CAPÍTULO

3 ESPECTROFOTOMETRÍA DE UV-VIS

Figura 1. Espectro de la luz

Para poder entender la espectrofotometría de UV-VIS, es necesario

conocer la luz (Fig. 1), la cual es una forma de energía radiante que
presenta propiedades tanto de onda como de partícula, según la
explicación de Einstein referente al fenómeno fotoeléctrico, donde sugiere

1
que la radiación electromagnética (fig. 2), está constituida por partículas
discretas llamadas ” fotones, que tienen energías definidas y se desplazan

en el espacio a la velocidad de la luz, por lo cual se hace uso de la dualidad

“partícula-onda.

Cuando la luz se comporta como partícula. Para poder explicar como

interacciona la radiación electromagnética con la materia es conveniente
pensar en un haz de luz como transportador de fotones, por lo tanto la
energía de cada fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación  por
una constante y se encuentra dada por la siguiente relación:

E=h 

Sí E = la energía del fotón en ergs

 = frecuencia en ciclos por segundo

h = constante de Planck 6.624 x 10-27 ergs-seg ó 6.63 x 10-34 J/s

2
 Figura 2. Radiación electromagnética

Cuando la luz se comporta como onda. Como su nombre lo indica, una

onda electromagnética presenta una componente eléctrica y una
magnética, ambas componentes oscilan en planos perpendiculares entre sí
y de la misma forma en dirección de propagación de la radiación, solo
Interviniendo la componente eléctrica en las interacciones comunes con la
materia, por lo tanto solo consideraremos esta componente, como se
observa en la figura (Fig. 3).

La longitud de onda, se define como la distancia entre dos puntos

correspondientes de la onda, por ejemplo la distancia entre dos crestas se
denota λ y se puede expresar en las siguientes unidades:

3
 λ m cm
1 nm ( nanómetro )= 10-9 m = 10-7 cm
1 mμ ( milimicra ) = 10-9 m = 10-7 cm
1 μ ( micra ) = 10-6 m = 10-4 cm
1 A0 ( Angstrom ) = 10-10m =10-8 cm

Figura 3. Espectro de longitud de onda

La velocidad de la luz se expresa por la siguiente relación:

c= λ 

c = Velocidad de la luz en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg.

4
λ = Longitud de onda
 = Frecuencia

Sí la frecuencia  se expresa en ciclos por segundo o Hertz, siendo el

producto de la frecuencia por la longitud de onda la velocidad de la
radiación.

La amplitud de la onda. Se representa con (A), que es la longitud del

vector del campo eléctrico en el punto máximo de la onda. Donde el
cuadrado de la amplitud de A de la onda es la medida de su intensidad de
radiación (I)la cual es proporcional al número de fotones y la potencia (P)
es la radiación que llega a un área por unidad de segundo y puede quedar
expresado como:

P=Ixs

Si el tiempo es un segundo se puede decir que:

P=I
En la figura 4 se puede observar que si entra una cantidad de radiación
fotones al pasar por la muestra esta disminuye.

5
 I0 = 100
It = 50

FOTONES FOTONES

Figura 4. Proceso de absorción transmisión de fotones

Io
It

LUZ INCIDENTE LUZ TRANSMITIDA.

Figura 5. Principio fotométrico

De aquí podemos usar potencia o intensidad indistintamente En muchos

tipos de interacción de la radiación electromagnética con la materia, es más
adecuado considerar a la luz como paquete de fotones o cuantum. Que es

6
la energía de un fotón la cual puede relacionarse con su longitud de
onda, la frecuencia y número de onda mediante la ecuación:

hc
E = h = = hc 


De esto en número de onda es el inverso de la longitud de onda en cm

según la siguiente relación:

1
= = cm −1
cm

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

El espectro electromagnético (Fig.5), abarca un intervalo muy amplio de

energías (frecuencias) y, por lo tanto, de longitudes de onda. Las
frecuencias de mayor utilidad van desde > 10 19 Hz ( los rayos gama) hasta
103 Hz (ondas de radio). Siendo de mayor energía los rayos Gama.

7
 10nm 200nm 380nm 780nm

Wave- 50µm 30cm

2.5 25
Length
µm µm

Near Visible N Infra Far-IR to

Spectral Vacuum
or I Red Microwave
Region UV
Quartz R

UV
Wave
4000 400 200
Number
/cm /cm /cm

Figura 6. Rangos del espectro electromagnético

8
 Figura 7. Aplicaciones de los rangos del espectro electromagnético

Considerando que la radiación interacciona con la materia, la cual esta

absorbe dicha radiación y después la transmite como se obserba en la
figura 8.

LUZ

REFLEJADA

LUZ LUZ

INCIDENTE
TRANSMITIDA

Figura 8. Interacción de la radiación con la materia

Para tener una idea de como se realiza este proceso, se dará un breve
repaso del efecto sobre la materia, comenzando con la radiación de más
alta energía que son los rayos gama:
9
Los rayos gama son los de mas alta energía, cuando estos inciden sobre la
materia penetran hasta nivel núcleo donde este absorbe y posteriormente
emite radiación característica en esta región generando durante su proceso
transiciones nucleares

Los rayos x, también se consideran de alta energía pero menor que los
rayos gama, la energía de los rayos x es absorbida por electrones internos
que se encuentran en estado basal y pasan al estado excitado en otro nivel
y cuando regresan emiten energía que es detectada como se observa a
continuación:

10
 Figura 9. Interacción de la radiación de rayos x con la materia

Cuando se aplica radiación de la región U.V (ultravioleta) a un compuesto

que tenga por lo menos un doble enlace conjugado o un heteroátomo,
donde este absorbe provocando una resonancia de los electrones y
cuando regresan estos emite radiación característica en esta región como
se observa en la ( Fig.10 ).

