MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de Microbiología y

que deben considerarse las más importantes se describen a continuación:

1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas

anteriormente como observaciones generales en la hoja anterior, reglas
establecidas para el trabajo correcto del laboratorio.
2. Se debe verificar diariamente la temperatura de la incubadora y de la estufa
bacteriológica y del estado de los aparatos que se utilizan en el laboratorio.
3. Hay que usar permanentemente la bata de laboratorio. Debe estar
expresamente prohibido el consumo de alimentos y bebidas, así como fumar y
aplicarse cosméticos.
4. Antes y después de la jornada de trabajo, limpie y descontamine las mesas y el
equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado.
5. No se debe utilizar el teléfono celular dentro de las prácticas de laboratorio.
6. No guardar alimentos en el refrigerador de sustancias contaminantes o
químicos.
7. No se debe pipetear con la boca. Use siempre pipetas automáticas o propipetas.
8. Todos los procedimientos se deben realizar con cuidado para no formar
aerosoles o contaminar áreas limpias. De preferencia hay que trabajar en una
campana de flujo laminar.
9. Emplee mascarillas y cubrebocas durante procedimientos que puedan generar
salpicaduras –aerosoles- de sangre u otros líquidos corporales.
10. Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de su sitio
de trabajo.
11. Utilice un par de guantes desechables.
12. Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de
manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.
13. Evite accidentes y avise de inmediato si esto ocurre. Debe limpiarse con
soluciones de yodo, cloro, fenol o benzal cualquier sitio o implemento que
accidentalmente se haya contaminado. En caso de derrame de sangre u otros
líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material
absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al 6% (o cualquier otro
desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante,
dejando actuar durante 30 minutos; después limpie nuevamente la superficie con
desinfectante a la misma concentración y realice limpieza con agua y jabón. El
personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes,
cubrebocas y bata.
14. En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido
corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las
manos.
15. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente son jabón germicida o
desinfectante después de trabajar con muestras clínicas, material contaminado y
animales infectados.
16. Todo el material sucio debe manejarse con guantes.
17. Hay que separar las pipetas, cajas de petri y tubos de rosca contaminados del
resto de material sucio.
18. Colocarlas cubreobjetos y portaobjetos en el contenedor de punzocortantes.
19. Absténgase de doblar o partir manualmente cualquier material punzocortante.
20. A todo el material contaminado de desecho se le debe quitar etiquetas, cintas
adhesivas o despintarlos; se colocan en cubetas con solución desinfectante
(cloro diluido), después de ser esterilizado para su posterior lavado. El material
contaminado como agar se colocan en las bolsas rojas que lo identifique con el
símbolo de RPBI y se depositan en el congelador del área temporal para RPBI.
21. Las pipetas contaminadas se sumergen una solución de hipoclorito de sodio
durante 30 minutos.
22. En caso de accidente con material punzocortante reportar inmediatamente al
maestro.
Práctica No. 1

PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO:
 Que el alumno sea capaz de preparar el material de laboratorio que se utiliza
con más frecuencia en el trabajo rutinario, tomando como ejemplo el más sencillo
(cajas de petri, tubos de ensaye, matraces y pipetas).
 Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización
de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología.
 Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la
contaminación microbiana en el laboratorio.

FUNDAMENTO:
La preparación del material de laboratorio se inicia desde el momento de que se
colectan los recipientes o utensilios conteniendo sustancias de un estudio ya realizado,
estos deberán esterilizarse y lavarse, posteriormente se secan, se tapan y se
envuelven adecuadamente para ser esterilizados al horno o autoclave. La aplicación de
calor es el método más simple para esterilizar material, a condición de que el material
por sí mismo no sufra deformación por el calor. Una temperatura de 100 ºC mata a
todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos. Generalmente se usa el vapor, tanto por
que las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como
por que el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las
partes del recipiente de esterilización. Para esterilizar material que debe permanecer
seco se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que la
distribución del calor es menos efectiva en estos aparatos se acostumbra aplicar una
temperatura de 160°C durante dos horas asegurando en esta forma que todas las
partes del interior del recipiente alcance cuando menos 120 ºC por quince minutos.

