la prevalencia como a la gravedad: edad: afecta a la gravedad; hay un pico entre los 50 - 60 afios (incrementa la pérdida media de insercién en mm) (Brown y cols., 1989). género: en general, después de los 40 afios, los hombres tienen mayor prevalencia y gravedad que las mujeres (Salonen y cols., 1991). raza, educacién y situacién econémica: parece que la prevalencia se relacione de manera inversa con grados crecientes de educacién e ingresos, mientras que el factor étnico no es tan determinante (Spolsky, 1997). Area geogréfica: tradicionalmente se pensaba que prevalencia y gravedad de la PE eran mayores en Asia y en Africa, pero es ms importante el nivel de desarrollo socio-econémico de la zona (Papapanou, 1996).tabaquismo: aumenta prevalencia y severidad (Haber y cols., 1993) y la progresién. diabetes mellitus: los diabéticos tipo II presentan tres veces mas pérdida de hueso alveolar que los no diabéticos (Emrich y cols., 1991). Ademés, la diabetes de larga duracién, de aparicién temprana y con pobre control metabélico aumenta el riesgo de PE destructiva (Thorstensson y Hugoson, 1993). infeccién por VIH: algunos estudios recientes han establecido que no hay relacién entre el estado periodontal y los recuentos de linfocitos T4, siendo més importante otros factores de riesgo como el tabaco para la extension y destruccién periodontal (Swango y cols., 1991; Barr y cols., 1992). cuidado dental profesional: prevalencia y gravedad aumentan con el abandono odontolégico (Spolsky, 1997). otros: patologia periapical (Jansson y cols., 1993) y ciertas formas de maloclusién en la infancia. Asimismo la PE es un factor de riesgo para otras enfermedades: isquemia coronaria y aterosclerosis (Beck y cols., 1996; Loesche y cols., 1998) cuyo riesgo aumenta en un 25% respecto a los no-PE y para el nacimiento de hijos prematuros de bajo peso (Offenbacher y cols., 1996). aCARACTERISTICAS HISTOPATOLOGICAS (Moskow y Polson, 1991). 1.- Presencia y eventual migracion apical de la insercién epitelial; 2.- Presencia y eventual profundizacién de un infiltrado inflamatorio subyacente al epitelio de unién; 3.- Presencia y eventual rotura de las fibras del tejido conectivo ancladas en el cemento radicular; 4.- Presencia y eventual reabsorcién de la porcién marginal del hueso alveolar. La inflamacién gingival crénica se considera una fase temprana de la periodontitis, hablandose de una secuencia gingivitis-periodontitis. Sin embargo no toda gingivitis desarrolla necesariamente una periodontitis, pero, con raras excepciones, ésta comienza siempre como una gingivitis. En un conocido estudio publicado en 1965, Lée y cols. establecieron la relacién entre acumulacién de placa e inflamacién gingival; los cambios histolégicos asociados con gingivitis y periodontitis fueron objeto de estudio durante la década de los 70. En 1976 Page y Schroeder describen cuatro estadios histopatolégicos en la inflamacién periodonta lesién periodontal inicial, temprana, establecida y avanzada. 1.- lesié inicial: aparece tras 4 dias de acumulacién de placa, no es visible clinicamente (Lée y cols., 1965) y se caracteriza por una respuesta inflamatoria aguda (Payne y cols., 1975), Hay aumento del flujo del fluido crevicular y de la migracién de leucocitos polimorfonucleares (PMN) desde del plexo vascular subyacente a los epitelios de unién y sulcular.Este infiltrado ocupa del 5 al 10 % del tejido conectivo gingival. 2.- lesién temprana: tras 7 dias de acumulacién de placa, el infiltrado inflamatorio predominante esté constituido por linfocitos y macréfagos y escasas células plasmdticas en la periferia de la lesién (Brecx y cols., 1987). En este estadio el infiltrado representa el 15% del tejido conectivo gingival, con una destruccién de colaégeno del 60%. Los cambios inflamatorios son detectables clinicamente (Ltée y cols., 1965). 