Tema - 5 Otros Métodos de Inclusión

Manual de Preparación Técnico Anatomía Patológica
Tema 5. Otros métodos de inclusión (gelatina, celoidina, resinas

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intelectual y por tanto protegidos
Otros métodos de inclusión
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legalmente, quedando prohibida su difusión,
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consentimiento explícito de IFAPES. plásticas). La inclusión en
de estos actos supondría la
violación de las leyes que protegen la microscopia electrónica
propiedad intelectual, e implicaría la toma de
medidas legales por nuestra parte.
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tanto protegidos legalmente, quedando prohibida su difusión, venta o distribución sin permiso y
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Tema 5 Otros métodos de inclusión (gelatina,
celoidina, resinas plásticas). La inclusión en
microscopia electrónica
1. Inclusión en diferentes clases de medios.
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1. Inclusión en diferentes clases
de medios
Aunque se aplican raramente en la rutina diaria del laboratorio, son de gran interés para protocolos
específicos de investigación o en ciertas tecnologías especiales. Normalmente se utilizan medios
alternativos de inclusión cuando:
- El tejido es demasiado duro (microscopia electrónica) o tiene estructuras que se desnaturalizan
con calor (estudio enzimático).
- El tejido contiene abundantes interfases de consistencia heterogénea.
- Para el estudio de tejidos que requieres cortes superiores a 20 micras.
1.2 Inclusión en gelatina
Se utiliza fundamentalmente como medio de inclusión en especímenes muy viables, para realizar cortes
macrométricos de órganos completos en micrótomo tipo Tetrander y como alternativa sencilla cuando
se necesitan secciones en congelación.
Es un material soluble en agua por lo que no necesita deshidratar y aclarar la muestra. Deberemos
hacer hincapié en el lavado postfijación, ya que los fijadores desnaturalizan las proteínas que componen
la gelatina. Este lavado se realiza mediante agua corriente en circulación continúa durante 12-24 horas.
Otra característica de la gelatina es que posee un punto de fusión bajo, los tejidos infiltrados por este
método no sufren temperaturas superiores a 40ºC.
La inclusión se realiza mediante infiltraciones sucesivas en gelatina a 37ºC en concentraciones
crecientes.
1.2,1fapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifa
Realización de la técnica
Fijación: es preferible la formalina tamponada al 10%, aunque pueden utilizarse otros.
1. Lavado prolongado postfijación en agua corriente 12-24 horas.
2. Solución de gelatina al 10% 37ºC durante 24 horas.
3. Dos cambios en solución gelatina al 20% 37ºC de 12 horas cada uno.
4. Confeccionar el bloque con solución gelatina 20% y enfriar a 4ºC durante unas horas.
5. Retallar el bloque al tamaño deseado para los cortes.
6. Endurecer el bloque por inmersión en formalina cálcica al 10% durante 12-24 horas.
OBSERVACIONES:
1. Todas las soluciones de gelatina tienen que contener solución fenol 1% para evitar la
contaminación bacteriana.
2. Esta inclusión presenta el inconveniente de que la gelatina no puede ser eliminada del corte al
ser solidificada por la acción de formol, quedando los colorantes fijados.
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3. Los tejidos incluidos no deben exceder de los 3mm de espesor para facilitar la penetración de
la gelatina.
1.3 Inclusión en celoidina
Es una sustancia amorfa, blancoamarillenta, insoluble en agua y soluble en alcohol-éter 50% (coloidon
elástico) y benzoato de metilo.
Químicamente es una forma purificada de nitrocelulosa, normalmente se emplea como mezcla di-, tri- y
tetranitrato de celulosa. Existe otra variante, la celoidina de bajo peso molecular, más explosiva pero
que se disuelve a mayor concentración en alcohol- éter.
La celoidina se utiliza:
- Para ciertos trabajos neurohistológicos.
- En muestras duras, frágiles o de gran heterogeneidad (tejido óseo, ocular).
Con esta técnica se obtienen bloques de gran dureza y no es necesario aplicar altas temperaturas.