H  .. 
C = O
H   ¨
11
 Figura 10. Interacción de la radiación de rayos ultravioleta

En la fig. 10, se tienen dobles enlaces conjugados asociados a un

heteroátomo es por esto que este compuesto absorbe en la región
comprendida entre en un rango de 200-360 nm que es el U.V normal,
siendo las responsables las transiciones electrónicas que en este caso son
de:

σ σ*

π π*

n π*

Figura 11. Tipo de transiciones electrónicas en UV

Cuando se hace incidir radiación en la región visible la muestra tiene que

ser colorida y si no hay que formarle color, para esto los elementos que
presentan color en solución son los de transición, debido a sus orbitales de

12
tipo “ d “ y “ f “ los cuales presentan transiciones de d d y
f f
En la región visible el color que presenta la muestra no es el color del filtro
o longitud de onda que debemos ocupar, si no siempre se usará el f
complementario.

Longitudes de Onda Dominante

Ambito de  nm Tono

400 - 465 Violeta

465 - 482 A z úl

482 - 497 Azúl verde

497 - 530 Verde

530 - 575 Amarillo verdoso

575 - 580 Amarillo

580 - 587 Anaranjado

587 - 598 Anaranjado

598 - 620 Rojo anaranjado

620 - 700 Rojo

Figura 12. Rango de longitudes de onda en el Visible y tonos de color

13
La radiación IR es débil y solo es capaz de provocar en un compuesto
movimientos de rotación y translación, siempre y cuando exista un
momento dipolar diferente de cero y por esto se puede decir que es activa
en el infrarrojo, por lo tanto en esta técnica se pueden verificar la existencia
de grupos funcionales los cuales se utilizan para la elucidación de
estructuras de preferencia orgánicas, organometálicas y algunas
inorgánicas.

Los espectros de UV-VIS de compuestos se encuentran asociados a la

transición de niveles electrónicos de energía dentro de la región
ultravioleta, para obtener un espectro por lo menos la estructura debe de
contener un doble enlace conjugado para que pueda absorber en esta
región o un par de electrones asociado a un doble enlace.
Las transiciones son generalmente entre orbital enlazante o par solitario de
electrones conjugado, siendo en este caso la longitud de onda una medida
de separación de los niveles de energía de los orbitales afectados por la
radiación o sea cuando se hace incidir radiación UV a un compuesto que
absorba en esta región provoca transiciones electrónicas, siendo estas:

σ σ* son las de mayor energía y se presentan en la región del UV al

vacío en un rango de 100-200 nm.

π π* son de menor energía y se presentan en el UV normal, en el

rango de 200-280 nm.

14
n π* son las de mas baja energia y tambien aparecen en el UV
normal el el rango de 280-360 nm

σ*
π*
E
n
π
σ

Figura 13. Niveles de energía de las transiciones electrónicas

Estas transiciones quedan representadas en el siguiente espectro:

En la región visible los compuestos deben de poseer color en solución

siendo estos los elementos de transición o compuestos que se les pueda
desarrollar color mediante alguna reacción química para que puedan
absorber en esta región, como se puede observar en la fig. 14.

15
 0.137
ANALISIS CUANTITATIVO
0.12
CAFEÍNA
0.10

0.08

A 0.06

0.04

0.02

0.001
225.0 300 400 500 600 700 800 850.0
NM

100nm 200nm 360nm 750nm

UV-Vacio UV Normal Visible

Figura 14. Regiones del espectro UV-VIS

Medida del espectro

El espectro de UV-VIS se realiza en una solución de concentración en el

rango de 10-3 a 10-6 M, si se tiene información del coeficiente de
absortividad molar o coeficiente de extinción o coeficiente de extinción
especifico con los que podemos conocer la concentración a partir de la ley
de Beer, partiendo de una solución de 100mg/100 mL se efectúan
diluciones hasta que entre en el rango entre 0.2 a 1.2 de Absorbancia.
Después se efectúa un barrido ya sea en el rango en la región UV de 200-
360 nm o en Visible de 350- 750 nm de forma automática en un

16
espectrofotómetro de UV-VIS, obteniendo graficas de A= f (  ) o de %
T = f ( )

Elección del disolvente

El disolvente mas empleado es el agua y etanol al 99 %, pero algunos

disolventes utilizados en la región UV absorben en esta región son:

Disolvente  max en nm

Acetonitrilo 190
Ciclohexano 195
Hexano 201
Metanol 203
Etanol 204
Eter 215
Dicloruro de metilo 220
Cloroformo 237
Tetracloruro de metilo 257

17
 Tabla 1. Longitudes de onda de algunos disolventes

Un buen disolvente es aquel que es transparente por debajo de 210 nm

Un cromóforo es aquel que se utiliza para describir un sistema que
contiene pares de electrones y dobles enlaces conjugados y algunos no
conjugados, por lo tanto una  longitud de onda corta que son poco
usuales.

Electrones y cromóforos transición  max ( nm )

C-C-H σ σ* 150

O n π* 185

S n π* 195

N n π* 195

n π* 190

π π* 190

18
 Tabla 2. Longitudes de onda y transiciones de disolvente

Leyes de Absorción

Se han formulado dos leyes empíricas sobre la intensidad de la absorción.