MATERIAL:

Caja de Petri 100 X 15 mm. Autoclave

Matraces Erlenmeyer de diferente capacidad Potenciómetro
Pipetas Pasteur. Incubadora a 37°C
Mechero Fischer Horno de calor seco
Tapones con algodón y gasa.
Papel Manila o de estraza para envolver.
Fosfato de amonio (NH4H2PO4)
Sulfato de magnesio (MgSO4)
Cloruro de potasio (KCl)
Dextrosa (glucosa)
Soluciones Amortiguadoras pH 4 y 7.
Tripié.
Algodón.

METODO:
El profesor explicará los principios generales de trabajo en el Laboratorio de
Microbiología, enfatizando en la desinfección de áreas, así como en la preparación y
esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano
con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el
estudiante aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones
asépticas.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente las cajas de petri y pipetas con escobillón y detergente.

Enjuagar con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una
pizeta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o
papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de petri y pipetas
con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón
y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les
colocará un capuchón de papel.
4. Preparar 100 ml de Agar Simple, agar + minerales, agar + minerales + fuente de
carbono orgánico (dextrosa) y agar + minerales + dextrosa + fuente de nitrógeno
orgánico (peptona) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml respectivamente y
ajustar el pH con el potenciómetro a un pH de 7.0 ± 0.2 agregando con una
pipeta Pasteur poco a poco solución de HCl 0,1M o de NaOH 0,1M, en caso de
que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. (Revisar la preparación en
Anexos de esta práctica)
5. Calentar cada medio de cultivo en un tripié agitando constantemente hasta
ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida a un
frasco para posteriormente esterilizarlo.
Esterilización del material de laboratorio y medios de cultivo

1. Las cajas de petri y pipetas envueltas se colocarán en horno a 160°C durante 2

horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en
área aséptica.
2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de calor húmedo de acuerdo
a las siguientes instrucciones:
a) Revisar que el nivel del agua coincida con la marca en el tubo indicador.
En caso necesario añadir agua destilada.
b) Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.
Acomodar los medios y los materiales en la canasta del autoclave y
colocarla dentro.
c) Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada
y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado.
Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.
d) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 libras de
presión revisando cuidadosamente la escala del manómetro. Una vez
 alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento
moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.
e) Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos.
f) Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de “0”. Abrir la
válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga
húmeda abrir cuidadosamente la tapa, de adelante hacia atrás para evitar
quemaduras por la salida del vapor.

Preparación de las cajas de petri

1) Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave
se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50°C, que coincida con la
posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor
excesivo.
2) Cerca del mechero, etiquetar 4 cajas con A, 4 cajas con AM, 4 cajas con AMD y
4 con AMDP. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de petri
(aproximadamente 25 ml) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de
flujo laminar.
3) Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 15 minutos) y posteriormente
envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma
invertida en bolsas de plástico limpias.
4) Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

RESULTADOS:
 Describir figuras sobre el proceso de envoltura, preparación de medios y
esterilización.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología?

2. Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización,

desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la
pasteurización?

3. Mencione diferencias entre la esterilización con calor húmedo y el seco.

4. ¿En qué consiste la esterilización con vapor a presión?

5. ¿Cómo funciona la cinta testigo cuando se introduce al autoclave?

6. ¿Por qué a los medios de cultivo previo esterilización se deben ajustar el pH y

calentar?
 7. ¿Cómo ajustaría el pH a un medio con agar?

8. ¿Cuál es más eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor húmedo?
¿Por qué?

9. De una lista de materiales que deben esterilizar preferentemente en un horno de

aire caliente en vez de autoclave. Indicar en el caso de cada material, porqué el
aire caliente es el método elegible para esterilizar?

10. Dibuje el material esterilizado.

11. Comparar las células vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas
en relación con su resistencia al calor.

12. Distinga entre las expresiones punto térmico letal, tiempo térmico letal y tiempo
de reducción decimal.

13. ¿Qué es un autoclave?

14. ¿Qué significado tiene la presión “per se” en la efectividad del proceso de
esterilización con el autoclave para lograr esta operación?

BIBLIOGRAFIA:

 Bradshaw L. J. (2000). Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual

Moderno. México, D.F.
 Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw Hill. 4ª.
Edición en español. México, D.F.
 Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser.
20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
 Koneman E., Allen S., Dowell V. R., Sommers H. (1996). Atlas de Diagnóstico
Microbiológico. Editorial Interamericana. México.