3.- lesién establecida (o periodo de estado): tras 2 0 3 semanas de acumulacién de placa, aumenta la extensién del area afectada. Predominan las células plasmaticas y los linfocitos Ben la periferia de la lesién; macréfagos y linfocitos se encuentran en la lamina propia y en la bolsa gingival. En el epitelio de unién y sulcular el infiltrado es neutrofilico (Lindhe y cols., 1980; Brecx y cols., 1988). Estos cambios edematosos clinicamente asociados con inflamacion gingival, no parecen conllevar un aumento del volumen microvascular por unidad de tejido conectivo (Brecx y col., 1992b). 4,.- lesién avanzada: hay destruccién del tejido conectivo y migracion apical del epitelio de unién (Schroeder y Lindhe, 1975) Las caracteristicas del infiltrado son similares al estadio anterior. Parece existir un aumento en el didmetro de las vénulas (Zoellner y Hunter, 1991).PATOGENESIS. La PE seria el resultado de una infeccién especifica y una inapropiada respuesta del huésped. La placa dental bacteriana es el factor etioldgico primario; consiste en una biopelicula transparente e incolora vinculada con un huésped (Costerton y cols., 1994): matriz de mucoproteinas y mucopolisacéridos que incluye poblaciones bacterianas adheridas entre si y/o a superficies (diente, restauraciones,) e interfases. la placa supragingival estdé en o sobre el margen gingival y es critica en la formacién de sarro y caries dental; cuando la placa supragingival esta en contacto con el margen gingival se llama placa marginal y tiene importancia en la gingivitis. La placa subgingival se encuentra por debajo del margen gingival, entre el diente y el tejido del surco gingival, y puede estar vinculada con el diente o con los tejidos; en este ultimo caso es importante en la destruccién del tejido blando en la PE. La formacién de la placa dental representa una sucesién ecolégica muy ordenada: la mucina de la saliva crea una cuticula o pelicula adquirida sobre el diente que facilita la adherencia selectiva de las bacterias a la superficie supragingival del diente. las bacterias grampositivas facultativas son pioneras en la colonizacién (comenzando Streptococcus sp. y luego Actinomyces sp.). Posteriormente, este ambiente aerobio se transforma en otro muy escaso enoxigeno donde predominan las bacterias anaerobias gramnegativas. La mayoria de las bacterias que contribuyen al origen y progresién de las enfermedades periodontales pertenecen a la flora fisiolégica normal de la boca. Entre las bacterias patégenas para el periodonto se encuentran fundamentalmente las bacterias gramnegativas Actinobacillus | actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Bikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Selenomonas sp. y espiroquetas, asi como las bacterias grampositivas Eubacterium sp. y Peptostreptococcus micros (Savitt y Socransky, 1984). Esta biopelicula, usualmente es resistente a los mecanismos de defensa del huésped, asi como a los antibidticos, sistémicos y locales, y agentes antimicrobianos. Por otro lado, la transmisién bacteriana es comin dentro del grupo familiar, lo cual es de utilidad para prevenir y tratar a los individuos con alto riesgo de enfermedad periodontal severa (Darveau y cols., 1997). El c&leulo dental es la placa calcificada; se compone fundamentalmente de bacterias muertas y sales minerales; favorece la colonizacién bacteriana de la placa, debido a su superficie rugosa y dificulta su eliminacion. El calculo dental se puede localizar a nivel supra o subgingival. El c&lculo dental subgingival es de color pardo y contiene minerales que proceden fundamentalmente del fluidogingival, por lo que se desarrolla una vez formada la bolsa periodontal; su localizacién es independiente de los orificios de desembocadura de las glandulas salivales. Las bacterias bucales que colonizan el célculo