Ley de Lambert-Beer
A= εcl

A= abc A= Absorbancia

C= A*F ε= Cte. de absortibidad

A
l= Espesor de celda
c= Concentraciòn
F= Factor de concentraciòn

La Ley de Lambert establece que la fracción de la luz incidente absorbida

es independiente de la intensidad inicial. La Ley de Beer dice que la

19
absorción es proporcional al número de moléculas absorbentes. Estas dos
leyes pueden representarse como:

I0 P
Log10 = cl = A o Log10 0 = cl = A
IT PT

Recordando que la P= I t si t= 1 seg la P= I

P= potencia de la radiación
I = intensidad de la radiación
A= absorbancia
De aquí podemos representar esta ley de tres formas dependiendo de la
concentración:

1.- A = cl A= absorbancia (unidimensional)

 = coeficiente de absortividad molar ( L/moles cm

c = concentración (moles/L)
l = longitud del paso óptico ( 1 cm )

2.- A = Kcl A= absorbancia (unidimensional)

A = acb K ó a = coeficiente de extinción (L/g cm)
c = concentración (g/L)
l = longitud del paso óptico ( 1 cm )
20
3.- A= E11cm
%
cl A= absorbancia (unidimensional )

E11cm
%
= coeficiente de extinción (100mL/g cm)

c = concentración (g/100mL)
l = longitud del paso óptico ( 1 cm )

en la literatura en la mayoría de las ocasiones se acostumbra a no poner

las unidades, pero podemos distinguir estos coeficientes por sus valores
aproximadamente por ejemplo:

Si es  =coeficiente de absortividad molar tendría un valor de 20 000

Si es K ó a = coeficiente de extinción tendría un valor de 2000

Si es E11cm
%
= coeficiente de extinción tendría un valor de 200

por este orden podemos distinguir cual es para con este valor poder
realizar los cálculos para determinar las concentraciones que vamos a
preparar nuestro analito en una determinada operación analítica.

Si conocemos estas leyes podemos transformar la absorbancia en

transmitancia y viceversa:

21
 I0
log T = = 10 − A = 10 −cl
IT

log 1/T = A
T x 100 = % T

Instrumentación de UV-VIS

Los espectrofotómetros en UV-Vis pueden ser de un haz y de doble haz

cuyos componentes son:

a) Fuente de radiación
b) Monocromador
c) Área de muestra
d) Detector
e) Pre amplificador
f) Amplificador
g) Sistema de lectura
h) Graficador

22
FUENTES DE RADIACIÓN
La función de la fuente es la de producir radiación característica en la
región donde se trabaje.
En la región Visible ( 350 a 750 nm ) se utiliza una lámpara con filamento
de w

Figura 15. Lámpara de filamento de w

Se utiliza una lámpara de descarga de deuterio o de hidrogeno para la
región Ultravioleta normal ( 200 a 360 nm ).

Figura 16. Lámpara de descarga de deuterio

23
MONOCROMADOR

Es un selector de longitudes de onda, donde entra luz policromatica y sale

monocromatica.
Los primeros selectores de longitud de onda fueron los filtros, los cuales
tenían un color especifico los cuales son utilizador por algunos
espectrofotómetros qué se utilizan
El monocromador esta compuesto de slit de entrada, óptica, selector de
longitudes de onda y slit de salida..
Uno de los selectores de longitud de onda utilizados fueron los prismas,
entre los cuales se encontraban el Cornu 60O y el de Littrow 30O entre los
más comunes.

Figura 17. selector de longitud de onda prisma Cornu 60O

24
Otro de los dispositivos para seleccionar la longitud de onda son las rejillas
de difracción

Una rejilla de difracción es una placa de plástico de unas cuantas pulgadas

rayada y con una superficie aluminizada con un número grande de rendijas
de iguales tamaños y situadas a la misma distancia una de otra donde se
muestran los patrones de difracción para rejillas que tienen 1, 2, 5 y 20
rendijas, cuando son iluminadas por un haz de luz que incide
perpendicularmente sobre ellas. En este caso vemos que hay nuevamente
zonas iluminadas alternando con zonas oscuras. Obsérvese que al
aumentar el número de rendijas, la luz difractada se va concentrando en
regiones cada vez más angostas. Para una rejilla con 20 rendijas el patrón
se forma prácticamente de rayas muy marcadas, que tienen
sensiblemente la misma intensidad. Por otro lado, para rejillas con pocas
rendijas, las zonas iluminadas están más extendidas y tienen distintos
tamaños, así como diferentes intensidades.
La cantidad de líneas por pulgada cuadrada depende para que región sea
utilizada:

UV 50 000 – 20 000 Líneas por pulgada cuadrada

Vis 20 000 – 5 000 Líneas por pulgada cuadrada
IR 2 000 - 200 Líneas por pulgada cuadrada

25
Figura 18. Rejilla de difracción

26
Área de muestra. Se pueden ocupar una o dos celdas dependiendo de
que tipo de instrumento se tenga, si es de un solo haz solo utiliza una celda
y si es de doble haz utiliza dos celdas, colocando el disolvente en la
referencia y el disolvente más la muestra en la celda problema.

Las cedas son de un cm de espesor de unos 5 a 7 cm de altura y

esmeriladas por dos caras dos transparentes son de cuarzo para trabajar
en las regiones UV-Vis, pero también existen las celdas de vidrio que son
utilizadas en la región visible solamente.

27
 Figura 19. Celdas

Las cedas pueden ser de una gran variedad de tamaño y forma

dependiendo del equipo hasta encontrar micro celdas

28
 Figura 20. Microceldas
DETECTOR
Su función es la de recibir la señal del análisis en forma de radiación
posteriormente trasformarlo a señal eléctrica.
Un detector es un bulbo de vidrió con una ventana de cuarzo en su parte
interna consta de dínodos y diodos de voltaje , donde un fotón choca con
una superficie metálica , estableciéndose con esto una diferencia de
potencial que es transformada a corriente eléctrica que posteriormente es
pre amplificada y después amplificada.
Los mas utilizados son los fototubos multiplicadores, antiguamente fueron
las fotoceldas y los fototubos.

