Capitulo 16 Especies de Clostridium Los clostridios son bacterias grandes Gram positivas fermentadoras, catalasa negativas y oxidasa negativas y que requieren medios enriquecidos para el crecimiento, Son bacilos rectos o ligeramente curvados y la mayoria son méviles por flagelos peritricos. Las especies de Clostridium producen esporas que normalmente abul- tan las células madre (Fig, 16.1). Para la distincién de las especies se puede emplear el tamafio, forma y locali- zacién de las esporas. Pese a que la mayoria de las espe- cies de clostridios patégenos son anaerobias, algunas son comparativamente aerotolerantes. Los clostridios apa- recen en todo el mundo y ciertas especies pueden estar asociadas con regiones geogrificas definidas, Los re- cientes cambios en la nomenclatura de algunas especies estin indicados en la Tabla 16.1. ‘Aunque se reconocen mas de 100 especies de clostridios, menos de 20 son patégenas. Estas pueden ser C. tetant.bacilos delgados C. perfringens: que caracteristicamente grandes yanctos net cape boris eae (en «pall» de tambor) producen esporas invito C. chauvost bacles de tamatiointermedio que producen esporas en forme de limén Figura 16.1 Mortologia caracteristica de algunas especies clostidiales, Puntos clave Bacilos grandes, Gram positivos. Producen esporas. Anaerobios, catalasa y oxidasa negativos. Méviles (salvo C. perfringens), Requieren medios enriquecidos para crecer. Las colonias de C. perfringens estan rodeadas de zonas de doble hemolisis a Presentes en el suelo, tracto alimentario de los animales y heces. Los patégenos deben agruparse segtin el modo y lugares de accién de sus potentes exotoxinas — clostridios neurotéxicos — clostrdios histot6xicos — clostridios enteropatégenos y prodactores de enterotoxemia = Ocasionan varias formas de enfermedad en muchas especies animales agrupadas en cuatro categorias, tres basadas en la act dal de las toxinas y los tejidos afectados y la cuarta con- teniendo patsgenos de menor importancia (Fig. 16.2) Clostridivm retani y C. botulinum, los clostridios neuro- (6xicos, afectan a la funcién neuromuscular sin inducir lesionestisulares observables. En contraste, los clostridios histot6xicos producen lesiones relativamente localizadas Tabla 16.1 Cambios de nomenclatura de algunas especies de lostrisios. Nombre actual Nombre anterior CCostrsium perringens Clostricium welch Clostrsium argentionse (lostrsium naemolyticum Clostrsium novyi Clostridium botulinum tipo G Costraium novy! ipo © Clostridium oedemations lostrisium pittorme Bails pilitormis 101102 Microbiologia y enfermedades infecciosas veternarias ent tejidos como miisculo o higado y pueden, subsecuen- temente, producir una toxemia. Los Clostridium perfrin- gens A al E, irportantes miembros de la tercera categoria, producen lesion inflamatoria en el tracto gastrointes! nal junto con enterotoxemia. Los clostridios de la cuarta categoria estin asociados con enfermedades esporddicas, normalmente afectando a animales individuales. Habitat normal Los clostridios son sapréfitos quese encuentran en el sue- lo, sedimentos de agua dulce o marinos con adecuada- ‘mente bajos potenciales redox. Consttuyen parte de la flora intestinal normal y algunos pueden estar secuestra- dos como esporas en misculo 0 higado. Las esporas se- ccuestradas, si se ativan, pueden product la enfermedad, Recoleccién de muestras y requerimientos de cultivo Se precisan métodos especiales para la recoleccién y pro- cesado de las muestras para asegurar la supervivencia de estos exigentes anaerobios, * Arno ser que las muestras procedan de animales vi- vos 0 recién muertos, los clostridios invasores post mortem pueden diseminarse ripidamente desde el in- testino alos tejdos, dificultando la interpretacién de los resultados de taboratorio, Para el transporte al laboratorio, los bloques de teji- do 0 10s fluidos de los animales afectados deben ser colocados en medio de transporte para anaerobios. Las muestras deben ser cultivadas répidamente tras su tecoleccién Para el cultivo de los clostridios es apropiado el agar sangre enriquecido con extracto de levadura, vitamina K y hemina, Los medios deben ser recién preparados 0 prerreducidos para asegurar la ausencia de oxigeno, * Los requerimientos de atmésfera adecuados se con- siguen cultivando en jarras de anaerobiosis que con- tengan hidrégeno suplementado con un 5 a un 10% de didxido de carbono para favorecer el crecimiento. Algunos clostridios vegetativos pueden no sobrevi- vir si se exponen al aire ms de 15 minutos Diferenciacién de los clostridios Los procedimientos de laboratorio para diferenciar la mayorta de los clostridios incluyen morfologfa colonial, pruebas bioquimicas, métodos de neutralzacién de toxi- nas y el perfil de écidos orgénicos por cromatografia gas- liguido. «La morfologia colonial es de limitado valor para dife- renciar la mayoria de las especies de clostridios, No obstante, las colonias de C. perfringens estin rodea- das de una doble zona de hemolisis caracterfstica, ‘© Comercialmente hay disponibles kits miniaturizados| para la identificacién bioquimica ‘Se pueden identificar las toxinas especificas en los fluidos corporates 0 en contenido intestinal mediante pruebas de neutralizacién o proteccidn en roedores de laboratorio, normalmente ratones. ‘© Las pruebas de anticuerpos fluorescentes son amplia- mente utilizadas para la identificaci6n ripida de lostridios histot6xicos en lesiones, # Para la deteccién de las toxinas se pueden emplear inmunoensayos como el ELISA. La reaccién en ca- dena de la polimerasa puede emplearse para detectar los genes que codifican la produecién de toxinas de aislados de C. botulinum, Estas pruebas han reem- plazado actualmente muchos de los bioensayos, pero ‘ain no han sido desarrolladas para la deteccién de todas las toxinas. Cuadros clinicos causados por los clostridios neurotoxicos Los clostriios neurot6xicos C- tetaniy C. botulinum pro- ducen sus efectos mediante la elaboracién de potentes neurotoxinas, La neurotoxina de C. tetani es producida por los microorganistios en replicacién localmente en los tejidos daftados. La