dental son dificiles de eliminar con los procedimientos de higiene oral rutinarios, sin embargo, pueden retrasar su desarrollo. Si no se elimina la placa, se produce una reaccién inflamatoria aguda y posteriormente crénica en la encia, es decir, gingivitis. La gingivitis puede evolucionar a PE. En el proceso patogenético se distinguen cuatro fases: A)Colonizacién bacteriana: las bacterias poseen factores de virulencia que les permiten dafiar directa o indirectamente (reaccién patolégica del huésped) los tejidos periodontales. En el surco gingival estén presentes anticuerpos (inmunoglobulinas) y factores del complemento que intentan inhibir la colonizacién y producir lisis bacteriana; se forman asi complejos antigeno-anticuerpo-complemento (Ag-Ac-C) que pueden estimular reacciones de anafilaxia. B)Cuando estos mecanismos de defensa se ven superados por la carga antigénica se produce la invasién bacteriana y los mismos complejos Ag-Ac-C acttian como factores quimiotacticos para los leucocitos polimorfonucleares neutréfilos (PMNn). Las bacterias pueden invadir los tejidos del huésped bien directamente o a través de ulceraciones en el epitelio del 10surco gingival o de los espacios intercelulares. Producen sustancias que contribuyen a la invasién y a evitar la respuesta del huésped: a) exotoxinas: p.e., leucotoxina (A. actinomycetemcomitans), toxica para PMN. b) elementos celulares: (i) endotoxinas.o lipooligosacdéridos (LOS) que producen leucopenia, activan el factor XII o de Hageman (responsable de la coagulacién intravascular) y el complemento por la via alterna (C3), y son citotéxicas para los fibroblastos; (ii)otros: cides grasos (butirico, propiénico), aminas, compuestos sulfurados, indol, amoniaco y glucanos (p.e., el peptidoglucano de la pared celular es capaz de estimular la reabsorcién ésea y a los macréfagos para que produzcan prostaglandinas y colagenasas) . c) enzimas: colagenasa, hialuronidasa, fosfolipasa, fosfatasas, proteasas IgA e IgG, superdxido dismutasa (SoD) , catalasa. La respuesta del huésped representa la reaccién inflamatoria aguda. En primer lugar, se produce vasodilatacién y aumento de la permeabilidad en el plexo vascular subyacente al epitelio de unién provocadas por el factor XII (que estimula el sistema kinina-kalicreina con liberacién de bradikinina), el complemento, la histamina (producto de la 1degranulacién de los mastocitos), la serotonina y PGE (producidas por celulas endoteliales y plaquetas), y leucotrienos (producidos por neutréfilos y ‘macréfagos).. Los PMNn infiltran el epitelio de unién y sulcus gingival y se fijan a las bacterias a través de su receptor C3b;. son atraidos por factores quimiotaécticos como C5a, productos bacterianos (LOS) y complejo Ag-Ac-C, que a su vez estimulan la produccién de otros, tales como leucotrienos By y citokinas (interleukinas, ciertos factores de crecimiento, TNF-a y linfokinas) (Fantone y Ward, 1994). Los PMNn intentan la fagocitosis a través de un mecanismo oxidativo y de uno no-oxidativo que funciona liberando enzimas lisosomales. El mecanismo oxidativo consiste en la produccion de especies reactivas del oxigeno (ERO) que tienen actividad bactericida, fungicida e inactiva a ciertos pardsitos (Fantone y Ward, 1994). Los PMNn, y los fagocitos en general, son pobres en mitocondrias y satisfacen sus necesidades energéticas principalmente a través de la glicolisis. Tras la perturbacién de su membrana por parte del microorganismo se incrementa de forma notable el consumo de oxigeno: este fenémeno recibe el nombre de “respiratory burst” o explosién respiratoria. El oxigeno es reducido a anién superéxido (0,:") por una NADPH oxidasa de la membrana plasmatica. Este enzima tiene necesidad de NADPH, la cual consigue de la oxidacién de la glucosa en el shunt hexosa monofosfato. El 0,-", bien por