El mayor inconveniente es que su utilización necesita mucho tiempo para completar el procesamiento,
tiempo que se mide en días o semanas. Además, los cortes que obtenemos no son inferiores a 10
micras (media de 15 micras).
1.3,1 Realización de la técnica
Fijación: Preferible formalina tamponada 10%, se puede emplear otros, pero nunca ácido pícrico
porque son incompatibles.
Deshidratación: Ha de ser completa y óptima.
1. Alcohol etílico 70% 1-3 días dependiendo tamaño muestra.
Los alcoholes deben renovarse al menos una vez para cada paso.
Aclaramiento: Con una mezcla de alcohol-éter 50% 12-24 horas.
Infiltración: En soluciones creciente de celoidina.
1. Solución débil, celoidina 2% o nitrocelulosa de baja intensidad 5% 3-5 días.
2. Solución media, celoidina 4% o nitrocelulosa de baja intensidad 10% 5 días.
3. Solución fuerte, celoidina 8% o nitrocelulosa de baja intensidad 20% 5 días.
Endurecimiento: Depende:
- Evaporación uniforme y lenta del solvente.
- Ausencia de formación de burbujas de aire.
Se endurece vertiendo celoidina al 14% o nitrocelulosa de baja intensidad al 30%. Después conservar
en alcohol de 80%.
Montaje de bloque sobre el portabloques del micrótomo: Agregar al portabloques celoidina o
nitrocelulosa. Dejar evaporar el solvente.
Precauciones generales:
- Todas las soluciones deben guardarse en frascos herméticamente cerrados para impedir la
evaporación de éter y la humidificación del alcohol.
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- Antes de disolver la celoidina secar con papel de filtro a 37ºC toda la noche, tras secarse
humidificar con alcohol- éter y dejar reposar toda la noche.
1.4 Inclusión de tejidos en medios hidrosolubles distinto de la
gelatina
Se utiliza principalmente para la demostración de enzimas, lípidos, para tejidos sensibles al calor o por
el tratamiento con agentes deshidratantes y líquidos intermedios.
La sustancia más empleada es el polietilenglicol y sus derivados, se caracterizan por ser polímeros
de peso molecular variable y fórmula genérica HOCH2 (CH2OCH2) CH2 OH.
Las moléculas de peso inferior a 1000 se encuentra en estado líquido y son hidrosolubles; a medida que
aumenta el peso, se incrementa el grado de polimerización, aumenta de forma paralela su grado de
viscosidad hasta alcanzar un punto en el que se transforman al estado sólido(carboxirresinas).
La técnica radica en embeber el tejido en polietilenglicol de bajo peso molecular para después hacer la
polimerización, empleando monoestereato de polietilenglicol, químicamente activo y capaz de
desencadenar la unión molecular.
1.4,1 Realización de la técnica
Fijación: Formalina 10% para lípidos, Fijadores alcohólicos para glucógeno, no fijar para actividad
enzimática.
Técnica:
1. Lavado postfijación en agua destilada.
2. Solución acuosa de polietilenglicol pM= 550 50% 30 minutos.
5. Solución concentra de polietilenglicol 550 30 minutos 37ºC.
8. Mezcla a partes iguales de polietilenglicol 1000 y activador de la polimerización 20 minutos a
37ºC.
9. Solución concentrada de activador 20 minutos a 37ºC.
10. Enfriar los bloques en el refrigerador a 4ºC.
Observaciones:
- La técnica expuesta es una de muchas que se pueden utilizar.
- Los cortes se realizan en criostato en una solución de polietilenglicol al 40%.
- Es aconsejable el montaje sobre sustancias adherentes como gelatina-glicerina, gelatina-
crómica etc.…
1.5s®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes
Inclusión en plástico
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Se utilizan resinas acrílicas (metacrilato, glicolmetacrilato, butilmetacrilato, resinas hidrosolubles etc.…)
o de tipo epoxi.
Este método se utiliza para la infiltración de muestras para el microscopio electrónico de transmisión,
muestras óseas y materiales de elevada dureza (dientes). Las resinas plásticas se utilizan en
microscopia óptica de alta resolución, permitiendo la realización de secciones muy finas con excelentes
resultados, conservando la estructura y poder aplicar las técnicas de histoenzimología e
inmunohistoquímica cuando la resina es hidrosoluble.