toxina absorbida ejerce su efecto ‘en la uniones sindpticas lejos del lugar de produccién de toxina, La neurotoxina de C. botulinum es producida nor- malmente por microorganismos en replicacién en mate- ria orginica en descomposicién o en las condiciones anaerdbicas en latas de came o vegetales contaminadas. Una vez absorbidas desde el tracto gastrointestinal al torrente sanguineo, la toxina afecta el funcionamiento de las uniones neuromusculares. Algunas caracteristicas de las neurotoxinas de C. tetani y C. botulinum se pre- sentan en la Tabla 16.2. Tétanos El tétanos es una intoxicacién aguda potencialmente fa- tal que afecta a muchas especies incluyendo la humanaExpecies deCClossidium 103 Especies patégenas de Clostridium Clostidios neurotéxicos Clostidos histotéxicos ©. chavvoe! . septicum C. novyl ipo A . partingens tipo A . sordelii C. haemoiyticum CC. novyi tipo 8 © tetani C. botulinum (tinos AG) CClostrisios enteropatégenos Otros clostricios Y productores do enterotoxemia . perringens (lipos AE) colin ©. atcile © piliforme C. spioforme Figura 16.2 Especies patégenas de Clostridium de importanca veterinaria Sin embargo, la susceptibilidad de cada especie ala toxi- na varia considerablemente. Los caballos y el hombre son muy susceptibles, los rumiantes y cerdos moderada- ‘mente y los carnfvoros son comparativamente resisten- tes, Las aves no son susceptibles al tétanos, Clostridium tetani, el agente etiolégico, es un bacilo anaerobio recto, delgado, Gram positivo. Las esporas féricas, que son terminales y abultan a la célula madre, ‘otorgan su caracteristico aspecto de «palillo de tambor» «los microorganismos esporulados (Fig. 16.1). Las es- poras son resistentes a los agentes quimicos y ala ebulli- cidn pero son destruidas por tratamiento en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Clostridium terani tiene un crecimiento invasivo y es hemolitico en agar sangre por Ja produccién de tetanolisina. Se pueden distinguir diez serotipos de C. retani por sus antigenos flagelares. La rneurotoxina, tetanospasmina, es antigénicamente unifor- ime independientemente del serotipo, y los anticuerpos inducidos por la neurotoxina de cualquiera de los seroti- pos neutralizan las neurotoxinas producidas por los otro. La infeccién se produce cuando las esporas se intro- dducen en tejido traumatizado desde el suelo 0 las heces. Los lugares comunes de infeccién incluyen heridas pe- netrantes profundas en el caballo, heridas de eastracién y raboteo en ovino, abrasiones asociadas con distocias fen vacas y ovejas y los tejidos umbilicales de todos los animales j6venes. La presencia de tejido necrético, ob- jetos extrafios y contaminantes anaerobios facultativos en las heridas puede crear las condiciones anaer6bicas en las que pueden germinar las esporas de C. tetani. Los microorganismos clostridiales pueden replicar més rapi- damente en los tejidos cuando la toxina hemolitica, la ina, se ha liberado, Las bacterias vegerativas que se multiplican en los tejidos necrdticos producen la po- Tabla 16.2 Produccién, modo de actuacién y efectos de las neurotoxinas de Clostridium tetany C. botulinum, Caracterisica Clostridium tetani Clostridium dela neurotoxina botulinum Lugar En nerdas En cadaveres, de produecién vegetacién en putvelaccién, alimentos enlatados Ocasionalmente en heridas 9 inestino (toxitecciones) Gonos que regulan En plismidos —__Normalmente la produecion nel genoma (en bacteridtagos ‘en os tipos C y D) (Ocho toxnas astntas antigénicamente ‘Tipos antigénicos Un tipo antigénico (otanospasmina) tipos Aa Modo de accién _Inhibicidn sindptica Inhibicion de la tansmision neuromuscular Etecto clinica Espasmos Paralisis flécida musculares tente tetanospasmina que es responsable de los signos, clinicos del tétanos, Patogénesis La toxina tetdnica consta estricturalmente de dos cadenas Unidas por un puente disulfuro, La cadena ligera es el ra- ical t6xico y la cadena pesada es responsable de la unin al receptor y lainternalizacién de la toxina, La neurotoxina se une de forma irreversible alos receptores de ganglidsido de las terminaciones motoras de las neuronas y es tran portada al cuerpo de Ia neurona y las dendritas en el siste-104 Microbiologia y enfermedades infecciasas veterinarias ma nervioso central en vesfculas que contienen toxina por un flujo intra-axonal retrégrado. La toxina es transferida tvans-sindpticamente a su sitio de actuacién en los termi- nales de neuronas inhibidoras, donde bloquea la transmi- sin presindptica de las seftales inhibidoras (Sanford, 1995), Lo hice mediante la hidtoisis de las sinaptobrevi- nas, componentes proteicos de las vesiculas de neurotrans- misores. Dado que se impide la liberacién de neurotrans- misores inhibidores, se produce una pardlisis espédstica La toxina también puede ser de origen hematégeno, espe- cialmente si es producida en grandes cantidades y puede ‘unirse a las terminaciones motoras en todo el cuerpo an- tes de transferrse al sistema nervioso central. Lat toxima ligada no se neutraliza con la antitoxina, Signos clinicos El periodo de incubacién del tétanos oscila normalmente entre 5 y 10 dias, pero puede Hegar a las tres semanas. Cuando se retrasa la aparici6n de signos clinicos, la heri- da.en el punto de infeccién puede haberse curado, y el ccuadro se denomina tétanos latente. Los efectos clinicos de la neurotoxina son similares en todos los animales do- imésticos, No obstante la naturaleza y gravedad de los sig- nos elinicos dependen de la localizacién anatmica de las bacterias en replicacién, la cantidad de toxina producida y la susceptibilidad de la especie. Las heridas en 0 cerca de la cabeza estén asociadas normalmente con un petiodo de incubacién més corto y una tendencia mayor al tétanos generalizado. El tétanos localizado, que normalmente afec- taa especies menos susceptibles como los perros, se pre- senta como tigidez y espasmos musculares cercanos a la localizacién de la lesi6n, como resultado del efecto de la toxina sobre las terminaciones nerviosas locales. Los signos elfnicos ineluyen rigidez, espasmos loca- lizados, ritmos respiratorio