dismutacién espontanea, bien por la accién catalitica de la SOD, genera a 12su vez peréxido de hidrégeno (H,0,). La enzima mieloperoxidasa cataliza, en presencia de cloruro, la formacién de Acido hipocloroso (HC10), un potente agente bactericida: HO, + Cl” + Ht ——+% HClO + H,0 En el interior del fagosoma el HClO se transforma en productos clorados. También puede tener lugar la formacién de radical hidroxilo (OH:) a partir de H,0, en presencia de metales de transicion segan los mecanismos de las reacciones de Haber-Weiss y Fenton (tratado en detalle en 1.2.). Otro fenémeno que se observa tras la estimulacién de los fagocitos es la liberacién de Acidos grasos insaturados de los fosfatidos. Se piensa que la movilizacién de iones calcio pueda activar la fosfolipasa A, que libera directamente un Acido insaturado del carbono 2 de los glicéridos. El Acido araquidénico liberado esté disponible para la via de la ciclooxigenasa y de la lipooxigenasa, que conducen a la formacién de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos. También durante la biosintesis de PGE se producen ERO. Se ha demostrado que la produccién de ERO por el PMN es también dafina para si mismo y para el ambiente circundante, especialmente células del endotelio vascular y macromoléculas del tejido conectivo. Los PMN a menudo resultan ser victimas del mismo proceso que desencadenan (Littarru, 1994). 13Si la infeccién continta, el infiltrado inflamatorio pasa a ser crénico y estén presentes en el tejido conectivo macréfagos, ‘monocitos y linfocitos T y B.. Las citokinas y los antigenos bacterianos activan las.diferenciacién de linfocitos B a células plasméticas y la consiguiente produccién de anticuerpos especificos. C) Destruccion tisular: producida por productos bacterianos (endotoxinas, peptidoglucanos,....), enzimas lisosomales de los PMN, productos de las células del tejido periodontal (como la metaloproteinasa para la matriz producida por fibroblastos; Page y cols., 1997) y reacciones de hipersensibilidad del huésped (tipos I, II, III y IV) (Newman y cols., 1997). La placa bacteriana, el epitelio de unién y el infiltrado se extienden apicalmente y son destruidos fibras coldgenas y cemento radicular. Se forma la bolsa periodontal (Page y cols., 1997). Los. mediadores quimicos de la reabsorcién ésea son citokinas: IL-1, IL-6, TNF-a y B, factor inhibidor de la leucemia (LIF), y bradikinina y trombina. Todos ellos estimulan la biosintesis tisular de los derivados del Acido araquidénico, principalmente PGE, y PGI, (Lerner y cols., 1998). Asi, se ha comprobado un aumento de PGE, en el fluido crevicular (GCF) de pacientes con PE cuando hay progresién de pérdida sea (Offenbacher y cols., 1986) y que ésta disminuye con la administracién de antiinflamatorios no- esteroideos (AINE) (Williams y cols., 1989). 14D)Cicatrizacion y fibrosis: caracterizada por la proliferacién de fibroblastos (estimulados por la fibronectina de los macréfagos) y remodelacién ésea. Citokinas (IL-1, IL- 2), interferon (a, B y y), factores necréticos tumorales (TNF- a, B) y factores estimulantes del crecimiento (G-FSC, M-FSC, GM-FSC) provocan la activacién, diferenciacién y proliferacién de leucocites, fibroblastos y osteoblastos, asi como ayudan al desarrollo y mantenimiento de la inmunidad (Mizel, 1989). ANOMALIAS. LEUCOCITARIAS. Los defectos (mimero, morfologia y funcionalidad) de los PMN pueden ser genéticos o adquiridos y se acompafian generalmente de cuadros de PE. 1.Neutropenia y agranulocitosis: debidas a quimioterapia del cancer (principal causa en la actualidad), otros medicamentos, infecciones, enfermedades autoimmunes y debilitantes (Fantone y Ward, 1994). 2.Defectosen la adhesién leucocitaria: se acompafia también de un. déficit quimiotdéctico (p.e., receptor C3b defectuoso) . 