Todos estos métodos se basan en la polimerización de una sustancia elemental de bajo peso molecular
hasta transformarla en un compuesto sólido, transparente y de gran dureza. La inclusión en metacrilato
es la más simple.
Debemos tener en cuenta que la deshidratación ha de ser exhaustiva, utilizando la acetona como
agente. A continuación, proceder a la infiltración de la muestra con el monómero plástico, activado
mediante la adición de un catalizador. El tiempo de infiltración difiere según el plástico que se utilice.
Antes de que la pieza solidifique hay que colocarla y orientarla en el bloque.
Muchas de las resinas tienen la desventaja de que la polimerización produce reacción exotérmica lo que
puede inducir daños en los componentes celulares de tejido debido a las elevadas temperaturas que se
pueden alcanzar.
1.5,1®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®I
Inclusión en metilmetacrilato
Se emplea en forma monomérica CH3=C (CH3)COOCH3.
Debido a su extrema dureza en su forma pura tienen que prepararse en mezclas con el metacrilato de
butilo que en su forma pura sería un polímero demasiado blando para ser cortado.
Como activador de la polimerización se utiliza el peróxido de benzoilo.
1.6®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®Ifapes®I
Inclusión en resinas hidrosolubles: glicolmetacrilato y jb4
1. GLICOMETACRILATO:El 2-hidroxietil metacrilato o glicolmetacrilato es una resina acrílica
miscible con el agua, lo que la diferencia del metilmetacrilato. No suele emplearse en estado
puro, sino añadiendo otras sustancias como el polietilenglicol y el butoxietanol, que le confiere
mayor plasticidad. El fundamento de la inclusión es análogo al de la inclusión en metilmetacrilato
con la adición de la NN-dimetilanilina como acelerador.
REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA:
Añadir página 82.
2. PREPARADOS COMERCIALES JB4 Y LR WHITE:
Se trata de resinas acrílicas hidrosolubles en agua, permite usarlas directamente para infiltrar
muestra no deshidratadas, lo mismo que el polietilenglicol.
Se venden en forma de preparados para uso directo, compuesto por dos soluciones, de
infiltración y de aceleración, y un catalizador. El fundamento es el mismo que para las otras
resinas.
Como ventajas destaca su fácil manejo, pero tienen el inconveniente de su elevado precio.
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1.7 La inclusión en microscopia electrónica
Como ya hemos comentado anteriormente, la microscopia electrónica posee dos cualidades
fundamentales:
- Espesor del corte muy fino, decenas de nanómetros, que permitan el paso de los electrones
para proyectar una imagen. Por eso necesitamos medios de inclusión de extremada dureza.
- Presentación optima de la estructura celular y subcelular de la muestra a estudio.
La inclusión en microscopia electrónica es a grandes rasgos, idénticos a los otros medios de inclusión
descritos. Para la realización del bloque primero se coloca la pieza y después añadimos la resina.
Deshidratación: Entre los agentes más empleados se encuentran la acetona y etanol. Debemos
recordar que la deshidratación ha de ser exhaustiva, ya que la mayor parte de los medios de inclusión
son fuertemente hidrófobos y la presencia de agua impide la correcta sección del bloque.
El número de baños y el tiempo serán más cortos que los de parafina, dado que el tamaño de las
muestras para inclusión en microscopia electrónica son de menor tamaño que en el caso de la
microscopia óptica.
Líquidos intermediarios:
Generalmente se emplea el ½ epoxipropanou óxido de propileno cuando se ha elegido como medio de
inclusión algún tipo de epoxirresina. Suelen realizarse 2-3 baños de 5-15 minutos de duración.
Cuando el etanol o la acetona son miscibles con el agente de inclusión, es posible el cambio directo del
tejido al agente.
Inclusión:
La técnica más utilizada es la inclusión en un tipo plástico. Hay diferentes variedades, pero normalmente
suelen seguir el mismo procedimiento.
En un principio la inclusión se realizaba en metilmetacrilato, pero desde la introducción de las
epoxirresinas se ha reducido su uso.