y cardiaco alterados, disfa- gia y expresion facial alterada. Estimulos téctiles 0 auditivos relativamente pequefios pueden precipitar con- traceiones tnieas de los misculos. El espasmo de los miisculos masticatorios puede producir trismo. La rigi- ddez muscular generalizada puede desembocar en un as- pecto de «caballete de aserrar», especialmente en caba- llos. Los animales que se recuperan del tétanos no son necesariamente inmunes ya que la cantidad de toxina que puede inducir la enfermedad clinica esta normalmente por debajo del umbral necesario para la produecign de anticuerpos neutralizantes. Procedimientos de diagnéstico El diagndstico del tétanos es normalmente presuntivo y se basa en los signos clinicos y un historial de recientes traumas en animales no vacunados. * Es necesario distinguirlo del envenenamiento por estricnina, especialmente en perros, * Frotis tefidos por Gram de material de las lesiones: puede revelar las caracterfsticas formas en «palillo de tamborm de C. tetani (Fig. 16.1). Se puede intentar el cultivo en anaerobiosis de Ctetani de tejido necrético de la herida, pero es a ‘menudo instil ‘+ El.suero de los animales afectados puede ser emplea- do para demostrar la neurotoxina citculante emplean- do la inoculacién en ratén Tratamiento ‘© Laantitoxina se debe administrar precozmente, por via intravenosa o en el espacio subaracnoideo, tres dias cconsecutivos para neutralizar la toxina no Tigada. ‘© Se puede administrarel toxoide subcuténeamente para promover una respuesta inmune activa, incluso en aquellos animales que hayan recibido antitoxina. ‘Se administran grandes dosis de penicilina intramus- cular o intravenosamente para matar en el lugar de la lesién a las células vegetativas de C. tetani producto- ras de toxina. + La limpieza quinirgica de las heridas y la elimina cin de cuerpos extrafios, seguidos del lavado con peroxido de hidrégeno, produce condiciones aerobias que ayudan a inhibir la replicacién bacteriana en el lugar de la lesién. * Los animales afectados deben alojarse en un ambien- te oscuro y tranguilo. La terapia de teemplazo de flui- dos, sedantes, relajantes musculares y unos buenos cuidados pueden minimizar las incomodidades clini- cas y mantener las funciones vitales. Control # Losanimales de granja deben vacunarse rutinariamen- te con toxoide teténico. Se puede recomendar una dosis de revacunacién si un animal susceptible suite tuna herida profunda. * En Jos cabullos, es deseable una limpieza quirdrgica ripida de las heridas. ‘Se debe administrar antitoxina a animales no vacu- nados que hayan sufrido heridas profundas o vayan a suftir cirugfa. Esta proteccién pasiva normalmente dura unas tres semanas. Botulismo El botulismo es una intoxicacién grave, potencialmente fatal, normalmente adquirida por la ingestién de toxinaExpecies de Clostidiam 105 preformada, Clostridium botulinum, el agente etiolégico, 5 un bacilo anaerobio Gram positivo que produce espo- ras ovales subterminales. Las esporas de C. botulinum estin distribuidas en suelos y ambientes acuaticos en el mundo entero, Se reconocen ocho tipos de C. botulinum en base alas toxinas que producen (A, B, Ca, CB, D,E, F y G). Estas neurotoxinas, que se inactivan por ebullicién durante al menos 20 minutos, inducen signos elinicos si- nilares pero difieren en su antigenicidad y potencia. Al- gunos serotipos de C. botulinum se circunscriben a reas geogrificas especiticas. La getminacién de las esporas, con crecimiento de células vegetativas y produccin de toxina, se produce en sitios anaerbicos como cadavers ‘ovegetacisn en putrefaccién y alimentos enlatados con- taminados. El botulismo toxiinfeccioso, una forma infre- ccuente de la enfermedad, se produce cuando las esporas germinan en heridas 0 en el tracto intestinal. El botulismo toxiinfeccioso intestinal ha sido descrito en potros (sin- drome del potro agitado-shaker foal), cachorros (Farrow etal, 1983), broilers y pavipollos Los C. botulinum tips C y D causan la mayorta de los brotes de botulismo en animales domésticos. Los brotes Tabla 16.3. Toxinas de Clostridium botulinum. Toxina Fuente Especies susceptibies Tipo A Came, erlatados Humanos Toxinteccion Nifos Came, cadveres Visén, perros, cerdos TpoB Came, enlatados Humanos: Toxinteccion Nifos Toxinteccion Potros (hasta 2 meses do edaa) ToC Invertebrados muertos, Aves acuaticas ‘qusanos, vegetacién y de corral pochida y cadaveres de aves Galinaza ensilada, ‘Vacuno, ovina, caballos ‘enslados empacados de bala calidad, heno ‘© ensilados contaminados con cadaveres de roedores Came, especiaimenta Paros, visdn, leone, ccadveres de pollo ‘mones Tipo Cadiveres, huesos Vvacuno, ovine ‘Alimentos contaminades Caballos con cadveres Tipo E Invertebrados muertos, -Pescado fango de piscinas de fondo de tera ces culivados ‘Aves piscivoras, humanos Tipo F Came, pescado Humanos Tipo G Alimentos contaminados _Humanos (en Argentina) on suelo de la enfermedad ocurren mas frecuentemente en aves acuiticas, caballos, vacuno, ovino, visones, aves de co- tral y peces de piscifactorfa. Los cerdos y perros son rela- tivamente resistentes a las neurotoxins y el botulism es taro en gatos domésticos. El botulismo en vacuno se ha relacionado con Ia ingestién de cadaveres de pollos pre- sentes en la gallinaza utilizada como cama o distribuida en pastos (McLoughlin er al., 1988). Los ensilados emt lados de baja calidad o el heno que contenfan cadiveres de roedores han sido relacionados con brotes de botulis- mo en caballos y rumiantes. La pica de herbfvoros en ran- chos de Sudéfrica, EE UU y Australia debida a la falta de alimento o deficiencia de fésforo puede inducir a los ani- males afectados a masticar huesos 0 cadaveres que con- tengan toxina botulinica. El botulismo resultante se cono- ce como lamsiekte en Sudéfrica, pardlisis bulbar en Australia o enfermedad del lomoen BE UU. Lacame cruda contaminada y los cadéveres son fuentes habituales de toxina para los carnivoros. Las aves acuiticas y otras aves pueden adquiri la toxina de invertebrados muertos, vege- tacidn en putrefaccién o del consumo de gusanos que con- tengan la toxina (Harihan y Mitchell, 1977; Quinn y Crinion, 1984). Las fuentes habituales de las toxinas de los C. botulinum tipos A-G para las especies susceptibles estdn restmidas en ta Tabla 16.3. Patogénesis Las neurotoxinas de C, botulinum son las toxinas biol6gi- cas mas potentes conocidas. La toxina preformada en los alimentos, absorbida del tracto gastrointestinal, circula por el torrente sanguineo y acta en las uniones neuromuscu- lares de los nervias colinérgicos y en las sinapsis auténo- mas periféricas. Su estructura es similar ata de la toxina tetdica, se une a los receptores en las terminaciones ner- Viosas, y penetra en las células durante fa liberacién de acetilcolina. Como con la toxina tetinica la hidrolisis de Jas sinaptobrevinas causa una interferencia irreversible con laliberacién del neurotransmisor, aceticolina eneste caso, produciendo paralisis flécida, La muerte se produce por Pardlisis de los miisculos respiratorios. La diferencia en- tre los efectos de las toxinas tetinica y botulfnica se debe 4 sus diferentes lugares de actuaci6n, La toxina teténica Viaja hacia arriba por el axén nervioso hasta el cuerno ventral mientras que la toxina botulinica se queda en la Uunién neuromuscular, Las esporas ingeridas de C. botulinum normalmente se excretan en las heces. Sin embargo, en el botulismo t6xico-infeccioso, la germinacién de las esporas en el intestino ocasiona la produccién de toxina por los mi: croorganismos vegetativos, No se conocen los factores106 Microbiologia y enfermedades infeciasas veterinarias {que predisponen al botulismo t6xico-infeccioso. El sin- drome del potro agitado, una forma de botulismo téxico- infeccioso en potros de hasta dos meses de edad, se ha atribuido al impacto de estrés en la yegua que produce veles incrementados de corticosteroides en la leche (Swerczek, 1980). Signos clinicos Los signos clinicos del botulismo, que son parecidos en todas las especies, se desarrollan en 3 a 17 dias tras la ingesti6n de la toxina, Las caracteristcas de la enferme- dad en animales de granja son pupilas dilatadas, mucosas secas, salivacién debilidad, flacidez de lengua y disfa- gia. La incootdinacién y la imposibilidad de mantenerse cn pie, es seguido por pardlisis flécida y decibito. La parilisis de los misculos respiratorios lleva a tespira- cién abdominal, La temperatura corporal continta nor- imal y los animales afectados permanecen alerta, La muer~ te ocurte unos dias tras la aparicién de la emergencia de los signos clinics. En los pajaros, hay una pardlisis f14- ccida progresiva que inicialmente afecta a las patas y alas. La pardlisis de los miisculos del cuello (cuello flécido) s6lo es evidente en especies de cuello largo. Procedimientos de diagnéstico Los cadaveres y material sospechosos deben ser mane- jados con precaucién ya que pueden estar presentes al- tas cantidades de la potente neurotoxina, ‘© Los signos clinicos y un historial de acceso a comida contaminada puede sugerir botulismo como causa de un brote de enfermedad neurolégica mal definida. © Laconfirmacién requiere la demostracién de la to cenel suero de los animales afectados. El método tradi- ional para demostrar la toxina es la inoculacién en raton. Los ratores inyectados desarrollan una aparien- cia caracteristica de «cintura de avispa» consecuencia de la tespiracién abdominal por pardlisis de los mscu- Jos respiratorios. El suero recogido de animales muer- {o5 no es utilizable para la inocalacién en ratones. ‘© Se ha ulilizado la PCR y métodos basados en sondas de Acidos nucleicos para la deteccién de los genes de las toxinas de C. botulinum. Los métodos inmunol6gi- cos usando ELISA o ensayos quimoluminiscentes son procedimientos sensibles y especificos para la detec- ign de toxinas. + Los métodos de neutralizacién de toxina en ratones sando antitoxinas monovalentes pueden emplearse para identificar la toxina especifica implicada si es necesatio. ‘© Se debe recoger suero de varios animales afectados ya que el no demostrar la toxina en animales indivi- duales no excluye el botulismo, + Laiidentificacién de la toxina en alimentos puede ser tl en estudios epidemiolégicos. Tratamiento + Si esti disponible, el suero polivalente es efieaz new tralizando la toxina no fijada al principio del curso de laenfermedad, El coste y la disponibilidad limitan la extensiGn con que se pueda usar terapéuticamente + Agentes terapéuticos como los cloruros de tetractila- ‘ida y guaniina, que aumentan la liberaciGn de neu- rotransmisores en las uniones neuromusculares, pu den ser titiles administrados intravenosamente, © Los animales afectados moderadamente a menudo se recuperan sin tratamiento tras unas semanas, © Se debe complementar el régimen terapéutico con buenos cuidados. Control * La vacunacién con toxoides del vacuno puede estar indicada en zonas endémicas de Surifrica y Austra- lia, Puede recomendarse la vacunaci6n de rutina de visones y zorros de granja. + No se deben dar alimentos sospechosos a animales domésticos. * Cuando sea posible, la provisién de dietas equilibra- . Es un abultamiento edematoso de los tejidos sub- coutineos de la cabeza, cuello y t6rax craneal. La muerte puede ser répida. Los signos elnicos se atribuyen a la toxina necrotizante letal a de C. novyi tipo A Braxy El braxy, una abomasitis del ovino, esté causado por las exotoxinas de C. septicum. La enfermedad, que se pro- duce en invierno en periodos de fuertes heladas 0 neva- das, se ha descrito en partes de Europa del norte y oca- sionalmente en otras partes del mundo. Se ha sugerido que la ingestién de hierba congelada puede causar la desvitalizacin local de tejido del abomaso en su punto de contacto con el rumen, permitiendo Ia invasién por C. septicum, B] curso de la enfermedad es ripido y la mayorfa de los animales mueren sin signos premonito- rios. Inmediatamente antes de la muerte pueden ser evi- dentes anorexia, depresién y fiebre. Se puede demostrar . septicum en muestras dela lesign abomasal mediante ténicas de anticuerpos fluorescentes Hepatitis necrética infecciosa La hepatitis necr6tica infecciosa (black disease) es una enfermedad aguda