FIGURA 21. Fototubo

29
 Figura 22. Fototubo Multiplicador

LECTURA
Los sistemas de lectura se dan:

Absorbancia A 0------ 1-------- 2------+n la señal es lineal

% Transmitacía % T 100 — 0 la señal es logarítmica
Concentración 0.0------- 9999

30
Métodos de trabajo en espectrofotometría UV-Vis

Curva estándar
Comparación con un estándar
Adición con un estándar método grafico y matemático

Curva estándar

C1 A1

Cestandar C2 A2

C3 A 3

C4 A4

C5 A5

31
 CPROBLEMA AP

AP

CP C

Figura 23. Curva de calibración

Comparación con un estándar

c estándar A estándar

ASTD = εSTD CSTD l

32
 CPROBLEMA AP

AP = εP CP l

Despejando ε L de cada ecuación e igualando las ecuaciones

A EST A P
queda: =
C STD C P

ASTD / CSTD = εSTD L

AP / CP = εP L

A ST D A P
=
C STD CP
33
 Adición con un estándar método grafico

CSTD

CP + CSTD 0 AP+STD 0

CP + CSTD1 AP+STD 1

CPROBLEMA CP + CSTD2 AP+STD2

CP + CSTD3 AP+STD3

CP + CSTD 4 AP+STD4

34
AP+STD0

AP+STD1

CP+STD 0 CP+STD

Figura 24. Curva de adición de un estándar

Adición de un estándar método matemático

CP

CP + CSTD 0 AP+STD0

35
 CP + CSTD AP+STD
CSTD
La concentración total es la suma de ambas concentraciones y puede
quedar representada por CP+STD y las absorbancias de la misma forma por
lo tanto es AP+STD y la del problema solo CP.

CP + CSTD 0 = CP AP+STD 0 = AP

CP + CSTD = CP+STD AP+STD

Aplicando la ley de Beer para ambos casos se tiene:

ASTD = ε CP+STD L
AP = ε CP L
Despejando e igualando se tiene:

A P +STD / C P +STD = ε L
AP / CP = ε L

36
 A P+ STD AP
=
CP+ STD CP

VP C P + VSTDC STD
Sí C P +STD = , Sustituyendo en la ecuación anterior
VP + VSTD
se tiene:

A P+ ST D AP
=
v p c p + v std c std CP
v p + v std

37
 CALIBRACIÓN DE ESPECTROFOTOMETROS

Los criterios y directrices fundamentales sobre calibración, rutinas de calibración y

diagnóstico aplicado por laboratorios de prueba y metrología. En la aplicación de
métodos espectrofotométricos de análisis es la responsabilidad del analista verificar que
los instrumentos estén funcionando adecuadamente y además que sean capaces de
proporcionar resultados analíticos aceptables. Utilizando para esto materiales de
referencia estables, los cuáles presentan propiedades que han sido medidas
exactamente por el laboratorio de estandarización.

Algunos estándares certificados son obtenidos en la Nacional Bureau of Standard los

cuales son utilizados para la evaluación satisfactoria de la funcionalidad de los
espectrofotómetros ( ASTM E 925-83 ).

Con ello se logro establecer que criterios más importantes en espectrofotometría, donde
los datos sean exactos y reproducibles, por ello el equipo debe ser verificado, certificado
y calibrado. Estableciendo las condiciones de operación adecuadas para establecer el
buen funcionamiento.

LA CALIBRACIÓN .-Es un conjunto de operaciones que se establecen bajo condiciones

especificas, en la relación entre los valores indicados por un aparato o sistema de
medición, con los valores representados por una medida realizada y los valores conocidos
correspondientes a una magnitud dada.

El resultado de una calibración permite estimar los errores de indicación del aparato de
medición, del sistema de medición o de la medida realizada o la asignación de valores a
los trazos sobre escalas arbitrarías.

El resultado de una calibración puede ser referido en un documento, algunas veces

llamado “Certificado de Calibración” o “Reporte de Calibración”.

CRITERIOS Y DIRECTRICES DE LOS PERIODOS DE CALIBRACIÓN PARA SU USO Y

MANTENIMIENTO DE UN INSTRUMENTO

 El equipo nuevo debe calibrarse antes de ser puesto en servicio.

38
 Todo equipo de medición o de prueba en servicio debe ser recalibrado regularmente a
los intervalos especificados en la recomendación ( ASTM E 925-83 ). Dos veces por año
como mínimo.

 El equipo debe de someterse a supervisiones en periodos comprendidos entre las

recalibraciones regulares.

 Cada vez que una parte de equipo de medición se dañe, repare, se someta a un
mantenimiento que pueda afectar su funcionamiento ó que se presente duda sobre su
exactitud, se deberá retirar del servicio hasta que sea recalibrado y se encuentre en
condiciones satisfactorias.

 Todas las calibraciones deben ser trazables a un padrón primario.

 Todo equipo de medición debe cumplir con los requerimientos del método de prueba o
ser capaz de cumplir con las incertidumbres de la medición señalada por el laboratorio
para los propósitos calibración ó acreditación.

 Se recomienda la integración de los registros de adquisición, mantenimiento y

calibración para cada uno de los equipos de medición.

 Los patrones de referencia de medición que tenga el laboratorio, serán utilizados

exclusivamente para la calibración del equipo en servicio y no para otros propósitos.

 Los patrones de referencia de medición deberán calibrarse por el organismo nacional

autorizado, Dirección General de Normas ( DGN ) que otorga reconocimiento para la
realización de dichas mediciones.

 El propósito de la recalibración de los instrumentos de medición es asegurar la

continuidad de la validez de las mediciones.