3.Defectos en la quimiotaxis: en la hiperinmunoglobulinemia IgE o sindrome de Job, autosémico recesivo, y en la diabetes mellitus. 154.Carencia o déficit en los granulos (Fantone y Ward, 1994): a) sindrome de Chédiack-Higashi: autosémico recesivo; hay pocos grénulos lisosomales, pobre degranulacién y quimiotaxis; b) deficiencia granulocitica especifica (SGD): también genética, con ausencia de grénulos, pobre quimiotaxis, poca produccién de 0,-" y ausencia de defensinas. 5.Incapacidad para generar el impulso respiratorio (Fantone y Ward, 1994): a) enfermedad granulomatosa crénica, déficit heredado de NADPH oxidasa con ausencia de produccién de 0,*" y H,0, durante la fagocitosis; b) déficit de mieloperoxidasa, no se produce HClO; c) sindrome de Papillon-LeFévre, hay reduccién de la produccion de 0,-" (Bullén y cols., 1993), asi como en receptores para quimiotaxinas (Miyasaki, 1997). 161.2. RADICALES LIBRES: GENERALIDADES. Un radical libre se define como cualquier especie quimica capaz de existir de forma independiente y con uno o mas electrones desapareacos (cada orbital de un dtomo puede tener como m4ximo dos electrones; cuando es ocupado por un tnico electron, se llama a éste desapareado) (Halliwell y cols., 1992). Pueden ser catiénicos, aniénicos o neutros. Un radical libre puede formarse de tres maneras: a) .por ruptura homolitica de un enlace covalente de una molécula normal: cada fragmento retiene uno de los electrones (fision homolitica). Este mecanismo requiere mucha energia. A:B. > A’ + B* (RL eléctricamente.neutros) b) por pérdida de un electrén de una molécula normal: A+B: Av +B (RL cargado:-" 0 "#") ce) por adicién de un electron a una molécula normal, llamado transferencia electrénica, bastante comin en los sistemas biolégicos: A +e > Av. (RLcargado"-") La fisién heterolitica no produce RL sino tnicamente iones porque los electrones del enlace covalente son retenidos por un solo fragmento de la molécula inicial: A:B > Ar +B En la simbologia quimica tradicional el caracter radical se representa con un punto, indicando la presencia de al menos un electrén desapareado, por ejemplo, R*(se lee como R punto © radical R)(Littarru, 1994). 17Debido a la existencia de estos electrones desapareados, los radicales libres (RL) son extremadamente reactivos (Halliwell y Gutteridge, 1989). Cuando los RL reaccionan con moléculas no radicales, comienza una reaccién en cadena (Halliwell y cols., 1992). Sélo cuando dos radicales se unen entre si puede acabar la reaccién en cadena: A+A> A, A+ Bo > AB Los RL més. abundantes e importantes biolégicamente son los del oxigeno: ERO (especies reactivas del oxigeno). Este término incluye no s6lo a los RL del oxigeno, sino también a algunas especies no radicales derivadas del oxigeno, tales como el peréxido de -hidrégeno (H,0,), el Acido hipocloroso (HOCL) 0 el singlete de oxigeno ('ag0,) (Halliwell y Gutteridge, 1990a). Las ERO, especialmente el anion superdxido (0,-7) y H,0,, se producen de forma constante in vivo, por lo que los organismos tienen mecanismos de defensa antioxidante y mecanismos reparadores que previenen la acumulacién de moléculas dafiadas oxidativamente. NOMENCLATURA Y PROPIEDADES DE RADICALES LIBRES Y ERO. 1.- Anién superéxido (0,° Es el resultado de la reduccién monoelectrénica de una molécula de oxigeno. 0, + & > OF 18Es poco reactivo, existe una clase de enzima que evita su acumulaci6: : las superéxidos dismutasas (SOD). 