que afecta a ovino y ocasionalmente a vacuno. Se han descrito raros casos en caballos y cer- dos, La necrosis hepatica esté causada por exotoxinas de C. novyi tipo B replicando en el tejido hepatico que ha sido lesionado por formas inmaduras de Fasciola hepatica w ottos pardsitos migrantes. Aunque se consi- dera el cuadro como endégeno, es posible que las fasciolas migrantes puedan llevar a las bacterias o sus esporas al hfgado, La muerte es répida sin signos premo- nitorios y la enfermedad debe distinguirse de ta fasciolosis aguda. La denominacién «black disease» se relaciona con la decoloracién oscura de la piel causadaIR II IE I IIR em a eee A AAR Om 109 Expecies de Ciostidiun por la marcada congestién venosa subcutdnea ehserva- daenel examen post mortem, La técnica de anticuerpos fluorescentes puede emplearse para demostrar C. novyi tipo B en muestras de lesiones hepaticas, Hemoglobinuria bacilar La hemoglobinuria bacilar ocurre primariamente en va- cuno y ocasionalmente en ovino. En esta infeceién end6gena, las esporas clostridiales estin latentes en el higado, probablemente en las células de Kupffer. Como en la hepatitis necrética infecciosa, el principal factor que failita la germinaci6n de las esporas y a replicacion clostridial es la migraci6n de distomas, La toxina f, una lecitinasa, producida por las células vegetativas, causa hemoliss intravascular ademas de necrosis hepatica. La hemoglobinuria, una caracteristica clinica principal de le enfermedad, es una consecuencia de la destruccién masiva de hematies. El agente etiologico puede ser de- rmostrado en muestras de las lesiones hepiticas por la téenica de anticuerpos fluorescentes Procedimientos de diagnéstico + Los clostridios histot6xicos que contribuyen a estos cuadros pueden ser ientificados por téenicas de an- ticwerpos fluorescentes, Clostridium perfringens se cultiva anaerdbicamente ‘en agar sangre a 37°C durante 48 horas + Lascolonias de C.perfringens tipo A son de hasta S mm de diametro, ciculares, planas, grsdiceas y estén rodea- das por una zona de doble hemolisis (Fig. 16.3) + Una prueba de CAMP positiva se da con Sireptococ cus agalactiae, Un factor difusible producido por S. agalactiae incrementa la hemolisis parcial de ta toxina alfa de C. perfringens. El patron de hemolisis, es similar al observado en la reaccin de S. agalactiae con la hemolisina B de Staphylococcus aureus (ver Fig. 9.4) Hemolsis completa (toxina theta) ‘Agar sangre. ts de cordero 0 busy ~ Wes Figura 16.3. Hemolisis doble en agar sangre alrededor de una colonia de C, pertringens. Aniitoxina con especticidad por la toxina alfa aplicada en la supericie del agar ‘Agar yema de huevo \ Estria de Clostrciam perfringens Opalascencia Actividad alrededorde la estia| lecitinasa de C. porringens indicando neutralzada actividad lectinasa por la anitoxina Figura 16.4 Reaccién de Nagler produclda por C. pertringens cre- ‘endo en agar yea de huevo. Se aplca una anttoxina con espe tificidad por i toxina alla ala superficie de media placa de agar yema de huavo, y se deja sacar. Se siembra C. pertringans en estria cruzando la placa, que se inevha anaerdbicamente a 37°C. durante 24 horas. Pese a que el microorganisme erece en ambas mitades de la placa, la actividad lectinasa s6lo es eviderte en la mitad sin anttoxina, © La reaccign de Nagler, una prueba de neutralizacion enplaca, identifica la toxina cede C. perfringens, que tiene actividad lecitinasa (Fig. 16.4), # Seha descrito un método basado en PCR para la iden- ‘ificacién de C. chauvoei en material clinico (Kuhnert eral, 1997) Tratamiento y control de las enfermedades clostridiales histotéxicas ‘# Debido a que la patogénesis de las enfermedades cau- satdas por los clostriios histot6xicos es similar, los procedimientos importantes para su tratamiento y control son también similares # ese a que el tratamiento es usualmente ineficaz, si se administra penicilina o antibiticos de amplio es- pectro a los animales al principio de la enfermedad, pueden ser de utilidad, ‘+ El método més eficaz para prevenir estas enfermeda- des es la vacunacién, normalmente con bacterina y toxoide adyuvantados. En algunas granjas se puede necesitar vacunas multicomponente que induzcan pro- teccién contra varias especies clostridiales pat6genas, Los animales deben vacunarse alos res meses de edad110 Microbiologia y enfermedades infecciosas veterinarias y revacunarse aproximadamente tres semanas des- Patogénesis y patogenicidad pués. Se recomienda una revacunacién anual Clostridium perfringens tipos A aE produce un niimero de exotoxinas potentes, inmunoldgicamente diferentes Fy i 5 que ocasionan los efectos locales y sistémicos que se er Clostridios enteropatogenos cuentran en las enterotoxemias. El patrén de producciéa y productores de enterotoxemia de toxinas varia con cada tipo de C. perfringens y deter ‘mina el sindrome clinico observado. Las toxinas prods Los clostridios que producen enterotoxemia y enteropatiacidas por C. perfringens tipos A a E, sus actividades bo se replican en ef tracto intestinal elaboran toxinas que jégicas y enfermedades asociadas se presentan en li producer efectos locales y generalizados. En animales dameésticos, C. perfringens tipos B, C y D son de patti cular significacién, Los factores que predisponen a la proliferacién clostridial en el intestino incluyen méto- dos de cria inadecuados, cambios bruscos de dieta o in fluencias ambientales locales, Tabla 16.5. Se reconoce también una serie de toxinas me nores, algunas de las cuales puede incrementat 1a vin lencia, Estas incluyen dos hemolisinas (8 y 6), um ccolagenasa (x) y una hialuronidasa (jt). Factores predisponentes intestnales y dietéticos per mmiten el sobrecrecimiento de C. perfringens en ovin (Cuadro 16.1), Se necesitan altos niveles sostenidos & Habitat normal exotoxinasclosridiales para el desarrollo de signos cl nicos sistémicos, Clostridiin perfringens se encuentra en el suelo, en he ces y en los tractos intestinales de animales y hombre. Infecciones clinicas Clostridium perfringens tipos B, C y D puede sobrevivir ‘como esporas en el suelo varios