39
El mantener en buen funcionamiento un espectrofotómetro es un pre-requisito para
asegurar la exactitud de los resultados analíticos. Más aún el incremento constante de la
regularización de los laboratorios de control, de calidad por parte de agencias oficiales y
gubernamentales ( DGN ) las cuales exigen que los instrumentos de medición sean
verificados periódicamente para que funcionen adecuadamente y se eliminen las variables
probables de error.

El mínimo de pruebas, se recomiendan las siguientes ( ASTM E 275-83 ).

 Revisión de la exactitud de la longitud de onda

 Linearidad fotométrica
 Luz espuria o extraña
 Nivel de ruido
 Exactitud fotométrica
 Efecto de la correlación de la señal de fondo

REVISIÓN DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA

Exactitud de la longitud de onda. Indica que tanto se desvía el promedio de las

lecturas que se hacen a una longitud de onda de la banda de máxima absorción o la línea
de emisión de un estándar conocido.

Precisión de la longitud de onda. Es la habilidad del instrumento de reproducir la

lectura de una banda de absorción o emisión de una longitud de onda conocida cuando el
instrumento es estabilizado nuevamente.

40
Normalmente, la absorbancia de un compuesto que absorbe en la región UV-VIS se mide
a la longitud de onda máxima que presenta. De tal que la si la longitud de onda es
inexacta, la absorbancia también lo será.

La magnitud de error de la absorbancia debido a la inexactitud de la calibración de la

longitud de onda depende de que tan desviada este del punto de máxima absorción del
espectro; es decir, el error de absorbancia en relación al error de longitud de onda es
superior cuando la absorbancia se mide en la pendiente de la banda que cuando se mide
en el pico máximo.

El verificar la exactitud de la longitud de onda es tan importante que cuando se trata de

analizar compuestos que trabajan a longitudes de ondas especificas con rangos muy
estrechos ó que para su cuantificación emplean factores teóricos a una longitud de onda
especifica, como en las reacciones enzimáticas.

La revisión periódica será necesaria con el objeto de asegurar que, a una longitud de
onda dada por el instrumento, refleja exactamente la energía que pasa a través de los
slits enviada desde el monocromador.

Varios métodos son aprovechables para revisar la exactitud de la longitud de onda de un

espectrofotómetro o de un espectrómetro. Los más exactos involucran el uso de fuentes
de energía radiante que tienen líneas de emisión a longitudes de onda bien definidas,
como son:

 Lámpara de descarga de hidrógeno

 Lámpara de descarga de deuterio
 Lámpara de vapor de mercurio

41
Los espectrofotómetros que incluyen cualquiera de las lámparas antes mencionadas,
deben de contar con un accesorio para verificar la longitud de onda en cualquier
momento, algunos equipos lo hacen al iniciar su funcionamiento automáticamente.

METODOS DEVERIFICACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

1.- Verificación con una lámpara de deuterio. Este es un método rápido y exacto para
verificar la exactitud de la longitud de onda, siendo útil para cualquier espectrofotómetro
de UV-Vis que tenga una lámpara de deuterio cuya energía radiante sea reflejada a la
entrada del monocromador y obtener en la región visible unas líneas de emisión,
efectuando la operación a un solo haz. La lámpara de deuterio tiene solo dos líneas de
emisión, una a 656.0 y 486.1 nm.

2.- Otro método para verificar la longitud de onda es por medio del uso de filtros de vidrio
que contienen tierras raras, como el cloruro de HOLMIO o DIDIMIO los cuales presentan
las siguientes líneas de absorción:

HOLMIO ( nm ) DIDIMIO ( nm )

241 537
279 586
287 685
333 741
361 803
418
453
536
636

Tabla 3. Valores de longitud de onda para los filtros de Holmio y Didimio

Otra forma para caracterizar la longitud de onda consiste en una solución de óxido de
Holmio al 4% en ácido perclórico: 4 M ( 40 g/ L)

42
 Figura 25. Celda de Didimio

La verificación de la exactitud de la longitud de onda por medio filtros de óxido Holmio y

óxido Didimio, es un método muy aceptado para este propósito.

Estos filtros se adquieren directamente en las compañías que venden los

espectrofotómetros de tal forma que sólo se requiere instalar el filtro en el adaptador para
celdas y obtener su espectro sus lecturas.

43
 Figura 26. Celda de Holmio

3.- El tercer método para revisar la longitud de onda involucra el uso de soluciones:

 Solución de Oxido de Samario, exhibe un espectro de 13 bandas

 Vapor de benceno, presenta bandas estrechas y bien definidas

 Soluciones de colorantes a diferentes pH, como son rojo de metilo, naranja de metilo,
rojo de fenol usando lo que se denomina punto isobéstico

 Verde de alimentos que posee tres bandas a 257, 410 y 630

 Soluciones de sulfato de amonio, dicromato de potasio, permanganato de potasio

44
 La desventaja de este método es que las soluciones fácilmente se contaminan,
envejecen ó hay error en su preparación.

Independientemente del método que se utilice para la calibración de la exactitud de la

longitud de onda, se debe revisar más de una vez longitudes de onda que cubran el
rango UV ( 200nm-360 ) y VISIBLE ( 350-750).

Cuando el equipo tiene un selector de longitudes de onda una rejilla de difracción, se

puede calibrar con solo dos longitudes de onda, en cambio cuando su selector es un
prisma o filtro de vidrio colorido se tienen que utilizar por lo menos tres longitudes de onda
diferentes ya que las separaciones de las longitudes de onda son de forma no lineal.