El metacrilato posee la ventaja que su dureza u elasticidad pueden ser modificadas en función de los
monómeros que constituyen la mezcla final, pero tiene como inconvenientes la dificultad de la realización
de los cortes y los artefactos que induce por alteraciones en la polimerización.
Inclusión en Epoxirresinas.
Los más importante son: el araldite, la resina epon y la resina Spurr, se retraen escasamente (menos
2% de su volumen total) y proporcionan una buena conservación de la estructura subcelular, más que
la que proporciona el metacrilato. El procedimiento de inclusión es similar al de la parafina.
Características.
- Cortes ultrafinos. 60-90 nm.
- Fijación. Glutaraldehído 2.5-5%.
- Postfijación. Fija y proporciona contraste a las muestras.
- Lavado. Eliminar cualquier residuo de los fijadores.
- Deshidratación. Principalmente con acetona, se puede utilizar también el etanol.
- Aclaramiento. Normalmente oxido de propileno.
- Contraste. Citrato de plomo.
Los inconvenientes son:
- Elevada viscosidad que dificulta la penetración el en tejido
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- La toxicidad de sus moléculas, principalmente del dióxido de vinilciclohexano (VCD),
considerado como un potente carcinógeno y determinante de las numerosas normas
establecidas para su manejo.
La araldita y el epon son epoxirresinas de difícil manejo, de ahí que Spurr introdujera en 1969 una nueva
resina de muy baja viscosidad, históricamente se ha convertido en la más usada en los laboratorios a
pesar de sus inconvenientes:
- Escaso contraste final con el citrato de plomo.
- Requiere uso adicional del acetato de uranilo como contraste suplementario.
- Extrema toxicidad.
El fundamente de la inclusión en epoxirresinas radica en la utilización de una resina monomérica líquida
que se transforma en un polímero sólido de gran dureza en presencia de calor, un endurecedor, un
acelerador y opcionalmente un plastificante que disminuye su fragilidad. El catalizador normalmente es
un anhídrido responsable de la ruptura de los enlaces de tipo éster monómero para que aparezcan
puentes intermoleculares determinantes de la polimerización. A medida que aumenta la longitud de la
cadena alifática del anhídrido, se incrementa la plasticidad interna del polímero.
Entre los aldehídos (Catalizador y endurecedor), se utilizan fundamentalmente el dodecinilsuccinico
(DDSA) y el metilnádico (AMN).
Como aceleradores se emplean derivados amínicos como la bencildimetilamina (BDMA), el
dimetilaminofenol (DMP30) o el ftalatodibutilo (DBP).
Inclusión en Araldita:
Lo más importante de esta técnica radica en la utilización de la cantidad exacta de agente plastificante
(dibutilftalato). Al ir añadiendo más cantidad aumenta la plasticidad del bloque y disminuye la dureza.
Inclusión en Resina Epon:
Es de menor viscosidad que la Araldita, fue la primera alternativa para solventar los problemas de ésta.
Añadir cuadro Página 87.
Inclusión en Resina Spurr:
Resina de muy baja viscosidad. Consiste en una mezcla de un diepóxido alifático cíclico
(viniciclohexano, VCD o ERL 4206) con un plastificador (polipropilenglicol o DER 736), un endurecedor
como el anhídrido nonenilsuccínico (NSA) y el acelerador dimetilaminoetanol (DMAE o S-1). Si se quiere
disminuir más la viscosidad se puede utilizar como plastificador el anhídrido hexenilsuccínico y como
endurecedor el butanodiolgliceril éter.
1.8 Realización de los bloques para microscopia electrónica
El encastramiento y la confección de los bloques se realiza en moldes plásticos o de silicona, que se
eliminan tras la polimerización seccionándolos longitudinalmente con una cuchilla, o en cápsulas de
gelatina que se eliminan por disolución en un baño de agua a 70ºC. Cuando el tejido a estudiar requiere
condiciones especiales de orientación, la manipulación, una vez colocada en la resina fresca del molde,
ha de realizarse con extrema delicadeza para no producir burbujas.
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