meses. Ctostridium per- Las enfermedades asociadas con C. perfringens tipos & fringens tipo A, que constituye parte de la flora intesti- al Eestin listadas en la Tabla 16.5. Pese a que C. perfi- nal normal, esté ampliamente distribuido en el suelo. gens tipo A se asocia primariamente con la gangrena ge Table 16.5 Tipos de Clostridium pertingens y sus toxinas. Toxina Clostridium perfringens Enfermedad Nombre ‘Actividad biolégica Tipo A Enteritis necrotica en pollos a (loxina significative} Lecitinasa Enteracoltis necratizante en cerdos Gastroenteritis hemorrgica canina Enterotoxia Gitotdxica Tipo B Disentera de os corderos a Lecitnasa Enteritis homordgica en temeros y potros _f(toxina signficatva) Leta, necrotizanto «(existe como protoxina Increment la permeatildat yyrequiere acivacién intestinal y capil, etal or proteasas) Tipo C ‘Strucke en ovino aduto « Lecitinasa Muerte sitita en cabras y vacuno de engorde {losin signicativa) Leta, necrotizante Enteritis necrdtica en polos Enlorotoxina Gitotbxiea Enters nocrétca en lechones neonatos Tipo D Rin pulposo (basqulla) en ovino « Lecitinasa Entaroloxemia en tereros, cabras adutas __¢(loxina signifcatva, _Incrementa la permeabildat yeeabritos ‘existe como protoxina intestinal y capil, let yy requiere activacion por protoasas) Tipo Entrits hemorrégica en temeros « Lecitinasa Enerits en cones \(loxinasignieativa) __LetalExpecies ée Clostridium = MN Cuadro 16.1 Factores predisponentes del desa- rrollo de enterotoxemias asociadas con Clostridium perfringens en ovino, * Baja actividad proteolitica del intestino del neonato: — presencia de inhibidores de la tripsina en el calostro — baja secrecién pancrestica ‘+ Establecimiento incompleto de la flora intesti- nal en neonatos 4 Influencias de la dieta en animales mayores — cambio brusco a una dieta rica — alto consumo de una dieta alta en energfa — hipomotilidad intestinal, consecuencia de un exceso de ingesta seosa en humanos y animales y con intoxicacién alimen- taria en humanos, se ha implicado también en enteroco- ltis necrotizante en lechones lactantes y cerdos de en- gorde, enteritis neerética en pollos broiler, gastroenteritis hhemorrgica canina ytflocolitis en caballos. Clostridium perfringens tipo E causa ententis en conejos y ocasio~ nalmente enteritis hemorrdgica en terneros. En ovino, C.perfringens tipos B, C y D causan la disenterta de los corderos, el «struck» y el rifién pulposo (basquilla),res- pectivamente, Clostridium perfringens tipo C causa ente- ritis hemorragica en lechones neonatos. En otras especies, se describen periédicamente enfermedades comparables Disenteria de los corderos La disenteria de los corderos, causada por C. perfrin- eas tipo B, ha sido descrita en zonas de Europa y Afri- adel Sur, La morbilidad en los brotes en rebaiios puede alcanzar el 30%, con altas tasas de mortalidad. Los cor- deros afectados, normalmente en su primera semana de vida, puede mostrar distensién abdominal, dolor y heces tefidas de Sangre. Pueden mori sifbitamente sin signos premonitorios, La alta susceptibilidad de este grupo de edad puede atribuirse a Ia ausencia de competencia mi- crobiana y baja actividad proteolftica det intestino det neonato (Cuadro 16.1). En ausencia de actividad proteolitica, la toxina fi conserva su potencia y produce Ia enfermedad. Post mortem se encuentra presente ente- Titis hemorrigica extensa con sreas de ulceracién en el intestino delgado. La permeabilidad capitar inerementada inducida por la toxina produce acumulacién de Muidos en la cavidad peritoneal y el saco pericdrdico. Enfermedad del rifién pulposo (basquilla) Esta enfermedad, causada por C. perfringens tipo D, se dda en ovinos en todo el mundo. El euadro se describe también como la «enfermedad del atracén» ya que inge- rir excesivamente tna dieta alta en grano 0 de pastos frescos predisponen a su desarrollo (Cuadro 16.1), La ingestién de excesiva cantidad de comida Hleva al paso de alimento parcialmente digerido del rumen al intesti- +0, E1 alto contenido en almidén de la comida parcial: mente digerida es un sustrato adecuado para una ripida proliferacién clostridial, La produccién mantenida de toxina €, que existe como protoxina y requiere activa- cidn por enzimas proteoliticas, conduce a la toxemia y al desarrollo de signos elinieas Los corderos més desarrollados de 3 a 10 semanas de edad son los comtnmente afectados. El curso de la enfermedad es frecuentemente corto y los corderos a menudo son encontrados muertos. Los signos clinicos incluyen torpeza, opist6tonos, convulsiones y coma ter- minal, Signos de sistema nervioso central como cegue- ray topetazos pueden estar presentes en la enfermedad subaguda, En las tltimas fases de la enfermedad, la hin- chazén puede ser evidente. La hiperglucemia y la glu- cosuria son caracterfsticas constantes de la enfermedad. Los ovinos adultos afectados, que hayan sobrevivido varios dias, pueden exhibir diarrea y tambaleos. En la enfermedad aguda, los tinicos hallazgos post mortem pueden ser zonas dispersas hiperémicas en i testinos y acumulacién de fluids en el save pericdrdico. Un hallazgo post mortem tipico es la répida autolisis de los riflones que conduce a un reblandecimiento pulposo de la cortical. La encefalomalacia focal simétrica, una manifestaci6n de los efectos subagudos de la toxina een la vascularizacién, esta caracterizada por lesiones, hemorrdgicas simétricas en los ganglios basales y cere bro medio, Infeccion por Clostridium perfringens tipo C en ovino La infeccién por C. perfringens tipo C causa el «struck», ‘una enterotoxemia aguda en ovino adulto en regiones geogrificas definidas como el distrito Romney Marsch en Inglaterra, La enfermedad, que se produce en ovinos pastando, se manifiesta como muerte sGbita, aunque algunos an112 Microbiologia y enfermedades infecciosas veerinarias ‘males pueden ser encontrados con las convulsiones ter- minales. La toxina juega el papel principal en la patogénesis de Ia enfermedad. Los hallazgos post mortem incluyen ulceracién yeyunal, hiperemias en placas en el intestino delgado y acumulacién de fluidos en la cavi- dad peritoneal junto