VERIFICACIÓN DEL ANCHO DE LA BANDA ESPECTRAL

Las líneas de emisión ó bandas de absorción se pueden emplear para verificar el ancho
de la banda espectral de un espectrofotómetro. Estas líneas de emisión aisladas,
simétricas y únicas, como las de la lámpara de deuterio a una longitud de onda de 656
nm, es la más utilizada en la región visible y las bandas del vapor del benceno se
emplean en la región ultravioleta.

nm

45
 Figura 27. Línea de emisión de la lámpara de deuterio

LINEARIDAD FOTOMETRICA

Linearidad fotométrica. Permite comprobar el funcionamiento del equipo por medio de

una solución conocida que conforme a la ley de Beer dará una línea recta que parta del
origen al graficar absorbancia vs concentración.

El uso de un colorante verde de alimentos se usa para determinar la linearidad

fotométrica, donde se verifica cada semana a tres diferentes longitudes de onda: 257, 410
y 630 nm.

Un espectrofotómetro que este funcionando apropiadamente debe de exhibir una relación

lineal entre la energía radiante absorbida y la lectura del instrumento. La linearidad
instrumental es un prerrequisito para la exactitud espectrofotómetrica, así como la
exactitud analítica. Varios métodos se han propuestos para certificar que la respuesta del
detector es lineal sobre el rango de longitudes usado

Exactitud fotométrica. Es la habilidad de un espectrofotómetro para indicar

correctamente el nivel de energía presentado por el detector.

Precisión fotométrica. Representa la capacidad del sistema fotométrico para reproducir

el mismo el mismo valor en determinaciones sucesivas. Todas las mediciones deben
realizarse continuamente con el mismo instrumento y el mismo material.

Desviación de la luz espuria. Es la dificultad para definir y medir. También se define

como la proporción de energía trasmitida fuera del paso Terminal de la banda del
monocromador, para la energía total transmitida ( luz extraña ).

El criterio importante es la ausencia de la luz espuria. La luz espuria que llega al detector,
la cual es indeseable limitando la linearidad, esto ocurre a absorbancias muy bajas.

46
Normalmente el sistema óptico del monocromador debe de estar libre de la influencia de
luz espuria, la fuente del lado del monocromador puede reducir esta, por esta razón, la
fuente del lado del monocromador es pequeña en comparación con la imagen trazada.

Ya que la luz espuria es detectada por el detector, se puede medir usando soluciones que
se muestran a continuación en la tabla 4.

soluciones concentraciones Longitud de onda  Absorbancia

Yoduro de potasio 0.10 % 220 nm
Yoduro de sodio 1.00 % 220 nm
Cloruro de potasio 1.20 % 200 nm
Dicromato de potasio 0.25 g/L 370 nm

Tabla 4. Soluciones para valorar la desviación de la luz ( luz espuria )

Esta concentración se utiliza cuando se tiene un espectrofotómetro que su escala de

absorbancia es capaz de dar mas de 3 unidades. En la tabla 5, se observa que la
absorbancia es mayor de 2 por lo cual no existe luz espuria.

sustancia Primer día Segundo día Promedio Desviación C.V

lectura lectura general Std. S
K2Cr2O7 25 3.952136 4.060480 4.006308 0.047512 1.18993
mg/100 mL
KI 0.01 % 3.572245 3.592670 3.582458 0.37613 1.04992
NaI 1.0 % 3.320950 3.322545 3.321748 0.052804 1.58963
KCl 1.2 % 2.133891 3.253895 2.193893 0.006805 0.76599

Tabla 5. Resultados obtenidos en la prueba de desviación de la luz

Los materiales deben ser grado reactivo. Ellos son opacos a las longitudes de onda
indicadas. Sin embargo, estas soluciones absorben más haz espuria a 40 nm dentro de
las longitudes de onda indicadas y no debe de ser mayor de 2 absorbancia El nivel

47
aceptable de luz espuria va a depender del carácter espectral y el nivel de absorbancia
para la muestra investigada,

Nivel ruido. Se conoce como la variación que sufre las lecturas fotométricas por causa de
interferencia por ruido, puede variar al cruzar el espectro y se detecta a niveles bajos de
energía.

Estabilidad de la línea base. Es la desviación que sufre la lectura después de ser

ajustado el espectrofotómetro dentro de un periodo de tiempo especificado. La estabilidad
de la línea base afecta al usuario cuando el 100 % T y el cero de absorbancia continua
variando durante una serie de lectura, afectando el valor de las lecturas de cada muestra
causando inconvenientes por tener que reajustar constantemente.

CALIBRACIÓN

EXACTITUD Y PRECISIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

a) Obtener 10 veces el espectro completo de una celda de Holmio

b) Evaluar en cada uno de las señales de máxima absorción, ( tabla 6 )
c) Evaluar los resultados mediante desviación estándar y coeficiente de variación

Número de banda Longitud de onda en (nm) Lectura en ( A)

1.0 279.4
2.0 287.5
3.0 333.7
4.0 360.9
5.0 418.0
6.0 453.2

48
 7.0 499.9
8.0 536.0
9.0 637.0
10.0 648.0

Tabla 6. Señales de máxima absorción para la celda de Holmio

Longitudes de onda de Longitud de onda Diferencia Desviación Coeficiente

referencia Promedio de 10 estándar de
XR lecturas Xp XR- XP variación
279.4 279.0 0.40
287.5 287.5 0.00
333.7 333.5 0.02
360.9 360.5 0.04
418.0 418.0 0.00
453.2 453.0 0.20
499.9 499.5 0.04
536.0 536.0 0.00
637.0 637.5 0.05
648.0 648.5 0.05

Tabla 7. Parámetros estadísticos para las longitudes de onda obtenidas

Al comparar los valores de X R- XP cumplen con los límites de tolerancia establecidos por
el fabricante que es de (  1.0 nm ), por lo que se puede decir en este caso que existe

49
exactitud . tomando como referencia los valores de longitud de onda reportados para cada
banda en el filtro de Holmio

La precisión de la longitud de onda se determina calculando el coeficiente de variación

(C.V) obteniendo valores menores al 2 % con lo que se puede decir que el equipo
presenta precisión en la longitud de onda.