20,"+ 2H" + -H,O, + 0, soD La fuente mds importante de produccién de 0,-~ in vivo es la mitocondria: cuando los electrones pasan por la cadena de transporte. electrénico mitocondrial pueden escapar al control de los transportadores electrénicos y son capturados directamente por el oxigeno (Fridovich, 1989). Las reacciones enzimaticas en las que se ha demostrado la presencia de superéxido son numerosas y de naturaleza variada. Puede resultar un producto 'de reaccién, como en las reacciones catalizadas por la xantina oxidasa (XOD) y la aldehido oxidasa. Otro mecanismo de produccién esta relacionado con la autooxidacion de hemoproteinas, hidroquinonas, catecolaminas, grupos tidlicos, impacto de radiaciones ionizantes o durante el proceso de la fagocitosis durante la inflamacién articular (Roberfroid y Buc-Calderon, 1995). Es ‘producido. por fagocitos (PMN y macréfagos) y actta como agente antibacteriano; por ello es fundamental su-papel en las enfermedades cronicas granulomatosas (Chapple, 1997). También lo‘producen los fibroblastos (Murrell y cols., 1990). Puede intervenir en el mecanismo de regulacién del tono vascular: las células endoteliales producen do nitrico (NO-), un RL idéntico.al factor de relajacién del endotelio (EDRF), y pequefias cantidades de 0,°~. El NO’, o un derivado 19suyo, acttia sobre las células musculares lisas produciendo relajaci6n; el 02°" provocaria vasoconstriccién (Muggli, 1993). 2.- Peréxido de hidrégeno (H,0,): Su presencia ha sido probada in vivo, tiene capacidad de atravesar las membranas biolégicas y constituye, junto al 0,°", el origen del radical hidroxilo (OH*), el més reactivo de todos in vivo). La mayoria de estas reacciones (Halliwell y Gutteridge, 1990b) implican iones metaélicos de transicion. 0, + Fe’ + O,+ Fe* Reaccién de Haber-Weiss H,O, + Fe — OH + OH'+ Fe* Se produce en mitocondrias, peroxisomas y citosol. 0, + 2e" + 2H" > HO, Concentraciones pequefias producen. lisis eritrocitaria y oxidacién de grupos tidlicos y metionina. Altas concentraciones .pueden inactivar el enzima glucolitico gliceraldehido~3 fosfato dehidrogenasa en mamiferos (Halliwell y cols., 1992). Puede ser usado por varias peroxidasas para oxidar iones cloruro a écido hipocloroso (HOC1), poderoso agente oxidante (Roberfroid. y Buc=Calderon, 1995). El H,0,es removido por las enzimas catalasa y glutation peroxidasa (GSH-Px), que es selenio-dependiente: 202H,0, -» 2H,0 + O, catalasa 2GSH + H,0,—> GSSG + 2H. GSH-Px 3.- Radical hidroxilo (OH*): Se produce en humanos segin mecanismos diferentes. En general, puede decirse, que el radical OH: es una ERO altamente peligrosa, dada su capacidad para atacar practicamente a todas las moléculas biolégicas (Halliwell y Gutteridge, 1989). 4.- Singlete de oxigeno (gO; 6 *0;): Es una forma electronicamente excitada del oxigeno molecular. Se forma cuando uno de los espines del oxigeno molecular cambia de orientacién y orbital; ésto requiere energia. La via m4s importante de .produccién en los sistemas biolégicos tiene lugar cuando ciertos compuestos (agentes fotosensibles) son iluminados en presencia de oxigeno, ellos | absorben la luz, entran en un estado de mayor excitaci6n electronica y transfieren el exceso de energia al oxigeno, convirtiéndolo al estado de singlete. Entre estos agentes fotosensibles se encuentran sustancias colorantes como la eosina, antibiéticos como la tetraciclina y otras presentes en aihumanos como porfirinas, riboflavinas y bilirrubina. Se trata de un oxidante muy activo capaz de interaccionar con macromoléculas como acidos grasos poliinsaturados (AGP), iniciando reacciones de peroxidacién. 5.- Radical nitroxilo (NO-): Producido por macréfagos (Stuehr y cols., 1990) y el endotelio vascular. Reacciona con el 0,‘~ produciendo el dafiino radical OH: con un producto intermedio que es el én peroxinitrito (ONOO") que también es nocivo biolégicamente (Beckman y cols., 1990) : NO: + 0,” + ONOO’ + H* > OH’ + NO, 6.- Acido hipocloroso (HOCL): Otra ERO que se forma durante la fagocitosis o como resultado de la accién de la mieloperoxidasa (MPO) de fagocitos (no macrofagos) sobre el H,0,. Es un potente agente antibacteriano capaz, incluso a bajas concentraciones, de interceptar la funcién de algunas proteinas (Schraufstatter y cols., 1990). Produce lisis celular a _ elevadas concentraciones. 