con congestién de los vasos peritoneales y hemorragias petequiales. Enteritis hemorragica en lechones Esta enterotoxemia sobreaguda causada por C. perfringens tipo C se ha descrito en todo el mundo en lechones re- cin nacidos. Frecuentemente se afectan camadas com- pletas con tasas de mortalidad de hasta el 80%. La infec- ign es probablemente adquirida de las heces dela cerda. Unsmal manejo puede ser un factor predisponerte en cier- tos brotes El curso clinico de la enfermedad es corto, produ- ciéndose la muerte a las 24 horas del comsienzo. Los le- cchones mayores, de hasta dos semanas de edad, que son ocasionalmente afectados, desarrollan una forma mas cer6nica de la enfermedad. Los signos elinicos incluyen torpeza, anorexia y, al final, heces teiidas de sangre ¢ hiperemia perianal. En el examen post mortem se en- cuentra necrosis de la mucosa intestinal y contenido te- ffido de sangre. Las lesiones se suelen encontrar en el intestino delgado terminal, ciego y colon. En las cavida- des pleurales y peritoneales esti presente un exceso de fluido serosanguinolento. Enteritis necrotica de los pollos La enteritis necrética, causada por C. perfringens tipos AoC, afecta primaviamente a pollos de hasta 12 sema- nas de edad. Es una enterotoxemia aguda caracterizada por un inicio sibito y alta mortalidad. Post mortem se encuentran reas necréticas confluentes en la mucosa del Intestino delgado, Los cambios de dieta, la hipomotilidad intestinal y las lesiones de la mucosa causadas por coccidios y otros patégenos entéricos pueden predispo- ner al deserrollo de la enfermedad, Infecciones causadas por C. perfringens tipos B, C y D en otras especies Se han descrito enterotoxemias causadas por C. perfrin- gens tipo B en potros recién nacidos, terneros y en ca- bras adultas. En estas especies el cuadro es répidamente fatal y un hallazgo post mortem comin es una enteritis)‘ T™ hemorrdgica severa. bd Se ha asociado a C. perfringens tipo C con una enfer: ‘mecad en vacuno de engorde similar al «struck» de ovino adalto, En terneros, corderos y potros, las infecciones con C.perfringens tipo C acaban en una enterotoxemia agus junto con una enteritis hemorrgica similar a la prodtuci en lechones recién nacidos. La enterotoxemia causada por C. perfringens tipo D se ha descrito en cabritos y cabras adultas. Las caracters ticasclinicas y patol6gicas de la enfermedad aguda en ca britos son similares a las de la enfermedad del rif pul poso (basquilla) en corderos. Se han descrito tambits formas subagudas de la enfermedad, pero laencefaloma cia focal simétrica no se ha descrito en cabras, an Procedimientos de diagnéstico + Las muertes stibitas en grupos de animales no vacu- nados en granjas en las que hayan registrado previe mente enterotoxemias clostridiales pueden sugerila implicaci6n de C. perfringens tipos B, C 0 D. + Enanimales recién muertos, los hallazgos post mortem pueden ser tiles. La presencia de encefalomalacia fc simétrica es indicadora de implicacién de C. perfrie ‘gens tipo D (Buxton etal, 1978). ‘+ Los frotis directos de 1a mucosa o el contenido del intestino delgado de animales recién muertos, gue contengan grandes cantidades de bacilos grueses Gram positivos, son consistentes con enterotoxemia clostridial + La glucosuria es un hallazgo constante en la enfe medad del rifén pulposo. + Las pruebas de neutralizaci6n de toxinas utitizand inoculacién en ratones y cobayas pueden identifier efinitivamente las toxinas de C. perfringens presee tes eneel contenido intestinal de animales recién muer tos, Debido a la labilidad de algunas de estas toxin particularmente la toxina B, el fracaso en demostrasi presencia en el contenido intestinal no excluye nece satiamente un diagndstico de enterotoxemia clostridia Generalmente para la prueba se usa el sobrenadant decentrfugar contenido lea. Se aiade al sobrenadane antitoxinas con especificidad para cada tipo de C. per ringens para conseguir una mezcla de 3 partes de fi- do de prueba y una parte de antitoxina conocida, Com control positivo de la presencia de toxina se usa sol na afiadida al sobrenadante. Para permit neutralizacién de la toxina, la mezela se deja 1 har temperatura ambiente antes de la inoculacién int Tr cién sase ewer ree Expecies de Clostridium 113 Tabla 16.6 Prucbas de neutralizacin de toxinas, en ratones o cobayas, pata identilicar los tpos de C. pertingens implicados en las enerotoxemias, Antitoxina(especificidad) Resultados de las pruebas Toxinas identificadas en contenido intestinal @ ape a8 we at Tipo A (ant-a) . . ° ° D Tipo B fant-e,e) - - - - D Tpo C (ant-a,8) - ° - D D Tpo (ant-ae) - D D . > Tpo E (ant-a.) - D D D - 1D Merde ratén o necrosis drmica en cobayo porque las toxnas no son noualzadas. = Ralén eobaya no aera; loxnas neutral zadas. vvenosa en ratones 0 intradérmica en cobayas. Es nor- smal inocular 0,3 ml de la mezcla en ratones 0 0,2 ml en cobayas. El patrén de neutralizacién cruzada ob- servada en rat6n 0 en cobaya indica el tipo especifico de C. perfringens que es causante de laenterotoxemia (Tabla 16.6). ‘Se puede emplear ELISA como una alternativa a las pruebas in vivo para demostrar la toxina en el conte~ nido intestinal (Songer, 1997). La sensibilidad y pecificidad del ELISA para la deteccién de las toxi- nas de C. perfringens se acerca a la de los métodos de inoculacién en ratén 0 cobaya. ‘Tratamiento y control «El suero hiperinmune, si esté disponible, puede ser de utilidad en ciertos casos. Dedido a la naturaleza aguda de la enfermedad, la terapia antibiética, aun- que se usa algunas veces, es generalmente ineficaz. + La vacunacién es el principal método de control, Las ovejas deben ser vacunadas con toxoides seis semma- nas antes del parto para asegurar la proteccién pasiva de los corderos hasta las ocho semanas de edad. Las ovejas vacunadas por vez primera deben recibir dos dosis de vacuna con un mes de intervalo, Se reco- mienda la revacunacién anual. © Peca la prevencién de la enfermedad del rfion pulpo- so, los corderas deben ser vacunados con toxoide antes de que tengan dos meses de edad y revacunados tun mes después, + Se deben evitar