EXACTITUD Y PRECISIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA EN LA REGIÓN VISIBLE

d) Obtener 10 veces el espectro completo de una celda de Didimio

e) Evaluar en cada uno de las señales de máxima absorción, ( tabla 3)
f) Evaluar los resultados mediante desviación estándar y coeficiente de variación

Número de banda Longitud de onda en (nm) Lectura en ( A)

1.0 572.0
2.0 585.0
3.0 685.0
4.0 741.0
5.0 807.0

Tabla 8. Señales de máxima absorción para la celda de Didimio

Longitudes de onda de Longitud de onda Diferencia Desviación Coeficiente

referencia Promedio de 10 XR- XP estándar de
XR ( nm) lecturas Xp (nm) ( nm) variación
572.0 572.0 0.0

585.0 584.8 0.2

50
 685.0 684.0 1.0
741.0 741.0 0.0
807.0 806.9 0.1

Tabla 9. Parámetros estadísticos para las longitudes de onda obtenidas para filtro de
Didimio en la región visible

Al comparar los valores de XR- XP cumplen con los límites de tolerancia establecidos por
el fabricante que es de (  1.0 nm ), por lo que se puede decir en este caso que existe
exactitud . tomando como referencia los valores de longitud de onda reportados para cada
banda en el filtro de Didimio

La precisión de la longitud de onda se determina calculando el coeficiente de variación

(C.V) obteniendo valores menores al 2 % con lo que se puede decir que el equipo
presenta precisión en la longitud de onda.

EXACTITUD FOTOMÉTRICA

a) Preparar una solución estándar de Dicromato de potasio alrededor de 50 mg/ 100

mL de ácido perclórico 0.01 M y realizar las diluciones indicadas en la tabla 7.

MATRAZ DE VOL. DE K2Cr2O7 VOL. DE HCLO4 CONCENTRACIÓN

50 mL mL 0.01 M  g/ mL
A 4.0 46.0 40.0
B 5.0 45.0 50.0
C 6.0 44.0 60.0
D 7.0 43.0 70.0

Tabla 10. Diluciones para la evaluación de la exactitud fotométrica

b) Dejar reposar 15 minutos a temperatura ambiente

c) Obtener 3 repeticiones por cada nivel de volumen a las 5 longitudes de onda

51
En la tabla 11. se observan los intervalos promedio de las absorbancias obtenidas por
cada día.

Longitud Concentración Rango de Absorbancia de Absorbancia de la

de onda en  g/ mL absorbancia la 1ªª 2ª determinación
( nm ) certificado determinación
235 40.0 0.485-0.499 0.4898-0.4950 0.4904-0.4942
50.0 0.607-0.625 0.6138-0.6231 0.6139-0.6181
60.0 0.730-0.752 0.7338-0.7509 0.7379-0.7439
70.0 0.853-0.879 0.8637-0.8726 0.8637-0.8690
257 40.0 0.564-0.582 0.5686-0.5766 0.5707-0.5777
50.0 0.706-0.728 0.7133-0.7144 0.7120-0.7181
60.0 0.840-0.875 0.8563-0.8674 0.8549-0.8654
70.0 0.993-1.023 1.0027-1.056 1.0039-1.0154
313 40.0 0.189-0.195 0.1922-0.1939 0.1920-0.1928
50.0 0.237-0.245 0.2402-0.2432 0.2396-0.2427
60.0 0.285-0.293 0.2886-0.2912 0.2877-0.2904
70.0 0.332-0.342 0.3360-0.3390 0.3356-0.3396
345 40.0 0.419-0.431 0.4198-0.4240 0.4215-0.4230
50.0 0.523-0.539 0.5266-0.5316 0.5273-0.5311
60.0 0.627-0.647 0.6288-0.6369 0.6204-0.6346
70.0 0.733-0.765 0.7346-0.7511 0.7373-0.7422
350 40.0 0.431-0.534 0.4262-0.4306 0.4293-0.4314
50.0 0.528-0.548 0.5302-0.5371 0.5321-0.5347
60.0 0.633-0.653 0.6342-0.6462 0.6355-0.6462
70.0 0.740-0.768 0.7414-0.7554 0.7432-0.7547
Tabla 11. Datos de absorbancia para la prueba de exactitud fotométrica

Longitud Concentrac Rango de Promedio general Desviación Desviacin

de onda en ión absorbancia estándar estándar
( nm )  g/ mL certificado límite límite
inferior superior
235 40.0 0.485-0.499 0.04910-0.49460 0.000424 0.000566
50.0 0.607-0.625 0.61385-0.62060 0.000071 0.003536
60.0 0.730-0.752 0.73585-0.74740 0.002889 0.004950
70.0 0.853-0.879 0.86370-0.87080 0.000000 0.002546
257 40.0 0.564-0.582 0.56965-0.57715 0.001485 0.000778
50.0 0.706-0.728 0.71265-0.72125 0.000919 0.004455
60.0 0.840-0.875 0.86560-0.86640 0.000990 0.001414
70.0 0.993-1.023 1.00333-1.01553 0.000283 0.000127
313 40.0 0.189-0.195 0.19210-0.19385 0.000141 0.000071
50.0 0.237-0.245 0.23990-0.24245 0.000424 0.001061
60.0 0.285-0.293 0.28815-0.2908 0.000636 0.000566
70.0 0.332-0.342 0.33580-0.33910 0.000283 0.000424
345 40.0 0.419-0.431 0.42060-0.42395 0.001202 0.000071
50.0 0.523-0.539 0.52705-0.53135 0.000636 0.000354