22ESTRES OXIDATIVO.BALANCE OXIDATIVO. Con el término estrés oxidativo nos referimos a las situaciones fisiolégicas y fisiopatolégicas que suponen un aumento de radicales libres del oxigeno y, por tanto, pueden originar dafio celular bien directamente (a nivel de proteinas, carbohidratos, lipidos y ADN), bien a través de segundos mensajeros celulares citotéxicos: la peroxidacién lipidica (Muggli, 1993). (Figura 1). Se ha planteado la duda sobre si es efectivamente el estrés oxidativo el que origina dafio celular, o es el dafio celular el que provoca un aumento del metabolismo de los RL. Por otro lado, los RL son intermediarios metabélicos de procesos fundamentales en el ser vivo como la respiracién celular, la maduracién celular (p.e., en el paso de reticulocito a eritrocito desaparecen la mayoria de los sistemas de membrana) (Sevanian y Hochstein, 1985); la respuesta inmune celular, oxidacién selectiva de proteinas, lipidos, carbohidratos y Acidos nucleicos; la oxidacién enzimatica de metabolites (p.e., en el metabolismo de las prostaglandinas) . Para evitar el dafio provocado por el aumento de RL, el organismo dispone de varios sistemas de defensa antioxidante. El equilibrio-entre éstos y los sistemas de produccién de RL, constituye el balance oxidativo;. cuando éste se inclina por cualquier motivo hacia la produccién de RL, tiene lugar el daiio o estrés oxidativo (Halliwell y Gutteridge, 1989). 23aii 87218) Figura 1 : Hipétesis del estrés oxidativo. Figura 2: Radicales libres y procesos relacionados.Son numerosas las situaciones fisioldgicas y patolégicas en las que interviene el estrés oxidativo (Figura 2). Entre ellas se encuentran: - Procesos de isquemia-reperfusién: por hipoxia continuada. - Modificaciones de la presién parcial de oxigeno en la hiperventilacién de prematuros. - Toxicidad ambiental por iones metélicos (plomo, cadmio, mercurio, hierro o cobre). - Aumento de la respuesta inmune como consecuencia de procesos de inflamacién o alergia. - Enolizacién de la glucosa en diabéticos. ~ Hiperlipemia e hipercolesterolemia. - Procesos asociados al envejecimiento. ~ Algunas neoplasias. ~ Hipertermia. - Enfermedades neurolégicas: Alzheimer, Parkinson, epilepsia, isquemia cerebral, esclerosis lateral amiotréfica. - Fotosensibilizacién de la piel en porfirias y ciertas terapias con.antibiéticos (tetraciclinas, quinolonas,...). - Cataratas. - Artrosis. - Artritis reumatoide. - Tabaco. - Ejercicio fisico no controlado, etc. 25LOS BLANCOS DEL DANO OXIDATIVO. 1.- Acidos grasos poliinsaturado Peroxidacién lipidica. Todos los materiales biolégicos contienen dcidos grasos poliinsaturados (AGP) localizados preferentemente a nivel de membrana. Su disposicién espacial e interrelacién contribuyen a la susceptibilidad que presentan las membranas celulares a sufrir dafio-por los RL (Lunec, 1992). La peroxidacién lipidica consiste en un deterioro oxidativo-dependiente de los AGP, cuyo resultado es la produccién de. hidroperéxidos de acidos grasos (Sevanian y Hochstein, 1985). Puede ser: - enzimAtica: tiene lugar durante el metabolismo de prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos y oxisteroles (Yamamoto, 1991). ~ no enzimatica: tiene lugar en los sistemas de membrana, cuando los -RL atacan-a los AGP de los fosfolipidos de las mismas, alterando sus. funciones (Muggli, 1993): alteran su permeabilidad, repercutiendo sobre la actividad de enzimas asociados.a la membrana, sus canales iénicos o sus receptores (Yung-Suk y Akera, 1987). Los. procesos se realizan en tres etapas: a) Iniciacion: Comienza. cuando un RL. suficientemente reactivo, por ejemplo el radical OH*, retira o extrae un hidrégeno de la cadena de AGP de.los fosfolipidos de la membrana. El carbono que ha perdido el hidrégeno posee ahora un electron 26