los cambios bruscos de dieta y otros factores predisponentes de las enterotoxemias (Cua- dro 16.1). Otros clostridios ocasionalmente implicados en enfermedades de animales Este grupo variado de clostridios est compuesto de mi- croorganismos que producen enfermedades esporddicas en animales domésticos, Clostridium piliforme Clostridium piliforme, un pat6geno intracelular filamen- ‘oso Gram negativo formador de esporas, ¢8 un miembro atipico de los clostridios. No se ha cultivado en medios anificiales y solo crece en cultivos celulares 0 en huevos embrionados. Pese a haber sido nombyado originalmente Bacillus pilformis, la secuenciacién de DNA demostr6 su retacién con los clostridios (Duncan et a., 1993) Lainfeccién con C. piliforme, enfermedad de Tyzzer; ocasiona una necrosis hepatica severa. El cuadro fue descrito originalmente en raiones y otros animales de laboratorio (Sparrow y Naylor, 1978). Se a descrito esporsidicamente en potros y raramente en terneros, pe- ros y gatos. El estrés y la inmunodepresidn pueden pre- disponer para la infeccién, Los otros afectados son normalmente le menos de 6 semanas de edad y muchos se encuentran comatosos 0 ‘muertos. El periodo de incubacién, tras la infeccién oral, 8 de hasta 7 dias. Los signos clinicos incluyen depre- sin, anorexia, fiebre, icericia y diarrea, BI principal hallazgo post mortem es hepatomegalia con extensas reas de neccosis, El diagndstico se basa en Ja demostra- i6n histol6gica de los snicroorganismos en los hepato:114 Microbiologia y enfermedades infecciosas veterinarias citos empleando la técnica Warthin-Starry de impregna- cidn argéntica, Debido a la naturaleza aguda de la enfer- medad, la terapia especifica no es aplicable Clostridium difficile Clostridium difficile se ha descrito en perros con diarrea erGnica (Berry y Levett, 1986) y en enterocolitis hemo- rrigica en potros recién nacidos (Jones et al, 1988). Puede estar asociado con colitis aguda en caballos adul- tos tras terapia antibistica o sobrecarga de grano. Clostridium colinum = Clostridium colinum ha sido implicado en enteritis en codornices, pollos, pavos, faisanes y gallos lira. El mi ‘croorganismo esti presente en las heces de aves afecta- das clinicamente y portadoras. La mortalidad puede acer- carse al 100% en codornices susceptibles, pero es normalmente menos del 10% en pollos. En el examen post mortem aparecen ulceracin intestinal ¥, a veces, necrosis hepética Terapéuticamente, se usan antibiéticos en el aguade be- bida o en el pienso, Las camas contaminadas deben elimi- narse regularmente como parte del programa de control. Clostridium spiroforme Clostridium spiroforme, un microorganismo clostridial con una atfpica forma en espiral, ha sido implicado en enteritis esponténeas ¢ indacidas por antibiéticos en co- nejos. Este cuadro parecido a la enterotoxemia puede set fatal en 48 horas. Los factores predisponentes inclu- yen la administracién oral de antibiéticos y dietas po- bres en fibra. La administracién de antibidticos afecta adversamente a la flora intestinal del conejo, que esté compuesta fundamentalmente de bacterias Gram posit vas. Una toxina elaborada por C. spiroforme es neutrali- zada por la antitoxina frente a la toxina 1 de C. perfrin- gens tipo E (Borriello y Carman, 1983). Referencias Bemry, AP. and Levett, PN, (1986), Chronic diarshoea in dogs associated with Clostridium difficie infection. Veterinary Record, 18, 102-103 Borrielo, SP. and Carman, RJ. (1983). Association ofan iota- like toxin and Clostridium spiroforme with both spontaneous and antibitic-associated diarthoea and colitis in rabbits Journal of Clinical Microbiology, 17, 414-418. Buxton, D, Linklater, K.A. and Dyson, D.A. (1978). Pulpy kid ney disease nd its diagnosis by histological examination. Neteriary Record, 102, 241 Duncan, A.J. Carman, RJ, Olsen, GJ. and Wilson, K.H. (1993). ‘The agent of Tyzzer's disease is a Clostridium species. Clinical Infetious Diseases, 16 (Suppl. 4), 422. Farow. B.R.H., Mumell, W.G., Revington, M.L,, Stewart, BJ. and Zuber, RIM. (1983). Type C botulism in young dogs. ‘Ausiratian Veterinary Journal, 60, 374-377. Harihan, H, and Mitchell, W.R. (1977). Type C botulism: the agent, host spectrum and environment. Veterinary Bulletin, 47, 95-103, Jones, R.L., Adney, WS., Alexander, A. Shideler,R.K.,Traub- Dargatz, J. (1988). Haemorthagic necrotizing enterocolitis associated with Clostridium difficile infection in four foals. Journal of the American Veterinary Medical Association 193, 16-79, Kuhnert P, Krampe, M., Capaul, S.E., Frey, J. and Nicolet, J (1997) Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR. Veterinary Microbiology, $1, 291-298, McLoughlin, ME, Melitay,S.G. and Nell S.D. (1988). A maior ‘outbreak of botulism in catle being fed ensiled poultry liter Veterinary Record, 122, 519-581. (Quinn, PJ. and Crinion, R.A.P. (1984). A two year study of bot- ‘lism in gulls in te vicinity of Dublin Bay. Frish Veterinary Journal, 38, 214-219. Sanford, J.P. (1995). Tetanus - forgotten but not gone. New England Journal of Medicine, 332, 812-813. Songer, J.G. (1997). Clostriial diseases of animals. In The Clostridia : molecular biology and pathogenesis. Eds. J Rood, B.A. McClane, J.G. Songer and R.W. Titbal ‘Academie Press, San Diego. pp. 153-182. Sparrow, S. and Naylor, P.(1978). Naturally occuring Tyzzer’s disease in guinea pigs. Veterinary Record, 102, 288, Swerczek, ‘T.W. (1980). Toxicoinfectious botulism in foals and adult horses. Journal of the American Veterinary Medical Association, 176, 217-220. Lecturas complementarias Bagadi, H.O. (1974. Infectious necrotic hepatitis (black disease) ‘of sheep, Veterinary Bulletin, 44, 385-388. Gay, C.C., Lording, PM., MeNeil, P. and Richards, W.PC. (1980), Infectious necrotic hepatitis (black disease) in a hose. Equine Veterinary Journal, 12, 6-21. Hatheway, C.L. and Johnson, E.A. (1998). Clostridium: the | spore-bearing anaerobes. In Topley and Wilson's " Microbiology and Microbial Infections. Volume. 2. Eds. Colles, A. Balows and M, Sussman, Amold, London. pp. 733-782. Jones, T. (1996). Botulism. dn Practice, 18, 312-313.