52
 60.0 0.627-0.647 0.62910-0.63570 0.000424 0.001626
70.0 0.733-0.765 0.73595-0.74665 0.001909 0.006293
350 40.0 0.431-0.534 0.42875-0.43100 0.000778 0.000566
50.0 0.528-0.548 0.53115-0.53590 0.001344 0.001697
60.0 0.633-0.653 0.63485-0.64670 0.000919 0.000707
70.0 0.740-0.768 0.74710-0.75505 0.001273 0.000495
Tabla 12. Parámetros estadísticos para la prueba de exactitud fotométrica

PRECISIÓN FOTOMÉTRICA

a) Preparar soluciones de Dicromato de potasio en ácido sulfúrico 0.01 M a las

concentraciones de 60 y 100  g / mL.

b) Leer a una longitud de onda de 257 nm

c) Realizar 10 lecturas para cada concentración dos días diferentes.

d) Calcular la precisión fotométrica, usando desviación estándar y coeficiente de

variación por cada día.

Como se puede observar en la tabla 10 el coeficiente de variación es menor del 2 % para

las dos concentraciones en los dos días, por lo que se establece que el
espectrofotómetro cumple con los criterios de precisión fotométrica.

CONCENTRACIÓN A 60  g/ mL CONCENTRACIÓN A 100  g/ mL

ABSORBANCIA 1ª ABSORBANCIA 2ª ABSORBANCIA 1ª ABSORBANCIA 2ª
DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN
1.0 0.8643 0.8781 1.4629 1.4817

53
2.0 0.8642 0.8781 1.4636 1.4824
3.0 0.8640 0.8776 1.4649 1.4817
4.0 0.8650 0.8778 1.4669 1.4810
5.0 0.8675 0.8776 1.4682 1.4817
6.0 0.8678 0.8776 1.4656 1.4804
7.0 0.8680 0.8773 1.4642 1.4817
8.0 0.8668 0.8773 1.4662 1.4824
9.0 0.8668 0.8775 1.4662 1.4817
10. 0.8661 0.8776 1.4649 1.4810
__
X 0.866070 0.87765 1.46536 1.48157
S 0.001561 0.00028 0.001592 0.000622
C.V 0.180283 0.03169 0.108675 0.041977

Tabla 13. Resultados obtenidos de la prueba de precisión fotométrica

LINEARIDAD FOTOMÉTRICA

a) preparar una solución stock de dicromato de potasio al rededor de 50 mg / 250

mL de ácido sulfúrico al 0,01N

b) Realizar las diluciones mostradas en la tabla 14 por triplicado en dos días

diferentes.

Matraz de 25 mL VOL. DE VOL DE CONCENTRACIÓN Absorbancia Absorbancia

SOL STOCK H2SO4 0.01  g/mL 1 2
N
1.0 2.5 22.5 20.0
2.0 5.0 20.0 40.0
3.0 7.5 17.5 60.0

54
 4.0 10.0 15.0 80.0
5.0 12.5 12.5 100.0
6.0 15.0 10.0 120.0
7.0 17.5 7.5 140.0
8.0 20.0 5.0 160.0
9.0 22.5 2.5 180.0
10.0 25.0 0.0 200.0

Tabla 14. Diluciones para la linearidad fotométrica

c) Leer a una longitud de onda de 257 nm usando ácido sulfúrico como blanco

d) Graficar absorbancia vs concentración y obtener una línea recta que parte del
origen

e) Evaluar estadísticamente, obteniendo la pendiente ( m ) ordenada al origen ( b ),

coeficiente de determinación ( r2 ) y realizar el análisis de varianza

55
 Concentración 1ª determinación 2ª determinación
en mg/mL
0.2942 0.2971
0.02 0.2970 0.2910
0.2986 0.2966
0.5894 0.5834
0.04 0.5833 0.5823
0.5791 0.5871
0.8817 0.8752
0.06 0.8785 0.8747
0.8743 0.8710
1.1550 1.1541
0.08 1.1693 1.1656
1.1577 1.1579
1.4414 1.4407
0.10 1.4466 1.4454
1.4433 1.4447
1.7496 1.7494
0.12 1.7540 1.7468
1.7489 1.7553
2.0493 2.0357
0.14 2.0328 2.0382
2.0392 2.0434
2.3329 2.0357
0.16 2.3136 2.0382
2.3080 2.0434
2.3329 2.5936
0.18 2.5955 2.2973
2.5831 2.5982
2.0936 2.8906
0.20 2.8959 2.8970
2.8040 2.9083

Tabla 15 Datos obtenidos para la prueba de linearidad fotométrica

Determinación Pendiente Ordenada DSR D.S.R Coeficiente de

m determinación

Primera 14.431081 0.008698 0.006698 0.29496 0.999880

segunda 14.434474 0.007360 0.007360 0.009889 0.999867

56
 Tabla 16. Parámetros estadísticos, para ambas determinaciones

BIBLIOGRAFIA

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Madrid, España, 2000.

Willard H. H., Merritt L. L., Dean J. A. y Settle, F. A., “Métodos Instrumentales

de Análisis” 4ª Edic. Editorial Continental, México, 1992.

ESPECTROFOTOMETROS

Biowave II (UV_VIS) Camspec M508 UV/VIS

58
 UV-1603 SHIMADZU

Espectrofotómetro UV EF003 UVmini-1240

59
UVmini-1240 SHIMADZU

UV-1601 SHIMADZU

UV-1700 SHIMADZU

UV-2401PC SHIMADZU

60
61